Os receptores canabinóides do tipo CB1 estão presentes em grandes quantidades no sistema nervoso central, especialmente no hipocampo, estrutura encefálica essencial para a formação de memórias e local onde o fenômeno eletrofisiológico da potenciação de longa duração (LTP) tem sido mais extensamente estudado. Neste trabalho, estudamos os efeitos da administração intrahipocampal de AM152, um antagonista seletivo para os receptores canabinóides CB1, ou da Anandamida, um agonista canabinóide endógeno, (a) sobre as etapas de aquisição, consolidação e evocação da memória, e (b) sobre a indução da LTP. Nossos resultados mostram que o antagonista CB1 prejudicou a consolidação, porém facilitou a evocação da memória; foi, também, capaz de inibir a indução da LTP. Já o endocanabinóide anandamida facilitou a consolidação da memória. As evidências sustentam um claro envolvimento do sistema CB1 endógeno na modulação dos processos plásticos subjacentes ao processamento do aprendizado e da memória. / CB1 cannabinoid receptors are abundantly present in the brain, with large concentration in the hippocampus, an essential structure for the memory processes and extensively studied in LTP experiments. Here, we have studied the effect of the dorsal hippocampus infusion of the selective CB1 receptor antagonist AM251, or the endogenous cannabinoid anandamide, (a) upon the memory acquisition, consolidation and retrieval of the step-down inhibitory avoidance task in rats, and (b) upon LTP induction. Our results show that AM251 has caused a memory consolidation deficit, but a retrieval facilitation; it has also blocked the LTP induction. The endocannabinoid anandamide, otherwise, has caused a facilitation of the consolidation. Our evidence support a clear role for the CB1 endogenous cannabinoid system in the modulation of plastic events underlying the learning and memory processes.

A hiperamonemia é observada tanto em doenças hepáticas quanto em erros inatos do metabolismo. A amônia em altas concentrações atravessa a barreira hematoencefálica e é tida como uma das principais causas para o desenvolvimento das alterações neuropsiquiátricas observadas na Encefalopatia Hepática (HE). Os prejuízos moleculares e fisiológicos causados por este íon são observados principalmente nas células astrocíticas às quais apresentam alterações na atividade de uma série de proteínas e enzimas clássicas de sua função. Entre elas destaca-se a proteína S100B, principalmente expressa e secretada por estas células e muito usada como marcadora de dano cerebral. Um aumento nas concentrações de S100B no soro tem sido observado em pacientes e modelos animais com HE, porém pouco foi visto sobre a indução na secreção da S100B provocado por altas concentrações de amônia no cérebro. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a secreção desta proteína em uma situação de hiperamonemia ex vivo, em fatias hipocampais e corticais, assim como in vivo em ratos hiperamonêmicos por indução com urease. Além disso, foi realizado a análise de outras funções astrocíticas, ainda controversas na literatura, e pouco analisadas na região hipocampal. A exposição à amônia induziu uma redução no conteúdo extracelular de S100B em fatias de hipocampo, porém não induziu alteração nas fatias de córtex cerebral. No entanto, um aumento na concentração de S100B foi observado no líquor, sem alteração no soro dos ratos com hiperamonemia. O hipocampo se mostrou uma região altamente susceptível aos efeitos da amônia, com redução na captação de glutamato, no conteúdo de GSH e sem alteração na atividade da glutamina sintetase. Além disso, o conteúdo de GFAP está aumentado nos ratos hiperamonêmicos evidenciando uma astrogliose na região hipocampal, o que pode estar contribuindo para patogênese de HE. / Ammonia serum concentration is commonly raised in liver diseases and in inborn errors of urea cycle. High ammonia levels cross the blood brain barrier and is considered one of the main causes for the development of Hepatic Encephalopathy (HE), a neuropsychiatric disease. The molecular and physiological damages are observed mainly in astrocyte cells which present alterations in the activity of a number of proteins and enzymes of their classic function. Among these, stands out the S100B protein, mainly expressed and secreted by these cells and used extensively as a marker of cerebral damage. An increase in S100B serum has been observed in animal models and patients with HE. However, it is not known if ammonia can directly induce S100B secretion in the brain. In this study, we evaluated the secretion of this protein in hyperammonemia condition ex vivo, in hippocampal and cortical slices, and in vivo, in urease treated rats. We also analyzed other astrocyte functions, which are still controversial in the literature and little examined in the hippocampus. We found a reduction in the extracellular S100B content in hippocampal slices exposed to ammonia, but no change was observed in cortical slices. However, an increase in cerebrospinal fluid (CSF) S100B level was found, with no change in serum level of this protein in hyperammonemic rats. The hippocampus revealed a very susceptible area to the ammonia effects, with a reduction in glutamate uptake as in glutathione (GSH) content and no change in glutamine synthetase activity. Moreover, GFAP content was increased in hippocampus of hyperammonemic rats indicating an astrogliosis, which may contribute to pathogenesis of HE.

