Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-14Bitstream added on 2014-06-13T20:49:21Z : No. of bitstreams: 1 kodama_fy_me_prud.pdf: 3657773 bytes, checksum: e2020e59e5ae04245371bee87b21d60a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Pro-Reitoria de Auxilio A Pesquisa / A imobilização é geralmente considerada como o método de escolha para o tratamento de lesões musculoesqueléticas, embora possa incorrer em alterações estruturais indesejáveis. Na literatura poucos estudos avaliam a recuperação da resistência do músculo após a imobilização, principalmente do músculo envelhecido, desta forma o objetivo do presente estudo é descrever os efeitos da imobilização, da remobilização livre e por meio de exercício físico sobre as propriedades mecânicas e histológicas do músculo esquelético de ratos de duas faixas de idade. Para tanto, foram utilizados 69 ratos machos Wistar (Rattus novergicus) divididos em dois grupos de acordo com a idade, sendo um grupo adulto (cinco meses) e um idoso (15 meses). Estes grupos foram subdivididos de acordo com os procedimentos experimentais em controle, imobilizado, remobilizado livre e remobilizado por meio de exercício físico. A imobilização foi realizada com membros posteriores dos animais em posição de encurtamento por um período de sete dias. O protocolo de exercícios foi composto por 5 sessões de natação, 1 vez por dia e 25 minutos por sessão. Para obtenção dos valores das propriedades mecânicas, o músculo gastrocnêmio foi submetido a ensaios mecânicos de tração na máquina universal de ensaio EMIC® (modelo DL 2000) e calculadas as respectivas propriedades mecânicas: alongamento no limite máximo, carga no limite máximo e rigidez. Foram realizadas também medidas de morfometria por meio de técnica histológica. Os resultados do ensaio mecânico demonstram diferenças significantes dos valores de carga no limite máximo entre os subgrupos controle e os demais, tanto no grupo adulto como no idoso. Não houve diferença significante com relação à rigidez... / Immobilization is generally regarded as the method of choice for the treatment of musculoskeletal injuries, but may incur undesirable structural changes. In literature, few studies evaluate the recovery of muscle strength after immobilization, mainly aged muscle, so the purpose of this study is to describe the effects of immobilization, the free remobilization and physical exercise on the mechanical and histological properties in the skeletal muscle of two age groups of rats. To this end, we used 69 Wistar rats (Rattus norvegicus) divided into two groups according to age, being an adult group (five months) and old group (15 months). These groups were subdivided according to the experimental procedures in control, immobilized, free remobilized and remobilized through exercise. Immobilization was performed with the hindquarters of the animals in a shortened position for a period of seven days. The exercise protocol consisted of five sessions of swimming, 1 time per day and 25 minutes per session. To obtain the values of mechanical properties, the gastrocnemius muscle was subjected to mechanical testing machine EMIC universal test ® (model DL 2000) and assessed their mechanical properties: stretching at the maximum limit, load at the maximum limit and stiffness. Morphometry measurements were also taken using histological technique. The results of mechanical tests show significant differences in the values of the maximum load between the control and the other subgroups, both in the adult and the elderly ... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5045.pdf: 2052003 bytes, checksum: a910cb23839ac3311034c86753544c56 (MD5) Previous issue date: 2013-03-22 / Universidade Federal de Sao Carlos / Lipases are enzymes of great biotechnological relevance. Besides its natural function (hydrolysis of triglycerides), they are capable of catalyzing regio- and enantioselective hydrolysis and synthesis of numerous esters. Pseudomonas fluorescens lipase (LPF) was immobilized on different supports and with different methods and was applied on the synthesis of compounds of industrial interest. The efficiency of these syntheses with the biocatalyst PFL-octyl-silica, PFL-XAD 7 HP and PFL-polystyrene were used on the production of ethylic biodiesel from babassu oil. The best yield (100% within 24 h) was obtained with PFL immobilized on octyl-silica (PFL-octyl-silica). This derivative and commercial immobilized lipases (Candida antarctica lipase, CALB IM; Thermomyces lanuginosus lipase, LTL IM) were used on the production of ethylic biodiesel from soybean oil, showing similar yields within 48 h of reaction time (80%). On the synthesis of aromas, the biocatalysts PFL-octyl-silica, CALB IM, LTL IM and LPF IM (commercial immobilized Pseudomonas fluorescens lipase) presented similar performance (yield above 90% within 24 h of reaction time). Yields of about 95% were obtained within 12 h of reaction time with the biocatalysts PFL-octyl-silica and CALB IM, being able to be reused in eight successive batches. CALB IM produced fructose oleate (55 ºC, 24 h, oleic acid:fructose molar ratio 1:2) with 96% yield, whereas the derivative PFL-octyl.-silica yielded 57% (45 ºC, 72 h, molar ratio 1:1). PFL immobilized on octyl-agarose and octadecyl-Sepabeads presented an immobilization yield of 99%, rendering hyperactivated derivatives (150% and 300% of recovered activity, respectively). The monomeric form of the enzyme could be immobilized on glyoxyl-agarose at 25 ºC, pH 10.5 (100 mM sodium bicarbonate buffer), however, in the presence of a surfactant (Triton X-100 0,5% v/v). On the hydrolysis of (R,S)-ethyl-2-hydroxy-4-phenylbutyrate, PFL immobilized on octylagarose (open conformation) and on glyoxyl-agarose (in the form of bimolecular aggregates) showed a higher enantioselectivity (E > 100) than PFL immobilized on monomeric form on glyoxyl-agarose (E = 27.9). PFL immobilized on octadecyl-Sepabeads and glyoxyl-Sepabeads produced benzyl oleate with 85% yield via olive oil and benzyl alcohol transesterification in cyclohexane. These results show that the activity, stability and enantioselectivity are catalytic properties of lipases which could be modulated via immobilization on activated supports which allows the enzyme orientation on the support by different region of its surface and with different structural conformation. In general, the biocatalyst prepared on this work (PFL-octyl-silica) presented a great performance on esterification and transesterification reactions, as well as good operational stability, rendering it competitive to the commercial immobilized biocatalysts. / Lipases são enzimas de grande relevância biotecnológica. Além