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Gen-Editierung von Photorezeptorgenen in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii mithilfe des CRISPR/Cas9-SystemsKelterborn, Simon 06 November 2020 (has links)
Die Modifikation von Genen ist in den molekularen Biowissenschaften ein fundamentales Werkzeug, um die Funktion von Genen zu studieren (Reverse Genetik). Diese Arbeit hat erfolgreich Zinkfinger- und CRISPR/Cas9-Nukleasen für die Verwendung in C. reinhardtii etabliert, um Gene im Kerngenom gezielt auszuschalten und präzise zu verändern.
Basierend auf vorausgegangener Arbeit mit Zinkfingernukleasen (ZFN) konnte die Transformationseffizienz um das 300-fache verbessert werden, was die Inaktivierung von Genen auch in motilen Wildtyp-Zellen ermöglichte. Damit war es möglich, die Gene für das Kanalrhodopsin-1 (ChR1), Kanalrhodopsin-2 (ChR2) und das Chlamyopsin-1/2-Gen (COP1/2) einzeln und gemeinsam auszuschalten. Eine Analyse der Phototaxis in diesen Stämmen ergab, dass die Phototaxis durch Inaktivierung von ChR1 stärker beeinträchtigt ist als durch Inaktivierung von ChR2.
Um das CRISPR/Cas9-System zu verwenden, wurden die Transformationsbedingungen so angepasst und optimiert, dass der Cas9-gRNA-Komplex als in vitro hergestelltes Ribonukleoprotein in die Zellen transformiert wurde. Um die Bedingungen für präzise Genmodifikationen zu messen und zu verbessern, wurde das SNRK2.2-Gen als Reportergen für eine „Blau-Grün Test“ etabliert. Kleine Insertionen von bis zu 30 bp konnten mit kurzen Oligonukleotiden eingefügt werden, während größere Reportergene (mVenus, SNAP-Tag) mithilfe eines Donor-Plasmids generiert wurden. In dieser Arbeit konnten mehr als 20 nicht-selektierbare Gene – darunter 10 der 15 potenziellen Photorezeptorgene – mit einer durchschnittlichen Mutationsrate von 12,1 % inaktiviert werden.
Insgesamt zeigt diese Arbeit in umfassender Weise, wie Gen-Inaktivierungen und Modifikationen mithilfe von ZFNs und des CRISPR/Cas9-Systems in der Grünalge C. reinhardtii durchgeführt werden können. Außerdem bietet die Sammlung der zehn Photorezeptor-Knockouts eine aussichtsreiche Grundlage, um die Vielfalt der Photorezeptoren in C. reinhardtii zu erforschen. / Gene editing is a fundamental tool in molecular biosciences in order to study the function of genes (reverse genetics). This study established zinc-finger and CRISPR/Cas9 nucleases for gene editing to target and inactivate the photoreceptor genes in C. reinhardtii.
In continuation of previous work with designer zinc-finger nucleases (ZFN), the transformation efficiency could be improved 300-fold, which enabled the inactivation of genes in motile wild type cells. This made it possible to disrupt the Channelrhodopsin-1 (ChR1), Channelrhodopsin-2 (ChR2) and Chlamyopsin-1/2 (COP1/2) genes individually and in parallel. Phototaxis experiments in these strains revealed that the inactivation of ChR1 had a greater effect on phototaxis than the inactivation of ChR2.
To apply the CRISPR/Cas9 system, the transformation conditions were adapted and optimized so that the Cas9-gRNA complex was successfully electroporated into the cells as an in vitro synthesized ribonucleoprotein. This approach enabled gene inactivations with CRISPR/Cas9 in C. reinhardtii. In order to measure and improve the conditions for precise gene modifications, the SNRK2.2 gene was established as a reporter gene for a ‘Blue-Green test’. Small insertions of up to 30 bp were inserted using short oligonucleotides, while larger reporter genes (mVenus, SNAP-tag) were integrated using donor plasmids. Throughout this study, more than 20 non-selectable genes were disrupted, including 10 of the photoreceptor genes, with an average mutation rate of 12,1 %.
Overall, this work shows in a comprehensive way how gene inactivations and modifications can be performed in green alga C. reinhardtii using ZFNs or CRISPR/Cas9. In addition, the collection of the ten photoreceptor knockouts provides a promising source to investigate the diversity of photoreceptor genes in C. reinhardtii.
