Der SET-Bereich befindet sich unter den verschiedenen Proteinsequenzbereichen, die mit epigentischer Regulation hauptsächlich durch die Präsenz von Trihtorax (trxG) und Polycomb (PcG) Gruppen von Chromatinmodifikatoren in Zusammenhang gebracht werden. Nach der Entdeckung des ersten SET-Bereichs vor einigen Jahren, welcher die Histon-Lysin-Methyltransferase (Su(var)39) enthält, wurde den Proteinen mit SET-Bereich sehr viel Aufmerksamkeit geschenkt. Obwohl die Histon-Lysin-Methylierung schon länger als 30 Jahre bekannt ist, war ihre Funktion vor diesem überragenden Ergebnis größten Teils unbekannt. In meiner Arbeit beschreibe ich die kombinatorische und funktionale Charakterisierung von 3 Hefe Proteinkomplexen durch die Anwendung von proteomischer SEAM (Sequential Epitope Tagging and Mass Spectrometry). Zwei dieser Komplex enthalten einen SET-Bereich und die Dritte ist der Rad6 Komplex aus S. pombe (Sp_Rad6C). Der Set1 Komplex (Set1C) beinhaltet 8 Bausteine, methylisiert Lysin 4 in Histon H3 und ist die erste, entdeckte Histone H3 Lysin 4 Methyltransferase. Es beinhaltet ein Ash2 Homolog (Bre2), einen bekannten Baustein von trxG. Kürzlich wurden Rad6 beinhaltende Komplexe gezeigt, die in engem Bezug zu der H3-K4 und H3-K79 Methylation durch ubiquitinierung von Histon H2B und die Etablierung von trans-histonen Signalwegen stehen. Unsere Analysen von Sp-Rad6C führten zu mehreren interessanten Ansichten. Der Set3 Komplex (Set3C) hat keine feststellbare Aktivität einer Methyltransferase, enthält jedoch zwei Histon deacetylasen (HDACs) ? eine klassische HDAC (Hos2) und eine NAD-abhängige HDAC (Hst1). Unsere funktionelle Analyse von Set3C zeigt, dass Set3C bei der Regulierung des meiotischen Genexpressionsprogramms in knospenden Hefen (S. cerevisiae) beteiligt ist. Evolutionbiologisch betrachtet, ist die Spalt-Hefe (S. pombe) sehr weit von S. cerevisiae entfernt und wird meist als ein besserer Modellorganismus fur höhere Eukaryoten angesehen. In einem Versuch, unser Wissen uber andere Organismen zu vergrößern, haben wir ähnliche Untersuchungen in S. pombe unternommen und haben herausgefunden, dass Set1C in beiden Hefen sehr stark konserviert ist. Darüberhinaus waren die Set1-Ash2 Verbindungen konserviert und wir nehmen an, dass auch in höheren Eukaryoten Set1-ahnliche Methyltransferasen Ash2-ahnliche Proteinen angehören. Dies wurde später durch mehrere Studien von anderen Gruppen bestätigt, die an Säugetieren arbeiten. Was Set3C anbelangt, wurden unsere weiteren Analysen nur durch vergleichende Proteomik beschränkt. Wir zeigen, dass der proteomische Kern von Set3C in Spalt-Hefe konserviert wird. Im Gegensatz zu Set3C in S. cerevisiae, beinhaltet diese in S. pombe nur eine HDAC, die zur Hos2 Familie gehört,. Die präsentierte Arbeit hat auch viele Auswirkungen auf die übergreifende Organisation von Proteomen. Wir beschreiben verschiedene Beispiele von gemeinsamen Komponenten zwischen unterschiedlichen Komplexen und prägen den Begriff "proteomischer Hyperlink". Wir waren in der Lage zu zeigen, dass proteomische Kerne sogar für unwesentliche Proteinkomplexe hoch konserviert sind. Die generelle proteomische Schaltung über proteomische Hyperlinks scheint jedoch verworrener und unvorhersehbar zu sein. Wir schlussfolgern, dass die Erschaffung von zuverlässigen, detailierten, proteomischen Abbildungen, welche auf dem Wissen von niederen Organismen fundieren, zur Zeit nicht möglich ist.