de sua função natural (hidrólise de triglicerídeos) são capazes de catalisarem hidrólises regio e enantiosseletivas e sínteses de inúmeros ésteres. Lipase de Pseudomonas fluorescens (LPF) foi imobilizada em diferentes suportes e por diferentes métodos e aplicadas na síntese de compostos de interesse industrial. A eficiência dessas sínteses com o biocatalisador LPF-octil-sílica foi comparada com lipases imobilizadas comerciais. Os derivados de LPF-octil-sílica, LPFXAD 7HP e LPF-poliestireno foram utilizados na produção de biodiesel etílico de óleo de babaçu. O melhor rendimento (100% em 24 h) foi obtido com LPF imobilizada em octilsílica (LPF-octil-sílica). Este derivado e lipases imobilizadas comerciais (lipase de Candida antarctica, CALB IM; lipase de Thermomyces lanuginosus, LTL IM) foram utilizadas na produção de biodiesel etílico de óleo de soja apresentando rendimentos similares em 48 h de reação (80%). Na síntese de aromas, os biocatalisadores LPF-octilsílica, CALB IM, LTL IM e LPF IM (lipase de P. fluorescens imobilizada comercial) apresentaram similar desempenho (conversão acima de 90% com 24 h de reação). Conversões de aproximadamente 95% foram obtidas em 12 h de reação com os biocatalisadores LPF-octil-sílica e CALB IM, podendo ser reutilizados em oito bateladas sucessivas. CALB IM produziu oleato de frutose (55ºC, 24 h, razão molar ácido oleico:frutose de 1:2) com 96% de conversão, enquanto o derivado LPF-octil-sílica rendeu 57% de conversão (45ºC, 72 h, razão molar de 1:1). LPF imobilizada em octil-agarose e octadecil-Sepabeads apresentou um rendimento de imobilização de 99%, rendendo derivados hiperativados (150 e 300% de atividade recuperada, respectivamente). LPF em solução forma agregados bimoleculares, os quais puderam ser imobilizados em suportes glioxil (agarose e Sepabeads), rendendo derivados com 70 a 75% de atividade recuperada. A forma monomérica da enzima pôde ser imobilizada em glioxil-agarose a 25ºC, pH 10,5 (tampão bicarbonato de sódio 100 mM), entretanto, na presença de um surfactante (Triton X-100, 0,5%, v/v). Na hidrólise de (R,S)-2-hidróxi-4-fenilbutirato de etila, LPF imobilizada em octil-agarose (conformação aberta) e em glioxil-agarose (na forma de agregados bimoleculares) mostraram-se mais enantiosseletivas (E > 100) do que LPF imobilizada na forma monomérica em glioxil-agarose (E = 27,9). LPF imobilizada em octadecil-Sepabeads e glioxil-Sepabeads produziram oleato de benzila com 85% de conversão, por transesterificação de azeite de oliva e álcool benzílico em ciclohexano. Esses resultados mostram que atividade, estabilidade e enantiosseletividade são propriedades catalíticas das lipases que podem ser moduladas por imobilização em suportes ativados que permitam a orientação da enzima ao suporte por diferentes regiões de sua superfície e com diferente conformação estrutural. De modo geral, o biocatalisador preparado neste trabalho (LPF-octil-sílica) apresentou ótimo desempenho em reações de esterificação e transesterificação, bem como boa estabilidade operacional, tornando-o competitivo com os biocatalisadores imobilizados comerciais.

A enzima β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como invertase, é uma hidrolase capaz de clivar o dissacarídeo sacarose, gerando mistura equimolar de glicose e frutose (‘açúcar invertido’). A aplicação deste, bem como a dos monossacarídeos de modo isolado é bastante comum na indústria alimentícia, por exemplo na manufatura de recheios de doces, além de outras aplicações, como na indústria farmacêutica. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes suportes e métodos de imobilização de uma invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os experimentos feitos com filmes de celulose, macroesferas de quitosana, e o suporte comercial Immobead não apresentaram resultados conclusivos. A imobilização covalente unipontual da invertase em mistura de nano e agregados de nanopartículas de quitosana possibilitou a obtenção dos seguintes resultados: além desse suporte ser de fácil preparação e ativação, oferecendo grande área superficial para a imobilização, o derivado imobilizado apresentou alta recuperação da atividade, sendo utilizado o protocolo que permitiu obter 74,3 % de rendimento e 61,6 % de eficiência de imobilização. A temperatura (55 ºC) e o pH ótimos de atividade (4,5), estabilidade térmica e ao armazenamento não foram modificados pós-imobilização. A afinidade da invertase pelo substrato decaiu cerca de 3 vezes, devido à reduzida acessibilidade da sacarose ao sítio ativo da enzima. Porém, o parâmetro Vmax manteve-se constante, indicando que não houve perda na máxima conversão da sacarose em seus monossacarídeos. Através da imobilização foi possível obter excelente estabilidade operacional: 59 reusos com 100 % da atividade catalítica da enzima (bateladas de 30 min, sob suave agitação, com solução de sacarose 8 %, a 55 ºC). / The enzyme β-D- fructofuranoside fructohydrolase (E.C. 3.2.1.26), also known as invertase, is one hydrolase able to cleave the sucrose disaccharide, generating an equimolar mixture of glucose and fructose (‘invert sugar’). The application of invert sugar, as well the isolated monosaccharides is very common in the food industry, for example in the manufacture of filling of sweets, besides other applications, as in the pharmaceutical industry. The objective of this work was to evaluate different supports and immobilization methods of an invertase from Saccharomyces cerevisiae. The experiments performed with cellulose films, chitosan macrospheres and the commercial support Immobead did not present conclusive results. The unipoint covalent immobilization of invertase in a mixture of chitosan nano and aggregated nanoparticles made possible to obtain the following results: besides the easy preparation and activation of this support, offering high superficial area for enzyme immobilization, the immobilized derivative presented high activity recovery, which allowed getting 74.3 % of immobilization yield and 61.6 % of immobilization efficiency. The optimal temperature (55 ºC) and pH (4.5) for activity, thermal and storage stabilities were not modified after immobilization. The enzyme affinity for its substrate decreased about 3 folds, mainly due to the reduced accessibility of sucrose to the catalytic site of the enzyme. However the parameter Vmax remained constant, indicating that there was not loss in the maximal conversion of sucrose in its monosaccharides. Through the immobilization was possible to obtain excellent operational stability: 59 reuses with 100 % of the catalytic enzyme activity (batches of 30 min, under genlte stirring, with sucrose solution 8 %, 55 ºC).

