Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T14:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_LucieneAlvesMoreira_M.pdf: 9700110 bytes, checksum: ca6af73e9b78b7a37b1d659403096c81 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: O envenenamento humano por lagartas de mariposas saturnídeas L. obliqua, leva a distúrbios hemostáticos, sendo o óbito, em geral, decorrente de insuficiência renal aguda ou de hemorragia maciça em órgãos nobres. Pouco se sabe sobre a composição bioquímica e imunológica do veneno destas lagartas. Esta dissertação descreve um estudo imunológico do veneno desta espécie, incluindo o desenvolvimento de um "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" (ELISA) para detecção do veneno de L. obliqua. As imunoreatividades do extrato de cerdas, hemolinfa e saliva de L. obliqua frente ao soro anti-Lonomia foram comparadas por imunodifusão de Ouchterlony, imunoeletroforese e imunoblot após SDS-PAGE. A reatividade do antiveneno com outros venenos animais também foi investigada. Na imunodifusão, o extrato de cerdas e hemolinfa mostraram várias linhas de imunoprecipitação, algumas das quais com completa identidade. A hemolinfa de L. achelous também reagiu com o antiveneno, mas em menor extensão, e mostrou algumas linhas de identidade parcial com a hemolinfa de L. obliqua. Com exceção do extrato de cerdas e hemolinfa da lagarta da mariposa saturnidea A. rectilínea, que mostrou fracas linhas de imunoprecipitação de não-identídade com o extrato de cerdas e hemolinfa de L. obliqua, não houve reação entre o soro mti-Lonomia e outros venenos animais testados. A imunoeletroforese essencialmente confirmou a imunoreatividade observada na imunodifusão. O Imunoblot mostrou que o perfil do extrato de cerdas foi semelhante ao da hemolinfa, particularmente na região de 45-205 kDa. O extrato de cerdas de A. rectilínea e as hemolinfas de A. rectilínea e L. achelous mostraram várias bandas semelhantes àquelas vistas com cerdas e hemolinfa de L. obliqua. Não houve reatividade com as salivas de A. rectilínea e L. obliqua nestes ensaios. Houve uma reatividade muito fraca (não específica) com os venenos de P. nigriventer e T. serrulatus, mas não ocorreu reatividade com venenos de serpentes. Para o ELISA, placas multi-poço foram sensibilizadas com soro anti-L. Obliqua (1:1000) "ovemight", lavadas e incubadas com extrato de cerdas, hemolinfa, saliva ou outros venenos animais. Após lavagem e incubação com IgG purificada por afinidade e conjugada à peroxidase (1:800), o substrato (oenilenodiamina) foi adicionado e a absorbância lida a 492 nm, após 30 min. Em alguns experimentos, o extrato de cerdas, hemolinfa e saliva de L. obliqua foram fracionados por gel filtração em Superdex 75,equilibrada com tampão Tris-HCl 0,1 M5 pH 7,8 e a imunoreatividade das frações foi testada pelo ELISA. A detecção limite para o extrato de cerdas no ELISA foi 0,5 - 1,0 ng/poço (5-10 µg/ml) com resposta máxima com >2 µg/poço (20 µg/ml). O coeficiente de variação íntra- ensaio foi <5%. A hemolinfa de L. obliqua mostrou imunoreatividade quase idêntica à do extrato de cerdas. No entanto, a saliva não mostrou reatividade. Houve moderada reatividade cruzada com a hemolinfa de L. achelow e baixa reatividade cruzada com a hemolinfa e extrato de cerdas da lagarta saturnídea A. rectilínea. Não ocorreu reatividade cruzada com venenos de serpentes, aranha e escorpião em concentrações de até 100 Hg/poço. A cromatografia de gel filtração em Superdex 75 mostrou que o extrato de cerdas e hemolinfa de L. obliqua possuem perfis de eluição muito semelhantes a 280 nm e imunoreatividade similar no ELISA. Ambos diferem marcadamente do perfil de eluição e imunoreatividade da saliva. A administração i.v. do extrato de cerdas de L. obliqua em ratos (400 µg/kg) mostrou rápido declínio nos níveis circulantes de antígenos nas primeiras 2 h, seguido por diminuição progressiva até as 16 h quando tomaram-se não detectáveis. Quando a mesma dose foi injetada s.c, houve variação considerável nos níveis séricos de antígenos com picos observados em 0,5,4 e 16 h após a injeção. O perfil cinético obtido com a administração i.d. foi semelhante àquele visto com a injeção i.v., embora os níveis absolutos de antígenos tenham sido muito menores. Estes resultados mostram que há pouca ou nenhuma reatividade cruzada entre o soro anti-£. obliqua e venenos animais não saturnídeos. As semelhanças de imunoreatividades do extrato de cerdas e hemolinfa sugerem que o veneno pode ser derivado da hemolinfa e que esta poderia ser uma fonte útil e mais acessível para a purificação de fatores que afetam a cascata de coagulação. A sensibilidade e a especificidade do ELISA desenvolvido pode ser útil para imunodiagnóstico na clínica, embora o tempo após o envenenamento e a quantidade de veneno injetado possam ser um dos fatores limitantes na detecção de antígenos circulantes, como mostrado pelos experimentos cinéticos em ratos / Abstract: Human envenoming by caterpillars of the saturnid moth Lonomia obliqua in southern Brazil leads to hemostatic disturbances and hemorrhage, with death resulting from acute renal failure or intracranial hemorrhage. Little is known of the biochemical and immunological composition of the venom of these caterpillars. This thesis describes an immunological study of the venom of this species, including the development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of L. obliqua venom. The immunoreactivities of L. obliqua spicule extract, hemolymph and saliva with antiserum to L. obliqua venom were compared by Ouchterlony immunodiffusion, Immunoelectrophoresis and immunoblotting following SDS-PAGE. The reactivity of the antivenom with other