Genetisch bedingte Veränderungen im Wnt-Signalweg sind in der Tumorigenese des Darms von zentraler Bedeutung. Mutationen des Wnt-Effektormoleküls β-Catenin in den adulten Stammzellen des Darmepithels führen zu unkontrollierter Proliferation und Expansion der Darmstammzellen und initiieren die Tumorentstehung. Auch in fortgeschrittenen Darmtumoren unterstützt die Wnt-Signalgebung maßgeblich das Tumorwachstum und den Erhalt von Tumorstammzellen. Nach erfolgreicher chemotherapeutischer Behandlung treten oftmals Tumorrezidive auf, für deren Entstehung therapieresistente Tumorstammzellen verantwortlich gemacht werden. Trotz intensiver Forschung fehlen in der Darmkrebstherapie nach wie vor Behandlungsansätze zur gezielten Therapie der Tumorstammzellen. Ziel dieser Dissertation ist es, unser Verständnis der molekularen Regulationsmechanismen in Kolonkarzinomen zu erweitern und die Entwicklung rationaler Behandlungsstrategien zu fördern. Ich konnte die Histonmethyltransferase Mll1 als entscheidenden Faktor in der epigenetischen Regulation humaner und muriner Darmkrebsstammzellen und -tumore identifizieren. Humane Kolonkarzinome weisen eine erhöhte Mll1-Expression auf, die mit dem Level an nukleärem β-Catenin korreliert. Im adulten Darmepithel ist Mll1 insbesondere in den Lgr5+ Stammzellen exprimiert und maßgeblich an der Wnt/β-Catenin-induzierten Stammzellexpansion sowie der Tumorentstehung beteiligt. Der konditionelle Verlust von Mll1 im murinen Darmkrebsmodell verhindert die β-Catenin-induzierte Tumorigenese. Mll1 unterstützt die Selbsterneuerungsfähigkeit und Proliferation der Tumorstammzellen, indem es die Expression von essentiellen Stammzellgenen wie dem Wnt-abhängigen Stammzellmarker Lgr5 aufrechterhält. Eine Inhibition der Mll1-Funktion in der Darmkrebstherapie kann eine gezielte Eliminierung der Tumorstammzellen ermöglichen, wodurch das fortschreitende Tumorwachstum unterbunden und die Bildung von Rezidiven verhindert werden kann. / Genetic mutations inducing aberrant activity of Wnt signalling are causative for intestinal tumorigenesis. Mutations of the Wnt effector molecule β-catenin in adult stem cells of the intestinal epithelium drive uncontrolled proliferation, expand the stem cell pool and initiate tumor formation. In advanced tumors, aberrant Wnt signalling promotes tumor growth and maintains cancer stem cells. The cancer stem cells are highly resistant to conventional chemotherapy and frequently initiate tumor relapse after completion of treatment. Despite extensive research, we are still lacking efficient therapies for colon cancer that specifically eliminate the cancer stem cells. This dissertation aims to expand our knowledge on molecular gene regulatory mechanisms in colon cancer cells to promote the identification and future development of rational therapies for colon cancer patients. I identified the histone methyltransferase Mll1 as an epigenetic regulator in human and mouse intestinal cancer stem cells and tumors. Human colon carcinomas with nuclear β-catenin exhibit high levels of Mll1. In the adult intestinal epithelium of mice, Mll1 is highly expressed in the Lgr5+ stem cells and is a prerequisite for the oncogenic Wnt/β-catenin-mediated stem cell expansion and tumorigenesis. Conditional knockout of Mll1 in an intestinal mouse tumor model prevents the β-catenin-driven intestinal tumorigenesis. Knockdown of Mll1 impairs the self-renewal and proliferation of colon cancer sphere cultures and halts tumor growth in xenografts. Mechanistically, Mll1 sustains the expression of intestinal stem cell genes including the Wnt/β-catenin target gene Lgr5 by antagonizing gene silencing through polycomb repressive complex 2-mediated H3K27 tri-methylation. Interfering with Mll1 function can efficiently eliminate colon cancer stem cells, and has potential as a rational therapy for colon cancer.

