Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6066.pdf: 3990215 bytes, checksum: 05550a0cc5074637afaa52685749e202 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Brazil is a major exporter of oranges in the world, with the state of São Paulo, the largest citrus producer in the country. In the last years plants of the genus citrus have been strongly affected by various diseases and among them, the disease Huanglongbing (HLB) have occupied prominent role and importance due to the devastating damage caused to citrus production worldwide. Caused by Candidatus Liberibacter spp., a bacterium that colonizes and blocks the conductive vessels of elaborated sap (phloem) and transmitted by the vector, hemiptera, the psyllid Diaphorina citri. In this context, it is necessary to search for strategies to control the disease in citrus orchards. In order to identify a cysteine peptidase D. citri, in this work, the identification, recombinant expression and characterization of a cysteine peptidase D. citri, the type (cathepsin B) called DiaciCATHB was performed. The identification of an ORF for cysteine peptidase was performed using the database of the transcriptome of D. citri. Recombinant expression was performed in Pichia pastoris yeast cells. For activation of the recombinant enzyme important factors were observed, acidic conditions and incubation in suitable temperature and time. Kinetic characterization of the enzyme was verified by hydrolysis of the synthetic substrate Z-Phe-Arg-MCA, resulting in a (km) of 15.7 mM. Inhibition of the enzymatic activity tests were conducted using the recombinant inhibitor of cysteine peptidases CaneCPI-4, resulting in the inhibition constant (Ki) of 0.05 nM. The analysis of gene expression DiaciCATHB demonstrated that gene expression occurs in all stages of insect development, there is however a significant difference in expression level. According to the developmental stages of the insect D. citri, the expression level gradually increases DiaciCATHB, being higher in nymph and adult stages. The present results do not prove that the location and function performed by the enzyme DiaciCATHB, but regardless, the cysteine peptidase in this study has the potential to become an important target for use in future studies on insect control. / O Brasil é um dos maiores exportadores de laranjas do mundo, sendo o estado de São Paulo o maior produtor de citros no país. Nos últimos anos as plantas do gênero citrus têm sido fortemente afetadas por diversas patologias e dentre estas, a doença Huanglongbing (HLB) têm ocupado papel de destaque e importância devido aos danos devastadores causados a citricultura mundial. Causada pela Candidatus Liberibacter spp., uma bactéria que coloniza e obstrui os vasos condutores da seiva elaborada (floema) e transmitida pelo vetor, hemíptero, o psilídeo Diaphorina citri. Neste contexto, se faz necessário à busca por estratégias de controle para a doença nos pomares de citros. Com a finalidade de identificar uma cisteíno peptidase de D. citri, no presente trabalho, foi realizada a identificação, expressão recombinante e caracterização de uma cisteíno peptidase de D. citri, do tipo (catepsina B) denominada DiaciCATHB. A identificação de uma ORF para cisteíno peptidase de foi realizada através do banco de dados do transcriptoma de D. citri. A expressão recombinante foi realizada em células da levedura Pichia pastoris. Para a ativação da enzima recombinante fatores importantes foram observados, como condições ácidas e incubação em temperatura e tempo adequados. A caracterização cinética da enzima foi verificada pela hidrólise do substrato sintético Z-Phe-Arg-MCA, resultando em um (Km) de 15,7 μM. Testes de inibição da atividade enzimática foram realizados utilizando a o inibidor de cisteíno peptidases recombinante CaneCPI-4, resultando na constante de inibição (Ki) de 0,05 nM. A análise de expressão do gene DiaciCATHB demonstrou que a expressão do gene ocorre em todas as fases de desenvolvimento do inseto, havendo no entanto, uma diferença significativa no nível de expressão. De acordo com as fases de desenvolvimento do inseto D. citri, o nível de expressão de DiaciCATHB aumenta gradualmente, sendo maior nas fases de ninfa e adulto. Os resultados obtidos nesse trabalho não comprovam qual a localização e função exercida pela enzima DiaciCATHB, porém, independente disso, a cisteíno peptidase em estudo apresenta potencial para tornar-se um importante alvo para a utilização em futuros estudos no controle do inseto.