animal venoms was also assessed, In immunodiffusion, the spicule extract and hemolymph showed several immunoprecipitin lines, some of which had complete identity. Hemolymph from the related L. achelous also reacted with the antivenom, but to a lesser extent, and showed some lines of partial identity with L. obliqua hemolymph. Except for a spicule extract and hemolymph from the saturnid moth Automeris rectilinea which showed weak immunoprecipitin lines of non-identity with L. obliqua spicule extract and hemolymph, there was no reaction between L. obliqua antiserum and the other animal venoms tested. Immunoelectrophoresis essentially confirmed the immunoreactivities observed with immunodiffusion. Immunoblotting showed that the profile of the spicule extract was similar to that of hemolymph, particularly in the region of 45-205 kDa. A spicule extract from A. rectilinea and hemolymph from A. rectilinea and L. achelous showed several bands similar to those seen with L. obliqua spicules and hemolymph. There was no reactivity with A. rectilinear or L. obliqua saliva in these assays. There was very low (non-specific) reactivity with P. nigriventer and T. serrulatus venoms but no reactivity with snake venoms. For the ELISA, multiwell plates were coated overnight with antivenom to L. oblique venom (1:1000) and then washed and incubated with spicule extract, hemolymph, saliva or other animal venoms. After washing and incubation with affinity-purified IgG conjugated to peroxidase (1:800), substrate (o-phenylenediamine) was added and the absorbance read at 492 nm after 30 min. In some experiments, L. obliqua spicule extract, hemolymph and saliva were fractionated by gel filtration on Superdex 75 equilibrated with 0.1 M Tris-HCl, pH 7.8 and the immunoreactivity of the fractions was tested by ELISA. The detection limit for spicule extract in the ELISA was 0.5-1.0 ng/well (5-10µg/ml) with a maximum response at > 2 µg/well (20 µg/ml). The intra-assay coefficient of variation was <5%. L. obliqua hemolymph showed an immunoreactivity which was almost identical to that of the spicule extract whereas saliva showed no reactivity. There was moderate cross- reactivity with L. achelous hemolymph and low cross-reactivity with hemolymph and a spicule extract from the saturnid caterpillar Automeris rectilinea. No cross-reactivity was observed with scorpion, snake or spider venoms (up to 100 µg Avell). Gel filtration chromatography on Superdex 75 showed that L. obliqua spicule extract and hemolymph had very similar elution profiles at 280 nm and similar immunoreactivities in the ELISA. Both of these differed markedly from the elution profile and immunoreactivity of saliva. The i.v. administration of L. obliqua spicule extract in rats (400 µg/kg) showed a rapid decline in circulating antigen levels in the first 2 h, followed by a progressive decrease up to 16 h post-injection after which antigens were no longer detectable. When the same dose was injected s.c, there was considerable variation in the serum antigen levels with peaks being observed at 0.5, 4 and 16 h post-injection. The kinetic profile obtained with i.d. administration was similar to that seen following i.v. injection, although the absolute antigen levels were much lower. These results show that there is little or no cross-reactivity between L. obliqua antiserum and non-saturnid animal venoms. The similar immunoreactivities of the spicule extract and hemolymph suggest that the venom may be derived from the hemolymph. Whether the latter may be a useful source for the purification of factors affecting the coagulation cascade remains to be determined. The sensitivity and specificity of the ELISA developed may be useful for immunodiagnosis in a clinical setting, although the time after envenomation and amount of venom injected may be limiting factors in the detection of circulating antigens, as shown by the kinetic experiments in rats / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-26T10:40:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 302478.pdf: 1631379 bytes, checksum: a3c3cfd874fb540789246fcf12ef6437 (MD5) / A via UPR (do inglês Unfolded Protein Response) é uma resposta celular ao acúmulo de proteínas desenoveladas no lúmen do retículo endoplasmático, possuindo três braços (PERK, IRE1 e ATF6) que atuam sinergicamente em controles traducionais e transcricionais com o objetivo de restabelecer a homeostase celular. Os vírus, ao induzirem a célula a produzir proteínas virais, aumentam a carga de proteínas que devem ser dobradas no retículo endoplasmático, frequentemente causando a ativação da via UPR. O presente trabalho teve como objetivo estudar o impacto da infecção do HIV sobre a via UPR em células de indivíduos HIV positivos submetidos a diferentes esquemas terapêuticos. Lisados proteicos provenientes de linfócitos B, linfócitos T CD4+ e monócitos de indivíduos sadios e de pacientes HIV positivos virgens de tratamento, sob tratamento antirretroviral sem inibidor de protease ou com inibidor de protease foram avaliados quanto à presença de proteínas relacionadas à via UPR através de Western Blot. BiP teve expressão significantemente maior em linfócitos B de indivíduos HIV positivos. O fator eIF2., relacionado ao braço PERK, foi detectado em pacientes HIV positivos sob terapia antirretroviral; na sua forma não-fosforilada foi encontrado em monócitos enquanto na sua forma fosforilada e inativada, em linfócitos B e linfócitos T CD4+. P-IRE1 foi expresso em linfócitos B e linfócitos T CD4+ de indivíduos HIV negativos e pacientes HIV positivos, porém esta expressão mostrou-se significantemente maior em células de indivíduos sob tratamento antirretroviral. Células de