La autoestimulación eléctrica intracraneal (AEIC) ha mostrado un efecto facilitador sobre la adquisición y retención de diferentes tareas de aprendizaje y memoria, tanto implícitas como explícitas, como se desprende de la evidencia recogida por nuestro y otros laboratorios. En el presente trabajo, a lo largo de 5 experimentos, se ha utilizado la técnica de la inyección intracelular con amarillo lucifer para investigar posibles modificaciones morfológicas en neuronas hipocampales que pudieran estar relacionadas con el efecto facilitador de la AEIC. En concreto, hemos intentado determinar cambios en la estructura, tamaño y patrón de arborización de la arborización basal y apical de las neuronas piramidales de CA1, inducidos por AEIC en la adquisición de una tarea espacial en el laberinto acuático de Morris. Además, también hemos explorado el debilitamiento asociado al paso del tiempo tanto de la memoria Control como de la AEIC, incrementando la longitud temporal del intervalo entre la fase de adquisición y el ensayo de prueba. De acuerdo con resultados previos de nuestro grupo, los animales que recibieron AEIC tras cada sesión de entrenamiento mostraron una mejor ejecución que los animales Control. Esto se hizo evidente en un ensayo de prueba a los 3 días pero también cuando la distancia temporal se incrementó a 10 y 20 días. Además, los animales AEIC también mostraron un incremento importante de la longitud, el área y la complejidad de la arborización tanto basal como apical en las neuronas piramidales de CA1, tanto a los 3 como a los 20 días de finalizar el entrenamiento. Más aún, en ambos casos también se observó un incremento en la densidad de espinas tanto basales como apicales. Estos resultados respaldan la hipótesis de que la facilitación por AEIC de una tarea espacial puede deberse, al menos en parte, a modificaciones en las células hipocampales y sus patrones de conectividad. / Post-training intracranial self-stimulation (ICSS) has shown a facilitative effect on the acquisition and retention of several learning and memory tasks. Evidence for this phenomenon has been observed in implicit and explicit tasks of our and other laboratories. In the present work, including 5 experiments, intracellular injections of lucifer yellow are used to investigate possible morphological modifications in hippocampal neurons that could be related to this facilitative effect of ICSS. Specifically, we tried to determine changes on the structure, size and branching complexity of the apical and basal dendrites of CA1 pyramidal neurons, induced by post-training ICSS in the acquisition of a spatial and distributed task in the Morris water maze. In addition, we also explored the memory delay associated with time in both, the Control and the ICSS memory, incrementing the amount of time between the acquisition of the task and the probe trial. Accordingly with our previous findings, the animals that received ICSS after each learning session showed a faster and higher performance than the control ones. This was evident when the probe trial was run three days after, but also when we increased this length to 10 and 20 days. In addition, the ICSS subjects also showed a significant increment in apical and basal branching length, area and complexity in pyramidal neurons of CA1 at 3 and 20 days after training. Furthermore, in both cases there was also an increment in spine density both in basal and apical arbors of this area. Our results support the hypothesis that ICSS facilitation on the acquisition of a spatial memory task could be due, at least in part, to modifications in hippocampal cells and its patterns of connectivity.