Os benefícios à saúde relacionados ao consumo moderado de vinho incluem diferentes mecanismos, nos quais estão envolvidos tanto etanol quanto compostos fenólicos que são constituintes do mesmo. Com o objetivo de avaliar variações glicêmicas, ponderais e o depósito de triglicérides, colesterol e glicogênio hepáticos com uso regular de vinho tinto em camundongo ApoE Knockout, foram utilizados 60 camundongos machos adultos ApoE Knockout de peso médio de 30 gramas, distribuídos em três grupos de 20 animais: grupo vinho, grupo etanol e grupo água, os quais receberam 50 mL de vinho e 50 mL água, 6mL de etanol e 94mL de água e somente água respectivamente por quatro meses. Os parâmetros avaliados foram: variações glicêmicas, ponderais, acúmulo de triglicerídeos, colesterol e glicogênio hepáticos. O grupo vinho teve em relação a sua massa corporal uma área sob a curva maior que a dos outros dois grupos, mas com um percentual pequeno de aumento. A concentração do triglicerídeo hepático foi maior no grupo vinho 57% em relação ao grupo etanol, que foi 31,6% menor que o controle (p<0,01%). A concentração do colesterol hepático foi menor no grupo vinho (23,6%), assim como no grupo etanol (24,5%), (p<0,05%). A concentração do glicogênio hepático foi maior no grupo vinho (16%), porém não alcançando significado estatístico. A glicemia em jejum no dia da eutanásia foi maior no grupo etanol em relação aos demais grupos, porém não demonstrou diferença estatisticamente significante. Na análise histológica não foi observada diferença significativa entre os grupos, embora o peso médio em gramas nas gorduras, retroperitoneal e subcutâneas tenha sido aproximadamente duas vezes maior no grupo vinho. Concluiu-se que neste estudo o uso regular e crônico de vinho tinto aumentou triglicerídeo hepático, porém o álcool diminui o colesterol hepático. O aumento do triglicerídeo pode ser devido ao alto valor calórico do vinho ou alguma propriedade lipogênica desconhecida que levou ao aumento importante das gorduras retroperitoneais e subcutâneas em camundongos ApoE Knockout. / The benefits to health related to regular consume of red wine includes different mechanisms in which are involved both ethanol and fenolics compounds of the wine. With the objective to evaluate glycemia, lipid profile and weight variations with regular use of red wine by ApoE Knockout mices, sixty adults ApoE Knockout mices weighing around 30g were distributed into 3 groups of 20 animals each: 1.Wine that received 50mL of wine plus 50mL of water, 2. Ethanol and Water groups, 6mL of ethanol plus 94mL of water and just water respectively for 4 months. We evaluate glycemia, weight variations and liver glycogen, triglycerides and cholesterol. The wine group had in relation to its mass body an area under the curve larger than the other two groups, but with a small percentage of increase. The concentration of liver triglycerides was higher in the wine 57% compared to ethanol group, which was 31.6% lower than the control (p<0.01%). The concentration of liver cholesterol was lower in wine (23.6%) and in ethanol group (24.5%) (p<0.05%). The liver glycogen concentration was higher in the wine (16%), although not reaching statistical significance. The fasting glicemia on the day of euthanasia was higher in the ethanol group compared to other groups, but not statistically significant difference. In histological analysis was not significantly different between groups, although the average weight in grams fat, retroperitoneal and subcutaneous was approximately two times higher in the wine group. It was concluded that in this study the regular and chronic use of red wine increased liver triglyceride, however alcohol decreases liver cholesterol. The increase of the triglyceride may be due to the high caloric value of wine or some lipogenic unknown property that led to an important increase in retroperitoneal and subcutaneous fat tissue in ApoE Knockout mice.

O Ca+2 tem sido relatado como um íon de extrema importância celular. Sua concentração intracelular alterada está relacionada com: (i) a ativação de proteínas importantes, dentre elas as de reparação e de apoptose, (ii) as doenças humanas de grande relevância sócio-econômica e (iii) o aumento dos danos celulares. Sabendo-se que a sua concentração intracelular é responsável pela manutenção da viabilidade celular e frente à importância já conhecida deste íon, esta dissertação teve por objetivo, primeiramente, fazer uma busca sobre os dados existentes na literatura para delinear quais são os possíveis mecanismos moleculares pelo qual o Ca+2 afeta os mecanismos de reparação e apoptose. Esta busca norteou posteriores testes e pesquisas que culminaram nos resultados obtidos e apresentados neste trabalho. Para a realização de alguns testes foi desenvolvida uma nova metodologia, o ensaio Poissoner Quantitative Drop Test (PQDT), a qual permite a análise de sobrevivência de diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes ou proficientes em determinadas proteínas, frente à exposição crônica a um agente genotóxico. Esta técnica também permite observar efeitos citostáticos e citotóxicos nas células testadas. Além disso, realizou-se uma análise de Biologia de Sistemas das proteínas de S. cerevisiae responsáveis pela homeostase de Ca+2 e encontrou-se uma correlação direta destas com proteínas responsáveis pela reparação de DNA por meio da via de excisão de nucleotídeos ou NER. Uma vez obtidos estes dados, as linhagens de leveduras deficientes nas proteínas tanto de homeostase de Ca+2, Pmr1p, Cod1p, Por1p, como para o gene RAD4 foram construídas. Além dos simples mutantes, foram construídas linhagens duplos mutantes para ambas as vias. Assim, foram realizados ensaios de