indivíduos HIV positivos apresentaram ainda níveis de clivagem e ativação de ATF6 significantemente maiores quando comparados a indivíduos sadios. O perfil de ativação da via UPR mostrou-se diferente para indivíduos HIV negativos e HIV positivos e dentre os últimos, indivíduos virgens de tratamento ativaram apenas o braço ATF6 da via UPR, enquanto pacientes sob terapia antirretroviral ativaram os três braços. Os diferentes perfis fenotípicos de expressão de proteínas relacionadas à via UPR parecem estar relacionados à infecção pelo HIV e às cargas virais apresentadas pelos indivíduos HIV positivos, estando estas últimas vinculadas à presença ou não de terapia antirretroviral. / The Unfolded Protein Response (UPR) is a mechanism initiated whenever protein folding in the endoplasmic reticulum (ER) is compromised. The UPR pathway has three sensors of ER stress (PERK, IRE1, and ATF6), which promotes the cell metabolism back to homeostasis through transcriptional and translational controls. Virus leads infected cells to produce a great amount of new proteins, which increases the number of unfolded proteins in the ER lumen and activates the UPR signal pathways. The aim of this study was to analyze the HIV infection impact in the UPR activation in cells from HIV-positive individuals under different antiretroviral therapy. Protein lysates from B lymphocytes, T CD4+ lymphocytes and monocytes from healthy individuals, treatment-naive HIV-positive patients, and HIV-positive patients under antiretroviral therapy with or without protease inhibitors were evaluated about their expression of UPR related proteins. Amounts of BiP were significantly higher in B lymphocytes from HIV-positive individuals when compared to healthy individuals. The eIF2. factor, related to the ER stress PERK sensor, was detected in cells from HIV-positive individuals under antiretroviral therapy; non-phosphorylated eIF2. was found in monocytes whereas its phosphorylated form was expressed in B lymphocytes and T CD4+ lymphocytes. P-IRE1 was expressed in B lymphocytes and T CD4+ lymphocytes from HIV-negative and HIV-positive individuals, however this expression was significantly higher in cells from treated HIV-positive individuals. Cells from HIV-positive patients also showed higher levels of ATF6 cleavage and activation in relation to healthy individuals. The expression profile of UPR related proteins showed to be different in HIV-negative and HIV-positive individuals. Differences were also detected between the expression protein profiles from treatment-naive and treated HIV-positive individuals. In treatment-naive patients only the ATF6 pathway was activated while in HIV-positive patients under antiretroviral treatment all the three ER stress sensors were activated. These non-equal phenotypes of UPR activation seem to be related to the HIV infection and the viral loads presented by the HIV-positive patients, being the number of infective particles in their plasmas connected to the presence of antiretroviral therapy.

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-17T20:27:52Z No. of bitstreams: 1 TESE Kilmara Higia Gomes Carvalho.pdf: 12352315 bytes, checksum: 5ada39abe3cab7c5edbd394847c93eae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-17T20:27:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Kilmara Higia Gomes Carvalho.pdf: 12352315 bytes, checksum: 5ada39abe3cab7c5edbd394847c93eae (MD5) Previous issue date: 2014-09-01 / FACEPE / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma infecção causada por várias espécies de protozoários pertencentes à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e ao gênero Leishmania, tendo L. (Viannia) braziliensis como agente etiológico de maior incidência no Brasil. A LTA é uma doença endêmica no país e que ainda apresenta dificuldades de diagnóstico laboratorial. Os pontos quânticos (PQ) são nanocristais fluorescentes de materiais semicondutores que recentemente vêm sendo empregados como fluoróforos no desenvolvimento de novos métodos imunoquímicos como alternativa diagnóstica, visando inovar e otimizar as técnicas atuais. O presente estudo demonstrou a viabilidade dos PQ como insumos fluoróforos em ensaios sorológicos para diagnóstico da LTA. PQ fluorescentes de Telureto de Cádmio (~3 nm) estabilizados com ácido mercaptosuccínico (AMS) foram preparados em meio coloidal e acoplados covalentemente à anti-imunoglobulinas G, via carbodiimida. Foi desenvolvida uma técnica de análise semiquantitativa para o monitoramento da bioconjugação baseada em leitura de fluorescência em microplacas negras. Os bioconjugados obtidos (PQ-Anti-IgG humana) foram submetidos à avaliação de desempenho para a pesquisa de anticorpos humanos anti-L. (Viania) braziliensis. pelas técnicas de citometria de fluxo, imunofluorescência indireta (IFI) e por ensaio imunofluorescente de adsorção baseado em pontos quânticos (PQ-FLISA). Empregou-se as formas promastigotas da cepa de referência (MHOM/BR/75/M2903) de Leishmania (V.) braziliensis na IFI e citometria de fluxo, enquanto que no PQ-FLISA utilizou-se o antígeno solúvel bruto de L. (V.) braziliensis. Os experimentos realizados por meio das técnicas de citometria de fluxo, IFI e PQ-FLISA em imunodiagnóstico para LTA demonstraram a afinidade dos conjugados obtidos de CdTe/AMS-Anti-IgG em se ligar a imunoglobulinas G, fornecendo resposta diferencial entre controles e amostras analisadas demonstrando a capacidade destes materiais como novos insumos em imunodiagnósticos. / The American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is an infection caused by various species of protozoa belonging to the Kinetoplastida order, family Trypanosomatidae of the Leishmania genre. The L. (V.) braziliensis genus is the most prevalent ethiologic agent of ATL in Brazil. ATL is endemic in the countrie and still presents difficulties in its laboratorial diagnosis. Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanocrystals that have been applied as markers in the development of new immunochemical methods as diagnostic alternative protocols, aiming to innovate and optimize as current techniques. The present study demonstrated the feasibility of QDs as new fluoroimmunoassay active material for the serological diagnostic of ATL. Fluorescent CdTe QDs (~3 nm) stabilized with mercaptosuccinic acid (MSA) were prepared in aqueous colloidal media and coupled covalently to antiimmunoglobulin G by carbodiimide. A semiquantitative technique using a fluorescence plate reader was developed to monitor the bioconjugation procedure. The human QD-anti-IgG bioconjugates were tested for the detection of human antibodies against L (Viania) braziliensis, applying flow cytometry, indirect immunofluorescence (IIF) and adsorption fluoroimmunoassay (QD-FLISA). The promastigote forms of the reference strain (MHOM / BR / 75 / M2903) of Leishmania (V.) braziliensis were used in IFI and flow cytometry, whereas in the QD-FLISA the crude soluble antigen of L. (V.) braziliensis was used. The analysis of all the data demonstrated the capacity of the CdTe/MSA-Anti-IgG bioconjugates to bind to immunoglobulin G and succesfully detect the LTA positive serum compared to the controls. The results showed that these materials may be applied as new tools in the diagnosis of LTA.

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-17T21:26:24Z No. of bitstreams: 1 TESE Aluizio Gonçalves Brasil Junior.pdf: 9131459 bytes, checksum: 6f52829993bc444f3d7aa2e53d6ff20f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-17T21:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Aluizio Gonçalves Brasil Junior.pdf: 9131459 bytes, checksum: 6f52829993bc444f3d7aa2e53d6ff20f (MD5) Previous issue date: 2014-08-01 / CAPES / O vírus do dengue (DENV) pertence ao gênero Flavivirus, família Flaviviridae, possuindo RNA genômico de fita simples e apresentando quatro sorotipos antigenicamente relacionados (DENV 1-4). A identificação precoce dos casos de dengue é de vital importância para a tomada de decisões e implementação de medidas de maneira oportuna. No entanto, os métodos de eleição para o diagnóstico das infecções pelos DENV (ensaios imunoenzimáticos de captura de anticorpos das classes IgM e IgG) apesar de possibilitarem a análise rápida e reprodutível, apresentam a limitação da não detecção da enfermidade em sua fase inicial. Tendo por finalidade suplantar essa dificuldade, a obtenção de insumos que possam ser empregados em fluoroimunoensaios de detecção da proteína viral solúvel NS1, apresenta acentuada relevância. Pontos quânticos (PQs) fluorescentes de CdTe foram preparados em água com os estabilizantes, cisteamina (CTM) e ácido mercaptosuccínico (MSA). Os PQs obtidos exibiram elevada fluorescência e estabilidade coloidal, realizando-se a caracterização óptica (emissão/excitação/absorção) e estrutural (DRX/MET). Anticorpos monoclonais anti-NS1 DENV (Mab-anti NS1) específicos para os quatro sorotipos do DENV foram acoplados covalentemente aos PQs, via agentes de acoplamento. Microplacas negras de poliestireno foram previamente sensibilizadas com a proteína viral NS1 nativa, e os bioconjugados obtidos (PQs-Mab anti-NS1) foram utilizados em fluoroimunoensaios de detecção da proteína viral. Os bioconjugados de CdTe/MSA-anti-NS1 DENV para os quatro sorotipos apresentaram resultados promissores nos ensaios de detecção da proteína viral NS1, destacando-se o bioconjugado constituído pelo anticorpo monoclonal anti-NS1 DENV-2. Os bioconjugados foram empregados em ensaios de marcação de células fixadas e não fixadas clone C6/36 infectadas com DENV2, obtendo-se resultados satisfatórios para as células não fixadas. / The dengue virus (DENV) belongs to the Flavivirus gender, Flaviviridae family possessing a single-stranded RNA genome and 4 antigenic related serotypes (DENV1 – 4). The early dengue diagnosis is vital for the efficient medical intervention. The existing diagnostic methods for the DENV infections (immunoenzymatic antibody capture based methods of the IgM and IgG classes) although precise and fast still present limitations related to the diagnosis at early stages of the patology. Aiming the development of new diagnostic products for the immunodetection of the NS1 soluble viral protein is still of great importance. Fluorescent CdTe quantum dots (QDs) were prepared in aqueous medium applying mercaptosuccinic acid (MSA) and cysteamine (CTM) as stabilizing agents and used to produce an immunodiagnostic tool for the DENV detection. The QDs showed high fluorescent yield and great colloidal stability and were characterized by X-ray diffractometry, Electronic transmission microscopy, zeta potential and spectroscopic measurements. Monoclonal anti-NS1 DENV (Mab-anti NS1) antibodies specific for the 4 serotypes were covalently attached to the QDs via coupling agents. Black polystyrene microplates were sensibilized with the viral NS1 native protein and the (QDs-Mab anti-NS1) bioconjugates were applied in immunoassays aiming the detection of the viral protein. The CdTe/MSA-anti-NS1 DENV bioconjugates applied for the four serotypes showed promising results in the detection assays of the viral NS1 protein, being the most efficient the bioconjugate that used the monoclonal anti-NS1 DENV-2. The bioconjugates were used in the staining of fixed and live cells of the clone C6/36 infected with DENV2. The results were satisfactory for the live cells.

