A pouca solubilidade do ferro impõe desafios para sua captação por bactérias e outros organismos. Uma solução eficaz para este problema é a utilização de sideróforos próprios ou exógenos para solubilizar o ferro do ambiente ou de proteínas do hospedeiro e transportá-lo para o interior da célula bacteriana. Neste trabalho, identificamos vias de produção e captação de ferro por sideróforos e definimos o papel destas moléculas na virulência da bactéria Chromobacterium violaceum, um abundante componente da microbiota de solo e água que ocasionalmente causa graves infecções em humanos. Por meio de análises in silico, vários genes relacionados com a síntese e captação de sideróforos foram encontrados no genoma de C. violaceum ATCC 12472 em dois clusters de síntese de metabólitos secundários. Obtenção de linhagens mutantes de vários destes genes e caracterização destas linhagens por ensaios de CAS, curvas de crescimento em carência de ferro e ensaios de estimulação de crescimento revelaram que C. violaceum produz sideróforos endógenos. Essa produção mostrou-se dependente do percursor comum 2,3-DHBA produzido pelas enzimas codificadas pelos genes entCEBA (CV_1485-84-83-82) e de duas enzimas sintetases de peptídeo não ribossomais (NRPSs CV_1486 e CV_2233), as quais provavelmente montam dois sideróforos distintos do tipo catecolato. Cada sideróforo foi captado por um receptor dependente de TonB (RDTB) específico, com o sideróforo produzido via NRPS CV_1486 sendo captado pelo RDTB CV_1491, e o sideróforo produzido via NRPS CV_2233 sendo captado pelo RDTB CV_2230, uma vez que mutantes sem esses RDTBs acumularam sideróforos no meio externo no ensaio de CAS. Além de seus sideróforos endógenos, C. violaceum foi capaz de utilizar xenosideróforos do tipo catecolato de outras bactérias via o RDTB CV_1491. Ensaios de infecção em camundongos revelaram que tanto a síntese quanto a captação de seus sideróforos endógenos são importantes para a virulência de C. violaceum, pois as linhagens mutantes que não produzem sideróforos (?CV_1485-84- 83-82, ?CV_1485-84-83-82/1486::pNPT e ?CV_1486/2233::pNPT) ou são incapazes8 de captá-los (?CV_2230/1491) tiveram sua virulência diminuída em relação a linhagem selvagem. Os dados mostrando que o mutante que não capta ambos sideróforos de C. violaceum teve atenuação mais acentuada da virulência e induziu menor produção de NET em ensaios com neutrófilos in vitro sugerem que o acúmulo de sideróforos na infecção pode ser benéfico para o hospedeiro. Por fim, demonstramos a possibilidade de gerar mutantes de transposon em C. violaceum e ao realizarmos varredura de uma coleção destes mutantes identificamos ao menos um potencial novo fator de transcrição envolvido na regulação da síntese de sideróforo nesta bactéria. Portanto, os dados obtidos neste trabalho revelaram que C. violaceum utiliza-se de diferentes sideróforos endógenos para captação de ferro e que estas moléculas são importantes para seu estabelecimento no hospedeiro. / The low solubility of iron imposes challenges for its uptake by bacteria and other organisms. An effective solution to this problem is the use of own or exogenous siderophores to solubilize the iron from environmental or host sources and transport it into the bacterial cell. In this work, we identified pathways for production and uptake of siderophores, and we defined the role of these molecules in virulence of the bacterium Chromobacterium violaceum, an abundant component of the microbiota of soil and water, which occasionally causes serious infections in humans. By performing an in silico analysis, we found several genes related with synthesis and uptake of siderophores in the genome of C. violaceum ATCC 12472 within two secondary metabolite biosynthesis gene clusters. Obtaining mutant strains from several of these genes and characterizing these strains by CAS assays, growth curves under iron deficiency and growth stimulation assays revealed that C. violaceum produces endogenous siderophores. This production was shown to be dependent on the common precursor 2,3-DHBA produced by the enzymes encoded by the genes entCEBA (CV_1485-84-83-82) and on two non-ribosomal peptide synthetase enzymes (NRPSs CV_1486 and CV_2233), which probably build two distinct catecholate siderophores. Each siderophore was picked up by a specific TonB-dependent receptor (RDTB), with the siderophore produced via NRPS CV_1486 being picked up by RDTB CV_1491, and the siderophore produced via NRPS CV_2233 being picked up by RDTB CV_2230, since mutants without those RDTBs accumulated siderophores in the external environment in the CAS assays. In addition to its endogenous siderophores, C. violaceum was able to use catecholate-type xenosiderophores from other bacteria via the RDTB CV_1491. Infection assays in mice revealed that both the synthesis and the uptake of its endogenous siderophores are important for the virulence of C. violaceum, since mutant strains