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) faz parte da família das α-amilases e se destaca por ser a única enzima capaz de produzir ciclodextrinas (CDs). Esses oligossacarídeos cíclicos possuem a capacidade de formar complexos de inclusão com uma variedade de moléculas, alterando suas características como, por exemplo, solubilidade, volatilidade e estabilidade. Desta forma, CDs tem encontrado aplicação nas mais diversas áreas. Na indústria de alimentos, se destacam por serem potenciais estabilizantes naturais. Buscando alternativas viáveis para produção destas ciclodextrinas, neste trabalho, a enzima CGTase foi imobilizada covalentemente em esferas de quitosana e posteriormente utilizada em um reator enzimático para uso contínuo. O rendimento da imobilização foi de aproximadamente 100 %, com uma carga de 20 mg de enzima por grama de suporte seco. O processo de imobilização foi capaz de manter o comportamento da enzima frente à variação de pH e temperatura de reação, apresentando pH ótimo em 5,0 e a faixa de temperatura ótima de 70 a 95 ºC, para ambos. A estabilidade conferida ao catalisador imobilizado possibilitou sua reutilização, 61 % da sua atividade inicial foi mantida após 100 ciclos de reação. Durante utilização contínua, realizada em um reator de leito fixo, analisou-se a influência da taxa de fluxo e da concentração do substrato na geração de β-CD. A máxima produção (1,32 g / L) foi alcançada utilizando-se 4 % de amido solúvel em uma taxa de fluxo de 3 mL / min. Além disso, o biocatalisador apresentou uma ótima estabilidade operacional a 60 °C, mantendo 100 % da atividade inicial após 100 h de uso contínuo. Estes resultados demonstram que o desempenho do reator é diretamente afetado pelos parâmetros analisados e que a produção pode ser otimizada por regulação simples na velocidade de fluxo, ou pela concentração do substrato; e sugerem a possibilidade de utilizar este biocatalisador imobilizado na produção contínua de CDs. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is member of the family α-amylase and is known for being the only enzyme able to produce cyclodextrins (CDs). These cyclic oligosaccharides have the ability to form inclusion complexes with a variety of molecules, changing its characteristics, for example, solubility, volatility and stability. Therefore, CDs have found application in several fields. In the food industry stand out for being potential natural stabilizers. Seeking to alternatives for producing these cyclodextrins, in this work, the CGTase enzyme was immobilized covalently on chitosan beads and subsequently used in enzymatic reactor for continuous use. The immobilization yield was high, reaching about 100 %, representing a load of 20 mg enzyme per gram of dry support. The immobilization process was capable of maintaining the behavior of the enzyme to the variation of pH and temperature of reaction, with pH optimum at 5.0 and the optimal temperature range of 70 - 95 ° C, for both. The stability afforded to the immobilized catalyst made possible its reuse, maintaining 61 % of its initial activity after 100 cycles of reaction. During its continuous use, in a packed bed reactor, we analyzed the influence of flow rate and concentration of the substrate in the generation of β-CD. The maximum yield (1.32 g / L) was achieved using 4 % soluble starch at a flow rate of 3 mL / min. In addition, the biocatalyst showed a great operational stability at 60 ° C, maintaining 100 % of initial activity after 100 h of continuous use. These results demonstrate that the performance is directly affected by the parameters analyzed and that the production can be optimized by simple adjustment in flow rate through the reactor, or the substrate concentration used and suggests the possibility of using this biocatalyst immobilized to the continuous production of CDs.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A lipase do tipo B de Candida antarctica recombinante expressa em Pichia pastoris pela inserÃÃo de um DNA externo (LIPB) foi imobilizada em sÃlica mesoporosa nanoestruturada (SBA-15) pelo mÃtodo da adsorÃÃo (SBA-15-LIPB) e ligaÃÃo covalente (SBA-15-APTES-GA-LIPB e SBA-15-APTES-DVS-LIPB). A influÃncia do tempo de contato enzima-suporte e do pH do meio foram avaliados para a produÃÃo dos biocatalisadores. A estabilidade tÃrmica das enzimas imobilizadas foi avaliada e os resultados mostraram que o SBA-15-APTES-GA-LIPB possui maior estabilidade tÃrmica com um t1/2 = 36,91 min enquanto o derivado SBA-15-APTES-DVS-LIPB teve t1/2= 11,83 min e o SBA-15-LIPB teve t1/2= 8,5 min, a 50 ÂC. No entanto, o SBA-15-LIPB possui maior estabilidade em solventes orgÃnicos do que os biocatalisadores produzidos por ligaÃÃo covalente. Assim, o biocatalisador SBA-15-LIPB (CondiÃÃes otimizadas: 100 % de atividade recuperada em um tempo de contato de 1 hora, pH 7) foi aplicado em uma reaÃÃo modelo de esterificaÃÃo, que à a sÃntese de Ãsteres de cadeia curta, o butirato de metila e etila. Os resultados mostraram que, em condiÃÃes otimizadas de esterificaÃÃo (temperatura: 37 ᵒC, tipo de solvente: hexano para o butirato de metila e iso-octano para a sÃntese do butirato de etila, a concentraÃÃo de substrato: 0,2 M, proporÃÃo molar de substratos de 1: 1, tempo de reaÃÃo: 12 h), as conversÃes foram: 79,25% para a sÃntese de butirato de metila e 86,52% para a sÃntese de butirato de etila. O biocatalisador SBA-15-LIPB exibiu elevada atividade e estabilidade operacional na sÃntese do butirato de metila e butirato de etila, por esterificaÃÃo, depois de cinco e seis ciclos sucessivos de 12 horas cada, respectivamente. Os biocatalisadores SBA-15-APTES-GA-LIPB e SBA-15-APTES-DVS-LIPB foram aplicados em uma reaÃÃo modelo de hidrÃlise, que à a resoluÃÃo cinÃtica do acetato de feniletila. Os dados experimentais mostraram que foram obtidos resultados positivos para ambos os biocatalisadores, mas