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Imatinib radiosensitizes bladder cancer by targeting homologous recombinationQiao, B., Kerr, M., Groselj, B., Teo, M.T., Knowles, M.A., Bristow, R.G., Phillips, Roger M., Kiltie, A.E. January 2013 (has links)
No / Radiotherapy is a major treatment modality used to treat muscle-invasive bladder cancer, with patient outcomes similar to surgery. However, radioresistance is a significant factor in treatment failure. Cell-free extracts of muscle-invasive bladder tumors are defective in nonhomologous end-joining (NHEJ), and this phenotype may be used clinically by combining radiotherapy with a radiosensitizing drug that targets homologous recombination, thereby sparing normal tissues with intact NHEJ. The response of the homologous recombination protein RAD51 to radiation is inhibited by the small-molecule tyrosine kinase inhibitor imatinib. Stable RT112 bladder cancer Ku knockdown (Ku80KD) cells were generated using short hairpin RNA technology to mimic the invasive tumor phenotype and also RAD51 knockdown (RAD51KD) cells to show imatinib's pathway selectivity. Ku80KD, RAD51KD, nonsilencing vector control, and parental RT112 cells were treated with radiation in combination with either imatinib or lapatinib, which inhibits NHEJ and cell survival assessed by clonogenic assay. Drug doses were chosen at approximately IC40 and IC10 (nontoxic) levels. Imatinib radiosensitized Ku80KD cells to a greater extent than RAD51KD or RT112 cells. In contrast, lapatinib radiosensitized RAD51KD and RT112 cells but not Ku80KD cells. Taken together, our findings suggest a new application for imatinib in concurrent use with radiotherapy to treat muscle-invasive bladder cancer. Cancer Res; 73(5); 1611-20. (c)2012 AACR.
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La génomique évolutive mitochondriale révèle des échanges génétiques et la ségrégation chez les GloméromycètesBeaudet, Denis 06 1900 (has links)
Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) sont des organismes microscopiques du sol qui jouent un rôle crucial dans les écosystèmes naturels et que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils vivent en relation symbiotique avec la vaste majorité des plantes terrestres. Ils sont des biotrophes obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent croître qu'en présence d'une plante hôte. Cette symbiose permet entre autres à la plante d'acquérir des nutriments supplémentaires, en particulier du phosphore et du nitrate. Malgré le fait que cette symbiose apporte des services importants aux écosystèmes, la richesse des espèces, la structure des communautés, ainsi que la diversité fonctionnelle des CMA sont mal connues et l'approfondissement des connaissances dans ces domaines dépend d’outils de diagnostic moléculaire. Cependant, la présence de polymorphisme nucléaire intra-isolat combiné à un manque de données génomiques dans différents groupes phylogénétique de ces champignons complique le développement de marqueurs moléculaires et la détermination de l'affiliation évolutive à hauts niveaux de résolution (c.a.d. entre espèces génétiquement similaires et/ou isolats de la même espèce).
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Pour ces raisons, il semble une bonne alternative d’utiliser un système génétique différent en ciblant le génome mitochondrial, qui a été démontré homogène au sein d'un même isolat de CMA. Cependant, étant donné le mode de vie particulier de ces organismes, une meilleure compréhension des processus évolutifs mitochondriaux est nécessaire afin de valoriser l'utilisation de tels marqueurs dans des études de diversité et en génétique des populations. En ce sens, mon projet de doctorat consistait à investiguerétudier: i) les vecteurs de divergences inter-isolats et -espèces génétiquement rapprochéesphylogénétiquement apparentées, ii) la plasticité des génomes mitochondriaux, iii) l'héritabilité mitochondriale et les mécanismes potentiels de ségrégation, ainsi que iv) la diversité mitochondriale intra-isolat in situ.