that do not produce siderophores (?CV_1485-84-83- 82, ?CV_1485-84-83- 82/1486 :: pNPT and ?CV_1486/2233 :: pNPT) or are unable to uptake them (?CV_2230/1491) had their virulence decreased relative to the wild type strain. The data showing that the mutant strain unable to uptake both siderophores of10 C. violaceum had more pronounced attenuation of virulence and induced lower NET production in in vitro neutrophil assays suggest that the accumulation of siderophores in the infection may be beneficial to the host. Finally, we demonstrated the possibility of generating transposon mutants in C. violaceum, and by screening a collection of these mutants we identified at least one potential novel transcription factor involved in the regulation of siderophore synthesis in this bacterium. Therefore, the data obtained in this work revealed that C. violaceum uses different endogenous siderophores for iron uptake and that these molecules are important for its establishment in the host.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica de caráter granulomatoso, causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides spp. A PCM é endêmica na America Latina e aproximadamente 80% do pacientes vivem no território brasileiro. O tratamento medicamentoso é eficiente, entretanto, é longo e vários pacientes acabam abandonando e recidivas são comuns neste grupo. A utilização de uma vacina terapêutica poderia resultar na redução do tempo de tratamento assim como, recuperar a resposta imune do hospedeiro frente ao fungo. As vacinas de DNA são uma abordagem promissora na imunoterapia e podem ser injetadas por via intramuscular, intradérmica ou via mucosa. As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas que estão ligadas a homeostase celular e também possuem efeitos imunológicos em diversos casos como doenças infecciosas e autoimunes. No presente trabalho, analisamos o esquema vacinal terapêutico em camundongos BALB/c previamente infectados intratraquealmente com 3x105 leveduras de P. brasiliensis Pb18, 60 dias depois, submetidos a imunização com pcDNA3 contendo sequências codificadoras de PbHSP60 e/ou IL-12 murina e/ou vetor vazio. Foi observada redução significativa no número de unidades formadoras de colônia (UFCs) nos pulmões de camundongos imunizados com PbHSP60. Os grupos que receberam PbHSP60+pcDNA3 vazio ou PbHSP60x2 apresentaram os maiores índices de redução da cargas fúngicas. A inclusão do plasmídeo contendo o inserto de mIL-12, resultou em um efeito deletério. A análise dos cortes histológicos indicou que os animais vacinados apresentavam áreas bem preservadas e com poucos ou nenhum foco de granuloma. Detectamos um perfil de citocinas típico Th1/Th2. Nossos resultados sugerem que a imunização utilizando plasmídeo contendo o inserto HSP60, tem grande potencial vacinal / The paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease of character, caused by the thermally dimorphic fungus Paracoccidioides spp. The PCM is endemic in Latin America and approximately 80% of patients are living in Brazil. The medical treatment is effective, however, is long and many patients end up abandoning and relapses are common in this group.The use of a therapeutic vaccine could result in the reducing time of treatment as well as recover the host immune response against the fungus. DNA vaccines are a promising approach for immunotherapy and can be injected by intramuscular, intradermal, or mucosal route. The heat shock proteins (HSPs) are proteins that are linked to cellular homeostasis and also have immunological effects in many cases as infectious and autoimmune diseases. In the present study, we analyzed the therapeutic vaccine schedule in BALB/c mice previously infected intratracheally with 3x105 yeast of P. brasiliensis strain 18, and 60 days after, undergoing immunization with pcDNA3 containing coding sequences PbHSP60 and / or murine IL-12 and / or empty vector. Significant reduction was observed in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of mice immunized with PbHSP60. The groups that received empty pcDNA3 and PbHSP60 or PbHSP60x2 have higher rates of reduced fungal loads. The inclusion of the plasmid containing the insert mIL-12 resulted in a deleterious effect. The analysis of histological sections indicated that vaccinated animals had wellpreserved, with few or no focus of granuloma areas. It was detected a profile typical Th1/Th2 cytokines. Our results suggest that immunization using plasmid containing the insert HSP60 vaccine has great potential