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439242-Texto+Completo-0.pdf: 1575567 bytes, checksum: 619d0569503f83efdbc96d24f37eb2fb (MD5) Previous issue date: 2012 / Memories are not stored in its final form immediately after the acquisition. They undergo a long stabilization process known as consolidation. Consolidated memories can become labile again after the retrieval and susceptible to the action of amnesic agents. Thus, to persist must go through the re-stabilization process called reconsolidation. Several evidences indicate that the hippocampus plays an important role in both consolidation and reconsolidation process of different memories. In this way, we decided investigate the participation of NMDA and GABA receptors of dorsal hippocampus CA1 region on the retrieval and reconsolidation of spatial memory. We used the Morris water maze task (MWM) to demonstrate that infusion of AP5 (5 μg/μl), the selective antagonist of the NMDA receptor, into the dorsal hippocampus CA1 region of rats is able to block temporarily the retrieval of spatial memory. However, when we administered different doses and different times after the reactivation session in the absence of reinforcement is not observed any effect on spatial memory reconsolidation. While agonists of the glycine site of NMDA receptors, D-SER (10 μg/μl), improves the consolidation and the reconsolidation of spatial memory. Furthermore, we found that infusion of the agonist of GABA, muscimol (0. 1 μg/μl), temporarily prevents the memory retrieval of MWM. However, when the animals received infusion of muscimol before the reactivation session and the protein synthesis inhibitor, anisomycin (160 μg/μl), immediately after this session, spatial memory remains inhibited. Thus, we have demonstrated that inhibition of NMDA receptors prevents the retrieval but not the reconsolidation of the spatial memory and the NMDA agonist is capable of improving consolidation and reconsolidation of memory, while the GABA activation temporarily prevents retrieval and the impairment of memory is maintained through inhibition of protein synthesis. / As memórias não são armazenadas em sua forma definitiva. Logo após a aquisição, elas passam por um longo processo de estabilização conhecido como consolidação. Memórias já consolidadas podem se tornar novamente lábeis logo após a evocação e suscetíveis a ação de agentes amnésicos. Dessa forma, para persistirem devem passar pelo processo de reestabilização denominado, reconsolidação. Inúmeras evidências indicam que o hipocampo tem um papel importante tanto na consolidação quanto na reconsolidação de diferentes memórias. Assim, decidimos investigar a participação dos receptores NMDA e GABA da região CA1 do hipocampo dorsal na evocação e reconsolidação da memória espacial. Utilizando a tarefa de labirinto aquático de Morris (LAM) em ratos, demonstramos que a infusão na região CA1 do hipocampo do antagonista seletivo do receptor NMDA, AP5 (5 μg/μl) é capaz de bloquear temporariamente a evocação da memória espacial. Porém quando administrado diferentes doses e diferentes tempos, após a sessão de reativação na ausência de reforço não se observa efeito algum sobre a reconsolidação da memória espacial. Enquanto que o agonista do sítio da glicina no receptor NMDA, D-SER (10 μg/μl), melhora não só a consolidação, mas também a reconsolidação da memória espacial. Além disso, a infusão do agonista do receptor GABA, muscimol (0,1 μg/μl), impede temporariamente a evocação da memória do LAM. Porém, quando os animais recebem a infusão de muscimol antes da sessão de reativação e do inibidor da síntese de proteínas, anisomicina (160 μg/μl), imediatamente após esta sessão, a memória espacial permanece inibida. Assim, demonstramos que a inibição dos receptores NMDA impede a evocação mas não a reconsolidação da memória espacial e seu agonista é capaz de melhorar a consolidação e a reconsolidação dessa memória, enquanto a ativação do receptor GABA impede temporariamente a evocação e o prejuízo na memória é mantido com a inibição da síntese de proteínas.