Zusammenfassung Die Asteraceae Brachycome dichromosomatica ist eine besonders geeignete Spezies, um B-Chromosomen zu analysieren. Die auf den B-Chromosomen-lokalisierte 45S rDNA wurde auf Ursprung und Funktion untersucht. Die Mikrodissektion von B-Chromosomen und PCR-Amplifikation ermöglichte es, B-Chromosomen-spezifische ITS2-Sequenzen der 45S rDNA zu erhalten. Auffallend bei dieser Analyse waren zwei beständige Differenzen zwischen den Sequenzen von A- und B-Chromosomen. Phylogenetische Untersuchungen identifizierten keine Spezies, die eine ITS2-Sequenz hatte, die ähnlicher zu der B-Chromosomen-ITS2-Sequenz war als die A-Chromosomen-ITS2-Sequenz von B. dichromosomatica. Es wurde ein Ursprung der B-Chromosomen in der Zeit vor der Ausbildung der vier Cytodeme von B. dichromosomatica postuliert. Die Analyse der Assoziationen von Mikro-B-Chromosomen mit dem Nukleolus ergab, dass 70% der Mikro-B-Chromosomen nicht mit dem Nukleolus assoziierten. Die hohe Frequenz von nichtassoziierten Mikro-B-Chromosomen weist auf eine Inaktivität der Mikro-B-Chromosomen-lokalisierten 45S rDNA hin. Die Immunfluoreszenzmarkierung zeigte, dass sich das Chromatin der A- und B-Chromosomen deutlich in der euchromatischen Histon-H3-Methylierung unterscheidet. Während die A-Chromosomen deutliche Immunfluoreszenzsignale aufwiesen, zeigten die Mikro-B- und Standard-B-Chromosomen nur eine schwache Markierung mit Antikörpern gegen Histon H3K4me1,2,3, H3K9me3 und H3K27me2,3. Die heteropygnotischen, mit Tandem-Repeats angereicherten Mikro-B-Chromosomen waren dabei noch weniger mit diesen euchromatischen Markierungen gekennzeichnet als die Standard-B-Chromosomen. Keine Unterschiede zwischen den A- und B-Chromosomen wurden für die heterochromatischen Markierungen Histon H3K9me1,2 und H3K27me1 gefunden, was darauf hinweist, dass die B-Chromosomen nicht spezifisch durch zusätzliche heterochromatische Histonmarkierungen gekennzeichnet sind. / Summary The Asteraceae Brachycome dichromosomatica is a suitable species for the analysis of B chromosomes (Bs). The origin and activity of micro B-located 45S rDNA of was analysed. Microisolation of Bs and PCR with internal transcribed spacer 2 (ITS2)-specific primers succeeded in the isolation of B-specific ITS2-sequences. ITS2 was sequenced for micro B, large B and A chromosomes, and conserved differences were identified between sequences originating from A and both types of Bs. Phylogenetic analysis did not identify a species that contained an ITS2 sequence that was more similar to either of the B’s sequences than that of the B. dichromosomatica A chromosomes (As). Thus, an origin of the Bs from As at a time prior to the divergence of the four cytodemes of B. dichromosomatica is suggested. Because 70% of micro Bs did not co-localize with the nucleolus I conclude that micro B-located 45S rDNA is not constitutively transcribed. Immunofluorescence demonstrates that the chromatin in A and both types of Bs differs markedly in euchromatic histone H3 methylation marks. While A chromosomes are labelled brightly, the micro B and large Bs are faintly labelled with antibodies against H3K4me2/3, H3K9me3 and H3K27me2/3. The heteropycnotic, tandem-repeat enriched micro Bs were even less labelled with euchromatic histone H3 methylation marks than large Bs. No differences between A and Bs were found as to the heterochromatic marks H3K9me1/2 and H3K27me1, indicating that Bs are not additionally labelled by heterochromatin typical histone H3 modifications. 1