o biocatalisador SBA-15-APTES-GA-LIPB foi mais eficiente, produzindo excessos enantiomÃricos de 99 %, conversÃo de 50 % e razÃo enantiomÃrica de 1057. / A recombinant Candida antarctica lipase B expressed in Pichia pastoris by insertion of an external DNA (LIPB) was i mmobilized in nanostructured mesoporous silicas of SBA - 15 type by physical adsorption (SBA - 15 - LIPB) and covalent attachment (SBA - 15 - APTES - GA - LIPB e SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB ) . Influence of contact time enzyme - support and the medium pH were ev aluated to the production of biocatalyst s . T he thermal stability of immobilized enzymes were evaluated and the results showed that the SBA - 15 - APTES - GA - LIPB has the best thermal stability with t 1/2 = 36,91 min while the SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB has t 1/2 = 11,83 min and the SB A - 15 - LIPB has t 1/2 = 8,5 min, a t 50 ÂC . However, the SBA - 15 - LIPB has high stability in organic solvents than the biocatalysts produced by covalent attachment. Therefore, the biocatalyst SBA - 15 - LIPB (Optimized conditions: 100 % of the recovery activity an 1 hour of contact time, pH 7) was applied in a model esterification reaction in the short chain esters synthesis, the methyl and ethyl butyrate. The results showed that in optimized conditions of esterification (temperatur e: 37 ᵒ C, solvent type: hexane for the methyl butyrate and isooctane for ethyl butyrate synthesis, substrate concentration: 0,2 mol/L, molar ratio of substrates 1:1, time of reaction: 12 h) the conversions were: 79.25 % for the methyl butyrate synthesis an d 86.52 % for ethyl butyrate synthesis. The biocatalyst SBA - 15 - LIPB exhibited high activity and operational stability on the methyl and ethyl butyrate synthesis by esterification after five and six successive cycles of 12 h each, respectively. The biocatalysts SBA - 15 - APTES - GA - LIPB and SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB were applied in a model hydrolysis reaction in the kinetic resolution of the phenylethyl acetate . The experimental data showed that were obtained positive results for both biocatalysts, but t he biocatalyst SBA - 15 - APTES - GA - LIPB was more efficient, producing enantiomeric excess 99 %, conversio n 50 % and enantiomeric ratio 1057.

A enzima β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como invertase, é uma hidrolase capaz de clivar o dissacarídeo sacarose, gerando mistura equimolar de glicose e frutose (‘açúcar invertido’). A aplicação deste, bem como a dos monossacarídeos de modo isolado é bastante comum na indústria alimentícia, por exemplo na manufatura de recheios de doces, além de outras aplicações, como na indústria farmacêutica. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes suportes e métodos de imobilização de uma invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os experimentos feitos com filmes de celulose, macroesferas de quitosana, e o suporte comercial Immobead não apresentaram resultados conclusivos. A imobilização covalente unipontual da invertase em mistura de nano e agregados de nanopartículas de quitosana possibilitou a obtenção dos seguintes resultados: além desse suporte ser de fácil preparação e ativação, oferecendo grande área superficial para a imobilização, o derivado imobilizado apresentou alta recuperação da atividade, sendo utilizado o protocolo que permitiu obter 74,3 % de rendimento e 61,6 % de eficiência de imobilização. A temperatura (55 ºC) e o pH ótimos de atividade (4,5), estabilidade térmica e ao armazenamento não foram modificados pós-imobilização. A afinidade da invertase pelo substrato decaiu cerca de 3 vezes, devido à reduzida acessibilidade da sacarose ao sítio ativo da enzima. Porém, o parâmetro Vmax manteve-se constante, indicando que não houve perda na máxima conversão da sacarose em seus monossacarídeos. Através da imobilização foi possível obter excelente estabilidade operacional: 59 reusos com 100 % da atividade catalítica da enzima (bateladas de 30 min, sob suave agitação, com solução de sacarose 8 %, a 55 ºC). / The enzyme β-D- fructofuranoside fructohydrolase (E.C. 3.2.1.26), also known as invertase, is one hydrolase able to cleave the sucrose disaccharide, generating an equimolar mixture of glucose and fructose (‘invert sugar’). The application of invert sugar, as well the isolated monosaccharides is very common in the food industry, for example in the manufacture of filling of sweets, besides other applications, as in the pharmaceutical industry. The objective of this work was to evaluate different supports and immobilization methods of an invertase from Saccharomyces cerevisiae. The experiments performed with cellulose films, chitosan macrospheres and the commercial support Immobead did not present conclusive results. The unipoint covalent immobilization of invertase in a mixture of chitosan nano and aggregated nanoparticles made possible to obtain the following results: besides the easy preparation and activation of this support, offering high superficial area for enzyme immobilization, the immobilized derivative presented high activity recovery, which allowed getting 74.3 % of immobilization yield and 61.6 % of immobilization efficiency. The optimal temperature (55 ºC) and pH (4.5) for activity, thermal and storage stabilities were not modified after immobilization. The enzyme affinity for its substrate decreased about 3 folds, mainly due to the reduced accessibility of sucrose to the catalytic site of the enzyme. However the parameter Vmax remained constant, indicating that there was not loss in the maximal conversion of sucrose in its monosaccharides. Through the immobilization was possible to obtain excellent operational stability: 59 reuses with 100 % of the catalytic enzyme activity (batches of 30 min, under genlte stirring, with sucrose solution 8 %, 55 ºC).