Objetivos. Investigar a associação entre consumo alimentar, índice glicêmico (IG) da dieta habitual com glicemia e insulinemia de jejum, resistência à insulina (HOMA R) e alteração da homeostase glicêmica (AHG: glicemia de jejum alterada - GJA, tolerância à glicose diminuída - TGD e diabetes mellitus tipo 2). Indivíduos e métodos. 1.054 nipo-brasileiros residentes em Bauru, ambos os sexos, 30 a 90 anos, primeira e segunda gerações, que participaram de inquérito transversal conduzido em 2000, sem diagnóstico prévio de AHG e/ou uso de hipoglicemiantes orais/insulina. Para avaliação da dieta habitual, utilizou-se questionário quantitativo de freqüência alimentar, previamente validado, com o auxílio do programa Dietsys versão 4.0. Os fatores dietéticos foram ajustados pelas calorias totais pelo método residual, após transformação logarítmica. As variáveis independentes foram inicialmente selecionadas segundo correlação de Pearson com glicemia e insulinemia de jejum ou HOMA R (variáveis dependentes contínuas) com valor de p<0,20. A associação entre nutrientes/ alimentos com as variáveis dependentes contínuas foi avaliada em modelos de regressão linear múltiplos. Modelos de regressão logística múltiplos foram utilizados para investigar a relação entre fatores dietéticos (tercis) com AHG, ajustados por fatores de confusão. Resultados. Após ajuste múltiplo, houve associações inversas entre o consumo dos grupos de laticínios integrais (g/dia), doces (g/dia), IG da dieta e glicemia de jejum (mg/dl). Relação inversa entre o consumo de IG da dieta e HOMA R também foi observada. Verificou-se razão de chances - RC (IC 95%) - para GJA de 1,70 (1,06 - 2,74) no último tercil de consumo de fibras totais em que as principais fontes alimentares foram o arroz polido, pão branco e frutas/sucos de frutas. Efeito protetor entre o tercil intermediário do consumo de vegetais [0,61 (0,38 - 0,98)] foi observado para TGD. Conclusão. Em nossa população de estudo, a fibra dietética proveniente do consumo excessivo de arroz polido, pão branco, frutas e sucos representou risco para AHG. Por outro lado, observou-se efeito protetor do maior consumo de vegetais para TGD. / Objective. To investigate the effects of food intake and dietary glycemic index (GI) on fasting plasma levels of glucose and insulin, homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA R) and impaired glucose disturbance - IGD (impaired fasting glucose - IFG, impaired glucose tolerance - IGT and diabetes mellitus type 2). Subjects and methods. 1,054 Japanese-Brazilians living in Bauru, of both genders, 30 to 90 years-old, first- and second-generation, who completed all the information for the cross-sectional survey in 2000, without previous diagnosis of IGD and/or use of oral hipoglycemic medication/insulin. Food consumption was assessed using a validated food frequency questionnaire, with the aid of the software Dietsys 4.0. All dietary factors were log-transformed and adjusted for total energy intake by residual method. The dependent variables were first selected using Pearson correlation with fasting plasma levels of glucose and insulin or HOMA R (continuous independent variables), with p<0.20. The associations between selected nutrients/foods and the continuous independent variables were assessed using multiple linear regression models. Logistic regression models were used to investigate the relationship between dietary factors (tercile) and IGD, while adjusting for confounding factors. Results. After multiple adjustments, intakes of whole dairy products and sweets (g/day) and dietary GI were inversely correlated with fasting glucose levels (mg/dl). Dietary GI was also inversely correlated with HOMA R. The odds ratio (95% confidence interval) for IFG was 1.70 (1.06 - 2.74) in the highest tercile of total dietary fiber (main food sources: white rice and bread, fruits/fruit juices). The second tercile of vegetable intake was associated with a risk reduction of IGT [0.61 (0.38 - 0.98)]. Conclusion. In our study population, the intake of total dietary fiber, largely attributable to high intakes of white rice, white bread, fruits/fruit juices, was positively associated with risk of IGD. On the other hand, a protective effect was observed for higher intake levels of vegetables

Die toxische Wirkung von Kationen ist verantwortlich für eine Reihe biologischer und pathologischer Erscheinungen. Zu den übergreifenden Zielen des Gesamtvorhabens wurden als wissenschaftliche Arbeiten i) die Analyse, graphische Darstellung und darauf basierende Gewichtung spezifischer genomischer Promotor-Regionen, ii) die Verarbeitung, Auswertung und genomweite Analyse von Mikro-Array Experimenten über die Auswirkung verschiedener Schwermetalle auf S. cerevisiae, iii) Mitarbeit an einer Simulations-Umgebung mit Modulen zur Digitalisierung, Präsentation, Analyse und mathematischer Modellierung der räumlichen Verteilung biologisch relevanter Moleküle sowie iv) ein Ansatz zur Modellierung der Kationen-Homöostase unter Verwendung der Theorie der Nichtgleichgewichts Thermodynamik beigetragen. Im Vordergrund der bioinformatorischen Arbeiten stand dabei der iterative Prozess, in dem verfügbare experimentelle Ergebnisse in aussagefähige Modelle oder Anwendungen übertragen wurden und die Resultate der Modellierung oder Vorhersage wiederum in neue entsprechende