citotoxicidade, citostaticidade e de parada do ciclo celular frente à exposição ao agente genotóxico 4-NQO. Conforme os resultados obtidos, a homeostase de Ca+2 exerce influência sobre os mecanismos de reparação de DNA, principalmente nas proteínas da via NER, como a Rad4p. As proteínas Pmr1p e Cod1p são as proteínas de homeostase de Ca+2 mais importantes na resposta ao dano celular. Estes resultados propõem que o estresse de retículo endoplasmático e a fosforilação de proteínas de parada de ciclo celular foram os principais processos metabólicos evidenciados nas linhagens de leveduras testadas após a exposição ao agente genotóxico 4-NQO. Os resultados da análise de Biologia de Sistemas e análise ontológica dos genes mostram que existem muitas vias bioquímicas relacionadas com a homeostase de Ca+2. Isso demonstra a importância destes achados e predispõem muitos outros testes para a elucidação completa destas influências. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-22T16:41:02Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Nadine Paese Poletto.pdf: 2514929 bytes, checksum: e52f9e75c1db5e89a4fbaf0d3b14215f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T16:41:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Nadine Paese Poletto.pdf: 2514929 bytes, checksum: e52f9e75c1db5e89a4fbaf0d3b14215f (MD5) / Calcium (Ca2+) has been reported as an important cellular ion. The changes in the intracellular Ca2+ concentrations are related to: (i) the activation of major proteins related to DNA repair and apoptosis; (ii) induction of human diseases; and (iii) increase in cellular damages. Considering that the Ca2+ intracellular concentration is also responsible for the maintenance of cellular viability, the aim of this study was to proceed with a literature data mining to outline the major Ca2+ molecular mechanisms that can affect the cellular activities. This data mining was necessary to define further biological assays described in this work. In this sense, it was developed a new methodology called PDQT, which allows to evaluate the survival of different Saccharomyces cerevisiae strains deficient or proficient for determined proteins in a chronic exposure conditions in the presence of a genotoxic agent. This new method also allows to observe the citotoxic, citostatic, and cell cycle arrests effects induced by a genotoxic agent. Moreover, it was performed a Systems Biology analyses of the major S. cerevisiae Ca2+ homeostasis-associated proteins and it was found a direct association with proteins of the nucleotide excision repair (NER) pathway. The data gathered by Systems Biology analyses were used to construct yeast strains single and double mutants deficient for Ca2+ homeostasisassociated proteins, like Pmr1p, Cod1p, Por1p, and for the NER-associated protein Rad4p. The yeast strains obtained were challenged against the genotoxic agent 4-NQO and citotoxic, citostatic, and cell cycle arrest assays were performed. Taking into account the results, it was observed that Ca2+ homeostasis mechanisms affect the DNA repair pathways, specially the NER proteins like Rad4p. In this sense, both Cod1p and Pmr1p are the most important Ca2+ homeostasis proteins for the damage cellular response. In addition, these results propose that ER stress and the phosphorylation of cell cycle arrest-associated proteins can be the major metabolic processes after 4-NQO exposure. The results obtained by System Biology and gene ontology analyses proved that many biochemical pathways are related to Ca2+ homeostasis, which demonstrate the importance of the results obtained in this work and lead to other studies.

Orientador: Luiz Edivaldo Pezzato / Coorientador : Margarida Maria Barros / Coorientador : Maura Seiko Tsutsui Esperancini / Banca: Wilson Massamitu Furuya / Banca: Priscila Vieira Rosa / Banca: Ricardo Oliveira Orsi / Banca: José Roberto Sartori / Resumo: A exigência de proteína e energia digestíveis não foram determinados para tilápia-do-Nilo em sistema intensivo (tanques-rede). Este estudo avaliou os parâmetros hematológicos antes e após estresse por transporte, composição da carcaça e filé e desempenho de tilápia-do-Nilo alimentadas com níveis de proteína digestível (PD) e energia digestível (ED). Tilápias-do-Nilo (450,96 ± 9,12g) foram distribuídas em 50 tanques-rede (1m3), na densidade de 100 peixes tanque-1 e alimentadas com dietas contendo 20,0; 23,0; 26,0; 29,0 ou 32,0% de PD, 3.000 ou 3.300 kcal de ED kg-1 em delineamento em blocos casualizados (n=5) e arranjo fatorial 5x2. Após 60 dias os peixes foram pesados e as dietas quantificadas para determinar o desempenho produtivo [biomassa final (BF), ganho de biomassa (GB), conversão alimentar aparente (CAA), peso final médio (PFM), sobrevivência (SOB), taxa de eficiência protéica (TEP), rendimentos de filé (RF) e carcaça (RC) e, os índices hepatosomático (IHS) e de gordura visceral (IGV). Os teores de umidade, proteína, extrato etéreo e matéria mineral dos filés e da carcaça foram quantificados. As análises hematológicas (eritrócitos, hemoglobina, hematócrito, volume corpuscular médio, concentração de hemoglobina corpuscular média e diferenciação de leucócitos) foram realizadas e posteriormente 40 peixes foram transferidos e submetidos à estresse por transporte (5 horas de duração), sendo os mesmos parâmetros hematológicos analisados novamente. Os níveis de PD influenciaram a BF, GB, CAA, PFM e TEP. Houve interação PD x ED para RF, IHS, além da umidade, proteína bruta e extrato etéreo da carcaça. Não houve influência da ED para as variáveis de desempenho produtivo e composição do filé e carcaça. O nível de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Abstract: Digestible protein and energy have not been determined for Nile