Orientador: Suely Regina Mogami Bomfim / Banca: Paulo Cesar Ciarlini / Banca: Breno Fernando Martins de Almeida / Resumo: Há evidências que a prática regular de atividade física potencializa a memória, diminui o estresse oxidativo plasmático e hipocampal e a ansiedade na senescência. Neste trabalho foram utilizadas 40 ratas (Rattus norvegicus albinus, Wistar), com 13 meses de idade ao início do experimento, divididas em quatro grupos: um grupo controle (GC) e três grupos tratamento (GT1, GT2 e GT3), sendo 10 animais em cada grupo. O grupo controle foi mantido apenas sob observação. Aos grupos tratamento foram aplicados exercícios físicos e de memória, sendo que ao GT1, apenas exercícios de memória; ao GT2 escalada em escada, e ao GT3 ambos os exercícios. Os animais que foram submetidos à escalada em escada três vezes por semana durante três meses consecutivos e aos testes de memória, apresentaram melhor desempenho nas memórias de curto e longo prazo e de habituação, bem como menor ansiedade em teste de campo aberto. A baixa concentração de malonaldeído (MDA), o equilíbrio da superóxido dismutase (SOD) e o aumento da capacidade antioxidante total (Ferric Reducing Antioxidant Power- FRAP, foram observados nas amostras plasmáticas e hipocampais de ratas submetidas aos tratamentos. Concluiu-se que a prática de exercício físico regular associado a exercícios de memória melhorou as capacidades mnemônicas, diminuiu o estresse oxidativo e a ansiedade de ratas na senescência / Abstract: There is evidence that regular physical activity enhances memory, decreases plasma and hippocampal oxidative stress, and anxiety in senescence. In this work, 40 rats (Rattus norvegicus albinus, Wistar), 13 months old at the start of the experiment, were divided into four groups: one control group (CG) and three treatment groups (GT1, GT2 and GT3), 10 animals in each group. The control group was kept under observation only. In the treatment groups, physical and memory exercises were applied, and to GT1, only memory exercises; to GT2 climbing stairs, and to GT3 both exercises. Animals that underwent ladder climbing three times a week for three consecutive months and memory tests showed better performance in short and long term memory and habituation as well as lower anxiety in the open field test. The low concentration of malonaldehyde (MDA), the balance of superoxide dismutase (SOD) and the increase in total antioxidant capacity (Ferric Reducing Antioxidant Power - FRAP) were observed in the plasma and hippocampal samples of rats submitted to treatments. Regular exercise practice associated with memory exercises improved mnemonic abilities, decreased oxidative stress and anxiety of rats in senescence / Mestre

O sistema bombesina / peptídeo liberador de gastrina (gastrin-releasing peptide - GRP) está implicado na regulação de vários aspectos neurofisiológicos e comportamentais. Em ambos estudos aqui reportados utilizamos o antagonista dos receptores GRP, (D-Tpi6, Leu13 psi[CH2NH]-Leu14) bombesin (6-14), RC-3095, como ferramenta farmacológica para ampliar o conhecìmento sobre a ação do sistema bombesina / GRP na memória na amígdala basolateral (ABL) e hipocampo. No primeiro estudo demonstramos que os receptores GRP na ABL estão envolvidos na memória aversiva. Ratos Wistar machos adultos foram treinados em tarefa de esquiva inibitória de teste único e avaliados 24 horas após para a retenção da memória. No primeiro experimento, a administração sistêmica do RC-3095 após o treino causou redução da retenção da memória. No segundo experimento, a microinfusão póstreino bilateral de RC-3095 intra-amigdaliana reduziu de maneira dose-dependente a retenção da tarefa. Consistentemente, quando a ABL foi inativada funcionalmente com o agonista GABAérgico muscimol, no terceiro experimento, o efeito da admnistração sistêmica do RC-3095 foi bloqueado. Estes resultados sugerem que a ABL medeia o efeito de inibição da memória aversiva causado pelo bloqueio de receptores GRP. No segundo estudo avaliamos o papel dos receptores GRP no hipocampo dorsal de ratos no medo inato e na formação da memória aversiva. Os ratos receberam microinfusões bilaterais de salina ou RC-3095 no hipocampo dorsal cinco minutos antes do treino em tarefa de esquiva inibitória, sendo testados 24 horas após para a retenção. Foi utilizada esquiva inibitória de múltiplos testes, e o RC-3095 não afetou a aquisição da tarefa; a retenção foi prejudicada