Orientadores: Maria Helena Andrade Santana, Ricardo de Lima Zollner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-27T04:52:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cabral_ElaineChristinedeMagalhaes_M.pdf: 3268697 bytes, checksum: 8b95028e2d3a4b7e0485f9f5f6958725 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A pesquisa no campo de doenças auto-imunes vem despertando grande interesse, pelas dificuldades de diagnóstico preciso e necessidade de melhor conhecimento das suas causas e mecanismos. O ensaio ELlSA (Enzyme-linked immunosorbent assay) é o mais utilizado para a detecção de auto-anticorpos. Nesse método, os problemas apresentados estão baseados na variabilidade dos kits disponíveis e na natureza multi-etapas envolvida na detecção dos auto-anticorpos. Visando contornar esses problemas, neste trabalho, foi desenvolvido um método de detecção de auto-anticorpos, quantitativo e qualitativo, em única etapa, baseado no reconhecimento molecular e desenvolvimento do sinal colorimétrico, usando lipossomas polimerizados. Na preparação dos lipossomas monoméricos foi usada cardiolipina como ligante específico e ácido 10,12-tricosadiinóico como lipídio estrutural. Os lipossomas polimerizados sob irradiação UV, absorveram a luz no comprimento de onda referente ao azul635nm, púrpura540nm e rosa480nm. A adsorção de auto-anticorpos na superfície dos lipossomas e o desenvolvimento do sinal colorimétrico foram estudados com soros de referência, de indivíduo sadio e auto-imunes. Os resultados experimentais mostraram que a preparação dos lipossomas polimerizados foi reprodutível. A adsorção de auto-anticorpos na superfície. desses lipossomas produziu resposta colori métrica, com alta sensibilidade de mudança de cor do "azul" ou "púrpura" para "rosa", detectável em única etapa. A especificidade do sistema foi 7 vezes maior com soro de referência que com IgG. A utilização de soros auto­imune e sadio reduziu a especificidade do sistema, devido às interferências dos outros componentes do soro. Esses resultados mostraram a potencial idade dos lipossomas polimerizados para a detecção de auto-anticorpos, pela reprodutibilidade do sistema e desenvolvimento de sinal em única etapa / Abstract: The research in the field of autoimmune diseases has been increased in the last years, due to the difficulties on the precise diagnostic, and the knowledgement of its causes and mechanisms. ELlSA (Enzyme -linked immunosorbent assay), commercially available, is the most used method for detection of autoantibodies. The problems presented in its procedure are based on the variability of the commercial kits and on the multi-steps included on the autoantibodies detection. Aiming to circumvent these problems, a alternative method for detection of autoantibodies using polymerized liposomes was developed in this work. The main advantage of this approach is the reprodutibility of the liposomes and the molecular recognition and development of colorimetric signal in only one step. Monomeric liposomes were prepared using cardiolipin a na affinity ligand and 10,12­tricosadiynoic acid as structural lipid. The polymerization was performed by UV irradiation in the blue, purple and pink phase. The adsorption of antibodies and the development of the colorimetric signal was studied using reference, normal and autoimmune sera. The experimental results showed that the polymerized were reprodutibles and stable during 5 months. The adsorption of autoantibodies on the surface of polymerized liposomes produced a colorimetric response trom the blue or purple to pink phase. The sensibility of the system was high, and the specificity was 60% compared the responses with reference serum and non specific immunoglobulin G. When real sera was used, the specificity of decreased due to interferences of the other components of the serum. The results show the potentiality of polymerized liposomes for detection of antibodies, due to reprodutibility of liposomes preparation and development of a colorimetric signal in only one ste / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Física, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:25:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 330808.pdf: 3299598 bytes, checksum: 70a98a2718755b326e1a698c0cd96d84 (MD5) Previous issue date: 2014 / Nos últimos anos a comunidade científica tem se dedicado à elaboração de sensores capazes de identificar e quantificar espécies químicas e biológicas. Grandes avanços foram alcançados no desenvolvimento de novos métodos de preparação, imobilização de receptores em plataformas específicas e novas formas de detecção. Este trabalho trata do estudo e caracterização de sensores e biossensores para aplicações práticas, e se divide em duas partes: na primeira, investigou-se a utilização da Feofitina-b, composto isolado da planta Turnera subulata, como sensor eletroquímico não enzimático, sendo testado na detecção do peróxido de hidrogênio. Foram preparados filmes automontados com diferentes arquiteturas e com utilização de materiais auxiliares como hidrocloreto de polialilamina (PAH) e a goma do cajueiro. Os resultados obtidos indicam que este sistema apresenta a atividade desejada. Na segunda, elaborou-se um novo dispositivo, o "Lab-in a syringe" (LIS), baseado em um simples imunoensaio de fluxo vertical (VFIA) para a detecção de proteínas, utilizando nanopartículas de ouro como marcadores do sinal resposta. Esse dispositivo é fácil e rápido de ser utilizado, uma vez que a leitura pode ser obtida em menos de 15 minutos. Os resultados obtidos são promissores, tendo sido aplicado com sucesso para a detecção do antígeno específico da próstata (PSA) diretamente na urina humana. Esse dispositivo pode ser útil como método rápido e simples para a detecção de outros analitos importantes para monitoramento ambiental, biossegurança e controle de alimentos.