tilapia (Oreochromis niloticus) in intensive system (cages). This study evaluates hematological parameters before and after transportation stress, fillet and carcass composition and growth of Nile tilapia fed increasing levels of digestible protein (DP) and energy (DE). Nile tilapia (450.96 ± 5.12 g) were distributed into 50 1m3 cages (100 fish tank-1) and fed diets containing 20.0; 23.0; 26.0; 29.0 or 32.0% DP, 3000 or 3300 kcal DE kg-1 in a completely randomized block design (n=5) and 5x2 factorial arrangement. After 60 days the fish were weighed and the diet was quantified to determine the growth performance [final biomass (FB), biomass gain (BG), feed conversion ratio (FCR), average final weight (AFW), survival (S), protein efficiency ratio (PER) , fillet yield (FY), carcass yield (CY), hepatosomatic index (HSI) and visceral fat index (VFI)]. Moisture, protein, lipid and mineral content of the fillets and carcass were quantified. Haematological analyses (red blood cell count, haemoglobin, haematocrit, mean corpuscular volume, mean corpuscular haemoglobin concentration and differential counting of leucocytes) were carried out and then 40 fish were transferred and subjected to transportation stress (4 hours), after which the haematological parameters were analysed again. FB, BG, FCR, AFW and PER were influenced by DP levels. FY and HIS, as well as moisture, crude protein and ether extract of the carcass were influenced by DP x DE interaction. There was no influence of DE on the productive performance and fillet and carcass composition. 3300 kcal DE kg-1 improved animal health. Fishes presented lymphocytopenia and neutrophilia after stress, regardless of feed consumed. Considering health and growth performance it is recommended... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Os benefícios à saúde relacionados ao consumo moderado de vinho incluem diferentes mecanismos, nos quais estão envolvidos tanto etanol quanto compostos fenólicos que são constituintes do mesmo. Com o objetivo de avaliar variações glicêmicas, ponderais e o depósito de triglicérides, colesterol e glicogênio hepáticos com uso regular de vinho tinto em camundongo ApoE Knockout, foram utilizados 60 camundongos machos adultos ApoE Knockout de peso médio de 30 gramas, distribuídos em três grupos de 20 animais: grupo vinho, grupo etanol e grupo água, os quais receberam 50 mL de vinho e 50 mL água, 6mL de etanol e 94mL de água e somente água respectivamente por quatro meses. Os parâmetros avaliados foram: variações glicêmicas, ponderais, acúmulo de triglicerídeos, colesterol e glicogênio hepáticos. O grupo vinho teve em relação a sua massa corporal uma área sob a curva maior que a dos outros dois grupos, mas com um percentual pequeno de aumento. A concentração do triglicerídeo hepático foi maior no grupo vinho 57% em relação ao grupo etanol, que foi 31,6% menor que o controle (p<0,01%). A concentração do colesterol hepático foi menor no grupo vinho (23,6%), assim como no grupo etanol (24,5%), (p<0,05%). A concentração do glicogênio hepático foi maior no grupo vinho (16%), porém não alcançando significado estatístico. A glicemia em jejum no dia da eutanásia foi maior no grupo etanol em relação aos demais grupos, porém não demonstrou diferença estatisticamente significante. Na análise histológica não foi observada diferença significativa entre os grupos, embora o peso médio em gramas nas gorduras, retroperitoneal e subcutâneas tenha sido aproximadamente duas vezes maior no grupo vinho. Concluiu-se que neste estudo o uso regular e crônico de vinho tinto aumentou triglicerídeo hepático, porém o álcool diminui o colesterol hepático. O aumento do triglicerídeo pode ser devido ao alto valor calórico do vinho ou alguma propriedade lipogênica desconhecida que levou ao aumento importante das gorduras retroperitoneais e subcutâneas em camundongos ApoE Knockout. / The benefits to health related to regular consume of red wine includes different mechanisms in which are involved both ethanol and fenolics compounds of the wine. With the objective to evaluate glycemia, lipid profile and weight variations with regular use of red wine by ApoE Knockout mices, sixty adults ApoE Knockout mices weighing around 30g were distributed into 3 groups of 20 animals each: 1.Wine that received 50mL of wine plus 50mL of water, 2. Ethanol and Water groups, 6mL of ethanol plus 94mL of water and just water respectively for 4 months. We evaluate glycemia, weight variations and liver glycogen, triglycerides and cholesterol. The wine group had in relation to its mass body an area under the curve larger than the other two groups, but with a small percentage of increase. The concentration of liver triglycerides was higher in the wine 57% compared to ethanol group, which was 31.6% lower than the control (p<0.01%). The concentration of liver cholesterol was lower in wine (23.6%) and in ethanol group (24.5%) (p<0.05%). The liver glycogen concentration was higher in the wine (16%), although not reaching statistical significance. The fasting glicemia on the day of euthanasia was higher in the ethanol group compared to other groups, but not statistically significant difference. In histological analysis was not significantly different between groups, although the average weight in grams fat, retroperitoneal and subcutaneous was approximately two times higher in the wine group. It was concluded that in this study the regular and chronic use of red wine increased liver triglyceride, however alcohol decreases liver cholesterol. The increase of the triglyceride may be due to the high caloric value of wine or some lipogenic unknown property that led to an important increase in retroperitoneal and subcutaneous fat tissue in ApoE Knockout mice.