À l'aide de la génomique mitochondriale comparative, en utilisant le séquençage nouvelle génération, on a démontré la présence de variation génétique substantielle inter-isolats et -espèces, engendrées par l'invasion d'éléments mobiles dans les génomes mitochondriaux des CMA, donnant lieu à une évolution moléculaire rapide des régions intergéniques. Cette variation permettait de développer des marqueurs spécifiques à des isolats de la même espèce. Ensuite, à l'aide d'une approche analytique par réseaux de gènes sur des éléments mobiles, on a été en mesure de démontrer des évènements de recombinaisons homologues entre des haplotypes mitochondriaux distincts, menant à des réarrangements génomiques. Cela a permis d'ouvrir les perspectives sur la dynamique mitochondriale et l'hétéroplasmie dans un même isolatsuggère une coexistence de différents haplotypes mitochondriaux dans les populations naturelles et que les cultures monosporales pourraient induirent une sous-estimation de la diversité allélique mitochondriale. Cette apparente contradiction avec l'homogénéité mitochondriale intra-isolat généralement observée, a amené à investiguer étudier les échanges génétiques à l'aide de croisements d'isolats génétiquement distincts. Malgré l'observation de quelques spores filles hétéroplasmiques, l'homoplasmie était le statut par défaut dans toutes les cultures monosporales, avec un biais en faveur de l'un des haplotypes parentaux. Ces résultats suggèrent que la ségrégation opère durant la formation de la spore et/ou le développement de la coloniedu mycélium. De plus, ils supportent la présence d'une machinerie protéique de ségrégation mitochondriale chez les CMAAMF, où l'ensemble des gènes impliqués dans ce mécanisme ont été retrouvé et sont orthologues aux autres champignons. Finalement, on est revenue aux sources avecon a étudié le polymorphisme mitochondrial intra-isolat à l'aide d'une approche conventionnelle de PCR en utilisant une Taq polymérase de haute fidélité, suivie de clonage et de séquençage Sanger, sur deux isolats de R. irregularis. Cela a permis l'observation d'hétéroplasmie in situ, ainsi que la co-expression de variantes de variantes de protéines'ARNm dans une souche in vitro. Les résultats suggèrent que d'autres études basées sur le séquençage nouvelle génération aurait potentiellement ignorée cette variation, offrant ainsi plusieurs nouveaux arguments permettant de considérer les CMA comme des organismes possédant une population de génomes mitochondriaux et nucléaires distincts. / The association between arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and plant roots is one of the most widespread symbioses involving plants, and thus has an important role in terrestrial ecosystems. In exchange for carbohydrates, AMF improve plant fitness by enhancing mineral nutrient uptake, especially in particular phosphate and nitrate. Although this symbiosisDespite the fact that these symbioses contribute provides to important services toin ecosystems, the species richness, community structure and functional diversity of AMF is not well understood due to a lack of reliable molecular tools. The intra-isolate genetic polymorphism of nuclear DNA observed in AMF, combined with a lack of genomic data in a broad range of phylogenetic groups, has made it difficult to develop molecular markers and to determine evolutionary relatedness at high levels of resolution (i.e. between genetically-similar species and/or isolates).
For these reasons, it seems a good alternative to use a different genetic system by targeting the mitochondrial genome, which have been shown to be homogeneous within AMF isolates. However, given the peculiar lifestyle of these organisms, a better understanding of the mitochondrial evolutionary processes and dynamics were is necessary in order to validate the usefulness of such markers in diversity and population genetics studies. In that regard, the objectives of my PhD project were to investigate: i) the divergence between closely related species and isolates, ii) mitochondrial genomes plasticity, iii) mitochondrial heritability and potential segregation mechanisms and iv) in situ mitochondrial intra-isolate allelic diversity.
With Using comparative mitochondrial genomics using and next generation sequencing (NGS) sequencing, we found substantial sequence variation in intergenic regions caused by the invasion of mobile genetic elements. This variation gives risecontributes to rapid mitochondrial genome evolution among closely related isolates and species, which makes it possible to design reliable intra- and inter-specific markers. Also, an extensive gene similarity network-based approach allowed us to provide strong evidence of inter-haplotype recombination in AMF, leading to a reshuffled mitochondrial genome. These findings suggest the coexistence of distinct mtDNA haplotypes in natural populations and raise questions as to whether AMF single spore cultivations artificially underestimates mitochondrial genetic diversity in natural population.. This apparent contradiction with the intra-isolate mtDNA homogeneity usually observed in these fungi, led to the investigation of mitochondrial heritability in the spore progeny resulting from crossed-cultures. Although an heteroplasmic state was observed in some daughter spores, we found that homoplasmy was the dominant state in all monosporal cultures, with an apparent bias towards one of the parental haplotypes. These results strongly support the presence of a putative mitochondrial segregation proteic machinery in AMF, whose complete set of genes were orthologous with those found in other fungi. Our findings suggest that segregation takes place either during spore formation or colony mycelium development. Finally, we performed a conventional PCR based approach with a high fidelity Taq polymerase, followed by downstream cloning and Sanger sequencing using the model organism Rhizophagus irregularis. We found in situ heteroplasmy along with substantial intra-isolate allelic variation within the mtDNA that persists in the transcriptome. Our study also suggest that genetic variation in Glomeromycota is higher than meets the eye and might be critically underestimated in most NGS based-AMF studies both in nuclei and mitochondria.