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6344.pdf: 28928980 bytes, checksum: e00be5b82af995a60fd2dc884613b411 (MD5) Previous issue date: 2014-03-26 / Financiadora de Estudos e Projetos / This paper describes the variation of the chemical profile study of citros after inoculation of the bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus", responsible for Huanglongbing (ex greening), one of the most serious diseases causing several losses in the Brazilian citrus industry. The bacterium "Ca. Liberibacter " was inoculated in seedlings of the" Valencia "(Citrus sinensis (L.) Osbeck) grafted on "Swingle" (Poncirus trifoliata x Citrus paradisi) and was evaluated the change of secondary metabolites by the development of analytical methods such as HPLC-UV, LC-MS/MS, LC-UVSPE- NMR and chemometric tools. The chemometric methods PCA and S-PLOT applied to data obtained in the studies by LC-MSE allowed to discriminate infected plants from healthy plants, and also allowed the characterization of the compounds that most contribute to this differentiation. By analyzing the change in the chemical profile of citrus studied by HPLC-UV-SPE-NMR, it was able to detect the change of some coumarins in the roots and stem from rootstock, and glycosides flavonoid in leaves, indicating that these compounds may be involved in defense mechanism of the plant, and may be acting as a Phytoanticipins. Aiming to better interpret this change observed, also performed a quantitative variation of some secondary metabolites, as coumarin identified in the roots, and flavonoids identified in leaves. This technique showed an increase of coumarins in infected plants, while there was a decrease in all the flavonoids in the leaves in infected treatment, indicating that the plant defense is in the roots. Finally, a phytochemical study of citrus was performed aiming obtain patterns compounds, and this study resulted in the isolation of 13 substances, from several classes of secondary metabolites. / O presente trabalho descreve o estudo da variação do perfil químico de citros após a inoculação da bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus , responsável pelo Huanglongbing (ex-greening) que é uma das doenças mais sérias causadoras de prejuízos na citricultura brasileira. Para isso, inoculou-se a Ca. Liberibacter em mudas de a Valência (Citrus sinensis (L.) Osbeck) enxertadas em Swingle (Citrus paradisi X Poncirus trifoliata) e avaliou-se a variação dos metabólitos secundários através do desenvolvimento de métodos analíticos como HPLC-UV, LC-MS/MS, LC-UV-SPE-NMR e de ferramentas quimiométricas. As ferramentas quimiométricas (PCA e S-PLOT) aplicadas aos dados obtidos nos estudos de LC-MS/MS permitiram discriminar as plantas infectadas daquelas sadias, e também permitiram a caracterização dos compostos que mais contribuem para essa diferenciação. Ao analisar a variação do perfil químico dos citros doentes e sadios através da HPLC-UV-SPE-NMR foi possível detectar a variação principalmente de algumas cumarinas nas raízes e caule do porta enxerto, e flavonoides glicosilados nas folhas, indicando que estes compostos podem estar envolvidos no mecanismo de defesa da planta, e podem estar atuando como uma fitoantecipina. Para melhor interpretar essa variação observada, realizou-se também a variação quantitativa de alguns metabólitos secundários, como cumarinas identificadas nas raízes, e flavonóides identificados nas folhas. A partir dessa técnica foi possível verificar o aumento das cumarinas nas plantas infectadas com a bactéria, enquanto nas folhas observou-se a diminuição de todos os flavonóides no tratamento infectado, indicando que a defesa da planta parece estar nas raízes. Por fim, foi realizado um estudo fitoquímico de citros com o objetivo de obter substâncias padrões, que resultou no isolamento de 13 metabólitos secundários de diversas classes.