The flavin-containing monooxygenases (FMO / E.C.1.14.13.8) are microsomal NADPH and oxygen-dependent flavoprotein enzymes that catalyze the oxidation of a wide variety of xenobiotics, including drugs and environmental toxicants. Nucleophiles containing nitrogen, sulfur, phosphorus and selenium heteroatoms are the substrates of FMO. Bovine liver microsomal FMO enzyme activity was characterized using methimazole as substrate, which is a highly specific substrate for FMO. From 12 different bovine liver samples, microsomes were prepared and the average specific activity of bovine liver microsomal FMO was found to be 2.37 &amp / #61617 / 0.30 nmol/min/mg (Mean &amp / #61617 / SE, n=12). The rate of reaction was linear up to 0.5 mg of bovine liver microsomal protein. The maximum FMO enzyme activity was detected at 37 &amp / #61616 / C and at pH 8.0. Effects of detergents / Triton X-100 and Emulgen 913, on FMO activity were determined and found that enzyme activity increased by the addition of either detergent at all concentrations (0.1%-1.0%). The apparent Vmax and Km values of bovine liver microsomal FMO for methimazole substrate were found as 1.23 nmol/min/mg and 0.11 mM, respectively. Thermostability of bovine liver microsomal FMO was studied at four different temperatures / 24 &amp / #61616 / C, 37 &amp / #61616 / C, 50 &amp / #61616 / C and 65 &amp / #61616 / C. The incubation time required for the complete loss of enzyme activity was 5 minutes at 65 &amp / #61616 / C, 10 minutes at 50 &amp / #61616 / C and 6.5 hours at 37 &amp / #61616 / C. 68 % of the activity was still detectable at the end of 53 hours at 24 &amp / #61616 / C. Bovine liver microsomal activity towards two drug substrates, imipramine and chlorpromazine, was also determined and found to be 3.73 and 3.75 nmol NADPH oxidized/min/mg, respectively. Effects of two drug substrates, imipramine and chlorpromazine, on bovine liver microsomal FMO-catalyzed methimazole oxidation activity was also studied and found that they inhibit FMO activity at all concentrations studied. Modulation of bovine liver microsomal FMO activity was studied using three different heavy metal ions / Ni+2, Cd+2 and Hg+2. At all other concentrations studied for each heavy metal ion and at all substrate methimazole concentrations (0.1, 0.2, 0.5, 1.0 mM), FMO-catalyzed methimazole oxidation activity decreased compared to control activity. KI values for Ni+2, Cd+2 and Hg+2 were found to be 0.5 mM, 0.085 mM, 4.6 &amp / #61549 / M, respectively. From the Dixon plot, the pattern of inhibition for three heavy metal ions was observed to be noncompetitive.

Neste trabalho, são abordados os estudos eletroquímicos e químico-quânticos, bem como o desenvolvimento de metodologias analíticas para o antidepressivo tricíclico imipramina e para o neurotransmissor dopamina. Os experimentos foram realizados em solução tampão Britton Robinson (BR) 0,10 mol L-1 no pH de melhor resposta analítica para os referidos compostos. Com base nos parâmetros eletroquímicos extraídos das técnicas de voltametria cíclica e de onda quadrada, utilizando-se um eletrodo de grafite-poliuretana (GPU), foi possível diagnosticar o grau de reversibilidade das reações, a presença ou não de processos de adsorção e também o número de prótons e elétrons envolvidos nas reações eletroquímicas. Quanto aos cálculos químico-quânticos, a representação gráfica do HOMO (orbital molecular de mais alta energia ocupado) e os cálculos das cargas atômicas derivadas do potencial eletrostático forneceram uma estimativa do provável sítio de oxidação dos compostos. Os resultados indicaram que a reação de oxidação da imipramina é irreversível e dependente da adsorção do reagente na superfície do eletrodo, ocorrendo a formação subseqüente de um dímero em uma etapa química posterior à transferência de dois elétrons e um próton. O provável sítio de oxidação da molécula abrange a região do átomo de nitrogênio do anel, salientando que após a transferência de dois elétrons há uma deslocalização de cargas pelo anel aromático, fato este que sugere a formação do dímero na posição 2. Paralelamente, experimentos de eletrólise a potencial