As deficiências da 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase de cadeia longa (LCHAD) e da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) são defeitos hereditários na oxidação de ácidos graxos. Os pacientes apresentam acúmulo de ácidos graxos hidroxilados de cadeia longa (LCHFA), especialmente os ácidos 3- hidroxitetradecanoico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA), no sangue e outros tecidos. A sintomatologia é bastante variada, incluindo cardiomiopatia severa e sintomas musculares como fraqueza, dor e episódios recorrentes de rabdomiólise, assim como hepatopatia, retinopatia, hipotonia, neuropatia periférica, atraso no desenvolvimento e na fala, podendo levar a morte ainda na infância. Considerando que os mecanismos patogênicos do dano aos tecidos musculares cardíaco e esquelético apresentados por esses pacientes ainda não estão esclarecidos, o presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos in vitro do 3HTA e 3HPA sobre importantes parâmetros da bioenergética mitocondrial, tais como os parâmetros respiratórios estado 3, estado 4, razão de controle respiratório (RCR) e estado desacoplado, bem como o potencial de membrana (ΔΨm), o inchamento, a liberação de citocromo c, a capacidade de retenção de Ca2+ e o conteúdo do NAD(P)H em mitocôndrias isoladas de músculo cardíaco e esquelético de ratos jovens. Inicialmente, observamos que o 3HTA e 3HPA em baixas concentrações (10-30 UM) aumentaram o estado 4 e diminuíram o RCR em mitocôndrias de músculo esquelético, indicando um efeito desacoplador. Quando em concentrações mais elevadas (50-100 UM), esses ácidos graxos diminuíram o estado 4, o estado 3 e o estado desacoplado da respiração mitocondrial, característicos de inibidores metabólicos. Ainda observamos que o 3HPA foi capaz de produzir efeitos semelhantes sobre a respiração mitocondrial em fibras musculares permeabilizadas, validando os resultados obtidos em mitocôndrias isoladas. Além disso, demonstramos que o 3HPA e o 3HTA (30 UM) diminuíram marcadamente o ΔΨm, o conteúdo de NAD(P)H, a capacidade de retenção de Ca2+ e a produção de ATP, além de induzirem inchamento, em mitocôndrias obtidas de ambos os tecidos e suplementadas com Ca2+. Esses efeitos foram prevenidos por ciclosporina A e ADP, assim como pelo rutênio vermelho, indicando o envolvimento do PTP e do Ca2+, respectivamente. O fato de termos verificado que o 3HPA aumentou marcadamente a fluidez das membranas mitocondriais em músculo esquelético indica que esse mecanismo pode estar envolvido no prejuízo da homeostase mitocondrial causado por esses compostos. Finalmente, verificamos que o análogo dicarboxílico do 3HTA, o ácido 3-hidroxitetradecanodioico, que também se acumula nos pacientes, não alterou os parâmetros avaliados, indicando uma ação seletiva para os ácidos monocarboxílicos. Analisando nossos resultados em conjunto, demonstramos que os principais LCHFA acumulados nas deficiências da LCHAD e MTP prejudicam a homeostase mitocondrial em músculo cardíaco e esquelético. Presumimos que esse mecanismo possa explicar, pelo menos em parte, a cardiomiopatia severa, os sintomas e alterações musculares que acometem os pacientes afetados. / Long-chain 3-hydroxy-acyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) and mitochondrial trifunctional protein (MTP) deficiencies are inborn errors of fatty acid oxidation. Affected patients present accumulation of long-chain hydroxylated fatty acids (LCHFA), particularly 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids, in blood and other tissues. The symptomatology is varied, including severe cardiomyopathy and muscular symptoms such as weakness, muscle pain and recurrent episodes of rhabdomyolysis, as well as hepatopathy, retinopathy, hypotonia, peripheral neuropathy, speech and development delay, leading to premature death. Considering that the pathogenesis of cardiac and skeletal muscle damage presented by the patients are still not established, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HTA and 3HPA on important parameters of mitochondrial bioenergetics, namely the respiratory parameters state 3, state 4, respiratory control ratio (RCR) and uncoupled respiration, as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm), swelling, Ca2+ retention capacity and NAD(P)H redox state in cardiac and skeletal muscle mitochondria isolated from young rats. Initially, we observed that 3HTA and 3HPA at lower concentrations (10-30 UM) increased state 4 and decreased RCR in skeletal muscle mitochondria, indicating an uncoupling effect. At higher concentrations (50-100 UM), these fatty acids decreased state 4, state 3 and uncoupled respiration, suggesting metabolic inhibition. Furthermore, we observed that 3HPA was capable to provoke similar effects on mitochondrial respiration in permeabilized skeletal muscle fibers, validating the results obtained in isolated mitochondria. We also demonstrated that 3HPA and 3HTA (30 UM) strongly decreased the ΔΨm, NAD(P)H content, Ca2+ retention capacity and ATP production, besides inducing swelling, in mitochondria obtained from both tissues and supplemented with Ca2+. These effects were prevented by cyclosporin A and ADP, as well as by ruthenium red, indicating the involvement of mitochondrial permeability transition and Ca2+, respectively. The fact that 3HPA strongly increased the mitochondrial membrane fluidity in skeletal muscle indicates that this mechanism may be involved in the mitochondrial bioenergetics impairment caused by these compounds. Finally we verified that the 3HTA dicarboxylic analogue, 3-hydroxytetradecanodioic acid, which also accumulates in the affected patients, did not alter the tested parameters, indicating a selective action of the monocarboxylic acids. Taken together, we demonstrated that the major LCHFA accumulated in LCHAD and MTP deficiencies impair mitochondrial homeostasis in cardiac and skeletal muscle. We presume that these mechanisms may explain, at least in part, the severe cardiomyopathy, symptomatology and muscle alterations characteristics of the patients affected by these disorders.

Recentemente observou-se experimentalmente, Johnson et al. (2010), que fatias organotípicas corticais de rato são capazes de completar padrões espaço-temporais, após serem treinadas. Embora se especule que mecanismos de plasticidade sináptica e homeostática estejam por trás do fenômeno, ainda não existe nenhuma explicação detalhada sobre o assunto. Com o intuito de propor uma explicação clara e consistente para os mecanismos que permeiam a resposta da rede aos estímulos como um todo, nos propomos a estudar este fenômeno por meio de uma rede de neurônios de integração-e-disparo dotada de mecanismos de homeostase intrínseca e de plasticidade sináptica dependente de disparos. O sistema construído foi explorado, de modo a determinar em que condições a rede poderia comportar-se como o sistema real, e treinado de forma similar `a realizada experimentalmente por Johnson et al. (2010). / Recently it has been observed experimentally, Johnson et al. (2010), that organotypic cortical slices of rat are capable of completing spatio-temporal patterns after training. Although it is speculated that synaptic and homeostatic plasticity may have an important role in this phenomenon, there is still no detailed explanation about this subject. In order to propose a clear and consistent explanation for the mechanisms that underlie the network response to stimuli as a whole, we propose to study this phenomenon through a network of integrate-and-fire neurons endowed with intrinsic homeostasis and spike-timing dependent plasticity mechanisms. The constructed system was explored, aiming to determine in which conditions the network could behave as the real system, and trained in a way similar as the experimental one done by Johnson et al. (2010).