Experimente umgesetzt wurden. Die Anwendungsumgebung zur Promotoranalyse sowie die Simulationsumgebung zur räumlichen Verteilung biologisch relevanter Moleküle wie zum Beispiel markierte Signalmoleküle wurde bereits veröffentlicht und erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse der genomweiten Analyse liefern Erkenntnisse über die individuellen Mechanismen und Strategien der Hefe auf verschiedene Metallionen in toxischer Konzentration zu reagieren. Der theoretische biophysikalisch-thermodynamische Ansatz liefert ein fundamentales Modell der Kationen-Homöostase der zahlenmäßig bedeutendsten Kationen: Kalium, Natrium und Protonen. Das Modell wurde an experimentellen Daten getest und konnte diese reproduzieren. Entsprechende Perspektiven für die Weiterentwicklung des Modells werden diskutiert. / Cationic toxicity is relevant for a number of qualitatively different biological and medical phenomena such as cationic surfactants, salt and heavy metal stress in plants and a number of pathological conditions which share similar critical metabolic processes (i.e. protein aggregation and oxidative stress). In line with the overall project goals the scientific work contributed to i) the analysis, graphical presentation and the respective assessment of specific genomic promoter-regions, ii) the conversion, evaluation and genome wide analysis of micro-array experiments on the effects of exposition of S. cerevisiae to heavy metals, iii) a simulation environment comprising modules for digitalization, presentation, analysis and mathematical modeling of the spatio-temporal distribution of biologically relevant molecules, and iv) a cation homeostasis modeling approach based on the non-linear thermodynamics theory. The bioinformatical work focused on an iterative process in which available experimental results were transferred into meaningful models or applications and results of modeling or prediction into corresponding new experimental designs. The software for the promoter-analysis and the simulation environment for integration of spatio-temporal distribution of biologically relevant molecules like labeled signal molecules have already been published and successfully implemented.The results of the genome-wide analysis - based on experiments of a project partner - provide insights in the individual mechanisms and strategies of the yeast cell upon exposition to various (heavy) metals in toxic concentrations. The theoretical biophysical-thermodynamic approach provides a fundamental model of cation homeostasis in S.cerevisiae of the major cations: potassium, sodium and protons. The model - confronted with experimental data - is capable to reproduce the observed uptake rates to a reasonable degree. Perspectives for further development of the model are discussed.

Introdução: A hipertensão pulmonar tromboembólica crônica (HPTEC) está incluída no grupo 4 da Classificação Internacional de Hipertensão Pulmonar (HP). É caracterizada pela persistência de obstrução por trombos sanguíneos na circulação pulmonar, associada à presença de HP, após três meses de anticoagulação efetiva. O tratamento de escolha é a cirurgia de tromboendarterectomia pulmonar (TEAP), mas alguns dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nesta forma de hipertensão ainda permanecem incertos. O redirecionamento dos fluxos sanguíneos pulmonares e a hipóxia exercem papel importante na HPTEC, como também em casos de hipertensão pulmonar residual, após a cirurgia de TEAP. Entretanto, existem poucos dados sobre as respostas das células endoteliais pulmonares a essas mudanças de fluxo e de oxigenação, surgindo a necessidade do estudo da proteostase celular nesta doença. Objetivo: (A) Caracterização morfológica das células em culturas provenientes de artéria pulmonar de pacientes com HPTEC submetidos à TEAP. (B) Avaliação da resposta das células endoteliais, a partir da análise de proteínas envolvidas na proteostase celular, quando submetidas a diferentes níveis de stress mecânico e à hipóxia. Método: Trombos extraídos por TEAP foram processados, as células retiradas foram cultivadas, marcadas com CD31 e submetidas a stress mecânico por vinte e quatro horas, constituindo o grupo HPTEC. A proteostase celular foi avaliada pela medida de proteínas expressas por essas células, tanto em culturas quanto pela análise imuno-histoquímica do tecido vascular pulmonar. Como grupo controle foram utilizadas células endoteliais pulmonares humanas de linhagem (CE) e tecido de artérias pulmonares de doadores de transplante de pulmão. As culturas de ambos os grupos também foram colocadas em hipóxia e analisada a expressão indireta de óxido nítrico (NO) por meio da medida de nitrato. Resultado: as células do grupo HPTEC com morfologia endotelial foram marcadas positivamente com CD31 e apresentaram características semelhantes às do grupo CE. Em relação ao stress mecânico, na condição estática as células HPTEC