controlado foram realizados com o objetivo de gerar produtos de reação para serem analisados pela técnica de espectroscopia de massa com ionização por electrospray (ESI-MS). Tomando-se por base os resultados obtidos pelas técnicas voltamétricas, pelos cálculos químico-quânticos e pelos espectros de massa, foi sugerido o provável mecanismo de oxidação da imipramina nas condições estudadas. A metodologia analítica desenvolvida para a imipramina é rápida, sensível e exata para a análise de rotina em comprimidos de Tofranil®. A sensibilidade alcançada pela metodologia permitiu ainda a análise direta de concentrações plasmáticas terapêuticas do antidepressivo e de seu metabólito (desipramina) em amostra de soro humano sintético. No entanto, a seletividade da metodologia ficou comprometida pela proximidade dos potenciais de pico dos dímeros formados após a oxidação da imipramina (-41 mV) e da desipramina (23 mV). A aplicação de um método matemático de deconvolução (Origin 6.0) tornou possível a determinação simultânea da imipramina e da desipramina. A dopamina, por sua vez, é oxidada a dopamina orto quinona em um processo reversível com a adsorção de reagente e produto na superfície do eletrodo. O processo envolve a participação de dois elétrons e dois prótons. A metodologia analítica desenvolvida para a dopamina foi aplicada na análise de rotina em ampolas de Revivan® com boa exatidão e precisão. Além disso, a sensibilidade e a seletividade alcançada pela metodologia resultou na determinação de dopamina em fluído cerebrospinal sintético. A separação dos picos de oxidação da dopamina (Ep = 200 mV) e do ácido ascórbico (Ep = 40 mV) deve-se, provavelmente, às interações eletrostáticas favoráveis entre a superfície do eletrodo de GPU e o ânion ascorbato. De maneira geral, os resultados obtidos foram bastante satisfatórios para as determinações pretendidas, concluindo que o eletrodo de GPU é um material promissor para a análise de moléculas de interesse biológico. / In this work, the electrochemical and quantum-chemical studies are discussed, as well as the development of analytical methodologies for the imipramine tricyclic antidepressant and for the dopamine neurotransmitter. Experiments were performed in 0.10 mol L-1 Britton Robinson (BR) buffer solution at the best analytical response pH for the mentioned compounds. From the electrochemical parameters extracted of cyclic and square wave voltammetric techniques, using a graphite-polyurethane electrode (GPU), it was possible to diagnose the reactions reversible degree, the presence or not of adsorptions processes and also the number of protons and electrons involved in the electrochemical reactions. Concerning to the quantum-chemical calculations, the graphic representation of HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital) and the calculation of the atomic charge derived from electrostatic potential provided an estimation of the probable oxidation sites of the compounds. The results indicated that the oxidation reaction of imipramine is reversible and dependent of the reagent adsorption at the electrode surface, occuring the formation of a dimer in a chemical step after the transference of two electrons and one proton. The probable oxidation site of the molecule includes the nitrogen atom region of the ring, emphasizing that after the transference of the two electrons there is a deslocalization of the charges though the aromatic ring, suggesting the formation of the dimeric specie at postion 2. At the same time, experiments of controlled potential electrolysis were carried out in order to generate reaction products to be analysed by electrospray ionization mass espectrosmmetry (ESI-MS). From the results obtained by voltammetric techniques, by quantum-chemical calculations and by mass spectroscopy, it was suggested a probable mechanism for the imipramine oxidation in the studied conditions. The analytical methodology developed for imipramine is fast, sensible and accurate for routine analysis in Tofranil® tablets. The reached sensibility also allowed the direct analysis of therapeutical plasmatic concentrations of the antidepressant and its methabolic (desipramine) in synthetic human serum sample. However, the selectivity of the methodology was compromised by the peak potentials proximity of the dimers formed after the oxidation of imipramine (-41 mV) and of desipramine (23 mV). The application of a deconvolution mathematical xviii method (Origin 6.0) permitted the simultaneous analysis of imipramine and desipramine. On the other hand, dopamine is oxidized to dopamine ortho-quinone in a reversible process with the adsorption of reagent and product at the electrode surface. The process involves the participation of two electrons and two protons. The analytical methodology developed for dopamine was applied in the routine analysis in Revivan® injections with good accuracy and precision. Besides that, the sensitivity and the selectivity reached by the methodology resulted in the determination of dopamine in synthetic cerebrospinal fluid. The separation of the oxidation peaks of dopamine (Ep = 200 mV) and of ascorbic acid (Ep = 40 mV) is probably due to the favorable electrostatic interactions between the GPU electrode surface and the ascorbate anion. In general way, the obtained results were very satisfatory for the desirable determinations, concluding that the GPU electrode is a promissing material for the analysis of biological interest molecules.

Neste trabalho, são abordados os estudos eletroquímicos e químico-quânticos, bem como o desenvolvimento de metodologias analíticas para o antidepressivo tricíclico imipramina e para o neurotransmissor dopamina. Os experimentos foram realizados em solução tampão Britton Robinson (BR) 0,10 mol L-1 no pH de melhor resposta analítica para os referidos compostos. Com base nos parâmetros eletroquímicos extraídos das técnicas de voltametria cíclica e de onda quadrada, utilizando-se um eletrodo de grafite-poliuretana (GPU), foi possível diagnosticar o grau de reversibilidade das reações, a presença ou não de processos de adsorção e também o número de prótons e elétrons envolvidos nas reações eletroquímicas. Quanto aos cálculos químico-quânticos, a representação gráfica do HOMO (orbital molecular de mais alta energia ocupado) e os cálculos das cargas atômicas derivadas do potencial eletrostático forneceram uma estimativa do provável sítio de oxidação dos compostos. Os resultados indicaram que a reação de oxidação da imipramina é irreversível e dependente da adsorção do reagente na superfície do eletrodo, ocorrendo a formação subseqüente de um dímero em uma etapa química posterior à transferência de dois elétrons e um próton. O provável sítio de oxidação da molécula abrange a região do átomo de nitrogênio do anel, salientando que após a transferência de dois elétrons há uma deslocalização de cargas pelo anel aromático, fato este que sugere a formação do dímero na posição 2. Paralelamente, experimentos de eletrólise a potencial controlado foram realizados com o objetivo de gerar produtos de reação para serem analisados pela técnica de espectroscopia de massa com ionização por electrospray (ESI-MS). Tomando-se por base os resultados obtidos pelas técnicas voltamétricas, pelos cálculos químico-quânticos e pelos espectros de massa, foi sugerido o provável mecanismo de oxidação da imipramina nas condições estudadas. A metodologia analítica desenvolvida para a imipramina é rápida, sensível e exata para a análise de rotina em comprimidos de Tofranil®. A sensibilidade alcançada pela metodologia permitiu ainda a análise direta de concentrações plasmáticas terapêuticas do antidepressivo e de seu metabólito (desipramina) em amostra de soro humano sintético. No entanto, a seletividade da metodologia ficou comprometida pela proximidade dos potenciais de pico dos dímeros formados após a oxidação da imipramina (-41 mV) e da desipramina (23 mV). A aplicação de um método matemático de deconvolução (Origin 6.0) tornou possível a determinação simultânea da imipramina e da desipramina. A dopamina, por sua vez, é oxidada a dopamina orto quinona em um processo reversível com a adsorção de reagente e produto na superfície do eletrodo. O processo envolve a participação de dois elétrons e dois prótons. A metodologia analítica