Made available in DSpace on 2014-12-05T18:38:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) luisa_miranda_ipec_dout_2013.pdf: 2382714 bytes, checksum: d55b4e803e3fb5de09cd228382c4aa44 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A ocorrência de formas graves de esporotricose felina, aliada a lesões sem granulomas e ricas em estruturas leveduriformes, evidencia a suscetibilidade destes animais para a doença e enfatiza a importância do estudo da sua patogenia. O objetivo deste estudo foi descrever o processo inflamatório e a carga fúngica das lesões em diferentes apresentações clínicas, e sua relação com o perfil de leucócitos no sangue periférico de gatos com esporotricose por meio da técnica de citometria de fluxo (CF) e com a infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV) e/ou pelo Vírus da Leucemia Felina (FeLV). Gatos com lesões cutâneas com isolamento de Sporothrix sp. foram incluídos no estudo, separados nos grupos L1, L2 e L3 (lesões em um, dois e três ou mais locais, respectivamente) e submetidos a coleta de sangue e de fragmentos de lesão. O estado geral dos animais foi classificado como bom, regular ou ruim. Ao exame histopatológico, as lesões foram agrupadas de acordo com o processo inflamatório (granulomatoso ou inespecífico), grau de ativação de fagócitos predominantes nos granulomas (macrófagos ou células epitelióides), organização do granuloma (bem formado ou mal formado) e intensidade dos tipos celulares no infiltrado A carga fúngica foi verificada pelas técnicas de impregnação pela prata de Grocott (IPG) e imuno-histoquímica (IHQ). A CF foi aplicada no sangue periférico, utilizando anticorpos monoclonais para os marcadores CD4, CD8, CD21, CD14 e granulócitos. Cento e um animais foram incluídos no estudo: 20 do grupo L1, 22 do grupo L2 e 59 do grupo L3. O processo inflamatório granulomatoso supurativo (PIGS) foi observado em 99 casos. A maioria das lesões, sobretudo no grupo L3, apresentavam granulomas mal formados (pvalor= 0,032) e com predomínio de macrófagos (p-valor=0,010). A IPG e a IHQ evidenciaram estruturas leveduriformes (EL) em 94 casos cada uma, sendo a concordância entre as duas observada em 92 casos. As duas técnicas associadas apresentaram sensibilidade de 98,0%. A carga fúngica de mais de 400 EL/ campo (400x) ocorreu em 48,5% dos casos com PIGS e foi predominante nos animais do grupo L3. Houve correlação entre granulomas mal formados e com predomínio de macrófagos e a carga fúngica superior a 100 EL/ campo (p-valor<0,01). A CF foi realizada em 33 casos de esporotricose e cinco animais não infectados (Grupo controle). O percentual de linfócitos T CD8+ foi maior nos animais dos grupos L2 e L3 (p-valor=0,01) O maior percentual de células CD4+ esteve associado ao grupo L1 e ao estado geral bom (pvalor= 0,04 e 0,03, respectivamente). A expressão CD8low ocorreu em 20 animais com esporotricose, sendo predominante no grupo L3 (p-valor=0,01), e não ocorreu no grupo controle. Esta expressão foi associada a granulomas com predomínio de macrófagos (p-valor=0,01) e ocorreu em 76,2% dos casos com carga fúngica acima de 100 EL/campo. Três animais foram positivos para FIV, quatorze para FeLV e dois para os dois testes. Não houve correlação entre estes testes e os demais achados. Estes resultados sugerem associação entre a resposta bem organizada, menor carga fúngica e aumento de linfócitos CD4+ com o controle da doença, manutenção do estado geral bom e lesões localizadas. No estado geral ruim, as lesões disseminadas e alta carga fúngica estavam relacionadas a existência de um padrão de resposta com aumento de células CD8+ e aumento da expressão de CD8low / The occurrence of severe forms of feline sporotrichosis, along with lesions without granulomas and rich in yeast-like forms, demonstrate the su sceptibility of these anim als to the disease and emphasizes the importance of the study of its pathogenesis. The aim of this study was to describe the inflammatory changes and fungal load at different clinical presentations and its relationship with the profile of leukocytes in peripheral blood of cats with sporotrichosis by means of flow cytometry (FC) technique and with Feline Immunodeficiency Virus (FIV) and / or Feline Leukemia Virus (FeLV). Cats presenting cutaneous lesions with isolation of Sporothrix sp. in culture were included. They were separated in groups L1, L2 and L3 (lesions in one, two and three or more sites, respectively) and were subjected to blood sample collection and to biopsy of the lesion. The general condition of the animal s was classified as good, fair or poor. Histologically, the lesions were described according to the inflammatory process (granulomatous or nonspecific), degree of activation of predominant phagocytes within the granulomas (macrophages or epithelioid cells), granulomas organization (well-formed or poorly formed) and intensity of cell types within the inflammation. The fungal lo ad was assessed by Grocott silver stain (GSS) technique and immunohistochemistry (IHC). The FC was applied to peripheral blood by means of monoclonal antibodies to target CD4, CD8, CD21, CD14 and granulocytes. One hundred and one animals were included: 20 in group L1, 22 in group L2 and 59 in group L3. Histologically, 99 lesions showed suppurative granulomatous inflammation (SGI). Most lesions, specially in the group L3, showed poorly formed granulomas (p-value=0.032) and predominantly macrophages (p-value=0.010). The GSS and IHC s howed yeast-like forms (YF) in 94 cases each one and their concordance was noted in 92 cases. Together, the two techniques showed sensivity of 98.0%. The fungal load of more than 400 YF/Field (400x) occurred in 48,5% of cases by GSS and was predominant in group L3. There was a correlation between poorly formed granulomas with macrophages predominance and the fungal load exceeding 100 YF/Field (p-value<0.01). The CF was performed in 33 cases of sporotrichosis and five uninfected cats (control group). The percentage of CD8 + T cells was greater in the groups L2 and L3 (p-value=0.001). The higher percentage of CD4 + T cells was correlated to group L1 and to good general condition (p- value=0.04 and 0.03, respectively). The reduced expression of the CD8 molecule (CD8low) occurred in 20 animals with sporotrichosis, being predominat in group L3 (p-value=0.01), and was not observed in control group. This expression was associated with granulomas with macrophage predominance (p-value=0.01) and occurred in 76.2% of cases with fungal load above 100 YF/field. Three animals were positive to FIV, four teen to FeLV and two to both tests. There was no correlation between these tests and the other findings. These results suggest an association of the well-organized response, the lower fungal load and increased CD4 + T lymphocytes with the control of the disease, al ong with the good general condition and localized lesions. At the poor general condition, the dissem inated lesions and high fungal load were related to a response patter n with and increase of CD8 + T lymphocytes and particulary of the CD8 low expression.