<br> / Abstract: In the last years the scientific community has devoted attention to developing sensors with the ability for identification and quantification of chemical and biological species. Important results have been obtained in developing new preparation methods, receptors immobilization in specific platforms and new detection mechanisms. This thesis deals with the study and characterization of sensors and biosensors alming at practical applications, and is divided into two parts: in the first, the use of Phaeophytin-b, a compound isolated from the plant Turnera subulata, was characterized and investigated as a non-enzymatic electrochemical sensor, being tested for detection of hydrogen peroxide. Self-assembled thin films were prepared with several architectures using auxiliary materials like Poly (allylamine) hydrochloride (PAH) and cashew gum. The obtained results indicated that the system presents the desired activity. In the second part, a new device was elabored, the "Lab-in a syringe" (LIS), based in a simple vertical flow immunoassay (VFIA) for protein detection, using gold nanoparticles as the signal response markers. This device is easy and fast to use, yieding results in less than 15 minutes. The sensor has been succesfully applied to detect the prostate specific antigen (PSA) directly from the human urine, with promising results. This device can be useful as a quick and simple method for detection of important analites to environmental monitoring, biosecurity and food control.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:35:23Z No. of bitstreams: 2 TESE TATIANNY de Assis Freitas.pdf: 2946545 bytes, checksum: 3fbab19838a2e5404d25fd09b3be4895 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:35:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE TATIANNY de Assis Freitas.pdf: 2946545 bytes, checksum: 3fbab19838a2e5404d25fd09b3be4895 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / FACEPE / A troponina T (TnT) é um marcador cardíaco considerado "padrão ouro" para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Métodos analíticos para melhorar o diagnóstico desta doença são importantes para o tratamento adequado dos pacientes. Atualmente, as técnicas baseadas em imunoensaios são as mais utilizadas para diagnóstico clínico e determinação da TnT à beira do leito. Entretanto, apresentam algumas limitações como procedimentos complicados para análise e um elevado tempo de espera do resultado. Neste contexto, os imunossensores surgem como uma atrativa ferramenta, de baixo custo, com alta sensibilidade e especificidade para determinação da TnT. Nesta tese, dois diferentes imunossensores eletroquímicos foram desenvolvidos para a detecção da TnT em soro humano. O primeiro imunossensor foi baseado em um método simples de amino-funcionalização de nanotubos de carbono empregado para promover uma imobilização dos anticorpos anti-TnT através de sua região Fc e sua ligação orientada ao antígeno TnT. Os nanotubos de carbono de múltiplas paredes foram amino-funcionalizados utilizando o reagente etilenodiamina e os ensaios foram realizados através de um estudo fatorial associado com uma matriz de Doehlert. As modificações estruturais dos nanotubos de carbono foram confirmadas através da espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourrier. Para detecção eletroquímica deste imunossensor, eletrodos impressos descartáveis de carbono foram utilizados e então modificados com estes nanotubos de carbono amino-funcionalizados. Um imunoensaio tipo "sanduíche" foi realizado, no qual a captura específica da TnT foi avaliada através das reações redox da enzima peroxidase conjugada ao segundo anticorpo anti-TnT. Sob condições experimentais otimizadas, uma curva de calibração para as diferentes concentrações de TnT foi obtida com faixa linear de resposta entre 0,02 e 0,32 ng mL-1 (r=0,985, n=5, p<0.001) e um limite de detecção de 0,016 ng mL-1. O segundo imunossensor foi baseado na formação de um filme polimérico sobre um eletrodo de carbono vítreo para imobilização de anticorpos anti-TnT. O ácido orto-aminobenzóico (o-ABA) foi eletropolimerizado sobre a superfície do eletrodo e empregado para fornecer grupamentos carboxílicos à superfície e permitir a ligação covalente de anticorpos anti-TnT. O eletrodo apresentou-se estável mantendo 91,6% da sua resposta inicial após 18 dias e apresentou um limite de detecção de 0,015 ng mL-1 de TnT. Os imunossensores desenvolvidos foram sensíveis, permitindo medidas confiáveis da TnT para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio na clínica médica.