desenvolvida para a dopamina foi aplicada na análise de rotina em ampolas de Revivan® com boa exatidão e precisão. Além disso, a sensibilidade e a seletividade alcançada pela metodologia resultou na determinação de dopamina em fluído cerebrospinal sintético. A separação dos picos de oxidação da dopamina (Ep = 200 mV) e do ácido ascórbico (Ep = 40 mV) deve-se, provavelmente, às interações eletrostáticas favoráveis entre a superfície do eletrodo de GPU e o ânion ascorbato. De maneira geral, os resultados obtidos foram bastante satisfatórios para as determinações pretendidas, concluindo que o eletrodo de GPU é um material promissor para a análise de moléculas de interesse biológico. / In this work, the electrochemical and quantum-chemical studies are discussed, as well as the development of analytical methodologies for the imipramine tricyclic antidepressant and for the dopamine neurotransmitter. Experiments were performed in 0.10 mol L-1 Britton Robinson (BR) buffer solution at the best analytical response pH for the mentioned compounds. From the electrochemical parameters extracted of cyclic and square wave voltammetric techniques, using a graphite-polyurethane electrode (GPU), it was possible to diagnose the reactions reversible degree, the presence or not of adsorptions processes and also the number of protons and electrons involved in the electrochemical reactions. Concerning to the quantum-chemical calculations, the graphic representation of HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital) and the calculation of the atomic charge derived from electrostatic potential provided an estimation of the probable oxidation sites of the compounds. The results indicated that the oxidation reaction of imipramine is reversible and dependent of the reagent adsorption at the electrode surface, occuring the formation of a dimer in a chemical step after the transference of two electrons and one proton. The probable oxidation site of the molecule includes the nitrogen atom region of the ring, emphasizing that after the transference of the two electrons there is a deslocalization of the charges though the aromatic ring, suggesting the formation of the dimeric specie at postion 2. At the same time, experiments of controlled potential electrolysis were carried out in order to generate reaction products to be analysed by electrospray ionization mass espectrosmmetry (ESI-MS). From the results obtained by voltammetric techniques, by quantum-chemical calculations and by mass spectroscopy, it was suggested a probable mechanism for the imipramine oxidation in the studied conditions. The analytical methodology developed for imipramine is fast, sensible and accurate for routine analysis in Tofranil® tablets. The reached sensibility also allowed the direct analysis of therapeutical plasmatic concentrations of the antidepressant and its methabolic (desipramine) in synthetic human serum sample. However, the selectivity of the methodology was compromised by the peak potentials proximity of the dimers formed after the oxidation of imipramine (-41 mV) and of desipramine (23 mV). The application of a deconvolution mathematical xviii method (Origin 6.0) permitted the simultaneous analysis of imipramine and desipramine. On the other hand, dopamine is oxidized to dopamine ortho-quinone in a reversible process with the adsorption of reagent and product at the electrode surface. The process involves the participation of two electrons and two protons. The analytical methodology developed for dopamine was applied in the routine analysis in Revivan® injections with good accuracy and precision. Besides that, the sensitivity and the selectivity reached by the methodology resulted in the determination of dopamine in synthetic cerebrospinal fluid. The separation of the oxidation peaks of dopamine (Ep = 200 mV) and of ascorbic acid (Ep = 40 mV) is probably due to the favorable electrostatic interactions between the GPU electrode surface and the ascorbate anion. In general way, the obtained results were very satisfatory for the desirable determinations, concluding that the GPU electrode is a promissing material for the analysis of biological interest molecules.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1958.pdf: 10581288 bytes, checksum: 1dc2b5264737849b6a8842144f1ad052 (MD5) Previous issue date: 2008-05-21 / Financiadora de Estudos e Projetos / The post-traumatic stress disorder (PTSD) affects a portion of subjects exposed to a traumatic event. This disorder leads to long-term alterations in the hypothalamus-pituitaryadrenal (HPA) axis, autonomic and cognitive function. The aim of our study was to evaluate whether the animal model of PTSD proposed for rats could be used in mice and, to evaluate the effect of benzodiazepine, tricycle antidepressant and selective serotonin reuptake inhibitor drugs in the PTSD model. For this we realized the following experiments: Experiment 1- The test consisted of exposure the male mice to inescapable electric footshock (0.3 mA) in the black side (BS) of the black-white box (BW). In the 7th, 14th and 21th day, mice were reexposed to the traumatic reminder on the white side (WS) or BS for 2 min, without footshock. In the 29th day, the animals were submitted to elevated plus-maze (EPM) for record the anxiety indexes [percentage of open arm entries (%OA) and percentage of open arm time (%OT) and as well as general locomotor activity, closed arm entries (CE)]. On day 34 the same animals were submitted to BW test for record the latency to escape (LE) from WS and time spent on WS of the BW box. Experiment 2 the same procedure of experiment 1 was performed, except that the animals were re-exposed at 7th, 14th e 21th days to reminder situation only in WS of BW box for 2 min, without footshock. On day 29th, the animals were exposed to EPM, 30 min after receiving treatment with midazolam. In 34th day the same animals after receiving treatment with midazolam were submitted to BW box test. Experiment 3, 4 and 5 - the same procedure was adopted from experiment 2, except that in 29th day, the animals were not submitted to EPM test and on 34th day 30 minutes after treatment with midazolam, imipramine and sertraline were submitted to BW box. Two-way ANOVA (stimulus x place remainder or treatment) followed by Duncan test showed that PTSD model increased anxiety in mice (P<0.05). The re-exposure in BS promoted anxiogenic-like effect extinction of the model. The midazolam treatment (1.0 and 2.0 mg/kg, i.p.) produced anxiolytic-like effect in maze-mice (P < 0.05) and the 0.5 mg/kg decreased latency to escape of WS (P < 0.05) of BW box and increased the exploratory activity, suggesting involvement of this GABA-benzodiazepine agonist on this PTSD modulation. The EPM test does not interfere in the evaluation of the BW test. It is important to note that no other behaviors were significantly altered by imipramine per se (P < 0.05). The sertraline (5.0 mg/kg), selective serotonin reuptake inhibitor, produced anxiolytic-like effect in the BW test (P < 0.05) and increase exploration activity. These results suggest that the employed PTSD model to study neurobiological disturbances associated with this disorder. / O Transtorno de Estresse Pós-Traumático (TEPT) afeta uma parcela de indivíduos que são expostos a um evento traumático. Este distúrbio induz em longo prazo alterações no eixo HPA, autonômicas e cognitivas. O objetivo deste estudo foi avaliar se o modelo animal de TEPT proposto para ratos poderia ser utilizado em camundongos e investigar o efeito dos fármacos benzodiazepínico, antidepressivo tricíclico e inibidor seletivo da recaptação de serotonina, no modelo de TEPT. Para isso realizamos os seguintes experimentos: Experimento 1- O teste consistiu em submeter camundongos machos, Suíço-albino ao choque inescapável (0,3mA) nas patas no lado escuro (LE) da caixa claro-escuro (CE). No 7º, 14º e 21º dia os camundongos foram reexpostos a situação de lembrança no lado claro (LC) ou LE da caixa por 2 min, sem choque. No 29º dia os animais foram expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE), para o registro dos índices de ansiedade [porcentagem de entradas (%EBA) e de tempo gasto nos braços abertos (%TBA) e atividade locomotora, entrada nos braços fechados (EBF)]. No 34º dia os mesmos animais foram submetidos ao teste CE para o registro da latência de fuga (LF) e do tempo gasto no LC da caixa CE. Experimento 2 o mesmo procedimento do experimento 1 foi adotado, exceto que os animais foram reexpostos no 7º, 14º e 21º dia a situação de lembrança apenas no LC da caixa por 2 min, sem choque. No 29º dia os animais, 30 min após receberem tratamento com midazolam, foram expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE). No 34º dia os mesmos animais após receberem o mesmo tratamento farmacológico, foram submetidos ao teste CE. Experimento 3, 4 e 5 o mesmo procedimento do experimento 2 foi adotado, exceto que no 29º dia os animais não foram submetidos ao LCE e no 34º dia, 30 min após receberem tratamento com midazolam, imipramina e sertralina foram submetidos ao teste CE. A ANOVA de duas vias (estímulo x local da SL ou tratamento) seguido do teste de Duncan mostrou que o modelo de TEPT produziu aumento da ansiedade nos camundongos (P < 0,05). As reexposições no LE promoveram extinção do efeito ansiogênico do modelo. O tratamento com midazolam (1,0 e 2,0 mg/kg) produziu efeito ansiolítico no LCE (P < 0,05), e a dose de 0,5 mg/kg reduziu a latência de fuga do ambiente claro (P < 0,05) no teste CE e aumentou a atividade exploratória, sugerindo o envolvimento deste agonista GABA-benzodiazepínico na modulação do TEPT. O LCE não interferiu na avaliação do teste CE. A imipramina não apresentou efeito sobre os camundongos (P > 0,05), ou seja, ausência de efeito deste antidepressivo tricíclico nos sintomas do TEPT. A sertralina (5,0 mg/kg) produziu efeito ansiolítico no teste CE (P < 0,05) e aumento na atividade exploratória, mostrando o envolvimento deste inibidor seletivo da recaptação de serotonina na modulação do modelo. Estes resultados sugerem que o modelo de TEPT utilizado poderá ser empregado para o estudo das alterações neurobiológicas envolvidas neste distúrbio.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Autophagy is a conserved cellular process that involves sequestration and degradation of cytosolic contents. The cell can engulf autophagic cargo (lipids, long-lived proteins, protein aggregates, and pathogens) through a double bound membrane called an autophagosome that fuses with a lysosome where hydrolases then degrade these contents. This process is one of the main defenses against starvation and is imperative for newborns at birth. Research on this process has increased exponentially in the last decade since its discovery almost a half a century ago. It has been found that autophagy is an important process in many diseases, continues to be at the forefront of research, and is clearly not fully understood. Our preliminary cell culture data in endothelial and epithelial cells show that a blockade of the de novo ceramide synthesis pathway, during treatment with an autophagy stimulus (cigarette smoke extract exposure), does not result in any reduction in autophagy or autophagic flux. Conversely, when acid sphingomyelinase (ASM) is pharmacologically inhibited, which prevents the generation of ceramide from sphingomyelin in an acidic environment, a profound increase in autophagy is observed. In this work, we hypothesize that (ASM) is an endogenous inhibitor of autophagy. ASM has two forms, a secreted form and a lysosomal form. N-terminal processing in the Golgi determines its cellular fate. In the lysosomal form, the phosphodiesterase is bound in the lysosomal membrane. The pharmacological inhibition mechanism is to release ASM from the membrane and allow other hydrolases to actively degrade the enzyme which, in turn, decreases the activity of ASM. This suggests that either the activity of ASM is a regulator of autophagy or that the presence of ASM, activity aside, is required for the lysosomal nutrient sensing machinery (LYNUS) to function properly. Here, we show that ASM is, in fact, an endogenous inhibitor of autophagy in vitro. The phosphorylation status of P70 S6k, a downstream effector of mammalian target of rapamycin (mTOR), which is part of the LYNUS, shows that dissociation of ASM from the membrane regulates mTOR and disturbs the LYNUS in such a manner as to signal autophagy.