(OMIM 246450), também conhecida por acidúria 3-hidroxi-3-metilglutárica (HMGA), é um distúrbio genético caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo predominante dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA) e 3-metilglutacônico (MGT), bem como em menor grau do ácido 3- hidroxiisovalérico em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Os pacientes apresentam sintomas neurológicos graves e anormalidades no córtex cerebral e gânglios da base cuja fisiopatogenia é pouco conhecida. No presente estudo investigamos os efeitos dos principais metabólitos acumulados na HMGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em estriado de ratos injetados com esses compostos e em astrócitos cultivados de córtex cerebral, bem como sobre a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de estriado e córtex cerebral de ratos com 30 dias de idade. Assim, estudamos inicialmente os efeitos da administração intrastriatal de HMG e MGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em ratos em desenvolvimento. Nossos resultados demonstram que o HMG e o MGA induziram dano oxidativo em lipídios e proteínas. Os dois ácidos também aumentaram a oxidação da 2'- 7'-diclorofluorescina (DCFH), ao passo que apenas o HMG induziu a produção de óxido nítrico. Em relação às defesas antioxidantes o HMG e o MGA provocaram uma diminuição das concentrações de glutationa reduzida e das atividades da superóxido dismutase e glutationa redutase, bem como um aumento da atividade da glutationa peroxidase. Já o HMG também causou um aumento de atividade da catalase e uma diminuição da atividade da glicose-6- fosfato desidrogenase. Finalmente observou-se que antioxidantes preveniram completamente ou atenuaram as alterações dos parâmetros de estresse oxidativo causadas pelo HMG, reforçando a participação de espécies reativas nesses efeitos. Observou-se também que MK-801, um antagonista nãocompetitivo do receptor glutamatérgico do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), preveniu alguns dos efeitos provocados pelo HMG, indicando o envolvimento do receptor NMDA no desequilíbrio redox causado por esse metabólito. Tendo em vista que os astrócitos são importantes para proteção neuronal e são susceptíveis a danos por neurotoxinas, o passo seguinte de nossa investigação foi determinar os efeitos do HMG e MGA sobre parâmetros importantes da homeostase redox e produção de citocinas em astrócitos corticais cultivados. Ambos os ácidos orgânicos reduziram a função mitocondrial astrocitária sem alterarem a viabilidade celular e também diminuíram as concentrações de glutationa reduzida. Em contrapartida, ambos metabólitos aumentaram a formação de espécies reativas (oxidação da DCFH) e também provocaram um aumento na liberação das IL-1β, IL-6 e TNFα através da via de sinalização de Erk. Finalmente investigamos os efeitos do HMG, MGA e MGT sobre a fosforilação da GFAP e subunidades NFL, NFM e NFH dos neurofilamentos (NF) em fatias de estriado e de córtex cerebral. Nossos resultados demonstraram que o HMG, o MGA e o MGT provocaram uma hipofosforilação da GFAP e todas as subunidades dos NF nas duas estruturas cerebrais. Verificamos ainda que a hipofosoforilação induzida por HMG nas proteínas do citoesqueleto foi mediada pela inibição das proteínas cinases, sem alterações de proteínas fosfatases. Assim, demonstramos que uma inibição da PKA estaria envolvida na hipofosforilação da Ser55 na região aminoterminal da NFL, 3 bem como uma inibição da JNK, resultaria na hipofosforilação das repetições do tipo KSP na região carboxiterminal das subunidades NFM e NFH. Observou-se também que a hipofosforilação do citoesqueleto era dependente dos receptores glutamatérgicos sinápticos e extrasinápticos (subunidade NR2B) do tipo NMDA e também do íon Ca2+. Além disso, o inibidor da óxido nítrico sintase, L-NAME, e o antioxidante TROLOX (análogo hidrosolúvel da vitamina E) preveniram completamente a hipofosforilação e a inibição das atividades da PKA e da JNK causada pelo HMG. Podemos então presumir que, os presentes dados fornecem evidências sólidas de que o estresse oxidativo induzido pelo HMG e MGA em estriados de ratos e em astrócitos corticais cultivados, além de uma resposta inflamatória evidenciada nessas células neurais e uma hipofosoforilação em proteínas do citoesqueleto possam representar mecanismos patológicos importantes que contribuem, ao menos em parte, com as alterações cerebrais observadas nos pacientes afetados pela deficiência da HL. / 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase (HL) deficiency, also known as 3- hydroxy-3-methylglutaric aciduria (HMGA) is a genetic disorder biochemically characterized by predominant accumulation of 3-hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA) and 3-methylglutaconic (MGT), as well as lesser amounts of 3-methylglutaconic and 3-hydroxyisovaleric acids in tissues and biological fluids of affected individuals. Clinically, the patients present neurological symptoms and basal ganglia injury, whose pathomechanisms are partially understood. In the present study, we investigated the effects of the main metabolites accumulating in HMGA on important parameters of oxidative stress in intrastriatally injected rats, in cortical cultured astrocytes, as well as on the phosphorylation of striatal and cortical cytoskeletal proteins of 30 day old rats. Thus, we first investigated the effects of the intrastiatal administration of HMG and MGA on important parameters of oxidative stress in developing rats. Our results demonstrate that HMG and MGA induced lipid and protein oxidative damage. HMG and MGA also increased 2',7'-dichlorofluorescein oxidation, whereas only HMG elicited nitric oxide production. Regarding the antioxidant defenses, both organic acids decreased reduced glutathione concentrations and the activities of superoxide dismutase and glutathione reductase and increased glutathione peroxidase activity. HMG also provoked an increase of catalase activity and a diminution of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. We finally observed that antioxidants fully prevented or attenuated HMG-induced alterations of the oxidative stress parameters, further indicating the participation of reactive species in these effects. We also observed that MK- 801, a non-competitive antagonist of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor, prevented some of these effects, indicating the involvement of the NMDA receptor in the redox imbalance provoked HMG effects. Considering that astrocytes are important for neuronal protection and are susceptible to damage by neurotoxins the next step of