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:51:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4070.pdf: 5454081 bytes, checksum: ca554fa7a9667cd15a69e9c5e0a36841 (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / Universidade Federal de Minas Gerais / This research aimed to study the activity of the HLB's scouts, workers whose function is to identify symptomatic plants, in order to understand the physical constraints, cognitive and organizational involved in accomplishing the task, characterizing the operative approach used to identify diseased plants, and to elucidate what aspects hinder the identification of symptoms. The method adopted for the research was the Ergonomic Analysis of Work EAW (Güérin et al., 2001). The results, after validation with the operators and management, allowed understanding the complex relationships between the physical, cognitive and organizational aspects present on activity. Major difficulties were observed mainly in relation to the disposal of the scouts on the platforms and in relation to working hours, at the beginning and end of the journey. Important findings have highlighted strategies, unknown by the organization, used by scouts to locate candidates‟ trees to the fine analysis of investigation of symptoms. In conclusion, the analysis enable to understand the constraints and find technical and organizational solutions to the survey work on citrus groves as well as it showed signs and symptoms not investigated yet or rarely considered by researchers involved on searches aimed at increasing the ability to diagnose the disease in the field. / Esta pesquisa teve como objetivo estudar a atividade dos inspetores de HLB, trabalhadores cuja função é identificar plantas contaminadas por HLB, a fim de entender os constrangimentos físicos, cognitivos e organizacionais envolvidos na realização da tarefa, caracterizar as estratégias operatórias utilizadas para identificar as plantas doentes, e elucidar quais os aspectos dificultam a identificação de sintomas. O método adotado para a pesquisa foi a Análise Ergonômica do Trabalho - AET (Güèrin et al., 2001). Os resultados, após a validação com os operadores e gestão, permitiu a compreensão das intrincadas relações entre os aspectos físicos, cognitivos e organizacionais presentes na atividade. Maiores dificuldades foram observadas principalmente em relação à disposição dos inspetores nas plataformas e em relação ao horário de trabalho, no início e no fim da jornada. Achados importantes destacaram estratégias, desconhecidas pela organização, usadas pelos inspetores para localizar plantas candidatas para a análise fina de verificação dos sintomas. Em conclusão, a análise permitiu compreender os constrangimentos e encontrar soluções técnicas e organizacionais para o trabalho de inspeção em pomares de citros, bem como mostrar sinais e sintomas não investigados ainda ou raramente considerados pelos pesquisadores envolvidos em estudos que visam aumentar a capacidade de diagnóstico da doença no campo.

Submitted by Tatiany Aparecida Teixeira Soratto (tatiany_soratto@hotmail.com) on 2017-10-31T12:37:37Z No. of bitstreams: 2 DISSERTACAO_Tatiany_final.pdf: 3171924 bytes, checksum: 81e554e8e0137d88785acf8a80455d32 (MD5) Encaminhamento do orientador.pdf: 236358 bytes, checksum: 344f7f279720c6058970c50ae22f4a46 (MD5) / Approved for entry into archive by Alini Demarchi (alini@cca.ufscar.br) on 2017-11-30T14:04:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 DISSERTACAO_Tatiany_final.pdf: 3171924 bytes, checksum: 81e554e8e0137d88785acf8a80455d32 (MD5) Encaminhamento do orientador.pdf: 236358 bytes, checksum: 344f7f279720c6058970c50ae22f4a46 (MD5) / Approved for entry into archive by Alini Demarchi (ri.bar@ufscar.br) on 2018-01-15T17:25:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 DISSERTACAO_Tatiany_final.pdf: 3171924 bytes, checksum: 81e554e8e0137d88785acf8a80455d32 (MD5) Encaminhamento do orientador.pdf: 236358 bytes, checksum: 344f7f279720c6058970c50ae22f4a46 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-01T13:19:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTACAO_Tatiany_final.pdf: 3171924 bytes, checksum: 81e554e8e0137d88785acf8a80455d32 (MD5) Encaminhamento do orientador.pdf: 236358 bytes, checksum: 344f7f279720c6058970c50ae22f4a46 (MD5) Previous issue date: 2017-09-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC has been conducting an extensive breeding program of citrus via directed crosses. In a previous study with Citrushuanglongbing pathosystem (HLB) held in our group, using a population obtained by hybridization between Citrus sunki and Poncirus trifoliata, differences were found in the multiplication of the bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), the causal agent of HLB, in the parents and in the progeny. It was observed that the rate of infection and bacterial concentration was higher in C. sunki than in P. trifoliata. Thus, it is important to deepen the studies with this genus and hybrids to increase knowledge of which mechanisms could be involved in the tolerance to HLB, considered the most important disease of citrus currently. In this sense, the objective of this study was to establish sinteny between the linkage groups of the C. sunki and P. trifoliata maps with the genome of Citrus sinensis and to map genomic regions associated to tolerance CLas bacterium through phenotypic analysis (QTLs) and gene expression (eQTLs). With the comparative analysis between maps and genome, it was observed that all the linkage groups showed synteny with reference genome chromosomes used, with the exception of the linkage group 10 of the C. sunki map. For the phenotypic data, a population of 79 F1 hybrids between C. sunki and P. trifoliata was used. The quantification of the bacterium and accumulation of starch in the leaves were evaluated after two years of inoculation with the pathogen. Through the statistical analysis of the mixed model it was possible to group the hybrids into resistant, tolerant and susceptible, being important the validation of these data in the field. The expression of 14 candidate genes related to HLB was performed in 72 hybrids of the population and used as expression data for the mapping of eQTLs. It was possible to locate nine QTLs and 52 eQTLs on the C. sunki genitor map and 17 QTLs and 40 eQTLs were found on the P. trifoliata genitor map. The overlapping eQTLs of the majority genes of QTL (phenotypic data) indicates that the genes are related to the phenotype and are probably responsive to the pathogen infection. / O Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC vem realizando um amplo programa de melhoramento genético de citros via cruzamentos dirigidos. Em um estudo prévio com o patossistema Citros-huanglongbing (HLB) realizado pelo nosso grupo, utilizando uma população obtida por hibridação controlada entre Citrus sunki e Poncirus trifoliata, foram verificadas diferenças na multiplicação da bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), agente causal do HLB, tanto nos genitores quanto na progênie. A taxa de infecção e a concentração de bactéria foi maior em Citrus sunki em relação ao P. trifoliata. Assim, é importante aprofundar os estudos com esses gêneros e seus híbridos para ampliar o conhecimento de quais mecanismos poderiam estar envolvidos na tolerância ao HLB, considerada a mais importante doença dos citros atualmente. O objetivo do trabalho foi estabelecer sintenia entre os grupos de ligação dos mapas de C. sunki e P. trifoliata com o genoma de Citrus sinensis e mapear regiões genômicas associadas à tolerância a CLas por meio de análise fenotípica (QTLs) e de expressão gênica (eQTLs). Com a análise comparativa entre mapas e genoma, foi observado que todos os grupos de ligação apresentaram sintenia com pseudocromossomos do genoma de referência utilizado, com exceção do grupo de ligação 10 do mapa da C. sunki. Para os dados fenotípicos foi utilizada uma população de 79 híbridos F1 entre C. sunki e P. trifoliata, sendo avaliada a quantificação da bactéria e acúmulo de amido nas folhas após dois anos da inoculação com o patógeno. Com a análise estatística utilizando modelo misto foi possível agrupar os híbridos em resistentes, tolerantes e suscetíveis, sendo importante a validação desses dados em campo. A análise de expressão de 14 genes candidatos relacionados ao HLB foi realizada em 72 híbridos da população e utilizados como dados de expressão para o mapeamento de eQTLs. Foram encontrados nove QTLs e 52 eQTLs no mapa do genitor C. sunki enquanto no mapa do genitor P. trifoliata foram encontrados 17 QTLs e 40 eQTLs. A sobreposição de eQTLs da grande maioria dos genes com QTLs dos dados fenotípicos, indicam que os genes têm relação com o fenótipo e que provavelmente são responsivos à infecção do patógeno.