na dose de 0,4 μg. Entretanto, em avaliação no aparato do labirinto em cruz elevado, o RC-3095 não demonstrou ter afetado o medo inato ou ansiedade. Em resumo, nossos experimentos indicam que os receptores GRP na amígdala basolateral e hipocampo estão envolvidos na consolidação da memória aversiva em ratos, e que a ABL é uma região crucial na mediação dos efeitos inibidores de memória do antagonista GRP RC-3095. / The bombesin / gastrin-releasing peptide (GRP) receptor system has been implicated in regulating several neurophysiologic and behavioral aspects. In both studies here reported we used the GRP receptor antagonist D-Tpi6, Leu13 psi[CH2NH]-Leu14 bombesin (6-14), RC-3095, as a pharmacological tool in order to extend the knowledge about the actions of bombesin / GRP system in the basolateral amygdala (BLA) and hippocampus in memory. In the first paper we show that GRP receptors in the BLA are involved in the consolidation of aversively motivated memory. Adult Wistar male rats were trained in a single-trial step-down inhibitory avoidance task and tested for retention 24 hours later. In the first experiment, post-training systemic injection of RC-3095 impaired memory retention. In the second experiment, post-training bilateral microinfusion of RC-3095 into the BLA dose-dependently impaired retention. Consistently, when BLA was functionally inactivated by the GABAergic agonist muscimol, in the third experiment, the memoryimpairing effect of RC-3095 was blocked. These results suggest that BLA mediates the memory-impairing effect of GRP receptors. Next, reported in the second paper, we evaluated the role of GRP receptors in the rat dorsal hippocampus in formation of fear-motivated memory and innate fear. Adult male Wistar rats were given a bilateral microinfusion of saline or RC-3095 into the dorsal hippocampus 5 minutes before they were trained in a continuous multiple trial inhibitory avoidance task, and tested 24 hours later. RC-3095 did not affected acquisition, but at the dose of 0,4 μg impaired retention test performance. RC-3095 did not affect innate fear and anxiety assessed in an elevated plus maze. In summary, our experiments indicate that GRP receptors in BLA and hippocampus are involved in regulating aversive memory consolidation in rats, and that the BLA is a crucial area mediating the memory-impairing effects of the GRP antagonist RC-3095.

Resumo não disponível

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (Pronex) / A vitamina D (VD), um hormônio esteróide com diversas funções no Sistema Nervoso Central (SNC), produz inúmeros efeitos fisiológicos através de respostas genômicas mediadas pelo seu receptor (VDR). Estudos clínicos e experimentais mostram uma associação entre disfunções da VD e epilepsia. Nesse sentido, o I objetivo de nosso trabalho foi analisar a expressão relativa de RNAm do VDR na formação hipocampal de ratos nos três períodos do modelo de epilepsia do lobo temporal induzido pela pilocarpina. Ratos machos, da raça Wistar, foram divididos aleatoriamente em 5 grupos: 1- ratos controle (Grupo CTRL), 2- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados após 4 horas de status epilepticus (Grupo SE), 3¬ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 7 dias após status epilepticus (Grupo SIL 7 dias) 4- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 14 dias após status epilepticus (Grupo SIL 14 dias) 5- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 60 dias após a primeira crise espontânea (Grupo Crônico). A expressão relativa de RNAm do VDR foi determinada através da técnica do RT -PCR em tempo real. Nossos resultados demonstraram um aumento da expressão relativa de RNAm do VDR nos grupos SIL 7 dias, SIL 14 dias e Crônico, respectivamente (O,060±0,024; O,052±0,035; 0,085±0,055) quando comparado com os animais do grupo CTRL e SE, respectivamente (0,019± 0,017; 0,019±0,025). Nossos resultados sugerem que o VDR é um possível candidato a na participação do processo de epileptogênese no modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina em ratos. / Vitamin D, is a steroid hormone with multiple functions in the central nervous system (CNS), producing numerous physiological effects mediated by its receptor (VDR). Clinical and experimental studies have shown a link between VD dysfunction and epilepsy. In these lines, the purpose of our work was to analyze the relative expression of VDR mRNA in the hippocampal formation of rats during the three periods of the pilocarpine-induced epilepsy. Wistar male rats were divided into five groups: 1- control rats (CTRL group), 2 – rats that received pilocarpine and were killed 4 hr after the status epilepticus (SE group), 3 - rats that received pilocarpine and were killed 7 days after the status epilepticus (SIL 7 days group), 4 - rats that received pilocarpine and were killed 14 days after the status epilepticus (SIL 14 days group), 5 - rats that received pilocarpine and were killed 60 days after the first spontaneous seizure, (chronic group). The relative expression of the VDR mRNA was determined through real-time PCR technique. Our results showed an increase of the relative expression of the VDR mRNA in the SIL 7 days, SIL 14 days and chronic groups respectively (0,060 ± 0,024; 0,052 ± 0,035; 0,085 ± 0,055) when compared with the CTRL and SE groups (0,019 ± 0,017; 0,019 ± 0,025). These data suggest the VDR as a possible candidate participating in the epileptogenesis process of the pilocarpine model of epilepsy. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A pilocarpina é um agonista colinérgico que, quando injetada em altas doses (i.p.) a ratos, reproduz as principais características da epilepsia do lobo temporal (ELT) humana. O animal exibe diferentes padrões de comportamentos, incluindo status epilepticus (fase aguda), normalização comportamental (fase latente) e finalmente crises espontâneas e recorrentes (fase crônica). Os objetivos desse estudo foram analisar por microdiálise e HPLC a concentração de ATP e seus metabólitos na formação hipocampal de ratos que se encontram nas fases aguda e crônica do modelo experimental de ELT induzida por pilocarpina, e avaliar através de imunoblot e imuno-histoquímica, os receptores P2X2,4,7 na formação hipocampal desses animais, incluindo o grupo latente. O procedimento de microdiálise foi aplicado para determinação da concentração de purinas liberadas durante o status epilepticus (SE) em amostras coletadas nos seguintes tempos: Basal (3 amostras antes de qualquer tratamento), após a administração de metilescopolamina (usada para minimizar os efeitos periféricos da pilocarpina) e 30 min. 1H, 2H, 3H e 4H após a aplicação da pilocarpina. Os animais crônicos foram estudados nos períodos interictal e ictal. As amostras foram analisadas por HPLC com detecção por fluorescência. Animais de três grupos experimentais (G12H; GLat; GCro) e respectivos controles, foram empregados para o estudo dos receptores P2X2,4,7, através de imunoblot e imuno-histoquímica. O imunoblot foi revelado por quimiluminescência. A imuno-histoquímica foi feita com cortes fixados e flutuantes em tampão, usando anticorpo biotinilado e kit ABC e revelação com diaminobenzidina. O estudo bioquímico revelou um aumento de ADP, AMP e adenosina durante o SE. Na fase crônica, evidenciou-se uma redução de todas as purinas no período interictal, e um aumento das mesmas no período ictal, sendo significante para o ATP e adenosina. Em relação aos receptores estudados por imuno-histoquímica e imunoblot, observou-se uma intensa redução dos P2X4 versus CT no período crônico (35%, p<0.001, ANOVA), um aumento do P2X7 nas fases aguda e crônica (G12H: 20%, p<0,05; GCRO: 18% p<0,05, ANOVA).Com base nos resultados, conclui-se que o metabolismo das purinas está alterado na fisiopatologia da ELT induzida por pilocarpina, por exemplo, na fase aguda o aumento na concentração de ADP, AMP e de adenosina, pode estar refletindo um aumento na taxa metabólica do ATP pelas ectonucleotidases, como um mecanismo compensatório inibitório. No entanto, o ATP antes de ser metabolizado pode estar ativando receptores P2X7, e exercendo um papel importante na citotoxicidade. Já na fase crônica, a redução das purinas, infere principalmente um comprometimento na atividade inibitória mediada pela adenosina, que por sua vez pode facilitar a susceptibilidade às crises epilépticas. / Pilocarpine, a muscarinic cholinergic agonist when inject at high doses (i.p.) in rats, reproduces the main characteristics of Human Temporal Lobe Epilepsy (TLE). The animal exhibits different patterns of behavior, including status epilepticus (acute phase), electrophysiological and behavioral normalization (latent phase) and spontaneous recurrent seizures (chronic phase). The objectives of this study were to analyze by means of microdyalysis and HPLC, the concentration of ATP and its metabolites ADP, AMP and adenosine in the hippocampal formation of rats during the acute and chronic phases of pilocarpine model, and evaluating by western blotting and immunohistochemistry, the receptors P2X2,4,7 in the hippocampal formation of these animals. The microdyalysis procedure used to determine the purines concentration in the acute period, was taken according to the following periods of time: Basal (three samples before treatment onset), after methylscopolamine injection (used in order to minimize the peripheral effects of pilocarpine) and 30 min. 1h, 2h, 3h and 4h after pilocarpine injection. Chronic animals were studied during the interictal and ictal period. The samples were analyzed by a fluorescence detector coupled to HPLC. Animals from three different experimental groups (Group 12h = G 12h, Latent Group = G Lat, Chronic Group = G Cro) and their respective controls were utilized to analyze the purinergic receptors P2X2,4,7, by means of western blotting and immunohistochemistry. The immunohistochemistry was achieved with fixated slices floating on buffer solution, using biotinylated antibody, ABC kit and development with diaminobenzidine. The biochemical study revealed an increase of ADP, AMP and adenosine concentrations during the SE. In contrast, a reduction of all purines was detected in the hippocampal formation during the interictal period of chronic rats. Rats studied during the ictal phase, exhibited high concentrations of ATP and adenosine. The immunohistochemistry and western blotting analysis showed a great reduction of P2X4, versus CT in the chronic period (35%, p<0.001, ANOVA), and an increase of P2X7, in the acute and chronic phases (G12H: 20%, p<0.05; GCRO: 18% p<0.05, ANOVA). According to these findings, we can conclude that the metabolism of purines is altered in the hippocampal formation of rats in pilocarpine-induced epilepsy. In the acute phase, the increase of ATP metabolites may reflect an increase in the metabolism rates of ATP by the ectonucleotidases, possibly as a compensatory inhibitory mechanism. On the other hand, before ATP is hydrolyzed, it may activate P2X7 purinoceptor, and consequently, intensify hyperexcitability and cytotoxicity cascades. A decrease in all purines analyzed in the chronic phase could suggest an energy metabolism dysfunction in the epileptic hippocampus. The decrease in the adenosine concentrations might facilitate the onset of spontaneous and recurrent seizures. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundo de Auxílio aos Docentes e Alunos (FADA) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (Pronex) / Objetivos: A nestina, uma proteína do filamento intermediário, pode ser usada como um indicador de imaturidade celular. Nas células já diferenciadas, essa proteína é substituída por outro tipo de filamento intermediário, específico do referido tecido. Porém, sua reexpressão pode ser induzida em condições regenerativas e/ou degenerativas. Assim, na tentativa de elucidar as alterações plásticas após um dano cerebral provocado pelo status epilepticus (SE) induzido pela pilocarpina em ratos, nossos objetivos foram: Ia) Estudar a expressão fisiológica normal da nestina no hipocampo e no córtex de ratos normais desde PN9 até a fase adulta (PN90); Ib) Avaliar as alterações da expressão da nestina no hipocampo e no córtex de ratos submetidos a três episódios de SE, induzidos pela pilocarpina, em PN7 PN8 e PN9. Esses animais foram estudados desde PN9 até PN90; 11) Estudar a expressão temporal e espacial da nestina no hipocampo de ratos adultos submetidos ao modelo da pilocarpina (fases aguda, silenciosa e crônica); 111) Avaliar a expressão da nestina no hipocampo de ratos idosos normais e em ratos idosos com epilepsia. Esses animais foram submetidos ao modelo da pilocarpina na fase adulta e seus cérebros foram estudados ao completarem dois anos de idade. Métodos: Indução do SE pela injeção de pilocarpina (ip); a expressão da nestina foi estudada por imuno-histoquímica. Resultados: No período pós-natal precoce, a expressão fisiológica da nestina foi intensamente visualizada nas glias radiais corticais, nas fibras hipocampais e nos vasos sanguíneos, desaparecendo nos animais adultos. Os animais submetidos ao SE em PN7-9, apresentaram aumento na expressão e atraso no desaparecimento da nestina, tanto nas glias radiais como nos vasos sanguíneos, em relação aos seus respectivos controles. Glias radiais corticais foram ainda encontradas nos ratos experimentais em PN21, enquanto que durante o desenvolvimento fisiológico normal elas já não estão mais presentes nessa idade. Quanto à distribuição temporal e espacial da nestina nos astrócitos reativos hipocampais de ratos adultos, submetidos ao modelo da pilocarpina, não encontramos a expressão dessa proteína nos animais dos grupos controle e agudo. Em contraste, os ratos...