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) faz parte da família das α-amilases e se destaca por ser a única enzima capaz de produzir ciclodextrinas (CDs). Esses oligossacarídeos cíclicos possuem a capacidade de formar complexos de inclusão com uma variedade de moléculas, alterando suas características como, por exemplo, solubilidade, volatilidade e estabilidade. Desta forma, CDs tem encontrado aplicação nas mais diversas áreas. Na indústria de alimentos, se destacam por serem potenciais estabilizantes naturais. Buscando alternativas viáveis para produção destas ciclodextrinas, neste trabalho, a enzima CGTase foi imobilizada covalentemente em esferas de quitosana e posteriormente utilizada em um reator enzimático para uso contínuo. O rendimento da imobilização foi de aproximadamente 100 %, com uma carga de 20 mg de enzima por grama de suporte seco. O processo de imobilização foi capaz de manter o comportamento da enzima frente à variação de pH e temperatura de reação, apresentando pH ótimo em 5,0 e a faixa de temperatura ótima de 70 a 95 ºC, para ambos. A estabilidade conferida ao catalisador imobilizado possibilitou sua reutilização, 61 % da sua atividade inicial foi mantida após 100 ciclos de reação. Durante utilização contínua, realizada em um reator de leito fixo, analisou-se a influência da taxa de fluxo e da concentração do substrato na geração de β-CD. A máxima produção (1,32 g / L) foi alcançada utilizando-se 4 % de amido solúvel em uma taxa de fluxo de 3 mL / min. Além disso, o biocatalisador apresentou uma ótima estabilidade operacional a 60 °C, mantendo 100 % da atividade inicial após 100 h de uso contínuo. Estes resultados demonstram que o desempenho do reator é diretamente afetado pelos parâmetros analisados e que a produção pode ser otimizada por regulação simples na velocidade de fluxo, ou pela concentração do substrato; e sugerem a possibilidade de utilizar este biocatalisador imobilizado na produção contínua de CDs. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is member of the family α-amylase and is known for being the only enzyme able to produce cyclodextrins (CDs). These cyclic oligosaccharides have the ability to form inclusion complexes with a variety of molecules, changing its characteristics, for example, solubility, volatility and stability. Therefore, CDs have found application in several fields. In the food industry stand out for being potential natural stabilizers. Seeking to alternatives for producing these cyclodextrins, in this work, the CGTase enzyme was immobilized covalently on chitosan beads and subsequently used in enzymatic reactor for continuous use. The immobilization yield was high, reaching about 100 %, representing a load of 20 mg enzyme per gram of dry support. The immobilization process was capable of maintaining the behavior of the enzyme to the variation of pH and temperature of reaction, with pH optimum at 5.0 and the optimal temperature range of 70 - 95 ° C, for both. The stability afforded to the immobilized catalyst made possible its reuse, maintaining 61 % of its initial activity after 100 cycles of reaction. During its continuous use, in a packed bed reactor, we analyzed the influence of flow rate and concentration of the substrate in the generation of β-CD. The maximum yield (1.32 g / L) was achieved using 4 % soluble starch at a flow rate of 3 mL / min. In addition, the biocatalyst showed a great operational stability at 60 ° C, maintaining 100 % of initial activity after 100 h of continuous use. These results demonstrate that the performance is directly affected by the parameters analyzed and that the production can be optimized by simple adjustment in flow rate through the reactor, or the substrate concentration used and suggests the possibility of using this biocatalyst immobilized to the continuous production of CDs.

Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, 2008. / Submitted by Caroline Silva (krol_bilhar@hotmail.com) on 2012-09-16T23:58:31Z No. of bitstreams: 1 diss2008fernandagermanoalves.pdf: 800800 bytes, checksum: 497362ef874efddd275ccc67dcdf0d1e (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-09-22T15:51:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 diss2008fernandagermanoalves.pdf: 800800 bytes, checksum: 497362ef874efddd275ccc67dcdf0d1e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-22T15:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 diss2008fernandagermanoalves.pdf: 800800 bytes, checksum: 497362ef874efddd275ccc67dcdf0d1e (MD5) Previous issue date: 2008 / A β-galactosidase é amplamente distribuída na natureza, podendo ser encontrada em plantas, órgãos de animais e microrganismos. A hidrólise da lactose via enzimática vem sendo uma alternativa para as indústrias alimentícias, visto que os açúcares resultantes deste processo, glicose e galactose, são mais solúveis e doces, o que proporciona melhorias nas características sensoriais de produtos lácteos e, desenvolvimento de alimentos com baixo teor desse carboidrato, tornando-os ideais a consumidores intolerantes a este açúcar. O aumento da demanda industrial da β-galactosidase resulta na necessidade do estudo da agitação e da aeração, visando obter um produto de elevada atividade. A utilização de enzimas na indústria alimentícia é muitas vezes limitada devido a sua baixa estabilidade. Uma das alternativas é o emprego de enzimas imobilizadas para reduzir os problemas causados pela utilização de enzimas solúveis em aplicações industriais. A presente dissertação teve por objetivo geral o estudo das condições de produção da β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 e caracterização parcial da enzima livre e imobilizada. No primeiro estudo foi avaliada a influência da agitação e da aeração na produção da enzima por fermentação submersa em fermentador Biostat B de 2 L, utilizando a técnica de planejamento experimental, através de um planejamento experimental 22 (4 ensaios e 3 pontos centrais), onde as condições estudadas foram: 200; 350; 500 rpm e 0,5; 1,0; 1,5 vvm para a agitação e a aeração, respectivamente. Neste estudo verificou-se que a agitação e a aeração, exerceram influência na produção da enzima, sendo a condição mais favorável 500 rpm e 1,5 vvm, respectivamente, atingindo uma produtividade de 1,2 U.mL-1.h-1, uma atividade enzimática de 17 U.mL-1 e uma concentração celular de 11 mg.mL-1. Em um segundo estudo foi realizada a imobilização da β-galactosidase empregando a técnica de inclusão em gel de alginato de cálcio, seguida da caracterização das enzimas livre e imobilizada, quanto ao pH e temperatura ótimos, parâmetros cinéticos e estabilidade térmica. Para o estudo da influência do pH na atividade enzimática foram testados valores de pH entre 4,6 e 8,6. A influência da temperatura na reação enzimática foi determinada pela atividade de β-galactosidase nas temperaturas de 25 a 60ºC. Os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando como substrato o-nitrofenil-b-D-galactopiranosídeo (ONPG) e lactose. A estabilidade térmica foi estudada determinando-se a constante cinética de desnaturação térmica, o tempo de meia vida e a energia de ativação da reação de desnaturação, incubando-se a enzima nas temperaturas de 30 a 45ºC. Os valores ótimo de pH e temperatura não foram alterados quando a enzima foi imobilizada, obtendo como resultados pH 6,6 e 37ºC, respectivamente, para ambas as formas enzimáticas. Os resultados dos parâmetros cinéticos, Km e Vmax, para a enzima livre foram 15,1 mM e 18,9 U.mL-1; 93,71 mM e 43,9 U.mL-1 para os substratos ONPG e lactose, respectivamente. Para a enzima na forma imobilizada os resultados para Km e Vmax foram 18,5 mM e 3,9 U.mL-1; 115,7 mM e 3,7 U.mL-1, respectivamente, utilizando ONPG e lactose. Com relação à estabilidade térmica enzimática, a equação de Arrhenius pôde ser aplicada para estabelecer uma relação entre a constante cinética de desnaturação térmica e a temperatura. Pela equação de Arrhenius determinou-se as energias da reação de ativação (9,4 e 2,1 Kcal.mol-1) e de ativação da reação de desnaturação (100 e 106 Kcal.mol-1), respectivamente, para b-galactosidase livre e imobilizada. / Production of b-galactosidase from Kluyveromyces marxianus CCT 7082 in fermenter and partial characterization of the soluble and immobilized enzyme β-galactosidase is widely distributed in nature and it can be found in plants, organs of animals and microorganisms. The enzymatic hydrolysis of lactose has been an alternative to the food industries, because the result sugars of this process, glucose and galactose, are more soluble and sweet, providing improvements in sensory characteristics of dairy products, and development of products without lactose, ideal to consumers intolerant to this sugar. The increased of the industrial demand of β-galactosidase results in the necessity to study the agitation and aeration, to obtain a product of high activity. The use of enzymes in the food industries is sometimes limited due to the low stability. One of the alternatives is the use of immobilized enzymes to reduce the problems caused by the use of soluble enzymes in industrial applications. The present dissertation had as main goal the study of the conditions of β-galactosidase production from Kluyveromyces marxianus CCT 7082 and the partial characterization of the free and immobilized enzyme. In the first study, the influence of the agitation and the aeration was evaluated in the enzyme production by submerged fermentation in Biostat B fermenter of 2 L, using experimental design 22 (4 assays with three replicates at the center point); the study conditions were: 200, 350, 500 rpm and 0.5, 1.0, 1.5 vvm for agitation and aeration, respectively. In this study the agitation and aeration, influenced in the β-galactosidase production, and the favorable condition was 500 rpm and 1.5 vvm, respectively, obtaining 1.2 U.mL-1.h-1 for productivity, 17 U.mL-1 for the enzymatic activity and a cellular concentration of 11 mg.mL-1. In a second study of β-galactosidase was immobilized employing the technique of calcium alginate gel inclusion, followed by the characterization of this enzyme, and comparison between free and immobilized enzymes, as for optimum pH and temperature, kinetic parameters and thermal stability. For the study of the influence of pH on the enzymatic activity, values of pH between 4.6 and 8.6 were tested. The influence of temperature on the enzyme reaction was determined at 25 to 60°C. The kinetic parameters were determined employing o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside (ONPG) and lactose. The thermal stability was studied in order to determinate the deactivation rate constant, the half-life and the deactivation energy, incubating the suspension enzyme at 30 to 45°C. The optimum values for pH and temperature weren’t changed by the immobilization process, obtaining as results pH 6.6 and 37°C, respectively. The results for the Km and Vmax for soluble enzyme were 15.1 mM and 18.9 U.mL-1; 93.7 mM and 43.9 U.mL-1 for ONPG and lactose, respectively; and for immobilized enzyme the results for Km and Vmax were 18.5 mM and 3.9 U.mL-1; 115.7 mM and 3.7 U.mL-1, respectively, for ONPG and lactose. In relation to the enzymatic thermal stability, the Arrhenius equation could be applied to establish a relation between deactivation rate constant and temperature. By the Arrhenius equation were determinated the activation energy (9.4 e 2.1 Kcal.mol-1) e deactivation energy (100 e 106 Kcal.mol-1), respectively, for the soluble and immobilized enzyme.