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5497.pdf: 10407694 bytes, checksum: db6127b4369c7514344d60d66a7e3612 (MD5) Previous issue date: 2013-07-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / This research aimed to develop a perceptual assistant device for citrus Huanglongbing (HLB) Greening´s scouts, which are workers responsible for symptomatic diseased plants identification by visual inspections on field. The methodology used has as starting point the Ergonomics Work Analysis (EWA) of HLB´s scouts, proceeded by Gonçalves (2011). The inspection´ EWA is articulated with Engineering Project methods for device development from the Activity standpoint. From EWA problem structuring, the device concept was defined as a lens which provides perceptual aid to HLB scouts by color contrast enhancement of mottling leaves, facilitating yellow bunch identification during visual inspection, but without any restriction to additional symptoms identification. Based on efficiency and productivity perspective, confronted against health and wellbeing perspective, it was used a method of data acquisition for quantitative analysis by statistical analysis of variance, related to inspection activity efficiency, and qualitative analysis, by semi-structured interviews related to user perception about wearing the perceptual assistant device. Results show that, in one hand, wearing the device helps to relief some cognitive constraints related to inspection activity, such as lightness, sun light reflection, shadows over the leaves, sun light direction variation, and also enhances symptomatic mottled leaves visualization. On the other hand, related to inspection efficiency, wearing the device does not resulted in higher or lower HLB identification on field. Therefore, the perceptual assistant device utilization for health improvement in the workplace and how is done mobilization and coordination between different social actors around the device development and evaluation, stays in this research as a reference about a way to create innovation. / Esta pesquisa teve como objetivo desenvolver um dispositivo de ajuda perceptiva para os inspetores de Huanglongbing (HLB) Greening da citricultura, trabalhadores cuja função é detectar plantas doentes em campo por meio de inspeções visuais. A metodologia utilizada tem como ponto de partida a Análise Ergonômica do Trabalho (AET) dos inspetores de HLB realizada por Gonçalves (2011). A AET do trabalho de inspeção é articulada com o Projeto de Engenharia para o desenvolvimento do dispositivo sob o ponto de vista da atividade. A partir da estruturação do problema pela AET, definiu-se o conceito do dispositivo como uma lente que proporciona ajuda perceptiva aos inspetores pela intensificação do contraste entre as cores do mosqueado das folhas, facilitando a detecção do ramo amarelo durante as inspeções, sem restringir a identificação dos demais sintomas. Balizado na confrontação entre a perspectiva de eficiência e produtividade com a perspectiva de bem-estar e saúde, a análise dos dados coletados foi direcionada de forma quantitativa por análise estatística de variância, relaciona a eficiência da atividade de inspeção, e qualitativa, por entrevistas semi-estruturadas relacionadas à percepção dos usuários quanto à utilização do dispositivo de ajuda perceptiva. Os resultados demonstram, por um lado, que a utilização do dispositivo ajuda a minimizar alguns constrangimentos cognitivos relacionados à atividade de inspeção quanto à claridade, reflexo dos raios solares, sombra sobre as folhas, variação de direção dos raios solares e também melhora a visualização dos sintomas de mosqueamento das folhas. Por outro lado, quanto à eficiência de inspeção, a utilização do dispositivo não acarretou em maior ou menor identificação de HLB em campo. Portanto, a utilização do dispositivo de ajuda perceptiva para melhoria da saúde no trabalho e o modo de mobilização e coordenação entre os diferentes atores sociais em torno do desenvolvimento e avaliação do dispositivo, ficam nesta pesquisa como referência de uma forma de criar inovação.