expressaram menor quantidade de óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Quando submetidas a stress de alta intensidade (shear stress >= 15 dynes/cm2), as reduções ficaram ainda mais evidentes, sinalizando uma disfunção endotelial. Na análise de outras proteínas, como GRP94, GRP78, HSP70, as respostas também foram menores no alto fluxo. Na avaliação imunohistoquímica da camada íntima do vaso pulmonar, a HSP70 apresentava-se diminuída, corroborando os achados das culturas. Os valores de NO foram inferiores no grupo HPTEC quando se comparam hipóxia e normóxia. Conclusão: (A) A avaliação morfológica mostrou que as culturas de células HPTEC eram endoteliais. (B) A análise funcional revelou que estas células apresentaram redução de resposta, o que caracteriza alteração da proteostase, que se tornou mais evidente quando foram submetidas a shear stress de alta magnitude. A hipóxia reduziu a produção de NO, entretanto sem diferenciar os grupos celulares estudados / Introduction: Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) is included in group 4 of the International Classification of Pulmonary Hypertension (PH). It is characterized by persistent obstruction by blood clots in the pulmonary circulation, associated with the presence of PH, after 3 months of effective anticoagulation. The treatment of choice is pulmonary endarterectomy (PEA). However, some of the pathophysiological mechanisms involved in this form of hypertension still remain uncertain. The redirection of pulmonary blood flow and hypoxia play an important role in CTEPH, and also, in cases of residual pulmonary hypertension after PEA surgery. Nevertheless, there is insufficient data from the pulmonary endothelial cell responses to this flow and oxygenation changes, reflecting the need to further study of cellular proteostasis in this disease. Objective: (A) Morphological characterization of cells in cultures from the pulmonary artery of CTEPH patients submitted to PEA. (B) Evaluation of the response of endothelial cells, through the analysis of proteins involved in cellular proteostasis, when submitted to different levels of mechanical stress and hypoxia. Method: Thrombus extracted by PEA were processed and the cells removed were cultured, marked with CD31 and submitted to mechanical stress for 24 hours and constituted the group CTEPH. Cellular proteostasis was measured by the quantification of the proteins expressed in cultures and in pulmonary vascular tissue by immunohistochemistry analysis. As a control group, the human pulmonary endothelial cells (EC) and pulmonary artery tissue from lung transplant donors were used. Cultures of both groups were also placed in hypoxia and the indirect expression of nitric oxide (NO) was analyzed by nitrate measurement. Results: The cells with endothelial morphology from the CTEPH group were positively marked with CD31 and presented similar characteristics as the EC group. Regarding mechanical stress, in the static condition, the CTEPH cells expressed a lesser amount of endothelial nitric oxide synthase (eNOS). When submitted to high flow (shear stress > 15 dynes / cm2) the reductions became even more evident, signaling an endothelial dysfunction. In the analysis of other proteins, such as GRP94, GRP78, HSP70, responses were also lower in high shear stress. In the immunohistochemistry analysis of the intimal layer of the pulmonary vessel HSP70 was diminished, corroborating with the findings of the cultures. The NO values were lower in the CTEPH group when compared hypoxia and normoxia. Conclusion: (A) Morphological evaluation showed that cultures of CTEPH cells were endothelial. (B) Functional analysis revealed that these cells had reduced response, which characterizes proteostasis alterations, which became more evident when they underwent shear stress of high magnitude. Hypoxia reduced NO production, however without differentiating the cell groups studied

A pouca solubilidade do ferro impõe desafios para sua captação por bactérias e outros organismos. Uma solução eficaz para este problema é a utilização de sideróforos próprios ou exógenos para solubilizar o ferro do ambiente ou de proteínas do hospedeiro e transportá-lo para o interior da célula bacteriana. Neste trabalho, identificamos vias de produção e captação de ferro por sideróforos e definimos o papel destas moléculas na virulência da bactéria Chromobacterium violaceum, um abundante componente da microbiota de solo e água que ocasionalmente causa graves infecções em humanos. Por meio de análises in silico, vários genes relacionados com a síntese e captação de sideróforos foram encontrados no genoma de C. violaceum ATCC 12472 em dois clusters de síntese de metabólitos secundários. Obtenção de linhagens mutantes de vários destes genes e caracterização destas linhagens por ensaios de CAS, curvas de crescimento em carência de ferro e ensaios de estimulação de crescimento revelaram que C. violaceum