Orientador: Helia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:00:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Contesini_FabianoJares_M.pdf: 1094439 bytes, checksum: 9f9e34abfc4a94978b97e21b2b7168c1 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A isomaltulose é um dissacarídeo redutor, isômero da sacarose, com propriedades interessantes para a indústria de alimentos. Este açúcar apresenta propriedades similares às da sacarose, entretanto, apresenta baixo potencial cariogênico e baixo índice glicêmico. A isomaltulose é produzida industrialmente através da conversão enzimática da sacarose pela enzima glicosiltransferase produzida por certas linhagens de bactérias, como Protoaminobacter rubrum e Erwinia rhapontici. Este trabalho teve por objetivo purificar e caracterizar a glicosiltransferase produzida pela Erwinia sp. D12 e imobilizar a glicosiltransferase bruta em Celite e pectina de baixo teor de metoxilas (BTM). A glicosiltransferase foi purificada por cromatografia em coluna de troca catiônica SP-Sepharose Fast Flow, obtendo-se duas frações com atividade de glicosiltransferase. A enzima da fração n° 17 foi purificada cerca de 17,9 vezes, e a massa molecular foi estimada em 65 kDa, por SDS-PAGE. A glicosiltransferase bruta e as frações purificadas apresentaram atividade ótima em pH de 6,0 a 6,5 e em temperatura de 30 a 35°C e estabilidade na faixa de pH de 5,0 a 7,0 e em temperaturas inferiores a 30°C, sendo que as frações purificadas apresentaram menor estabilidade. As condições ótimas de imobilização da glicosiltransferase bruta em Celite foram pH 4,0 para adsorção da enzima no suporte, e quantidade de enzima de 1700 U. A glicosiltransferase bruta imobilizada em Celite, em processo de batelada e em coluna de leito empacotado, converteu cerca de 50% de sacarose em isomaltulose, porém a conversão diminuiu com o tempo. O tratamento da glicosiltransferase imobilizada em Celite com 0,1% de glutaraldeído não resultou em aumento da retenção e estabilidade da enzima. A glicosiltransferase imobilizada em gel de pectina BTM com adição de gordura manteve maior atividade de glicosiltransferase que as preparações de enzima imobilizada sem gordura e liofilizadas. Quando essa preparação foi aplicada em processo de batelada foi observada conversão inicial em torno de 30% com queda gradativa nas posteriores bateladas. Em colunas de leito empacotado foi observada conversão de sacarose em isomaltulose máxima de 10,5% em 2 horas, sendo que após 60 horas foi igual a 3% / Abstract: Isomaltulose is a reducing disaccharide and an isomer of sucrose. Because of its properties it is interesting for application in the food industry. This sugar shows similar properties to sucrose, but it has low cariogenic potential and low glycemic index. Industrially, isomaltulose is produced by conversion of sucrose using glucosyltransferase. This enzyme is produced by few bacterial strains such as Protoaminobacter rubrum and Erwinia rhapontici. The aims of this research were the purification and characterization of glucosyltransferase produced by Erwinia sp. D12 and the immobilization of the crude enzyme in Celite and low-metoxyl pectin. The glucosyltransferase was purified using cationic exchange column of SPSepharose Fast Flow and it was obtained two fractions with glucosyltransferase activity. The enzyme found in 17th fraction was purified 17.9-fold, and showed a molecular mass of 65 kDa, by SDS-PAGE. The crude glucosyltransferase and the purified fractions showed optimum activity in pH of 6.0 ¿ 6.5 and 30 ¿ 35°C and stability in pH 5.0 to 7.0 and under 30°C, and the purified preparation was less stable than the crude enzyme. The optimum condition of the immobilization of crude glucosyltransferase was using pH 4.0 for the adsorption of the enzyme into the support, and amount of enzyme of 1700 U. The glucosyltransferase immobilized on Celite was applied to the conversion of sucrose into isomaltulose in a batch system and packed-bed reactor. A conversion rate of 50% was observed, but this decreased over a period of hours. The treatment of the immobilized glucosyltransferase on Celite, with 0.1% glutharaldehyde did not increase the stability of the enzyme. The immobilization of crude glucosyltransferase in lowmetoxyl pectin with a fat addition, presented a higher activity when compared to microcapsules without fat or freeze dried. When this preparation was applied to the conversion of sucrose into isomaltulose, in a batch system, it was observed an initial conversion rate of 30%. However this value decreased in further batches. In the packed-bed reactors, the highest conversion value of sucrose to isomaltulose was 10.5% in 2 hours, but after 60 hours the conversion was 3% / Mestrado / Bioquimica de Alimentos / Mestre em Engenharia de Alimentos

Esta tese aborda quatro tópicos fundamentais para o desenvolvimento e aplicação de membranas eletroativas nanoestruturadas (MENs): (i) síntese e caracterização de nanopartículas (Nps) de prata, ouro e platina encapsuladas em moléculas de dendrímero poliamidoamina geração 4 (PAMAM); (ii) preparação de filmes automontados contendo PAMAM e Nps de ouro (PAMAM-Au); (iii) preparação de MENs utilizando sistema core-shell PAMAM-Au@Me, onde Me é um mediador redox; (iv) imobilização enzimática em MENs e estudos biocatalíticos associados a processos eletroquímicos. As Nps foram caracterizadas observando-se a banda plasmônica em espectros na região do UV-Vis. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão revelaram que PAMAM-Au e PAMAM-Pt possuem morfologias esféricas, enquanto o PAMAM-Ag forma grandes cristais com estruturas fractais. Estruturas cúbicas de face centrada caracterizaram os cristais formados de Au e Pt, sendo possível estimar os diâmetros (3,0 nm) das Nps pela equação de Scherrer em difratogramas de raios X, confirmados posteriormente por microscopia eletrônica por transmissão (TEM). Um indício de estabilização por encapsulamento do híbrido PAMAM-Au foi obtido de espectros de infravermelho (FTIR), a partir de modificações nas bandas das amidas. A cinética de reação para formação de PAMAM-Au também foi estudada. Filmes de PVS/PAMAM-Au (onde PVS é o poli(ácidovinilssulfônico)) foram preparados com 5 minutos de imersão, com a mesma quantidade de material sendo adsorvida em cada camada, segundo medidas de espectroscopia UV-Vis e voltametria cíclica (CV). No caso do eletrodo ITO-(PVS/PAMAM-Au), saltos de elétrons foram considerados o mecanismo de transporte de carga ao longo do filme. Um novo sistema core-shell Au@PB foi preparado, formando um sistema ITO-(PVS/PAMAM-Au)6@PB, em que a eletrodeposição de PB (azul da Prússia) foi monitorada medindo-se as correntes faradaicas durante os ciclos potenciodinâmicos. Outros mediadores de hexacianoferratos de metais de transição (Fe, Ni, Co e Cu) foram obtidos sobre eletrodos de ITO-(PVS/PAMAM-Au). De resultados de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS), verificou-se que a resistência de transporte de carga decresce na sequência CuHCF > FeHCF > NiHCF > CoHCF e todos os eletrodos apresentaram atividade catalítica para o peróxido de hidrogênio. Uma nova configuração de eletrodo, ITO-(PVS/PAMAM-Au)3@CoHCF-GOx, pôde ser aplicada como dispositivo enzimático, com a glicose oxidase (GOx) sendo imobilizada por drop-coating na superfície do eletrodo e aplicada em experimentos de biocatálise. A glicose pôde ser detectada a 0,0 V (Ag/AgCl), com resposta linear até 100 µmol L-1 de glicose, sensibilidade de 115 nA mmol L-1, limite de detecção de 5,5 µmol L-1 e KMapp de 0,24 mmol L-1, mostrando que o sistema aqui proposto cria um ambiente propício para a enzima operar com alta atividade catalítica. / This thesis addresses four fundamental topics for producing and applying electroactive nanostructured membranes (ENMs): (i) synthesis of Au, Pt and Ag nanoparticles (Nps) using polyamidoamine (PAMAM generation 4) dendrimers as template/stabilizers; (ii) fabrication of layer-by-layer (LbL) films comprising PAMAM with AuNps (PAMAM-Au) and poly(vinylsulfonic acid) (PVS); (iii) preparation of a new core-shell system with Prussian blue (PB) around the Au nanoparticles (PAMAM-Au@PB); (iv) enzyme immobilization on ENMs and bioelectrochemistry studies. The formation of the Nps inside PAMAM was monitored by measuring the plasmonic band of NPs via UV-Vis spectroscopy. Images from transmission electron microscopy (TEM) showed well-organized Au and Pt spherical particles, with average diameter of 3 nm and narrow size distribution. In addition, X-ray diffraction of Nps enabled easy identification of the Nps atomic planes (face-centered cubic arrangements). However, PAMAMAg growth showed fractals structures. In order to confirm Au NPs encapsulation inside the PAMAM dendrimer, FTIR spectra in the transmission mode for neat PAMAM and PAMAM-Au were compared. The kinetics of formation of PAMAM-Au was studied by UV-Vis spectroscopy. The deposition of individual PAMAM-Au layers was examined in detail: the adsorption kinetics was determined by CV to be first-order and that 5 min of adsorption was sufficient for maximum coverage. Formation of PVS/PAMAM-Au multilayers showed a linear increase in anodic and cathodic peak currents, indicating that the same amount of material was adsorbed in each deposition step. Electron-hopping was inferred as the charge transport mechanism between PAMAM-Au layers. Using hexacyanoferrate (III) to probe the electrochemical reaction at the electrode surface, the charge transport in the PAMAM-Au layers was shown to be faster than for non-modified electrodes. A new system based on PAMAM-Au@PB was prepared by simple potential cycling electrodeposition after ITO-PVS/PAMAM-Au LbL film preparation. New systems are described based on ENM membranes of ITOPVS/ PAMAM-Au LbL electrodes, with a redox mediator (Me) electrodeposited around Au nanoparticles. The resulting ITO-PVS/PAMAM-Au@Me system was then characterised electrochemically using cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. We demonstrated that the concept of ENM can be generalized to a wider variety of redox mediators. All electrodes modified with hexacyanoferrates showed electrocatalytic activity towards hydrogen peroxide, which is promising for the preparation of nanodevices requiring redox mediators. An electrochemical enzyme device with glucose oxidase (GOx) immobilized at ITO-(PVS/PAMAM-Au)3@CoHCF ENM was developed. Using CoHCF as redox mediator, hydrogen peroxide (the enzymatic reaction product) was determined at 0.0 V (vs. SCE), with linear range up to 100 Zmol L-1 of glucose, sensitivity of 115 nA mmol L-1, detection limit of 5.5 Zmol L-1 and KM app of 0.24 mmol L-1. Such a performance indicates that this system promotes a friendly environment for enzyme immobilization.