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:38:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcelle_franca_ioc_mest_2013.pdf: 5494780 bytes, checksum: 4d7051abc8e04e319d508a17bae990c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As áreas de distribuição geográfica do plasmódio e de parasitos intestinais se sobrepõem tornando a coinfecção malária-parasitoses intestinais comum nas regiões tropicais do planeta. A resposta imune contra o plasmódio é caracterizada por um perfil Th1 e por produção de anticorpos contra os estágios eritrocíticos, sendo os anticorpos citofílicos IgG1 e IgG3 relacionados com a imunidade protetora. As infecções por helmintos induzem forte resposta Th2 e imunorreguladora que podem inibir a resposta Th1 da malária, com possíveis consequências na clínica da doença. Dessa forma o objetivo do trabalho foi avaliar possíveis alterações nos parâmetros epidemiológicos e hematológicos, nos níveis de citocinas e na resposta imune humoral contra os antígenos candidatos vacinais de Plasmodium vivax AMA-1, MSP-1 e CVC nos indivíduos coinfectados com malária e parasitoses intestinais e nos indivíduos com apenas uma das infecções. O sangue dos 280 voluntários residentes na cidade de Porto Velho, Rondônia, foi coletado para a realização do exame parasitológico, do hemograma completo e para obtenção do plasma utilizado na quantificação de anticorpos IgG total, das subclasses de IgG e dos níveis de 6 citocinas e 3 quimiocinas. Também foi coletada uma amostra de fezes para a detecção de parasitos intestinais. Os quatro grupos formados Malária (M), Parasitoses Intestinais (PI), Coinfectado (CI) e Exposto (E) não apresentaram diferenças quanto aos parâmetros epidemiológicos. A concentração de hemoglobina assim como a frequência de indivíduos anêmicos também não foram diferentes entre os grupos M e CI. A população total apresentou prevalência de resposta de IgG de 62,9%, 65,7% e 68,6% contra respectivamente AMA-1, MSP-1 e CVC. A frequência de resposta de IgG total contra MSP-1 foi maior no grupo M que no grupo CI enquanto a frequência de resposta e o índice de reatividade (IR) de IgG total e o IR de IgG1 anti-MSP-1 foram menores no grupo PI quando comparados ao grupo E. Com relação aos anticorpos anti-AMA-1 observou-se que o IR de IgG1 foi menor e a frequência de resposta e os IRs de IgG2 e IgG4 foram maiores entre PI e E. O nível de IFN-\03B3 foi maior no grupo CI que em M enquanto IFN-\03B3, IL-4, IL-10, IL-8, MCP-1 e MIP-1\03B2 foram maiores no grupo PI quando comparado ao grupo E. IL-10 correlacionou-se significativamente com os IRs dos anticorpos contra as três proteínas estudadas. Dessa forma nossos dados sugerem que a coinfecção com parasitoses intestinais parece não estar interferindo na resposta imune humoral a antígenos candidatos a uma vacina antimalárica / The geographic distribution of the overlapped over the world, the common in tropical regions of the planet. The immun e response against is characterized by a Th1 profile and also antibodi es production against erythrocytic stages, which IgG1 and IgG3 cytophilic antibodies a re related to protective immunity. On the other hand, Helminth infections induce a str ong immunoregulatory and Th2 response that can inhibit the inflammatory response against malaria, fetching possible consequences for clinical disease. Thus th e aim of our study was to evaluate the occurre nce of parameters, level of cytokines and the humoral immu ne response against three Plasmodium vivax antigens (AMA malaria and intestinal parasites and in i 280 volunteers living in the city of Porto Velho, R ondônia examination, automated blood cell count and to obta in the plasma used in the quantification of antibodies and cytokine an also collected for detection of intestinal parasite s was also collected. The four groups formed Malaria (M) Intestinal Parasites (PI), Coinfected ( CI) and Exposed (E) showed no differences in the epidemiological param concentrations, as well as the frequency of anemic patients, were not different between groups M e CI . The total population showed a prevalence of IgG r esponse of 62.9%, 65.7% and 68.6% respectively against AMA f requency response of total IgG against MSP CI while the frequency response and reactivity index ( RI) of total IgG and IgG1 anti IR-MSP- 1 were lower in we observed that the IR IgG1 was lower and the frequency respon se and the IRs of IgG2 and IgG4 were higher between group M as CI IFN- γ , IL compared to the group E against three proteins studied. Thus our data sugge st that co parasites presented low interference in the vaccine candidates.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:06:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 edson_oliveira_ioc_dout_2014.pdf: 7681363 bytes, checksum: d1541a9340bac4e63312fb02768ab622 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A dengue é considerada uma grande ameaça em um vasto território mundial que resulta em cerca de 20 mil mortes ao ano. Modelos animais para o estudo da dengue constituem uma ferramenta importante não somente para o desenvolvimento de estratégias anti-dengue como vacinas e antivirais, mas também para o estudo da resposta imune induzida após a infecção. Uma abordagem amplamente utilizada para testes de candidatos vacinais é o uso de camundongos BALB/c infectados por via intracerebral (i.c.) com um vírus DENV neuroadaptado. Como este modelo envolve um desafio letal, inúmeros trabalhos fizeram uso apenas deste parâmetro para avaliar a eficácia de vacinas anti-dengue. Sendo assim, pouco se sabe a