produz sideróforos endógenos. Essa produção mostrou-se dependente do percursor comum 2,3-DHBA produzido pelas enzimas codificadas pelos genes entCEBA (CV_1485-84-83-82) e de duas enzimas sintetases de peptídeo não ribossomais (NRPSs CV_1486 e CV_2233), as quais provavelmente montam dois sideróforos distintos do tipo catecolato. Cada sideróforo foi captado por um receptor dependente de TonB (RDTB) específico, com o sideróforo produzido via NRPS CV_1486 sendo captado pelo RDTB CV_1491, e o sideróforo produzido via NRPS CV_2233 sendo captado pelo RDTB CV_2230, uma vez que mutantes sem esses RDTBs acumularam sideróforos no meio externo no ensaio de CAS. Além de seus sideróforos endógenos, C. violaceum foi capaz de utilizar xenosideróforos do tipo catecolato de outras bactérias via o RDTB CV_1491. Ensaios de infecção em camundongos revelaram que tanto a síntese quanto a captação de seus sideróforos endógenos são importantes para a virulência de C. violaceum, pois as linhagens mutantes que não produzem sideróforos (?CV_1485-84- 83-82, ?CV_1485-84-83-82/1486::pNPT e ?CV_1486/2233::pNPT) ou são incapazes8 de captá-los (?CV_2230/1491) tiveram sua virulência diminuída em relação a linhagem selvagem. Os dados mostrando que o mutante que não capta ambos sideróforos de C. violaceum teve atenuação mais acentuada da virulência e induziu menor produção de NET em ensaios com neutrófilos in vitro sugerem que o acúmulo de sideróforos na infecção pode ser benéfico para o hospedeiro. Por fim, demonstramos a possibilidade de gerar mutantes de transposon em C. violaceum e ao realizarmos varredura de uma coleção destes mutantes identificamos ao menos um potencial novo fator de transcrição envolvido na regulação da síntese de sideróforo nesta bactéria. Portanto, os dados obtidos neste trabalho revelaram que C. violaceum utiliza-se de diferentes sideróforos endógenos para captação de ferro e que estas moléculas são importantes para seu estabelecimento no hospedeiro. / The low solubility of iron imposes challenges for its uptake by bacteria and other organisms. An effective solution to this problem is the use of own or exogenous siderophores to solubilize the iron from environmental or host sources and transport it into the bacterial cell. In this work, we identified pathways for production and uptake of siderophores, and we defined the role of these molecules in virulence of the bacterium Chromobacterium violaceum, an abundant component of the microbiota of soil and water, which occasionally causes serious infections in humans. By performing an in silico analysis, we found several genes related with synthesis and uptake of siderophores in the genome of C. violaceum ATCC 12472 within two secondary metabolite biosynthesis gene clusters. Obtaining mutant strains from several of these genes and characterizing these strains by CAS assays, growth curves under iron deficiency and growth stimulation assays revealed that C. violaceum produces endogenous siderophores. This production was shown to be dependent on the common precursor 2,3-DHBA produced by the enzymes encoded by the genes entCEBA (CV_1485-84-83-82) and on two non-ribosomal peptide synthetase enzymes (NRPSs CV_1486 and CV_2233), which probably build two distinct catecholate siderophores. Each siderophore was picked up by a specific TonB-dependent receptor (RDTB), with the siderophore produced via NRPS CV_1486 being picked up by RDTB CV_1491, and the siderophore produced via NRPS CV_2233 being picked up by RDTB CV_2230, since mutants without those RDTBs accumulated siderophores in the external environment in the CAS assays. In addition to its endogenous siderophores, C. violaceum was able to use catecholate-type xenosiderophores from other bacteria via the RDTB CV_1491. Infection assays in mice revealed that both the synthesis and the uptake of its endogenous siderophores are important for the virulence of C. violaceum, since mutant strains that do not produce siderophores (?CV_1485-84-83- 82, ?CV_1485-84-83- 82/1486 :: pNPT and ?CV_1486/2233 :: pNPT) or are unable to uptake them (?CV_2230/1491) had their virulence decreased relative to the wild type strain. The data showing that the mutant strain unable to uptake both siderophores of10 C. violaceum had more pronounced attenuation of virulence and induced lower NET production in in vitro neutrophil assays suggest that the accumulation of siderophores in the infection may be beneficial to the host. Finally, we demonstrated the possibility of generating transposon mutants in C. violaceum, and by screening a collection of these mutants we identified at least one potential novel transcription factor involved in the regulation of siderophore synthesis in this bacterium. Therefore, the data obtained in this work revealed that C. violaceum uses different endogenous siderophores for iron uptake and that these molecules are important for its establishment in the host.

Resumo não disponível.

FERNANDES, Nayanny de Sousa. Uso da tampa interna da colmeia Langstroth na manutenção da homeostase em colônias de abelhas africanizadas Apis mellifera durante o período de estiagem no semiárido nordestino. 2013. 67 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Zootecnia, Fortaleza-CE, 2013 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-08-09T15:04:29Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_nsfernandes.pdf: 2903368 bytes, checksum: 038ea0edbe123e3b99de127e8a40e3de (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-08-09T15:04:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_nsfernandes.pdf: 2903368 bytes, checksum: 038ea0edbe123e3b99de127e8a40e3de (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T15:04:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_nsfernandes.pdf: 2903368 bytes, checksum: 038ea0edbe123e3b99de127e8a40e3de (MD5) Previous issue date: 2013 / The Langstroth hive has its original model in an inner lid, just below the lid which would serve to assist the bees in the nest thermoregulation. In Brazil, the inner cover was removed from the hive components on the grounds that the country is tropical and the inner cover would become unnecessary, but no study has been done in this direction. The present study aims to investigate the role of the inner cover of the hive Langstroth homeostasis of Africanized bee colonies Apis mellifera in the dry season in the Caatinga in Limoeiro Norte-Ceará. The survey was conducted in October and November 2012 at the site of Canafístula Bixopá, District Bixopá, in the city of Limoeiro do Norte, state of Ceará. The experiment consisted of 10 hives without inner cover (T1) and 10 hives with inner cover (T2), in which he recorded temperature and relative humidity in the hives, ventilation (intensity and number of workers fanning), water harvesting (number of collecting bees by time, number of trips per bee, interval between the journeys and time spent for collection), and the consumption of food reserves from the hives of the two treatments. The results showed a significant difference (p <0.05) for temperature and relative humidity in the hives, with averages differing significantly between T1 (32.08 ± 0,27ºC and 53.23 ± 0.62%) and T2 (31.60 ± 0,33ºC and 54.96 ± 0.75%). The intensity data of ventilation, and the number of fanning bees did not differ between T1 (20.65 ± 0.77mm and 0.62 ± 0.14 bees) and T2 (20.27 ± 0.86mm and treatments 0.3 ± 0.06 bees). In collecting water, there was no statistical difference in the times of 11:00, 15:00 and 16:00 in T1 (16.25 ± 2.05, 18.25 ± 2.28 and 14.00 ± 1.35 treatments) and T2 (8.25 ± 1.88, 12.25 ± 0.62 and 9.75 ± 0.75), as well as the time spent collecting water (T1 = 34.86 ± 0.56s and T2 = 37.64 ± 0.63s). The number of trips / bee / day differed between the T1 and T2 only between quartiles I and II (Q1T1: 11.25 ± 4.52; Q2 T1: 35.5 ± 22.22; Q1T2: 4 ± 1.71, Q2 T2: 25.5 ± 15.28), for the Man-Whitney test. In between trips was no statistical difference only in quartiles I, II and IV of T1 treatments (Q1T1: 6 ± 5.13; Q2 T1: 8 ± 7.41 and Q4 T1: 97 ± 23.50 min) and T2 (Q1T2: 5.25 ± 3.94; Q2 T2: 8 ± 6.94 and Q4 T2: 272 ± 82.29 min) for the Man-Whitney test. The average consumption of food supply did not differ between treatments, being in T1 177.7 ± 29.9g and 141.8± 3.8g in T2. We conclude that the inner cover of the hive Langstroth provides that these bees hives achieve better conditions of internal homeostasis of the nest giving off less effort than those of hives without inner cover in conditions of the Limoeiro do Norte, Ceará. / A colmeia Langstroth traz em seu modelo original uma tampa interna, localizada imediatamente abaixo da tampa que serviria para auxiliar as abelhas na termoregulação do ninho. No Brasil, essa tampa interna foi retirada dos componentes da colmeia sob a alegação de que o país é tropical e a tampa interna se tornaria desnecessária, sem que estudos tenham sido conduzidos a esse respeito. O presente estudo se propôs a investigar o papel da tampa interna da colmeia Langstroth na homeostase de colônias de abelhas africanizadas Apis mellifera no período de estiagem no Semiárido nordestino. O estudo foi realizado nos meses de outubro e novembro de 2012, no Sítio Canafístula do Bixopá, Distrito de Bixopá, município de Limoeiro do Norte-CE. O experimento constou de 10 colmeias sem tampa interna (T1) e 10 colmeias com tampa interna (T2), nas quais se registraram temperatura e umidade relativa no interior das colmeias, a ventilação (intensidade e número de operárias ventilando), coleta de água (número de abelhas coletoras por horário, número de viagens por abelha, intervalo entre as viagens e tempo gasto para coleta), bem como o consumo das reservas de alimento entre as colmeias dos dois tratamentos. Os resultados mostraram que houve diferença significativa (p<0,05) para a temperatura e umidade relativa no interior das colmeias, com as médias diferindo estatisticamente entre T1 (32,08±0,27ºC e 53,23±0,62%) e T2 (31,60±0,33ºC e 54,96±0,75%). Os dados de intensidade de ventilação, e o número de abelhas ventilando não diferiram entre os tratamentos T1 (20,65±0,77 mm e 0,62±0,14 abelhas) e T2 (20,27±0,86 mm e 0,3±0,06 abelhas). Na coleta de água, houve diferença estatística nos horários de 11:00, 15:00 e 16:00, nos tratamentos T1 (16,25±2,05, 18,25±2,28 e 14,00±1,35) e T2 (8,25±1,88, 12,25±0,62 e 9,75±0,75), como também no tempo gasto para a coleta de água (T1=34,86±0,56 s e T2=37,64±0,63 s). O número de viagens/abelha/dia diferiu nos tratamentos T1 e T2 somente entre os quartis I e II (Q1T1: 11,25±4,52; Q2 T1: 35,5±22,22; Q1T2: 4±1,71; Q2 T2: 25,5±15,28), para o teste de Man-Whitney. No intervalo entre viagens houve diferença estatística somente nos quartis I, II e IV dos tratamentos T1 (Q1T1: 6±5,13; Q2 T1: 8±7,41 e Q4 T1: 97±23,50 min) e T2 (Q1T2: 5,25±3,94; Q2 T2: 8±6,94 e Q4 T2: 272±82,29 min) para o teste de Man-Whitney. A média de consumo da reserva de alimento não diferiu entre tratamentos, sendo 177,7±29,9 g em T1 e 141,8±13,8 g em T2. Conclui-se que a tampa interna da colmeia Langstroth propicia que as abelhas dessas colmeias consigam melhores condições de homeostase interna do ninho desprendendo menor esforço que aquelas de colmeias sem tampa interna.