(au). / Purpose: Nestin is an intermediate filament component protein and can be used as an indicator of cellular immaturity. In the adult differentiated cell, nestin is replaced for other intermediate filament protein specific of the referred tissue. However, nestin re-expression can be induced by regenerative and/or degenerative conditions. In this way, in order to try to elucidate the plastic alterations followed by brain damage provoked by status epilepticus (SE) induced by pilocarpine in rats, the present work has the following purposes: Ia) Evaluate the physiological hippocampal and cortical nestin expression in rats from P9 to adulthood (P90); Ib) Evaluate hippocampal and cortical alterations of nestin expression in rats submitted to three episodes of SE induced by pilocarpine (P7,P8,P9). These animals were studied from P9 to P90; II) Evaluate the hippocampal temporal and spatial nestin expression of the adult rats submitted to the pilocarpine model of epilepsy (acute, silent and chronic phases); III) Evaluate the hippocampal nestin expression in aged normal rats and in aged rats with epilepsy. The aged chronic rats were submitted to the pilocarpine SE when young adults and they were studied with two years old. Methods: The SE was induced by pilocarpine injection (ip) and nestin expression was studied by immunohistochemistry. Results: Nestin expression was found in cortical radial glia, hippocampal fibers and blood vessels during early postnatal development, disappearing in the adulthood. Rats submitted to pilocarpine SE (P7-P9) showed a delayed nestin down-regulation in the cortical radial glia as well as in the blood vessels, when compared to their controls. We still found cortical radial glia in the experimental rats of P21 group, however they are not found anymore under normal physiological conditions at this age. Referring to the hippocampal reactive astrocytes expressing nestin in the adult rats submitted to the pilocarpine model, we did not detect nestin expression in the rats of the control and acute groups. In other hand, the animals of the silent group presented intense nestin expression 3 and 7 days after SE. Interestingly, still in the silent phase, we did not find any nestin expression 14 days after SE. However, in the 65 chronic phase of the model, the reactive astrocytes expressing nestin are again observed and they were sparsely distributed for all the hippocampal formation. The aged rats of the control group did not present nestin expression. However, aged chronic rats presenting long term epilepsy showed the same pattern of nestin immunoreactivity as observed in the chronic adult rats. Conclusions: This work showed that physiological nestin expression during early postnatal development to adulthood. Nestin immunoreactivity was intense in the cortical radial glia, hippocampal fibers and blood vessels during the early postnatal development disapearing in adulthood. Our data shoed that nestin expression was delayed in the rats submitted to SE (P7-9), suggesting a normal development impairment. We still found cortical radial glia in P21 in the experimental animals, suggesting a retardation of nestin down-regulation. The adult rats of the silent phase of the pilocarpine model presented transient nestin expression in the reactive astrocytes. However, reactive astrocytes expressing nestin were still found in the chronic phase of the model. These data suggest that nestin plays a role in the plastic events in the adult tissue after brain damage. The normal aging did not induce nestin re-expression. However, aged rats have the potential to re-express a developmental protein of immature cell, since the chronic aged rats in this study presented hippocampal reactive astrocytes. In this way, the knowledge of a temporal window of proteins such as nestin, with multi-potential and regenerative potential, allows advances in neurobiology understanding and contributes to the progress of cellular therapy in neurological diseases. / BV UNIFESP: Teses e dissertações