respeito da dinâmica da resposta imune primária em animais infectados pela via intracerebral, bem como os mecanismos pelos quais uma vacina pode exercer proteção contra a infecção sob tais condições. Neste contexto, o presente estudo objetivou analizar a resposta imune anti-dengue no modelo BALB/c infectado por via i.c. com o vírus DENV neuroadaptado, investigando a participação de subpopulações celulares na imunidade primária e também durante a imunidade adaptativa induzida por vacinas de DNA. Com relação à resposta imune primária, observamos que apesar da via de inoculação não natural empregada, foi possível observar efeitos periféricos decorrentes da infecção com DENV2, como ativação e migração de células T para órgãos alvo, bem como produção de anticorpos e citocinas Com relação à resposta imune adaptativa aos antígenos do DENV, detectamos que vacinas de DNA que codificam as proteínas NS1, NS3 ou E de DENV2 produzem efeitos peculiares quanto à ativação de células T. Vimos que os antígenos E e NS3, principalmente NS3, induzem ativação de células T mais acentuada do que o antígeno NS1, segundo a expressão reduzida de CD45RB na superfície destas células. Experimentos de transferência de células T utilizando CFSE como sonda mostraram que após o desafio com DENV, animais protegidos pela vacinação com pcTPANS1 apresentaram ativação marcante de células T com proliferação e migração destas células para diversos locais no hospedeiro, incluindo tecido hepático e cerebral. Durante a resposta imune adaptativa ao antígeno NS1, foram encontrados alguns possíveis correlatos de proteção, como por exemplo, os fenótipos TCD4+CD44hi e TCD8+CD44hiCD69- presentes no baço. Além disso, uma população celular de alta granulosidade B220hiCD19+CD11clow presente no sangue de camundongos BALB/c após o desafio com DENV parece estar relacionada a uma melhor condição clínica destes animais. Em conclusão, este estudo contribuiu para a compreensão da dinâmica da resposta imune em animais infectados pela via i.c. Além disso, o estudo forneceu novos insights na compreensão dos mecanismos envolvidos na proteção induzida por vacinas de DNA anti-dengue / Dengue is considered a major threat worldwide that results in approximately 20000 deaths every year. Animal models for dengue disease represent an important tool not only to delelop anti-dengue strategies, such as vaccines and antivirals, but also to investigate the immune response incuced during the infection. A commonly used appoach to evaluate vaccine candidates is the BALB/c mouse model infected with a neuroadapted DENV by the intracerebral (i.c.) route. Since the animals succumb to the infection in this model, many groups consider only the survival as the endpoint in the evaluation of anti-dengue vaccine efficacy. Therefore, little is known about the primary immune response dynamics of these animals infected by the i.c. route, as well as the mechanisms through which the vaccine may protect the host under such conditions. In this context, the present study aimed to analyse the primary immune response against DENV in the BALB/c mouse model, investigating the role of cellular subpopulations in the primary immunity and also during the adaptative immunity induced by DNA vaccines. Concerning the primary immune response, eventhough the inoculation route applied was not natural, peripheral effects caused by DENV infection, like T cell activation and migration to target organs, as well as the production of antibodies and cytokines were observed. With respect to the adaptive immune response to DENV antigens, DNA vaccines that encode the NS1, NS3 or E DENV proteins produced peculiar effects once considering the activation of T cells. We found that E and NS3 antigens, mainly NS3, induced more pronounced T cell activation in comparison to NS1 protein, as measured by the surface membrane expression of CD45RB. Transference experiments of T cells obtained from vaccinated animals and traced by CFSE showed evident T lymphocytes activation, proliferation and migration to different sites in the host, including hepatic and brain tissue, after DENV challenge. During the adaptive immune response to NS1 antigen we found possible cell-fenotypes related to protection, such as TCD4+CD44hi and TCD8+CD44hiCD69- detected in the spleen. Besides, a cell population B220hiCD19+CD11clow, showing high granulosity, detected in blood samples after DENV challenge seemed also to be related with a better clinical condition of these animals. In conclusion, this study contributed for the elucidation of the immune response dynamics in animals infected with DENV by the i.c. route. Moreover, this work provided new insights in the comprehension of the mechanisms involved in the protection induced by anti-dengue DNA vaccines. / 2017-10-16

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_araujo_ioc_dout_2015.pdf: 20521804 bytes, checksum: 9bd69ef7ed9c8b76f26b4b256fcd58cb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Apesar de tratáveis e curáveis, o diagnóstico das infecções ativa (aTB) ou latente (LTBI) por M. tuberculosis permanece desafiador, impactando diretamente o controle da tuberculose. Portanto, a apresentação de indicativos clínico-epidemiológicos é de grande importância na detecção da aTB na rotina clínica. Os LTBI são assintomáticos, sendo majoritariamente diagnosticados pela resposta imune a antígenos (Ags) micobacterianos, seja pelo teste cutâneo à tuberculina (TCT), ou pelos ensaios de liberação de interferon-gama (IGRA) baseados nos Ags da região de diferença 1 (RD1) ESAT6:CFP10. Contudo, a pequena diminuição nas taxas de novos casos de TB sugere que estes testes devem ser aprimorados. Assim, propomos, i) a avaliação de novos marcadores antigênicos, via IGRA de curta (WBA) e longa (LSA) estimulação, utilizando combinação de Ags constituintes da parede celular (ESAT6:CF10 e PstS1/CFP10), Ags associados a fase de latência (LAA) (Rv2029c, Rv2031c, Rv2034, Rv2628 e Rv3353c), bem como a nova proteína fusionada PStS1(285- 374):CFP10; ii) a investigação de biomarcadores transcriptômicos ex vivo, via amplificação de genes-alvo (qRT-PCR multiplex) ou de sequenciamento de RNA (RNAseq). Para isto, foram coletadas amostras de sangue periférico provenientes de uma coorte prospectiva de contatos recentes (rCt) e pacientes com a TB pulmonar O antígeno PstS-1(285-374):CFP10 apresentou-se mais seletivo que o tradicional ESAT6:CFP10 para os rCt com TCTpositivo (WBA = 42,9% vs 30,2%; LSA = 44,4% vs 41,3%). Em estudos longitudinais, a nova quimera foi capaz de detectar todos os casos incidentes em ambos os ensaios utilizados e de apresentar maior taxa de regressão pósquimioprofilaxia (WBA = 62,5% vs 37,5%; LSA = 77,8% vs 50%). Nenhum participante apresentou resposta exclusivamente aos Ags íntegros PstS1/CFP10. Dos LAA ensaiados, a combinatória dos Ags Rv2029c, Rv2031c e Rv2034 se destacou na detecção de respondedores ao IGRA-RD1 (93.5%). Frequência baixa de respondedores nos grupos controle (5,9%) e aTB (28,6%) foi observada para os LAA isoladamente, com aumento de detecção na combinatória (11,8% e 71,4%, respectivamente). Via amplificação multiplex de 170 alvos gênicos, os genes IFI35, PLAUR, IFIT2, LRG1, DOK2, IFITM1 e KIF22 apresentaram modulação diferencial na aTB, mas, baixo potencial de discriminação entre os rCt (Controles ou LTBI. No grupo rCt-LTBI não houve modulação diferencial para estes genes. Via RNAseq, 56 ou 98 transcritos foram identificados estarem diferencialmente expressos na infecção latente ou ativa, respectivamente, mas mantendo-se especificidade >89%, apenas o gene KRT1 ofereceu sensibilidade de 81,3% na detecção de LTBI. Altamente promissor foi a expressão diferencial dos genes DOCK9, EPHA4 e NPC2, conferindo excelente sensibilidade para pacientes com aTB (100%), ou para indivíduos sadios com alto risco de progressão para aTB. Os potenciais marcadores/biomarcadores, com perfis de resposta celular ou por transcrição gênica gerados neste estudo, fornecem possibilidades de desenvolvimento de ferramentas diagnósticas para LTBI e a TB pulmonar / Despite treatable and curable, the diagnosis methods for active (aTB) or latent (LTBI) M. tuberculosis infection remains challenging, directly affecting tuberculosis control. At clinical routine, the detection of aTB commonly relies on the presentation of clinicalepidemiological indicatives. The LTBI subjects are asymptomatic, being principally diagnosed by the elicited immune response to mycobacterial antigens (Ags), either by tuberculin skin test (TST) or, by interferon-gamma release assays (IGRA) using as stimuli Ags ESAT6 and CFP10, both present in the region of difference 1 (RD1). However, the small decrease in worldwide aTB incident cases suggests that nowadays tests for LTBI detection lack in accuracy and should be improved. Therefore, we propose the: i) evaluation of new antigenic markers, via IGRA short- (WBA) and long- term (LSA) stimulation using combination of mycobacterial cell wall antigens (ESAT6: CF10 and PstS1 / CFP10), latency-associated Ags (LAA: Rv2029c, Rv2031c, Rv2034, Rv2628 and Rv3353c) and the new fused-protein PStS1(285-374):CFP10; ii) investigation of ex vivo transcriptomic biomarkers, via target genes amplification (qRT-PCR multiplex) or RNA sequencing (RNAseq). Therefore, peripheral blood samples were collected from a prospective cohort of recent close contacts (rCt) and patients with pulmonary aTB. Stimulation with the Ag PstS-1(285-374):CFP10 was more selective than the traditional ESAT6:CFP10 at rCt-TCTpositive detection (WBA = 42.9% vs 30.2%; LSA = 44.4% vs 41, 3%). In longitudinal analysis, the new chimera was able to detect all incident cases by both tests and showed higher post-chemoprophylaxis regression rates than the RD1 Ags (WBA = 62.5% vs 37.5%; 77.8% vs LSA = 50%). No participant showed exclusive response to PstS1/CFP10 Ags. By combining the LAA Ags Rv2029c, Rv2031c and Rv2034, 93.5% of rCt-IGRA-RD1 responders were detected. While, the frequency of LAA-responders was low at control (5.9%) and aTB (28.6%) groups for the single LAA, or via Ags combination 11,8% e 71,4% , respectively. Via multiplex amplification of 170 target- genes the IFI35, PLAUR, IFIT2, LRG1, DOK2, IFITM1 and KIF22 demonstrated differential modulation at aTB, but low accuracy, showing areas under the curve ( AUC) between 0.67 and 0.73. However, no significant differential modulation was observed at LTBI group. Via RNAseq, 56 or 98 transcripts were found to be differentially expressed at latent or active infection, respectively. Keeping specificity >89%, only KRT1 gene distinguished the LTBI from aTB (sensitivity=81.3%), however, the DOCK9, EPHA4 and NPC2 genes were differentially expressed, providing excellent sensitivity for aTB (100%), or health subjects with a higher risk of progression (LTBI  aTB). The potential of new markers/biomarkers, via cellular response or gene transcription profile this study provide tools for the further development of new LTBI and pulmonary aTB diagnostic tests. / 2100-04-25

Dentre os microrganismos que a compõem a microbiota intestinal, sobressai Escherichia coli, que possui como principal nicho ecológico o intestino grosso de humanos. Sua importância destaca-se em fazer parte dos microrganismos comensais pioneiros na colonização da mucosa intestinal e também o seu papel patogênico causando doenças intra e extra intestinais. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta imune contra antígenos totais de Escherichia coli. Os resultados desse estudo podem servir como subsídio para o entendimento da resposta imune sistêmica a um microrganismo presente na mucosa. Os antígenos totais de E. coli foram obtidos após lise com solução de guanidina a 8M. Realizou-se a diálise e a dosagem de proteínas. Foi realizado a caracterização eletroforética em gel de poliacrilamida e perfil antigênico por Western Blotting. Avaliou-se a presença de anticorpos IgG total e IgA sérica específicos em 30 soros de humanos e também a resposta de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) através da metabolização de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a suspenção de antígenos obtida era composta por várias proteínas e o teste de Western Blotting revelou que estas foram reconhecidas por anticorpos presentes nos soros de humanos. Foi possível detectar a presença de anticorpos IgG total e IgA sérica contra os antígenos de E. coli por ELISA. No ensaio de viabilidade e proliferação celular pelo MTT, observou-se que houve proliferação celular em diferentes concentrações do antígeno e a viabilidade não foi inferior a 70%. Os resultados sugerem que os antígenos oriundos de E. coli podem induzir respostas imunes locais e sistêmicas. / Among the microorganisms that make it up the intestinal microbiota, stands out Escherichia coli, which has as main ecological niche, the large human intestine. Its importance stands out in being part of the pioneers commensal microorganisms on the colonization of the intestinal mucosa also his pathogenic role causing extra intra and intestinal diseases. The objective of this study was to evaluate the immune response against total antigens of Escherichia coli. The results of this study could aid to understanding systemic immune response to a commensal microorganism that lives in the mucosa. Total E. coli antigens were obtained after lysis with 8M guanidine solution. After dialysis, protein assay was carried out. It was performed electrophoretic characterization of the antigens using polyacrylamide gel electrophoresis and the antigenic profile by Western blotting. We evaluated the presence of total IgG and IgA specific antibodies in 30 human sera. It also assessed the human response of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) by MTT metabolization. The results obtained demonstrated that the antigens were composed of various proteins and Western Blotting showed that antigen proteins were recognized by antibodies present in human serum. It was possible to detect the presence of total IgG and IgA antibodies against E. coli antigens by ELISA. In viability assay evaluated by the MTT metabolization by PBMC, it found that cell proliferation occurred at different antigen concentrations, and viability was not less than 70 %. The results suggest that the antigens from E. coli can induce local and systemic responses. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T10:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 288452.pdf: 18421548 bytes, checksum: 1fce1ff2624a6da0c4283042fc679586 (MD5) / AIDS é um dos principais problemas de saúde pública atuais e acredita-se que a epidemia somente será controlada com uma vacina capaz de impedir ou controlar a infecção causada pelo HIV. Inúmeras estratégias vacinais têm sido investigadas experimentalmente, dentre elas o uso de vírus recombinantes como vetores vacinais, para indução de resposta imune no trato genital, uma das mais importantes portas de entrada do HIV. Neste estudo avaliou-se a indução de células T no trato genital feminino de camundongos BALB/c mediante a administração de vetores adenovirais expressando a proteína Gag de HIV-1. Diferentes protocolos de imunização utilizando vetores adenovirais símios foram avaliados quanto à indução de resposta imune celular Gag-específica em tecidos sistêmicos e de mucosas. A imunização por via intranasal induziu baixa frequência de células T CD8+ Gag-específicas no trato genital e em tecidos sistêmicos. A imunização por via intramuscular foi capaz de induzir frequência de células T CD8+ Gag-específicas de maior magnitude do que a administração por vias de mucosa, sendo esta resposta detectada em diversos tecidos, inclusive no trato genital feminino, por ao menos um ano após a administração da vacina. As células T CD8+ Gag-específicas de origem genital apresentaram elevada expressão de diversos marcadores de ativação celular e secretaram IFN- . A administração intramuscular do vetor adenoviral alterou também a frequência e o fenótipo de células T CD4+ e CD8+ de origem genital. Foi observado que apesar de anticorpos neutralizantes representarem a principal forma de interferência da imunidade pré-existente ao vetor vacinal na indução de células transgene-específicas em tecidos sistêmicos e sangue, no tecido mucoso esta situação é provavelmente também mediada por mecanismos celulares. Em conjunto, estes resultados sugerem que a administração intramuscular de vetores adenovirais símios expressando a proteína Gag de HIV-1 induz resposta imune celular transgene-específica capaz de residir no trato genital feminino por longos períodos, sendo que esta resposta pode ser alterada pela presença de imunidade pré-existente contra o vetor vacinal.

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 debora_mattos_ioc_mest_2014.pdf: 25027935 bytes, checksum: 36794f8df745a06c2879690ef1660179 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A susceptibilidade de Rhodnius prolixus ao T. rangeli depende da cepa do parasita e das interações moleculares no intestino e na hemocele do vetor. T. rangeli pode modular a resposta imune do vetor, preparando o hospedeiro à invasão e a sobrevivência dos parasitas na hemocele, superando assim as adversidades encontradas nos diferentes órgãos do inseto. Neste trabalho, são discutidos os mecanismos destas interações, destacando também o papel da microbiota intestinal e outros mecanismos importantes para o desenvolvimento do parasita. Inicialmente nossas investigações foram realizadas para comparar aspectos da imunidade celular e humoral de ninfas de 4º e 5º estádio de R. prolixus em resposta a uma infecção oral com a cepa Macias de T. rangeli. Na infecção oral em 4º estádio (acompanhamento em longo prazo), não foi observada diferença na mortalidade e muda ao comparar com os insetos controle não infectados. Constatou-se um número aumentado de flagelados no intestino das ninfas de 5º estádio durante o curso da infecção. Também, não houve alteração significativa na contagem de microagregados hemocitários (nódulos) em infecções de 4º estádio, enquanto em ninfas infectadas em 5º estádio houve um aumento no número de nódulos. Por outro lado, não houve diferença no número de hemócitos em ambas as infecções Demonstramos nos dois tipos de infecção oral com T. rangeli em R. prolixus, em comparação com os insetos controle não infectados, que o intestino médio atenuou a atividade de fenoloxidase, aumentou as atividades antibacterianas testadas in vitro contra Serratia marcescens, e alterou a expressão relativa de genes que codificam para defensinas (DefA, DefB, DefC), prolixicina e lisozimas (LisAe LisB). Isto sugere a influência destas atividades sobre a contagem de unidades formadoras de colônias, encontradas diminuídas no trato digestivo do inseto. Em uma segunda etapa do estudo, foram comparadas as respostas de defesa em ninfas de 5º estádio de R. prolixus inoculadas com T. rangeli, cepas Macias e H14. A cepa Macias de T. rangeli não aumentou a mortalidade desses insetos, apresentou capacidade de sobreviver e se multiplicar na hemolinfa, aumentou o número de hemócitos, e induziu alta atividade de fenoloxidase. Em contraste, estes mesmos parâmetros medidos em insetos inoculados com a cepa H14 de T. rangeli foram diferentes daqueles encontrados com inoculação de insetos usando a cepa Macias. Conclui-se que R. prolixus responde de forma distinta frente a vias de infecção oral ou por inoculação com T. rangeli, sugerindo que a capacidade infectiva deste protozoário, pode ser alterada por modulação do sistema imune do vetor

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 antonio_goncalves_ioc_dout_2013.pdf: 2946820 bytes, checksum: 18a0b77b3b95468e0be2f5a0005d91c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da dengue compreende quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV1-4) e até o momento não existe nenhuma vacina disponível comercialmente contra este patógeno. Alguns autores apontam a proteína NS1 de DENV como um antígeno protetor. Entretanto, ainda não se sabe ao certo o seu papel na replicação viral, bem como na indução de proteção ou patogênese. Nosso grupo vem trabalhando com as vacinas de DNA contra a dengue, testando-os em modelos murinos. Camundongos imunizados com uma vacina de DNA (pcTPANS1), que contém o gene NS1 de dengue 2 (DENV2), mostraram altos níveis de anticorpos anti-NS1 e quase 100 % de proteção quando desafiados com DENV2 (4 LD50). Este projeto tem por objetivo o mapeamento da resposta imune protetora gerada pela vacina pcTPANS1. Os resultados revelaram que 50 % dos animais que receberam o soro de outros camundongos, previamente imunizados com o plasmídeo pcTPANS1, sobreviveram à infecção após o desafio com DENV2 (4 LD50). Entretanto quando utilizamos um segundo estoque viral com 40 LD50, todos os animais apresentaram altas taxas de mortalidade e fortes sinais clínicos da infecção, com exceção do grupo de camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1. Posteriormente analisamos o papel da resposta imune celular na proteção. O ensaio de depleção in vivo mostrou que todos os animais vacinados e depletados de células CD4+ morreram após o desafio com DENV2, enquanto que 60 % dos animais depletados de CD8+ sobreviveram à infecção. Os ensaios de transferência adotiva de células T mostraram proteção somente no grupo de camundongos que receberam concomitantemente soro e linfócitos TCD4+ provenientes de animais imunizados com a vacina pcTPANS1 As células obtidas do baço de animais vacinados com o plasmídeo pcTPANS1 foram capazes de secretar IFN-\F067 após estímulo com o peptídeo 265AGPWHLGKL273, contido na proteína NS1 de DENV2 e descrito na literatura como específico para células TCD8+\F02E\F020Também avaliamos in vivo uma possível atividade citotóxica específica para este peptídeo. Nossos resultados mostraram que os camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1 promoveram a lise das células alvo pulsadas anteriormente com o peptídeo. Além disso, quando células alvos foram administradas 72 horas após o desafio com DENV2, houve um aumento significativo do percentual de lise. Em outro ensaio para avaliação de citotoxicidade in vivo, os animais foram imunizados com pcTPANS1 e submetidos ao tratamento para depleção de células CD4+ ou CD8+ Nossos resultados demonstraram que a atividade citotóxica específica para o peptídeo 265AGPWHLGKL273 é atribuída principalmente à população de células TCD8+, pois quando analisamos os resultados obtidos com animais imunizados e depletados de células TCD8- o percentual de lise foi reduzido para 37,9 %, corroborando os dados da literatura que descreve este peptídeo como específico para células TCD8+. Além disso, avaliamos a indução de possíveis danos gerados com a vacina pcTPANS1, tanto por análises histopatológicas do fígado quanto por dosagens dos níveis séricos de enzimas hepáticas, sem a detecção de qualquer alteração nos animais imunizados. De um modo geral, o conjunto de resultados obtidos nesse trabalho sugere que a proteção mediada pela vacina pcTPANS1 no nosso modelo experimental está relacionada principalmente com a resposta de células TCD4+ em associação com anticorpos anti-NS1, embora a vacina ative também uma resposta de células TCD8+ citotóxica / Dengue virus comprises four antigenically distinct serotypes (DENV1 - 4) . Nowada ys, there is no commercially available vaccine against this pathogen. Some authors point out the NS1 protein fr om DENV as a protective antigen, h owever, its role in viral replication, as well as in the induction of protection or pathogenesis, remains still unclear. Our group has been working with DNA vaccines a gainst dengue testing them in murine models. Mice immunized with one DNA vaccine (pcTPANS1), which contains the NS1 gene from dengue 2 (DENV2), showed high levels of anti - NS1 antibodies and almost 100 % protection when challenged with DENV2 (4 LD 50 ). This project aims to map the protective immune response generated by the pcTPANS1. Results showed that 50 % of animals that received serum from other mice, previously immunized with the pcTPANS1, survived infection after challenge with DENV2 (4 LD 50 ). However when we used a second viral stock with 40 LD 50 , all animals showed high mortality rates and strong clinical signs of infection, except the mouse group immunized with the pcTPANS1 vaccine. Subsequently, we analyzed the role of the cellular immune response in protection. The in vivo depletion assay showed that all vaccinated and depleted from CD4 + cells died after challenge with DENV2, whereas 60 % of CD8 + depleted animals survived infection. The assays o f T cell adoptive transfer showed protection only in the mouse group receiving concomitantly serum and CD4 + T lymphocytes recovered from animals immunized with the pcTPANS1 vaccine . Splenocytes obtained from pcTPANS1 vaccinated animals were able to secrete IFN   after stimulation with the peptide 265 AGPWHLGKL 273 , present in NS1 protein from DENV2 and described as specific for CD8 + T cells  We also analyzed in vivo a possible cytotoxic activity specific for this peptide. Our results showed that mice immuniz ed with the pcTPANS1 vaccine promoted the lysis of target cells previously pulsed with the peptide. Besides, when target cells were given 72 hours after challenge with DENV2, there was a significant increase in the lysis percentage. In another assay for th e assessment of in vivo cytotoxicity, animals were immunized with pcTPANS1 and subjected to treatment for depletion of CD4 + or CD8 + cells. Our results showed that the cytotoxic activity specific for the peptide 265 AGPWHLGKL 273 is attributed mainly to the population of CD8 + T cells, because when we analyzed results obtained from animals immunized and depleted of CD8 Tcells, the lysis percentage was reduced to 37.9 %, corroborating data from literature which describes this peptide as specific for CD8 + T c ells. Moreover, we evaluated the induction of possible damages generated by the pcTPANS1 vaccine, either by histopathological analysis in the liver or by quantification of serum levels of hepatic enzymes, without detection of any alteration in immunized an imals. In general, results obtained in this work suggest that protection mediated by the pcTPANS1 vaccine in our experimental model is related mainly to the CD4 + T cells response in association with anti - NS1 antibodies, although the vaccine also activate s a CD8 + T cells cytotoxic response.

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-20T14:04:17Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71865.pdf: 48467768 bytes, checksum: dcb3b08cfc32a71a87cfc37712819a0b (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-21T15:21:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71865.pdf: 48467768 bytes, checksum: dcb3b08cfc32a71a87cfc37712819a0b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T15:21:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71865.pdf: 48467768 bytes, checksum: dcb3b08cfc32a71a87cfc37712819a0b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As doenças tropicais não ocorrem de forma isolada devido a sua prevalência e distribuição. A malária e parasitoses intestinais são infecções endêmicas em várias regiões do planeta, incluindo a região amazônica. Evidência experimental mostra que infecções parasitárias concomitantes podem induzir modificações na resposta imune específica a antígenos de cada patógeno e nas manifestações clínicas causadas por essas infecções. Atualmente no Brasil são escassas informações sobre a prevalência de coinfecções malária-parasitoses intestinais em humanos, ou dados descrevendo alterações na resposta imune a estes patógenos quando elas se encontram associadas. Este fato nos levou a estudar tanto a prevalência quanto as alterações nas variáveis clínicas e imunológicas associadas à coinfecção malária-parasitoses intestinais em indivíduos moradores de assentamentos na Amazônia legal, localizados no Estado de Rondônia, Brasil. A partir do diagnóstico coproparasitológico e parasitológico e molecular de Plasmodium, os indivíduos participantes do estudo foram agrupados em quatro grupos: Infectados somente por Plasmodium (M), indivíduos coinfectados Plasmodium-parasitoses intestinais (CI), infectados unicamente com parasitoses intestinais (IP) e indivíduos sem infecções por Plasmodium e/ou parasitoses intestinais (UN). Observamos uma frequência importante de indivíduos coinfectados com malária-parasitoses intestinais (18%). Também foi visto que os protozoários são o principal grupo de parasitoses intestinais infectando esta população. O protozoário observado com maior frequência foi Giardia intestinalis enquanto Strongyloides stercoralis foi o helminto mais frequente Não observamos alterações de variáveis hematológicas nos indivíduos coinfectados comparados com os indivíduos com malária. Em relação à avaliação dos níveis de citocinas, não observamos diferenças entre os indivíduos dos grupos CI e M. Os indivíduos infectados com Plasmodium apresentaram altos níveis de IL-6, TNF-\03B1, IL-10 e CRP, junto com baixos níveis de IL-17ª. Em contraste, foram observados altos níveis de IL-17ª em indivíduos do grupo IP. Posteriormente foi avaliada a alteração da resposta humoral a proteínas plasmodiais em resposta à coinfecção. Não observamos alterações da produção de anticorpos contra as proteínas PvAMA-1 e PvMSP-119 associada à coinfecção, porém, o grupo PI apresentou menor frequência de resposta e menores índices de reatividade de IgG para as duas proteínas. Contudo, não foram observadas alterações na frequência de respondedores e índices de reatividade nas subclasses de IgG contra as duas proteínas recombinantes nos indivíduos do grupo CI. Em conjunto, estes resultados mostram que as infecções por parasitos intestinais são frequentes na população estudada, além de existir uma grande riqueza de algumas espécies de protozoários. Entretanto, apesar da prevalência destas infecções na população, elas parecem não influenciar as variáveis hematológicas, níveis de citocinas e anticorpos contra antígenos de P. vivax nos indivíduos coinfectados / Abstract: Tropical diseases do not occur isolated due to their prevalence and distribution. Malaria and intestinal parasites are endemic infections in several regions of the planet including amazonic regions. Experimental evidence has shown that concomitant parasitic infections could induce changes in both immune response to pathogen antigens and clinical manifestations caused by them. Nowadays there are few studies of prevalence of malaria-intestinal parasite coinfections in human populations, or data describing alterations caused in immune response to these pathogens when both infections coexist simultaneously. This lack of information led us to study the prevalence and changes of hematologic and immunological variables associated to coinfections in a population from a settlement located in the Amazon region in Brazil. Here we show in two articles the results of the investigation conducted in the described population. From stool samples diagnosis and parasitological and molecular diagnosis of Plasmodium, the studied individuals were grouped in: Individuals single-infected with Plasmodium (M), Plasmodium-intestinal parasites coinfected individuals (CI), Individuals single-infected with intestinal parasites (IP) and individuals without Plasmodium and/or intestinal parasite infections (UN). In the first paper a high frequency of coinfected individuals was observed (18%) We also observed that protozoans were the main intestinal parasite group infecting the studied population. Among protozoans the most prevalent species was Giardia intestinalis and the most prevalence helminth species was Strongyloides stercoralis. There were no changes in hematologic variables or cytokines comparing individuals from M and CI groups. Individuals infected with Plasmodium (groups M and CI) presented increased levels of de IL-6, TNF-\03B1, IL-10 and CRP, and low levels of LI-17A. On the other hand, individuals from IP group had increased levels of IL-17A. In the second paper we did not find changes in the antibody levels directed to PvAMA-1 and PvMSP-119 associated to coinfections. Nevertheless, the group of individuals with intestinal parasites presented a reduced frequency of responders and lower reactivity indexes of IgG subclasses frequencies and reactivity indexes among the groups studied. Together these results show that in the studied population there exists an important prevalence and intestinal parasites, mainly of protozoans. However, in spite of the important values of intestinal parasites prevalences in the population; hematological variables, cytokines and antibody production directed to P. vivax antigens are not affected in coinfected individuals

Após o nascimento, os recém-nascidos são expostos a vários tipos de micro-organismos, que podem determinar um processo infeccioso devido a sua imaturidade imunológica. Dentro deste processo, a amamentação tem um papel importante pela transferência passiva de imunoglobulina A (IgA). A cavidade oral é a principal porta de entrada destes agentes, especialmente os estreptococos, sendo que alguns colonizam inicialmente como Streptococcus gordonii (SGO), S. sanguinis (SSA) e S. mitis (SMI) e outros podem causar doenças, como S. mutans (SM), por ser o principal agente etiológico da cárie dentária. Pouco se sabe sobre a especificidade de IgA do colostro contra antígenos importantes destes estreptococos, o que pode ajudar na investigação dos mecanismos de estimulação antigênica e desenvolvimento da resposta imune de mucosa. Para tanto, foi avaliado no presente estudo, a especificidade e os níveis de IgA três antígenos de virulência de SM: glucan binding protein B (gbpB), glicosiltransferase (GTF) e antígeno I/II (Ag I/II) envolvidos na capacidade destas bactérias de aderir e acumular no biofilme. Além disso, as glicosiltransferases: 153 kDa de SGO e 170 kDa de SSA e IgA1- protease de SMI (220 kDa) em amostras de colostro humano. Um total de 77 amostras de colostro foram analisadas quanto aos níveis de immunoglobulian A, M e G por ELISA. A complexidade da IgA contra as bactérias foram analisadas por Western blot. Os resultados mostraram que a concentração média de IgA foi de 2850,2 (±2567,2) mg/100 mL sendo estatisticamente maior (p<0.05) dos níveis de IgM e de IgG (respectivamente 321,8±90,3 e 88,3± 51,5 mg/100 mL). A maioria das amostras tiveram níveis detectáveis de anticorpos IgA para extratos de antígenos de bactérias e seus antígenos de virulência, apresentando um elevado número de bandas reativas. Não houve diferença estatisticamente significante no número médio de IgA reativas a Ags entre os antígenos (p>0.4). A detecção de gbpB foi significativamente menor do que os outros antígenos de SM (p<0.05). Assim, o leite materno das primeiras horas após o nascimento apresentou níveis significativos de IgA contra importantes antígenos de virulência dos estreptococos orais estudados, que pode sugerir que a amamentação antes da erupção dos dentes pode interferir no processo de instalação e acumulação destes microorganismos na cavidade oral. / After birth, newborn babies are exposed to several types of microorganisms that can determine an infectious process due to their immunological immaturity. In this case, the feeding plays an important role by passive transfering of immunoglobulin A (IgA). The oral cavity is the main gateway of these agents, especially streptococci, some initially colonize as Streptococcus gordonii (SGO), S. sanguinis (SSA) and S. mitis (SMI) and others can cause diseases such as S. mutans (SM), as the main agent of tooth decay. Little is known about the specific IgA against major antigens of these streptococci which can help in the investigation of antigenic stimulation mechanisms and development of mucosal immune response. Therefore, we evaluated in this study, the specificity and levels of IgA from colostrum against three SM virulence antigens: glucan binding protein B (gbpB), glycosyltransferase (GTF) and antigen I/II (Ag I/II) involved in capacity these bacteria to adhere to and accumulate in the biofilm. Also, the glycosyltransferases: 153 kDa-SGO and 170 kDa-SSA and IgA1- protease of SMI (220 kDa). This study involved 77 samples of colostrum that were analyzed for levels of immunoglobulian A, M and G by Elisa. The specificity of IgA against extracts of SM and initials colonizators (SSA, SMI, SGO) were analyzed by the western blot. The mean concentration of IgA was 2850.2 (± 2567.2) mg/100ml followed by IgM and IgG (respectively 321.8 ± 90.3 and 88.3 ± 51.5), statistically different (p<0.05). Results showed that the majority of samples had detectable levels of IgA antibodies to extracts of bacteria antigens and theirs virulence antigens. To SM, the GbpB was significantly lower detected than others antigens of SM (p<0.05). High complexities of response to Ags were identified in the samples. There were no significant differences in the mean number of IgA-reactive Ags between the antigens (p>0.4). So, the breast milk from first hours after birth presented significant levels of IgA specific against important virulence of antigens those oral streptococci, which can disrupt the installation and accumulation process of these microorganisms in the oral cavity.