this work was investigated the effects of HMG and MGA on important parameters of redox homeostasis and cytokine production in cortical cultured astrocytes. Both organic acids decreased astrocytic mitochondrial function withouth altering cell viability, and also decreased the concentrations of reduced glutathione. In contrast, they increased reactive species formation (DCFH oxidation) and also provoked a significant increase of IL-1, IL-6 and TNFα release through the Erk signaling pathway. Finally, we investigated the effects of HMG, MGA and MGT on the phosphorylation of GFAP and the neurofilaments (NF) subunits NFL, NFM and NFH in striatal and cortical slices. Our results demonstrated that HMG, MGA and MGT caused hypophosphorylation of GFAP and of all NF subunits in both cerebral structures. We also found that the HMG-induced hypophosphorylation on the cytoskeletal proteins was mediated by the inhibition of protein kinases without altering protein phosphatases. Thus, we demonstrated that PKA inhibition was involved in the hypophosphorylation of Ser55 in the amino terminal region of NFL, as well as JNK inhibition resulting in the hypophosphorylation of KSPrepeats in the carboxyl terminal region of NFM and NFH subunits. It was also observed that the cytoskeletal hypophosphorylation was dependent on synaptic and extra synaptic (NR2B subunit) NMDA glutamatergic receptors and also on Ca2+. Furthermore, the nitric oxide synthase inhibitor, L-NAME, and the antioxidant TROLOX (polar analog of 5 vitamin E) fully prevented the hypophosphorylation and the inhibition of PKA and JNK activities caused by HMG. We can then presume that all these data provide solid evidence that oxidative stress induced by HMG and MGA in rat striatum and cortical cultured astrocytes, beyond of a inflamatory response verified in this neural cell type and an hypophosphorylation of cytoskeletal proteins could represent important pathomechanisms that contribute, at least in part, the cerebral alterations observed in the patients afected by the HL deficiency.

O ferro é essencial para a sobrevivência das bactérias, estando envolvido em vários processos metabólicos. Apesar de sua baixa solubilidade, as bactérias dispõem de sistemas eficientes e específicos para captação, utilização e armazenamento desse metal, ao mesmo tempo controlando adequadamente a concentração de ferro livre no meio, para evitar seus potenciais efeitos tóxicos. Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa que coloniza o xilema de uma diversidade de plantas cultivadas e silvestres em várias partes do mundo, sendo o agente causador de uma série de doenças em plantas economicamente importantes como citros, videiras e café. Alguns mecanismos de virulência de X. fastidiosa já foram elencados, entre esses a formação de biofilme, que promoveria a oclusão do xilema e consequente estresse hídrico para a planta. Postula-se que a captação de ferro por X. fastidiosa, causando redução da concentração desse metal no xilema das plantas infectadas, seja uma das estratégias utilizadas pela bactéria em seu processo de infecção. Nosso objetivo neste trabalho foi de investigar o processo de captação de ferro por X. fastidiosa e avaliar em maior detalhe o efeito da concentração de ferro no crescimento e na expressão de fatores de virulência dessa bactéria, expandindo os estudos anteriormente realizados em nosso grupo. Para tal propusemos: (i) avaliar a capacidade de X. fastidiosa produzir sideróforos, pequenas moléculas quelantes de ferro; (ii) investigar, em condições de cultivo com diferentes concentrações de ferro, o perfil de expressão de alguns genes de X. fastidiosa que possam ser integrantes do stimulon do ferro; (iii) analisar o efeito da concentração de ferro no crescimento e formação de biofilme por X. fastidiosa. Observamos que X. fastidiosa parece produzir um composto quelante de ferro que pode ser um sideróforo e elencamos alguns genes que poderiam estar envolvidos na síntese desse composto. Confirmamos que ferro é necessário para o crescimento de X. fastidiosa, sendo que em alta concentração de ferro foi observada maior deposição de biofilme pela cultura bacteriana. Interessantemente também foi observado que as células crescidas em meio com pouco ferro secretaram mais exopolissacarídeos totais na fração do biofilme, o que estabelece uma relação entre as concentrações de ferro no meio com a expressão de um fator de virulência essencial para o desenvolvimento da infecção por X. fastidiosa. / Iron is an essential nutrient for bacteria, being involved in many metabolic processes. Despite its low solubility, bacteria present efficient and specific systems for uptake, utilization and storage of iron, meanwhile controlling metal concentration adequately to prevent potential toxic effects of free iron. Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium which colonizes the xylem of a wide range of crops and wild species of plants worldwide. This bacterium is the agent of several diseases affecting economically important crops, such as citrus, grapevine and coffee. Among the proposed X. fastidiosa virulence mechanisms is the formation of biofilm which may occlude xylem vessels causing hydric stress. It is postulated that iron uptake might cause reduction of its concentration within the xylem of infected plants therefore constituting a virulence strategy during bacterial infection process. Our aims in this work were to investigate the process of iron uptake in X. fastidiosa and to evaluate the effect of iron concentration in the growth and morphology of this bacterium, expanding previous studies. For this we set to: (i) investigate the capacity of X. fastidiosa in producing siderophores, small biomolecules utilized for iron quelation; (ii) evaluate, under culture conditions at different iron concentrations, the expression profile of candidate genes that might be part of the iron stimulon; (iii) analyse the effect of iron concentration in growth and biofilm formation of X. fastidiosa. We observed that X. fastidiosa seems to produce a compound with iron quelating ability, such as a siderophore, and we point to a group of genes that might be involved in the synthesis of this compound. We confirmed that iron is necessary for growth of X. fastidiosa. At high concentrations of iron we observed higher biofilm production. Interestingly, we also observed that when grown in low iron concentration, X. fastidiosa secretes more exopolysaccharides (EPS) associated with the biofilm, suggesting a link between iron concentration and expression of an essential virulence factor to the infection process of X. fastidiosa.

(OMIM 246450), também conhecida por acidúria 3-hidroxi-3-metilglutárica (HMGA), é um distúrbio genético caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo predominante dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA) e 3-metilglutacônico (MGT), bem como em menor grau do ácido 3- hidroxiisovalérico em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Os pacientes apresentam sintomas neurológicos graves e anormalidades no córtex cerebral e gânglios da base cuja fisiopatogenia é pouco conhecida. No presente estudo investigamos os efeitos dos principais metabólitos acumulados na HMGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em estriado de ratos injetados com esses compostos e em astrócitos cultivados de córtex cerebral, bem como sobre a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de estriado e córtex cerebral de ratos com 30 dias de idade. Assim, estudamos inicialmente os efeitos da administração intrastriatal de HMG e MGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em ratos em desenvolvimento. Nossos resultados demonstram que o HMG e o MGA induziram dano oxidativo em lipídios e proteínas. Os dois ácidos também aumentaram a oxidação da 2'- 7'-diclorofluorescina (DCFH), ao passo que apenas o HMG induziu a produção de óxido nítrico. Em relação às defesas antioxidantes o HMG e o MGA provocaram uma diminuição das concentrações de glutationa reduzida e das atividades da superóxido dismutase e glutationa redutase, bem como um aumento da atividade da glutationa peroxidase. Já o HMG também causou um aumento de atividade da catalase e uma diminuição da atividade da glicose-6- fosfato desidrogenase. Finalmente observou-se que antioxidantes preveniram completamente ou atenuaram as alterações dos parâmetros de estresse oxidativo causadas pelo HMG, reforçando a participação de espécies reativas nesses efeitos. Observou-se também que MK-801, um antagonista nãocompetitivo do receptor glutamatérgico do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), preveniu alguns dos efeitos provocados pelo HMG, indicando o envolvimento do receptor NMDA no desequilíbrio redox causado por esse metabólito. Tendo em vista que os astrócitos são importantes para proteção neuronal e são susceptíveis a danos por neurotoxinas, o passo seguinte de nossa investigação foi determinar os efeitos do HMG e MGA sobre parâmetros importantes da homeostase redox e produção de citocinas em astrócitos corticais cultivados. Ambos os ácidos orgânicos reduziram a função mitocondrial astrocitária sem alterarem a viabilidade celular e também diminuíram as concentrações de glutationa reduzida. Em contrapartida, ambos metabólitos aumentaram a formação de espécies reativas (oxidação da DCFH) e também provocaram um aumento na liberação das IL-1β, IL-6 e TNFα através da via de sinalização de Erk. Finalmente investigamos os efeitos do HMG, MGA e MGT sobre a fosforilação da GFAP e subunidades NFL, NFM e NFH dos neurofilamentos (NF) em fatias de estriado e de córtex cerebral. Nossos resultados demonstraram que o HMG, o MGA e o MGT provocaram uma hipofosforilação da GFAP e todas as subunidades dos NF nas duas estruturas cerebrais. Verificamos ainda que a hipofosoforilação induzida por HMG nas proteínas do citoesqueleto foi mediada pela inibição das proteínas cinases, sem alterações de proteínas fosfatases. Assim, demonstramos que uma inibição da PKA estaria envolvida na hipofosforilação da Ser55 na região aminoterminal da NFL, 3 bem como uma inibição da JNK, resultaria na hipofosforilação das repetições do tipo KSP na região carboxiterminal das subunidades NFM e NFH. Observou-se também que a hipofosforilação do citoesqueleto era dependente dos receptores glutamatérgicos sinápticos e extrasinápticos (subunidade NR2B) do tipo NMDA e também do íon Ca2+. Além disso, o inibidor da óxido nítrico sintase, L-NAME, e o antioxidante TROLOX (análogo hidrosolúvel da vitamina E) preveniram completamente a hipofosforilação e a inibição das atividades da PKA e da JNK causada pelo HMG. Podemos então presumir que, os presentes dados fornecem evidências sólidas de que o estresse oxidativo induzido pelo HMG e MGA em estriados de ratos e em astrócitos corticais cultivados, além de uma resposta inflamatória evidenciada nessas células neurais e uma hipofosoforilação em proteínas do citoesqueleto possam representar mecanismos patológicos importantes que contribuem, ao menos em parte, com as alterações cerebrais observadas nos pacientes afetados pela deficiência da HL. / 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase (HL) deficiency, also known as 3- hydroxy-3-methylglutaric aciduria (HMGA) is a genetic disorder biochemically characterized by predominant accumulation of 3-hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA) and 3-methylglutaconic (MGT), as well as lesser amounts of 3-methylglutaconic and 3-hydroxyisovaleric acids in tissues and biological fluids of affected individuals. Clinically, the patients present neurological symptoms and basal ganglia injury, whose pathomechanisms are partially understood. In the present study, we investigated the effects of the main metabolites accumulating in HMGA on important parameters of oxidative stress in intrastriatally injected rats, in cortical cultured astrocytes, as well as on the phosphorylation of striatal and cortical cytoskeletal proteins of 30 day old rats. Thus, we first investigated the effects of the intrastiatal administration of HMG and MGA on important parameters of oxidative stress in developing rats. Our results demonstrate that HMG and MGA induced lipid and protein oxidative damage. HMG and MGA also increased 2',7'-dichlorofluorescein oxidation, whereas only HMG elicited nitric oxide production. Regarding the antioxidant defenses, both organic acids decreased reduced glutathione concentrations and the activities of superoxide dismutase and glutathione reductase and increased glutathione peroxidase activity. HMG also provoked an increase of catalase activity and a diminution of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. We finally observed that antioxidants fully prevented or attenuated HMG-induced alterations of the oxidative stress parameters, further indicating the participation of reactive species in these