A tentativa de compreender as consequências do tratamento precoce crônico com metilfenidato é muito importante uma vez que este psicoestimulante tem sido amplamente utilizado em crianças de idade pré-escolar. Além disso, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nas alterações persistentes no comportamento e no funcionamento neuronal associada à sua utilização. Neste estudo, nós inicialmente investigamos o efeito do tratamento precoce crônico com metilfenidato sobre o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano. Além disso, foram também avaliados a homeostase glutamatérgica, a Na+,K+-ATPase e o equilíbrio redox no córtex pré-frontal de ratos jovens. Ratos Wistar receberam injeções intraperitoneais de metilfenidato (2,0 mg/kg) ou um volume equivalente de solução salina 0,9% (controles), uma vez por dia, do 15º ao 45º dia de vida. Vinte e quatro horas após a última administração de metilfenidato, os animais foram decapitados e o líquido cefalorraquidiano e o córtex pré-frontal foram obtidos e processados conforme o protocolo para cada uma das análises. Os resultados mostraram que o metilfenidato alterou o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano, aumentando os níveis de glutamato. A captação de glutamato foi diminuída pelo tratamento crônico com metilfenidato, mas o conteúdo dos transportadores, GLAST e GLT-1, não foram alterados por esse tratamento. A atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas (α1, α2 e α3) da Na+,K+-ATPase foram diminuídos em córtex pré-frontal de ratos submetidos ao metilfenidato. Alterações na expressão gênica das subunidades α1 e α2 da Na+,K+-ATPase também foram observadas. O conteúdo de sulfidrilas, um marcador inversamente correlacionado com dano proteíco, foi diminuído. A atividade da CAT foi aumentada e a razão SOD/CAT foi diminuída em córtex pré-frontal de ratos. Os demais parâmetros avaliados não apresentaram diferenças significativas quando comparado aos controles. Os nossos resultados, tomados em conjunto, sugerem que o tratamento precoce crônico com metilfenidato promove excitotoxicidade devido, pelo menos em parte, à inibição da captação de glutamato provavelmente causada por perturbações na função da Na+,K+-ATPase e/ou pelo dano à proteína observados no córtex pré-frontal. Esses achados podem contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas alterações bioquímicas e comportamentais associadas ao uso crônico de metilfenidato durante o desenvolvimento do sistema nervoso central. / Understanding the consequences of chronic treatment with methylphenidate is very important since this psychostimulant is extensively in preschool age children. Additionaly to this, little is known about the mechanisms involved in persistent changes in behavior and neuronal function related with use of methylphenidate. In this study, we initially investigate the effect of chronic treatment with methylphenidate in juvenile rats on the amino acids profile in cerebrospinal fluid, as well as on glutamatergic homeostasis, Na+,K+-ATPase function and redox balance in prefrontal cortex. Wistar rats at early age received intraperitoneal injections of methylphenidate (2.0 mg/kg) or an equivalent volume of 0.9% saline solution (controls), once a day, from the 15th to the 45th day of life. Twenty-four hours after the last administration of methylphenidate, the animals were decapitated and the cerebrospinal fluid and the prefrontal cortex were obtained and processed according to the protocol for each analysis. Our results showed that methylphenidate altered amino acid profile in cerebrospinal fluid, increasing the levels of glutamate. In the prefrontal cortex, methylphenidate administration was able to decrease the glutamate uptake, with no changes in GLAST and GLT-1; and the activity and immunocontent of catalytic subunits (α1, α2 and α3) of Na+,K+-ATPase. We also observe changes in α1 and α2 gene expression of catalytic α subunits of Na+,K+-ATPase, decrease in sulfhydryl content, CAT activity and SOD/CAT ratio in juvenile rat prefrontal cortex treated with methylphenidate. Taken together, our results suggest that chronic treatment with methylphenidate at early age induces excitotoxicity, at least in part, due to inhibition of glutamate uptake probably caused by disturbances in the Na+,K+-ATPase function and/or protein damage observed in the prefrontal cortex. These findings may contribute, at least in part, to a better understanding of mechanisms involved in the biochemical and behavioral changes associated with chronic use of methylphenidate during the development of the central nervous system.

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