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Untersuchungen zur Funktion der Gene MPH1 und MMS2 aus Saccharomyces cerevisiae bei der fehlerfreien Umgehung von replikationsarretierenden DNA-Schäden / Studies on functions of the genes MPH1 and MMS2 from Saccharomyces cerevisiae during error free bypass of replication blocking DNA-lesionsEde, Christopher 13 January 2010 (has links)
No description available.
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Cascades of genetic instability resulting from compromised break-induced replicationVasan, Soumini January 2013 (has links)
Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Break-induced replication (BIR) is a mechanism to repair double-strand breaks
(DSBs) that possess only a single end that can find homology in the genome. This situation can result from the collapse of replication forks or telomere erosion. BIR frequently produces various genetic instabilities including mutations, loss of heterozygosity, deletions, duplications, and template switching that can result in copy-number variations (CNVs). An important type of genomic rearrangement specifically linked to BIR is half crossovers (HCs), which result from fusions between parts of recombining chromosomes. Because HC formation produces a fused molecule as well as a broken chromosome fragment, these events could be highly destabilizing. Here I demonstrate that HC formation results from the interruption of BIR caused by a defective replisome or premature onset of mitosis. Additionally, I document the existence of half crossover instability cascades (HCC) that resemble cycles of non-reciprocal translocations (NRTs) previously described in human tumors. I postulate that HCs represent a potent source of genetic destabilization with significant consequences that mimic those observed in human diseases, including cancer.
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SCF cdc4 regulates msn2 and msn4 dependent gene expression to counteract hog1 induced lethalityVendrell Arasa, Alexandre 16 January 2009 (has links)
L'activació sostinguda de Hog1 porta a una inhibició del creixement cel·lular. En aquest treball, hem observat que el fenotip de letalitat causat per l'activació sostinguda de Hog1 és parcialment inhibida per la mutació del complexe SCFCDC4. La inhibició de la mort causada per l'activació sostinguda de Hog1 depèn de la via d'extensió de la vida. Quan Hog1 s'activa de manera sostinguda, la mutació al complexe SCFCDC4 fa que augmenti l'expressió gènica depenent de Msn2 i Msn4 que condueix a una sobreexpressió del gen PNC1 i a una hiperactivació de la deacetilassa Sir2. La hiperactivació de Sir2 és capaç d'inhibir la mort causada per l'activació sostinguda de Hog1. També hem observat que la mort cel·lular causada per l'activació sostinguda de Hog1 és deguda a una inducció d'apoptosi. L'apoptosi induïda per Hog1 és inhibida per la mutació al complexe SCFCDC4. Per tant, la via d'extensió de la vida és capaç de prevenir l'apoptosi a través d'un mecanisme desconegut. / Sustained Hog1 activation leads to an inhibition of cell growth. In this work, we have observed that the lethal phenotype caused by sustained Hog1 activation is prevented by SCFCDC4 mutants. The prevention of Hog1-induced cell death by SCFCDC4 mutation depends on the lifespan extension pathway. Upon sustained Hog1 activation, SCFCDC4 mutation increases Msn2 and Msn4 dependent gene expression that leads to a PNC1 overexpression and a Sir2 deacetylase hyperactivation. Then, hyperactivation of Sir2 is able to prevent cell death caused by sustained Hog1 activation. We have also observed that cell death upon sustained Hog1 activation is due to an induction of apoptosis. The apoptosis induced by Hog1 is decreased by SCFCDC4 mutation. Therefore, lifespan extension pathway is able to prevent apoptosis by an unknown mechanism.
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