effects. We also observed that MK- 801, a non-competitive antagonist of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor, prevented some of these effects, indicating the involvement of the NMDA receptor in the redox imbalance provoked HMG effects. Considering that astrocytes are important for neuronal protection and are susceptible to damage by neurotoxins the next step of this work was investigated the effects of HMG and MGA on important parameters of redox homeostasis and cytokine production in cortical cultured astrocytes. Both organic acids decreased astrocytic mitochondrial function withouth altering cell viability, and also decreased the concentrations of reduced glutathione. In contrast, they increased reactive species formation (DCFH oxidation) and also provoked a significant increase of IL-1, IL-6 and TNFα release through the Erk signaling pathway. Finally, we investigated the effects of HMG, MGA and MGT on the phosphorylation of GFAP and the neurofilaments (NF) subunits NFL, NFM and NFH in striatal and cortical slices. Our results demonstrated that HMG, MGA and MGT caused hypophosphorylation of GFAP and of all NF subunits in both cerebral structures. We also found that the HMG-induced hypophosphorylation on the cytoskeletal proteins was mediated by the inhibition of protein kinases without altering protein phosphatases. Thus, we demonstrated that PKA inhibition was involved in the hypophosphorylation of Ser55 in the amino terminal region of NFL, as well as JNK inhibition resulting in the hypophosphorylation of KSPrepeats in the carboxyl terminal region of NFM and NFH subunits. It was also observed that the cytoskeletal hypophosphorylation was dependent on synaptic and extra synaptic (NR2B subunit) NMDA glutamatergic receptors and also on Ca2+. Furthermore, the nitric oxide synthase inhibitor, L-NAME, and the antioxidant TROLOX (polar analog of 5 vitamin E) fully prevented the hypophosphorylation and the inhibition of PKA and JNK activities caused by HMG. We can then presume that all these data provide solid evidence that oxidative stress induced by HMG and MGA in rat striatum and cortical cultured astrocytes, beyond of a inflamatory response verified in this neural cell type and an hypophosphorylation of cytoskeletal proteins could represent important pathomechanisms that contribute, at least in part, the cerebral alterations observed in the patients afected by the HL deficiency.

O encéfalo, através de complexa atividade elétrica, é capaz de processar diversos tipos de informação, que são reconhecidos, memorizados e recuperados. A base do processamento é dada pela atividade de neurônios, que se comunicam principalmente através de eventos discretos no tempo: os potenciais de ação. Os disparos desses potenciais de ação podem ser observados por técnicas experimentais; por exemplo, é possível medir os instantes dos disparos dos potenciais de ação de centenas de neurônios em camundongos vivos. No entanto, as intensidades das conexões entre esses neurônios não são totalmente acessíveis, o que, além de outros fatores, impossibilita um entendimento mais completo do funcionamento da rede neural. Desse modo, a neurociência computacional tem papel importante para o entendimento dos processos envolvidos no encéfalo, em vários níveis de detalhamento. Dentro da área da neurociência computacional, o presente trabalho aborda a aquisição e recuperação de memórias dadas por padrões espaciais, onde o espaço é definido pelos neurônios da rede simulada. Primeiro utilizamos o conceito da regra de Hebb para construir redes de neurônios com conexões previamente definidas por esses padrões espaciais. Se as memórias são armazenadas nas conexões entre os neurônios, então a inclusão de um período de aprendizado torna necessária a implementação de plasticidade nos pesos sinápticos. As regras de modificação sináptica que permitem memorização (Hebbianas) geralmente causam instabilidades na atividade dos neurônios. Com isso desenvolvemos regras de plasticidade homeostática capazes de estabilizar a atividade basal de redes de neurônios. Finalizamos com o estudo analítico e numérico de regras de plasticidade sináptica que permitam o aprendizado não-supervisionado por elevação da taxa de disparos de potenciais de ação de neurônios. Mostramos que, com uma regra de aprendizado baseada em evidências experimentais, a recuperação de padrões memorizados é possível, com ativação supervisionada ou espontânea. / The brain, through complex electrical activity, is able to process different types of information, which are encoded, stored and retrieved. The processing is based on the activity of neurons that communicate primarily by discrete events in time: the action potentials. These action potentials can be observed via experimental techniques; for example, it is possible to measure the moment of action potentials (spikes) of hundreds of neurons in living mice. However, the strength of the connections among these neurons is not fully accessible, which, among other factors, preclude a more complete understanding of the neural network. Thus, computational neuroscience has an important role in understanding the processes involved in the brain, at various levels of detail. Within the field of computational neuroscience, this work presents a study on the acquisition and retrieval of memories given by spatial patterns, where space is defined by the neurons of the simulated network. First we use Hebb’s rule to build up networks of spiking neurons with static connections chosen from these spatial patterns. If memories are stored in the connections between neurons, then synaptic weights should be plastic so that learning is possible. Synaptic plasticity rules that allow memory formation (Hebbian) usually introduce instabilities on the neurons’ activity. Therefore, we developed homeostatic plasticity rules that stabilize baseline activity regimes in neural networks of spiking neurons. This thesis ends with analytical and numerical studies regarding plasticity rules that allow unsupervised learning by increasing the activity of specific neurons. We show that, with a plasticity rule based on experimental evidences, retrieval of learned patterns is possible, either with supervised or spontaneous recalling.