Orientador: Alberto Cliquet Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T09:56:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_DanielaCristinaLeitede_D.pdf: 13961141 bytes, checksum: c15acd62de284b3ab7100e78b30fde38 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Indivíduos com tetraplegia apresentam uma acentuada perda óssea associada a uma redução da capacidade física, devido à extensa paralisia muscular e ao comprometimento do sistema nervoso simpático. Exercícios podem melhorar a capacidade física, além de possuírem um efeito positivo sobre a massa óssea. O presente estudo investigou o efeito do treinamento de marcha, provida pela estimulação elétrica neuromuscular (EENM), na melhora dos sistemas esquelético e cardio-respiratório de indivíduos tetraplégicos. Vinte e dois tetraplégicos (nível de lesão entre C4-C8) e três indivíduos nonnais participaram do estudo, divididos em três grupos: grupo 1 (n=12) realizou o treinamento de marcha, grupo 2 (n=10) não realizou a marcha e grupo 3 (n=3) incluiu indivíduos saudáveis, utilizados para comparação. As respostas metabólicas e cardio-respiratórias [consumo de oxigênio (V02), produção de dióxido de carbono (VC02), ventilação minuto (VE), razão de troca respiratória (R), :fi:eqüência cardíaca (FC)] e as respostas ósseas [análise dos marcadores ósseos (osteocalcina, fosfatase alcalina óssea, piridinolina e deoxipiridinolina) e densitometria óssea (DEXA) da coluna vertebral, colo femora!, trocânter maior e remur total] foram avaliadas e realizadas no início e após seis meses. Indivíduos do grupo 1 realizaram o treinamento de marcha sobre a esteira ergométrica, associada à EENM e descarga entre 50-700.10do peso corporal, durante seis meses, duas vezes por semana, vinte minutos diários. Os resultados ósseos foram analisados separadamente devido à grande variação individual. Os resultados mostraram que no grupo 1, 75% apresentaram aumentos signíficativos nos marcadores de fonnação óssea, dos quais 66,67% também apresentaram uma diminuição dos marcadores de reabsorção óssea. No grupo 2, 30% não apresentaram alterações nos marcadoresósseos e 200.10apresentaram aumento na formação óssea. Os resultados obtidos através da DEXA, na maioria das vezes, foram opostos aos resultados dos marcadores ósseos. Como a técnica DEXA apresenta o erro de precisão do equipamento associado a outras dificuldades durante o exame em indivíduos com lesão medular (espasticidade e dificuldade de reproduzir o mesmo posicionamento dos membros inferiores) e como os marcadores ósseos têm sido extensamente usados para analisar mudanças ósseas após períodos curtos de tratamento, a falta de correlação entre os marcadores ósseos e a densitometria óssea sugere que os dados da DEXA devam ser analisados cuidadosamente. Resultados dos testes cardio-respiratórios mostraram um aumento significativo para todos os parâmetros analisados após o treinamento de marcha (p<0,05), exceto para a FC: aumento de 36% para o VO2 ]Jmin, 42,97% para o VCO2, 30,48% para a VE e 4,93% para o R No grupo 2, apenas o V / Abstract: Quadriplegic subjects present an extensive muscle mass paralysis and sympathetic autonomic impairment, which are mainly responsible for the dramatic decrease of bone mass and physical deconditioning, increasing the risk for medical complications. Exercise can improve physical conditioning associated to the likely positive effect on bone mass. The present study evaIuated the effect of treadmill gait training, with 30-500-foof weight relie( associated to neuromuscular electricaI stimulation, on bone mass and on metabolic and cardiorespiratory responses of quadriplegic subjects. Twenty two subjects with tetraplegia (levels within C4-C8) and three hea1thy individuaIs participated in this study. They were separated into 3 groups: group 1 performed treadmill gait training (12 subjects), group 2 did not perform gait training (10 subjects), and results ITomgroup 3 were used as comparisons (3 subjects). Metabolic and cardiorespiratory responses [oxygen uptake (VO2), carbon dioxide production (VCO2), pulmonary ventilation (VE), respiratory exchange rate (RER), heart rate (HR.)] and bone responses [using dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA) of lumbar spine, femoraI neck, trochanteric area and total femur as well as biochemical markers of bone metabolism (osteocalcin, bone aIkaline phosphatase, pyridinoline and deoxipyridinoline)] were measured. Analyses were performed on inclusion and after 6 months. IndividuaIs ITomgroup 1 performed gait training during six months, twice a week, 20 minutes each session. Data :ITombone responses were ana1yzed individually due to the large individual variations. Results have shown that in the group 1, 75% presented a significant increase of bone formation markers; 66,67% aIso presented a significant decrease of bone resorption markers. In the control group, 300-fof individuaIs did not present any change of bone markers and only 200-foof individuais presented an increase of bone formation markers. Results obtained with biochemicaI markers were not always reproduCed in the BMD. Indeed, many individuaIs who presented an increase of bone formation markers presented a decrease ofBMD. Since DEXA technique has an error of precision associated to other difficulties during exams of spinaI cord injured persons (spasticity and difficulty to reproduce the same position of the lower limbs) and biochemical markers have been extensively used towards analyzing bone changes after short periods of treatment, the lack of correlation between biochemicaI markers and BMD suggests that data obtained by DEXA shall be carefully evaIuated. Results :ITom cardiorespiratory tests have shown significant differences in all parameters ana1yzed after gait training (p<0.05), except for HR: increase of 36% in VO2 Vmin, 42.97% in VCO2, 2.82% in HR, 30.48% in VE and 4.93% in RER For group 2, on1yVO2 Vmin increased significantly (26.290/c.)afier the 6 months período Although VO2 values did increase for group 2, they were significantly lower than those reached by group 1, which performed treadmill gait. Treadmill gait with NMES was therefore more efficient towards increasing aerobic capacity due to yielding higher metabolic and cardiovascular stresses. Moreover, results ftom bone markers have shown that the treadmill gait training, even with 30-500/c.of body relief, was efficient to promote biomechanical stress in order to stimulate bone formation process / Doutorado / Pesquisa Experimental / Doutor em Cirurgia

Vários autores já enfatizaram a importância do monitoramento do ciclo estral em cadelas e citaram exemplos de como ele pode ser feito. O objetivo deste estudo foi avaliar a técnica de dosagem de progesterona salivar para monitorar o ciclo estral da espécie. Para composição do grupo experimental, foram utilizadas 13 cadelas. As amostras de sangue e saliva foram colhidas paralelamente em todos os animais, a partir dos primeiros sinais de proestro. As amostras salivares foram obtidas com o uso de dispositivo específico para coleta Salivette®, método que se mostrou eficaz, visto que foi possível obter volume suficiente para dosagem de progesterona na grande maioria das amostras. As concentrações de progesterona no soro foram determinadas pela técnica de RIE e na saliva por EIE. Embora haja uma relação linear crescente e positiva entre a progesterona sérica e salivar (r=0,704; p<0,0001), não é possível utilizar o parâmetro salivar para determinar o momento da ovulação. / Several authors have already emphasized the importance of monitoring estrous cycle in bitches and mentioned examples of how it can be done. The aim of this study was to evaluate the salivary progesterone quantification technique in order to monitor the estrous cycle in this species. To compound the experimental group, 13 bitches were used. Blood and saliva samples were collected simultaneously in all animals, starting about the first day of proestrus signs. Salivary samples were collected with a specific device: Salivette®. This method was effective, since it was possible to obtain enough volume in almost all samples to quantify progesterone. Serum progesterone was quantified by radioimmunoassay and salivary progesterone by enzyme immunoassay. Although there is an increasing, linear and positive correlation between salivary and serum progesterone (r=0,704; p<0,0001), it is not possible to use the salivary parameter to set the moment of ovulation.

Orientador: Guilherme de Paula Nogueira / Banca: Marcelo Vasconcelo Meireles / Banca: Daniel de Jesus Cardoso de Oliveira / Banca: Andréa Fontes Garcia / Resumo: Esse estudo teve como objetivo a padronização de um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a determinação das concentrações plasmáticas de IGF-I total, utilizando o sistema de amplificação biotina-estreptavidina peroxidase em um ensaio competitivo. O IGF-I foi extraído da IGFBP, utilizando o tampão glicina acidificado seguido de neutralização do pH com hidróxido de sódio. As microplacas foram sensibilizadas com anti IgG de coelho, e as dosagens realizadas utilizando duas abordagens, um método sem competição (incubação prévia das amostras com o anticorpo anti-h-IGF-I) e outro com competição (adição simultânea de IGF-I biotilinado e amostra). Os melhores resultados foram obtidos utilizando o método competitivo, com a sensibilização da placa com 0,25 μg/poço de IgG anti-coelho, o anticorpo específico na diluição 1:250.000 e 0,06 ng/poço de IGF-I biotinilado. O ensaio in house apresentou, um limite inferior de detecção de 50 ng/mL, uma correlação de 0.945 entre doses quando comparado à uma metodologia comercial. Além disso, após 33 ensaios (1114 amostras) a metodologia apresentou uma boa precisão, com coeficientes de variação inter-ensaio de 12,94% (345,8 ng/mL) para os controles alto e 20,71% (131,6 ng/mL) para o baixo. Dessa forma, conclui-se que a metodologia imunoenzimática para quantificação de IGF-I total utilizando o sistema de amplificação biotina-estreptavidina peroxidase em um ensaio competitivo está estabelecida e apresenta-se como uma ferramenta útil para estudos que vis... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to standardize an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine plasma concentrations of total IGF-I using the amplification biotin-streptavidin peroxidase system in a competitive assay. The IGF-I was extracted from IGFBPs using the acidified glycine buffer followed by the pH neutralization with sodium hydroxide. The microplates were coated with anti-rabbit IgG, thereafter the measurements were carried out using two approaches, one without competition (prior incubation of samples with the anti-hIGF-I antibody) and another with competition (simultaneous addition of IGF-I and biotinylated sample). The best results were obtained using the competitive method, with the following combination of reagents: microplates were coated with 0.25 µg/well of anti-rabbit IgG, the specific antibody at a dilution of 1:250.000 and 0.06 ng/well of biotinylated IGF-I. The in house methodology showed sensitivity of detection limit of 50 ng/ml, a correlation between doses of 0.945 when compared to a commercial method. In addition, after 33 assays (quantification of 1114 samples) the proposed methodology presented a good precision, with interassay variation coefficients of 12.94% and 20.71% for the high and low controls, respectively. Finally, we concluded that ELISA method for the quantification of total IGF-I using the system biotin-streptavidin-peroxidase amplification in a competitive assay is established and is presented as a useful tool for studies aimed at monitoring ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor