As reabsorções dentárias são inflamatórias e/ou substitutivas e representam o fenômeno principal que impede o sucesso dos transplantes e reimplantes dentários. Sua ocorrência pode ser conseqüência de traumatismos, periapicopatias e movimentação dentária induzida. Na odontogênese, a dentina fica sempre “escondida" do sistema imunológico e posteriormente protegida pelo esmalte, cemento e cementoblastos no lado externo e pela camada de odontoblastos internamente. Duas proteínas não colagênicas são específicas da dentina: a fosfoforina e a sialoproteína dentinária. Construiu-se a seguinte hipótese: a dentina, como antígeno seqüestrado, pode induzir fenômenos auto- imunes e participar da etiopatogenia das reabsorções dentárias. A partir de dentes humanos, obteve-se um extrato dentinário inoculado em coelhos para análise dos soros imunes. O extrato dentinário humano apresentou capacidade de indução à resposta imunológica e reagiu com anticorpos de coelho. Foram selecionados 12 pacientes com reabsorção radicular inflamatória apical ativa, 12 indivíduos saudáveis sem quaisquer evidências de reabsorção radicular e quatro pacientes com reabsorção radicular por substituição. Através da metodologia Western blotting, verificou-se que a maioria das frações do extrato dentinário humano foi reconhecida de forma semelhante por pacientes com reabsorção dentária e controles, mas seis delas foram reconhecidas de forma estatisticamente diferente, não sendo reconhecidas como próprias pelo sistema imunológico. O extrato dentinário humano foi fracionado e os subprodutos coletados por intervalo de tempo com a utilização de HPLC. Resultados de ELISA demonstraram que os soros de pacientes com reabsorção dentária apresentaram quantidades maiores de IgG antiextrato dentinário humano e antifrações que indivíduos controles, sendo possível traçar um perfil sorológico próprio e possivelmente identificador do processo. IgM sérica antiextrato dentinário humano e antifrações dos pacientes com reabsorção inflamatória estavam em quantidades maiores ou iguais aos demais grupos estudados. Os perfis séricos de IgG e IgM permitem identificar especificidades dentro do próprio grupo de reabsorções dentárias, dividindo-as em inflamatória e por substituição. Há heterogeneidade na imunogenicidade das frações do extrato dentinário. As culturas de células provenientes de pacientes com reabsorção dentária mostraram índices de proliferação menores que os controles quando estimulados com o extrato dentinário ou suas frações, mas normais quando estimulados com mitógenos. O extrato dentinário humano e suas frações apresentaram capacidade de induzir à liberação de todas as citocinas relacionadas com a reabsorção dentária em maior ou igual concentração nas células de pacientes com reabsorção inflamatória se comparados com os controles sem reabsorção. Isto não foi observado nas células de pacientes com reabsorção por substituição, permitindo identificar os grupos com reabsorção dentária. Os resultados obtidos confirmam a hipótese que a dentina apresenta imunogenicidade e que o perfil sorológico dos pacientes com reabsorção dentária pode ser identificado por análise bioquímica sangüínea. O seu delineamento preciso pode levar ao diagnóstico precoce da reabsorção dentária antes que se manifeste radiograficamente. / The dental resorptions are inflammatory and/or substitutive and represent the principal phenomenon that prevents the success of transplants and dental reimplants from happening. Its occurrence can be a consequence of traumatism, periapical disease and induced dental movements. During the odontogenesis the dentin is always "hidden" from immune system and later protected by the enamel, cement and cementoblasts on the external side and, by the odontoblasts layer on the internal side. Two non-colagenical proteins phosphophorin and dentinal sialoprotein are specific of dentin. It was constructed the following hypothesis: the dentin, as a "hidden" antigen, can induce auto- immune phenomena and participate in the etiopathogenesis of the dental resorptions. Starting from extracted human teeth, we obtained a human dentinal extract inoculated into rabbits to obtain the immune sera. The huma n dentinal extract was able to react with the antibodies and to induce immune response in the rabbit. It was selected 12 patients with radicular inflammatory active apical resorption, 12 healthy individuals without signs of radicular resorptions evidences, and 4 patients with substitutive radicular resorption. Western blotting analysis showed that most of the fractions of the human dentinal extract were recognized by patients with resorption and controls in a similar way. Nevertheless, six of the fractions studied were not recognized as autologous by the immunological system of the patients. With the use of HPLC the human dentinal extract was fractioned and the subproducts collected by time interval. Results of ELISA demonstrated that the sera of patients with dental resorption presented larger amounts of IgG anti- total human dentinal extract and anti- fractions than control individuals, allowing a characterization of the sorological profile of the process. IgM anti-total human dentinal extract and anti- fractions in serum of patients with inflammatory resorption are in larger or equal amounts as the other studied groups. The seric profile of IgG and IgM allows to identify specificities inside of its own group of dental resorptions, dividing them into inflammatory and by substitution. There is an heterogenecity in the imunogenicity of the fractions of the dentinal extract. The cell cultures of patients with resorption had a smaller proliferation index than the controls when stimulated with total dentin extract or their fractions, but normal when stimulated with mitogens. The total human dentinal extract and its fractions presented capacity to induce a larger or equal concentration release of all the cytocins related to resorption in comparison to the controls without it. This was not observed with patients with dental substitution resorption, allowing the characterization of the groups with inflammatory and substitutive dental resorption. The obtained results reinforces an hypothesis that the dentin presents immunogenicity and the sorological profile of patients with dental resorption can be identified by blood biochemical analysis. Its precise screening can lead us to early diagnosis of dental resorption before it appears clinically and radiographically.

A asma é considerada uma das mais importantes doenças crônicas na infância, devido a sua alta incidência e ao aumento na morbidade observada nos últimos anos. Diversas anormalidades imunológicas têm sido descritas em pacientes com asma, incluindo hipogamaglobulinemia e deficiência de subclasses de IgG. O objetivo deste trabalho foi avaliar a imunidade humoral representada pelos níveis séricos totais imunoglobulinas, subclasses de IgG e níveis salivares de IgA e a imunidade específica representada pela resposta a antígenos timo-dependentes, antígenos timo--independentes tipo 1 e timo-independentes tipo 2 em crianças com asma brônquica moderada e grave. Foram coletadas amostras de sangue pré e pós-imunização com vacina Pneumo23® e saliva de 50 crianças, com idades entre 4 e 12 anos. Foram determinados os níveis séricos de IgG, IgA, IgM, IgE e subclasses de IgG (IgG2, IgG3 e IgG4) por nefelometria. A lgA secretória determinada nas salivas, os anticorpos IgG anti-toxóide tetânico, os anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111 e os níveis séricos anticorpos IgG pré e pós-vacinais anti-S. pneumoniae foram determinados por ensaio imunoenzimático. Foram avaliados os níveis séricos de IgE específicos para Dermatophagoides pteronyssinus, e o teste cutâneo para os alérgenos Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae e Blomia tropicalis. Foram observados níveis elevados de IgG total e das subclasses IgG2 e IgG3. Níveis altos IgG4 foram observados em 52% dos pacientes asmáticos, e deficiência de IgG4 apenas 8%. Os níveis séricos totais de IgM foram elevados em 24% dos pacientes, apenas um paciente apresentou resultado inferior ao valor de normalidade. Foi detectada deficiência de IgA sérica associada a deficiência de IgA secretória em 1 paciente. Foram detectados elevados níveis totais de IgE sérica e de anticorpos IgE anti-D. pteronyssinus (classes 4, 5 e 6). Testes cutâneos positivos Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae e Blomia tropicalis foram observados em 73% dos pacientes. Foram observados níveis séricos adequados de anti-toxóide tetânico em 76% das amostras e níveis normais de anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111, sendo que apenas 6% das crianças apresentaram níveis elevados IgM, e 4% de IgG anti-LPS 0111. Apesar da maioria dos pacientes apresentarem resposta de anticorpos anti-pneumococo, foram encontrados 2 pacientes deficiência de resposta de anticorpos para polissacarídeos. Em conclusão, foram identificadas imunodeficiências bem caracterizadas em 3 crianças asmáticas, que poderiam claramente levar a infecções, o que prioriza a importância da avaliação imunidade humoral. / Asthma is considered to be one of the most important chronic diseases childhood, with respect to its high incidence, and the increasing morbidity observed the last years. Several abnormalities have been described in patients with asthma, including hipogammaglobulinemia and IgG subclass deficiencies. The aim was to evaluate the humoral immunity represented by total seric immunoglobulin levels, IgG subclasses and salivary IgA levels and the specific immunity represented by response to thymus-dependent, thymus-independent type 1 and thymus-independent type 2 antigens in children with persistent moderate and severe bronchial asthma. Blood samples before and after immunization with Pneumo23® and saliva were collected from 50 asthmatic children (4-12 years old). IgG, IgA, IgM, IgE and IgG subclasses were analyzed by nephelometry. Secretory IgA, anti-tetanus IgG levels, anti-¬LPS 0111 IgG and IgM levels, and pre and post-immunization anti-pneumococcal IgG antibodies were measured by immunoenzymatic assay. Anti-Dermatophagoides pteronyssinus IgE levels and Prick tests with Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia tropicalis were also evaluated. Elevated levels were observed of total IgG, IgG2 and IgG3 subclasses. High IgG4 levels were detected 52% of the asthmatic patients, and IgG4 deficiency in 8%. High seric total IgM levels were founded in 24% of the patients, and only one presented IgM level bellow normal age-matched controls. Seric IgA deficiency associated with secretory IgA deficiency founded in one patient. Elevated seric IgE levels and anti-D. pteronyssinus IgE antibodies (classes 4, 5 and 6) were detected. Positive prick test to Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae and Blomia tropicalis were observed in 73% of the patients. An adequate anti-tetanus toxoid antibody response was observed 76% of the samples and normal anti-LPS 0111 IgG and IgM levels, although 6% of children presented high anti-LPS 0111 IgM levels, and 4% presented high anti-LPS 0111 IgG levels. Although most of the patients showed a good anti-pneumococcal response, two patients presented anti-polysaccharide antibody deficiency. In conclusion, well-characterized immunodeficiencies were identified in three asthmatic children, which could clearly lead to infections, emphasizing the importance evaluating the humoral immunity.

Orientador: Paulo Inácio da Costa / Banca: Virginia Paes Leme Ferriani / Banca: Cleni Mara Marzocchi Machado / Resumo: A alergia à proteína do leite de vaca (APLV) é comum no primeiro ano de vida e o seu reconhecimento e diagnóstico são difíceis. A proposta deste estudo é verificar a expressão de fenótipos linfocitários, as citocinas padrão Th1 e Th2, e a IgE total e específica em crianças com APLV, crianças atópicas (AC) e não atópicas (NAC) e suas respectivas mães.Foram colhidas amostras de sangue periférico para tipagem de linfócitos por citometria de fluxo, e dosadas as citocinas séricas, por CBA (Cytometric Bead Array) e dosado a IgE total e específica para as proteínas caseína, α lactoalbumina e β lactoglobulina , das crianças e suas mães nos grupos APLV, AC e NAC.Nas crianças do grupo APLV o início dos sintomas foi por volta dos 5,1 meses de idade, com idade média de 17,25 meses (sd=14,8 meses). As crianças e suas mães dos grupos alérgicos (APLV e AC) mostraram maior número de linfócitos CD4+CD25+ (p<0,05) em relação àquelas do grupo não alérgico (NAC), mas sem diferença significativa (p>0,05) entre os grupos APLV e AC. O grupo APLV mostrou maior tendência à presença do fenótipo CD25. As concentrações séricas das citocinas IL4, IL5, IL10, IL2, TNF-α e IFN-γ, entre os grupos estudados, não apresentaram diferenças estatísticas significantes (p>0,05), porém houve uma maior tendência à expressão da IL10 nas crianças do grupo APLV. A IgE total ficou mais evidente no grupo APLV do que nos demais grupos, e os principais alérgenos foram a α-lactoalbumina e β lactoglobulina. As crianças com alergia ao leite de vaca apresentam uma maior positividade de linfócitos CD4+CD25+, presença de IgE total e expressão de IL10 in vivo o que também pode sugerir um meio de controle da alergia para desenvolver tolerância à proteína do leite de vaca... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The allergy to cow‟s milk protein (CMA) is common in the first year of life and it is difficult to acknowledge and diagnose it. This study aims to verify the expression of lymphocyte phenotypes, detect the TH2 and TH1 pattern cytokines and the total and specific IgE in CMA children, in atopic (AC) and non-atopic (NAC) children and their respective mothers. Samples of peripheral blood were collected in order to type the lymphocytes by flow cytometry, dosed the serial cytokines by Cytometric Bead Array (CBA) and dosed the total IgE and specific IgE for the casein, α lactoalbumin and β lactoglobulin proteins of the children and their mothers in the CMA, AC and NAC groups. In the CMA children the symptoms first occurred around 5,1months old, with the average age of 17.25 months (sd=14.8 months). The children and their mothers from the allergic group (CMA and AC) showed significantly presence of CD4+CD25+ lymphocytes (p<0.05) higher than the non-allergic group (NAC), but without any significant difference (p>0.05) between the CMA and AC groups, although there was a tendency to an increase presence of these cells in the CMA group. The serial concentration of the IL4, IL5, IL10, IL2, TNF-α and IFN-γ cytokines, among the studied groups, did not present significant statistical difference (p>0.05), however, there was a tendency to an increase expression of IL10 in the CMA group of children. The total IgE was more evident in the CMA group than in the other ones and the main proteins which caused allergic reactions were α-lactoalbumin e β lactoglobulin. The children with cow‟s milk allergy presented a higher positivity of CD4+CD25+ lymphocytes, higher total IgE and an increase expression of in vivo IL10, which may also suggest a means of control of the allergy to develop tolerance to the cow‟s milk proteins... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Estudos em diferentes populaÃÃes tÃm mostrado que a vacinaÃÃo com a BCG concede proteÃÃo parcial contra a hansenÃase. Entretanto, a necessidade da revacinaÃÃo e seu impacto na resposta imune contra antÃgenos do Mycobacterium leprae à pouco compreendida, principalmente nas crianÃas que sÃo contatos destes pacientes com hansenÃase, e constituem uma populaÃÃo de risco para o adoecimento. Neste estudo, investigamos o papel da revacinaÃÃo com a BCG na modulaÃÃo da resposta imune em contatos menores de quinze anos de pacientes com hansenÃase. Amostras de sangue perifÃrico de vinte e cinco crianÃas, vacinadas com a BCG ao nascer, foram coletas antes e dois meses apÃs a revacinaÃÃo com a BCG. Suas cÃlulas mononucleares (PBMC) foram estimuladas com proteÃnas e peptÃdeos do M. leprae, dosando-se as quantidades de IFN-&#947; e IL-10 por ELISA. Anteriormente a revacinaÃÃo, foram coletas amostras para dosagem de IgM e IgG anti-PGL-1 e realizado o teste tuberculÃnico (PPD) para avaliaÃÃo da eficÃcia vacinal apÃs a revacinaÃÃo. Identificamos o potencial papel da BCG em estimular a produÃÃo de IFN-&#947; e/ou IL-10 dependendo do antÃgeno e da idade do contato, sem relaÃÃo com o PPD e sorologia anti-PGL-1. Estes resultados sugerem que a BCG modula a resposta imune dos contatos frente aos antÃgenos do M. leprae, com o frequente aumento nos nÃveis de IFN-&#947;, frente ao MLT, nas crianÃas com idade entre 1 a 4 anos (4.203 + 539,2 pg/mL prÃ-BCG x 9.141 + 860,9 pg/mL pÃs-BCG, p=0,001). Jà os contatos entre 5 a 9 anos mostram aumento na produÃÃo de IL-10 (210 +39,4 pg/mL prÃ-BCG x 680 + 76,74 pg/mL pÃs-BCG, p=0,001) e IFN-&#947; (4.912 + 1.065 pg/mL x 9.249 + 1.171 pg/mL, p=0,024). Estes achados sÃo acompanhados com o aumento dos casos de hansenÃase em crianÃas entre 5 a 9 anos na comunidade. Entretanto, nos contatos entre 10 a 15 anos a revacinaÃÃo falha em induzir o aumento de IFN-&#947; e IL-10. Os contatos de MB produziram, simultaneamente, altos nÃveis de IFN-&#947; e IL-10 em resposta ao MLT, enquanto que os contatos de PB somente produziram altos nÃveis de IFN-&#947; apÃs a revacinaÃÃo. A produÃÃo de IFN-&#947; e IL-10 frente aos peptÃdeos sintÃticos p38 e p69 indica que estes antÃgenos podem ser possÃveis marcadores de infecÃÃo. Assim, a BCG pode ser protetora, sendo eficiente em induzir o aumento da resposta por IFN-&#947; nestes contatos, frente aos antÃgenos do M. leprae. / Studies in different populations have shown that vaccination with BCG provides partial protection against leprosy. However, need of boost BCG vaccination and your impact in response immune against antigens of Mycobacterium leprae is poorly understood, mainly in children who are contacts of these patients with leprosy, and constitute population of risk for illness. This study, we investigated the paper a second dose of BCG given to contacts of leprosy patients under the age of fifteen years in modulate the response imune. Blood samples of twenty five children, who received a first dose of BCG at birth, were collected immediately before and two months after BCG revaccination. Your peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated by proteins and peptides of M. leprae, were measured IFN-&#947; and IL-10 by an ELISA assay. Before revaccination the serum anti-PGL1 IgG and IgM isotypes were measured by ELISA assays performed with native PGL1- coated microplates, and PPD-skin reaction was measured 2 to 3 months after revaccination. The study was approved by the local Ethic Committee, number 006-08, May 7th, 2008. BCG revaccination can induces IFN-gamma and/or IL-10 production related to antigen and age, but did not correlated with PPD-skin reaction or anti-PGL1 levels. The PBMCâs production of IFN-gamma against MLT (total M. leprae antigen) after BCG was higher on children under 4 years old (N= 8, 4203,0  539,2 pg/mL before BCG x 9141,0  860,9 pg/mL after BCG, p=0,015, Mann-Whitneyâs test). Children between 5 and 9 years old showed an increase either of IFN-gama levels (N=11, 4912  1065 pg/mL x 9249,0  1171 pg/mL, p=0,024, Mann-Whitneyâs test) or IL-10 levels (N=11, 210,6  39,4 pg/mL x 680,3  76,74 pg/mL, p=0, 0,001, Mann-Whitneyâs test). However children between 10 and 15 years old failed to increase the cytokines levels after BCG booster. Contacts of multibacillary patients produced higher IFN-gamma levels (N= 13, 4536,0  543,1 pg/mL x 9263,0  989,0 pg/mL, p=0,0012, Mann-Whitneyâs test) and IL-10 levels (N= 13, 235,9  46,5 pg/mL x 743,5  87,8, p=0,0012, Mann-Whitneyâs test) against MLT after BCG, but only IFN-gamma levels (N=12, 4975,0  995,8 pg/mL x 8126,0  788,6, p=0,0342, Mann-Whitneyâs test) increased after BCG on contacts of paucibacillary patients. The production of IFN-gamma and IL-10 against two synthetic peptides (p38 and p67), before and after BCG vaccine, were similar as seen with MLT antigen, but the absence of cytokine production against p69 help to identify this peptide as a effective diagnostic marker.

As reabsorções dentárias são inflamatórias e/ou substitutivas e representam o fenômeno principal que impede o sucesso dos transplantes e reimplantes dentários. Sua ocorrência pode ser conseqüência de traumatismos, periapicopatias e movimentação dentária induzida. Na odontogênese, a dentina fica sempre “escondida” do sistema imunológico e posteriormente protegida pelo esmalte, cemento e cementoblastos no lado externo e pela camada de odontoblastos internamente. Duas proteínas não colagênicas são específicas da dentina: a fosfoforina e a sialoproteína dentinária. Construiu-se a seguinte hipótese: a dentina, como antígeno seqüestrado, pode induzir fenômenos auto- imunes e participar da etiopatogenia das reabsorções dentárias. A partir de dentes humanos, obteve-se um extrato dentinário inoculado em coelhos para análise dos soros imunes. O extrato dentinário humano apresentou capacidade de indução à resposta imunológica e reagiu com anticorpos de coelho. Foram selecionados 12 pacientes com reabsorção radicular inflamatória apical ativa, 12 indivíduos saudáveis sem quaisquer evidências de reabsorção radicular e quatro pacientes com reabsorção radicular por substituição. Através da metodologia Western blotting, verificou-se que a maioria das frações do extrato dentinário humano foi reconhecida de forma semelhante por pacientes com reabsorção dentária e controles, mas seis delas foram reconhecidas de forma estatisticamente diferente, não sendo reconhecidas como próprias pelo sistema imunológico. O extrato dentinário humano foi fracionado e os subprodutos coletados por intervalo de tempo com a utilização de HPLC. Resultados de ELISA demonstraram que os soros de pacientes com reabsorção dentária apresentaram quantidades maiores de IgG antiextrato dentinário humano e antifrações que indivíduos controles, sendo possível traçar um perfil sorológico próprio e possivelmente identificador do processo. IgM sérica antiextrato dentinário humano e antifrações dos pacientes com reabsorção inflamatória estavam em quantidades maiores ou iguais aos demais grupos estudados. Os perfis séricos de IgG e IgM permitem identificar especificidades dentro do próprio grupo de reabsorções dentárias, dividindo-as em inflamatória e por substituição. Há heterogeneidade na imunogenicidade das frações do extrato dentinário. As culturas de células provenientes de pacientes com reabsorção dentária mostraram índices de proliferação menores que os controles quando estimulados com o extrato dentinário ou suas frações, mas normais quando estimulados com mitógenos. O extrato dentinário humano e suas frações apresentaram capacidade de induzir à liberação de todas as citocinas relacionadas com a reabsorção dentária em maior ou igual concentração nas células de pacientes com reabsorção inflamatória se comparados com os controles sem reabsorção. Isto não foi observado nas células de pacientes com reabsorção por substituição, permitindo identificar os grupos com reabsorção dentária. Os resultados obtidos confirmam a hipótese que a dentina apresenta imunogenicidade e que o perfil sorológico dos pacientes com reabsorção dentária pode ser identificado por análise bioquímica sangüínea. O seu delineamento preciso pode levar ao diagnóstico precoce da reabsorção dentária antes que se manifeste radiograficamente. / The dental resorptions are inflammatory and/or substitutive and represent the principal phenomenon that prevents the success of transplants and dental reimplants from happening. Its occurrence can be a consequence of traumatism, periapical disease and induced dental movements. During the odontogenesis the dentin is always "hidden" from immune system and later protected by the enamel, cement and cementoblasts on the external side and, by the odontoblasts layer on the internal side. Two non-colagenical proteins phosphophorin and dentinal sialoprotein are specific of dentin. It was constructed the following hypothesis: the dentin, as a "hidden" antigen, can induce auto- immune phenomena and participate in the etiopathogenesis of the dental resorptions. Starting from extracted human teeth, we obtained a human dentinal extract inoculated into rabbits to obtain the immune sera. The huma n dentinal extract was able to react with the antibodies and to induce immune response in the rabbit. It was selected 12 patients with radicular inflammatory active apical resorption, 12 healthy individuals without signs of radicular resorptions evidences, and 4 patients with substitutive radicular resorption. Western blotting analysis showed that most of the fractions of the human dentinal extract were recognized by patients with resorption and controls in a similar way. Nevertheless, six of the fractions studied were not recognized as autologous by the immunological system of the patients. With the use of HPLC the human dentinal extract was fractioned and the subproducts collected by time interval. Results of ELISA demonstrated that the sera of patients with dental resorption presented larger amounts of IgG anti- total human dentinal extract and anti- fractions than control individuals, allowing a characterization of the sorological profile of the process. IgM anti-total human dentinal extract and anti- fractions in serum of patients with inflammatory resorption are in larger or equal amounts as the other studied groups. The seric profile of IgG and IgM allows to identify specificities inside of its own group of dental resorptions, dividing them into inflammatory and by substitution. There is an heterogenecity in the imunogenicity of the fractions of the dentinal extract. The cell cultures of patients with resorption had a smaller proliferation index than the controls when stimulated with total dentin extract or their fractions, but normal when stimulated with mitogens. The total human dentinal extract and its fractions presented capacity to induce a larger or equal concentration release of all the cytocins related to resorption in comparison to the controls without it. This was not observed with patients with dental substitution resorption, allowing the characterization of the groups with inflammatory and substitutive dental resorption. The obtained results reinforces an hypothesis that the dentin presents immunogenicity and the sorological profile of patients with dental resorption can be identified by blood biochemical analysis. Its precise screening can lead us to early diagnosis of dental resorption before it appears clinically and radiographically.

O complexo teníase-cisticercose humana representa importante problema sócio-econômico e de Saúde Pública em países em desenvolvimento, incluindo nosso país. A forma mais grave da doença decorre da localização de cisticercos no Sistema Nervoso Central, a neurocisticercose. Devido à dificuldade de obtenção de parasitas a partir de suínos naturalmente infectados estudamos como fonte alternativa, preparações antigênicas de cisticercos de Taenia crassiceps (antígeno heterólogo), para pesquisa de anticorpos anti-cisticercos em líquido cefalorraquiano (LCR) de pacientes com neurocisticercose. Foram estudados os extratos antigênicos de líquido vesicular de cisticercos de Taenia crassiceps (LV-Tcra) e as frações purificadas por Concanavalina A (ConA-Tcra) obtida por coluna de afinidade com lectina e glicoprotéico fracionado (GP-Tcra) obtida a partir do antígeno LV-Tcra em eletroforese preparativa. Os antígenos LV-Tcra, ConA-Tcra e GP-Tcra para a detecção de anticorpos IgG anti-T. solium, foram ensaiados por ELISA em amostras de LCR e por imunoblot em amostras de LCR e soro. Foi utilizado também, kit comercial ELISA com antígeno de T. solium. A sensibilidade e a especificidade obtidas para os antígenos LV-Tcra, ConA-Tcra e GP-Tcra no teste ELISA foram de 100%, com boa reprodutibilidade. Os peptídeos em ordem de freqüência de reatividade para o antígeno LV-Tcra foram: 14-11kD (100%), 62kD (100%), 68kD (100%), 91kD (76%), 25kD (70%), 46KD (64%), 18kD (58%), 43kD (23%), 9-8kD (17%), 56kD (11%) e 32kD (11%). Para o antígeno ConA-Tcra foram identificados os peptídeos, por ordem de freqüência, 14kD (100%), 28kD (66%), 18kD (55%), 46kD (44%), 43kD (22%), 94kD (22%), 103kD (22%). Para o antígeno GP-Tcra, foram identificados somente os peptídeos de 14 - 18kD. Amostras de LCR de pacientes com esquistossomose não apresentaram reatividade com os extratos antigênicos e uma amostra de LCR de paciente com neurossífilis, apresentou forte reatividade eom os peptfdeos de baixo peso molecular&#8804;20kD, para os três antígenos, inclusive no teste ELISA comercial com antígeno de T. solium. Os resultados confirmam que os antígenos de T. crassiceps são importantes fontes alternativas de extratos antigênieos. As frações glicoprotéicas mostraram-se eficientes na detecção de anticorpos anti-T. solium em amostras de LCR e soro de pacientes com neurocisticercose. / The human taeniasis-cysticercosis complex represents an important socioeconomic and Public Health problem in developing countries, including Brazil. The most severe form of the disease is due to the localization of cysticerci in the Central Nervous System, i.e. neurocysticercosis. Due to the difficulty in obtaining parasites from naturally infected swine, we studied an alternative source consisting of Taenia crassiceps cysticerci (heterologous antigen) for the search of anti-cysticercus antibodies in cerebrospinal fluid (CSF) from patients with neurocysticercosis. We studied the antigenic extracts of vesicular fluid of Taenia crassiceps cysticerci (VF-Tcra) and the purified fractions Concanavalin A (ConA-Tcra) obtained from an affinity column with lectin and fractionated glycoprotein (GP-Tcra) obtained from the VF-Tcra antigen by preparative electrophoresis. The VF-Tcra, ConA-Tcra and GP-Tcra antigens for the detection of IgG antibodies were assayed by ELISA in CSF samples and by immunoblot in CSF and serum samples. A commercial ELISA kit with T. solium antigen was also used. The sensitivity and specificity obtained for the VF-Tcra, ConA-Tcra and GP-Tcra were 100% in the ELISA test, with good reproducibility. The peptides in order of frequency of reactivity with the VF-Tcra antigen were: 14-11kD (100%), 62kD (100%), 68kD (100%), 91kD (76%), 25kD (70%), 46KD (64%), 18kD (58%), 43kD (23%), 9-8kD (17%), 56kD (11%), and 32kD (11%). The following peptides, in order of frequency were identified for the ConA-Tcra antigen: 14kD (100%), 28kD (66%), 18kD (55%), 46kD (44%), 43kD (22%), 94kD (22%), and 103kD (22%). Only peptides of 14-18kD were identified for the GP-Tcra antigen. CSF samples from patients with schistosomiasis did not show reactivity with the antigenic extracts and a CSF sample from a patient with neurosyphilis presented strong reactivity with low molecular weight (&#8804;20kD) peptides for the three antigens also in the commercial ELISA with the T. solium antigen. The results confirm that T. crassicepsantigens are important alternative sources of antigenic extracts. The glycoprotein fractions proved to be efficient in detecting anti-T solium antibodies in CSF and serum samples trom patients with neurocysticercosis.

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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthlea@bce.unb.br) on 2008-10-22T15:47:58Z No. of bitstreams: 1 2008_AliceMeloRibeiro.pdf: 765803 bytes, checksum: 64d83181d608218897c1293017932928 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2008-11-17T13:35:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AliceMeloRibeiro.pdf: 765803 bytes, checksum: 64d83181d608218897c1293017932928 (MD5) / Made available in DSpace on 2008-11-17T13:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AliceMeloRibeiro.pdf: 765803 bytes, checksum: 64d83181d608218897c1293017932928 (MD5) / As proteínas de choque térmico (HSPs) são reconhecidas como importantes moléculas na modulação do sistema imunológico e são altamente conservadas entre os diferentes organismos. A vacina DNA-hsp65 de Mycobacterium leprae demonstrou efeitos profiláticos e imunoterapêuticos contra diversas doenças como, por exemplo, tuberculose, artrite e leishmaniose. Neste trabalho, avaliamos a eficácia e o potencial imunomodulador na imunização e no tratamento de camundongos infectados experimentalmente com o fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis, o agente etiológico da Paracoccidioidomicose, a mais importante micose endêmica na América Latina. A vacina DNA-hsp65 conferiu proteção aos animais contra o P. brasiliensis em ensaios de imunização ou de tratamento como indicado por: redução significativa no pulmonar fúngica carga (UFCs); diminuição da perda da função pulmonar e na presença de colágeno em granulomas (revelada por análises histológicas do tecido pulmonar); reestabelecimento proliferativo das células de baço; perfil de resposta imunológica de padrão Th1 com níveis elevados de IL-12, IFN - g, TNF-α e IGg2a e baixos níveis de IL-4, IL-10 e IgG1. Esses dados, em conjunto, indicam que, em BALB/c, tanto a imunização como o tratamento com a vacina DNA-hsp65 conferem proteção no curso da Paracoccidioidomicose. Nossos resultados abrem novas perspectivas sobre a prevenção e tratamento para outras micoses sistêmicas. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Heat shock proteins (HSPs) are recognized as important molecules in the modulation of the immune system and are highly conserved among different organisms. The DNA-hsp65 vaccine from Mycobacterium leprae (M. leprae) has been shown to have prophylactic and immunotherapeutic effects against various diseases, for instance, tuberculosis, arthritis and leishmaniasis. In this work, we evaluated the effectiveness and immunomodulatory potential of the DNA-hsp65 immunization and treatment in model BALB/c mice infected with Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), the etiological agent of Paracoccidioidomycosis, the most important endemic mycosis in Latin America. The DNA-hsp65 vaccine conferred protection against this pathogen for both, the prophylactic and therapeutic assays, as indicated by: a significant reduction in pulmonary fungal burden (CFUs); a decrease in pulmonary function loss and in the presence of collagen in granulomas (revealed by histological analyses of the pulmonary tissue); the reestablishment of spleen cells proliferation; the Th1 pattern immune response with higher levels of IL-12, IFN- γ, TNF- and IGg2a and lower levels of IL-4, IL-10 and IgG1. Together, these findings indicate that, in mice, the immunization and treatment with the DNA-hsp65 vaccine protect mice against Paracoccidioidomycosis. Our results open new perspectives on prevention and treatment of other systemic mycoses.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-09-14T19:32:53Z No. of bitstreams: 1 Dissert_ Hernandez Moura Silva.pdf: 4796639 bytes, checksum: 25de57ac126c223d229f1cdfef26506e (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-06-30T20:24:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_ Hernandez Moura Silva.pdf: 4796639 bytes, checksum: 25de57ac126c223d229f1cdfef26506e (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-30T20:24:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_ Hernandez Moura Silva.pdf: 4796639 bytes, checksum: 25de57ac126c223d229f1cdfef26506e (MD5) Previous issue date: 2008 / O anticorpo anti-CD3 tem sido utilizado como imunoterápico na prevenção da rejeição a órgãos transplantados e considerado um fármaco promissor para o tratamento de doenças auto-imunes. Entretanto, o único anticorpo anti-CD3 utilizado para uso clínico aprovado pelo FDA, o OKT3, possui origem murina o que gera uma resposta imunogênica quando administrado, impossibilitando uma utilização prolongada e, assim, diminuindo sua eficácia. Uma técnica que vem ao encontro da solução desse problema é a humanização de anticorpos, que por meio de manipulações gênicas propicia um aspecto “mais humano” a essa molécula, atenuando a resposta imunogênica desencadeada. Nesse sentido, foi avaliada a atividade ligante e a função efetora de duas versões humanizadas do anticorpo anti-CD3 apresentando o resíduo murino treonina (T) ou o resíduo humano arginina (R) na posição 86 da cadeia variável pesada. Posição essa, considerada importante estruturalmente. Para expresão dos anticorpos humanizados foram construídos vetores de expressão dicistrônicos, os quais foram utilizados para produção das imunoglobulinas em células de mamíferos da linhagem CHO, de forma estável. Os anticorpos produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade para posterior análise da atividade ligante e da função efetora. Os resultados indicam que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos. Contudo, são incapazes de bloquear completamente a ligação do anticorpo murino OKT3 à superfície de linfócitos, em ensaios de competição. Em conjunto com análises estruturais, esses dados indicam uma perda de afinidade das versões humanizadas provavelmente devido à substituição de resíduos importantes estruturalmente na cadeia leve humanizada. As versões humanizadas também apresentam uma capacidade mitogênica menor que a apresentada pelo OKT3, corroborando a perda de afinidade desses anticorpos. Esses dados sugerem que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos, mas o processo de humanização levou a uma diminuição da afinidade original desses anticorpos. Nesse sentido, para se restabelecer a atividade ligante dos anticorpos recombinantes sugerimos a realização de algumas mutações específicas para com isso avaliar o seu futuro uso clínico. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Anti-CD3 antibodies have been used for the prevention of organ allograft rejection and are also considered a promising immunotherapic for autoimmune diseases treatment. Currently, there is only one anti-CD3 antibody approved by FDA for clinical use, the OKT3. Unfortunately, due to its murine origin, it promotes an immunogenic reaction when administrated, limiting its long-term use and reducing the treatment effectiveness. To solve this problem we have proposed humanized versions of this anti-CD3 to avoid its immunogenic properties. In this work was evaluated the binding activity and effector function of two humanized anti-CD3 antibodies. The first one has the murine residue threonine (T) 86 VH position while the second version shows the human residue arginine (R) at position 86 in VH. Modeling analysis indicated that this position is structurally important. To express the recombinant antibodies we constructed a dicistronic expression vector and produced the immunoglobulins in CHO cell lines. To analyze the binding activity and effector function, the recombinant proteins were previously purified by affinity chromatography. The results show that humanized antibodies were able to binding to the human CD3 on the T lymphocyte surface. However, they weren’t able to completely block OKT3 binding to T lymphocyte surface on competitive assays. Along with structural analysis, this data indicate an affinity loss of humanized versions probably due the substitution of important residues on humanized VL. The humanized versions also presented a less mitogenic activity than that observed by OKT3, corroborating the affinity loss of these antibodies. These data suggest that the humanized antibodies are able to bind to human CD3, but the humanization procedure caused a decrease on recombinant antibody affinity, compared with OKT3. To restore the binding activity of these antibodies specific mutations and back mutations must have to be taken in order to permit its future clinical use evaluation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005Bitstream added on 2014-06-13T21:02:33Z : No. of bitstreams: 1 ferreirajr_rs_dr_botfm.pdf: 829148 bytes, checksum: 288ac8d28a1275e2f0667238f74937a9 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A técnica de ELISA foi utilizada para avaliar e comparar a resposta imune humoral de ovinos jovens para a produção de soro anticrotálico. Durante o processo de soroprodução, foi realizada a avaliação clínica e ponderal dos animais. Os parâmetros utilizados foram hemograma completo, dosagem de uréia, creatinina, aspartato aminotransferase, proteínas totais, albumina, globulina. O peso dos animais foi aferido quinzenalmente durante o experimento. A capacidade de neutralização do soro produzido a partir de veneno de serpente Crotalus durissus terrificus, nativo (VN) e irradiado (VIr) com Cobalto–60 foi verificada por meio de desafios in vitro. Um grupo de seis animais recebeu veneno nativo, o segundo grupo recebeu veneno irradiado e o terceiro grupo foi o controle. Os animais receberam seis imunizações durante 84 dias com intervalo de 14 dias. Houve diferença significativa (p<5%) no teste de ELISA do perfil de anticorpos produzidos pelos grupos experimentais (VN<VIr). Não houve diferença significativa (p<5%) para os testes bioquímicos, hemograma e peso dos animais entre os três grupos testados. O grupo imunizado com veneno irradiado apresentou perfil de anticorpos maior que o grupo imunizado com veneno nativo. A capacidade de neutralização do soro produzido a partir do VIr foi cinco vezes maior quando comparado ao soro produzido com VN. A avaliação clínica e ponderal, mostrou que ovinos em fase pós-desmame, não tiveram alterado seus perfis fisiológicos e apresentaram um excelente ganho de peso durante o período experimental. Estes resultados demonstram uma nova perspectiva para a utilização de ovinos visando a produção comercial de soro anticrotálico, que poderá ser aplicado no tratamento do envenenamento de seres humanos e animais. O custo para sua produção poderá ser reduzido pela posterior utilização dos ovinos hiperimunizados na alimentação humana. / The ELISA technique was used to evaluate and compare the humoral immune response of young ovines to anticrotalic serum production. During serum production, the clinical and weight evaluation of the animals was performed. The parameters utilized were complete blood count, and dosage of urea, creatinine, aspartate aminotransferase, total proteins, albumin and globulin. The animals weight was verified fortnightly during the experiment. The neutralization capacity of the serum produced from the snake Crotalus durissus terrificus natural (NV) and Cobalt-60-irradiated venom (IrV) was evaluated by in vitro challenges. One group of six animals received natural venom, the second group received irradiated venom, and the third was the control group. The animals received six immunizations during 84 days with an interval of 14 days. There was a significant difference (p<5%) in the ELISA test for the profile of the antibodies produced by the experimental groups (NV<IrV). There was no significant difference (p<5%) for biochemical tests, complete blood count, and animals weight between the three groups tested. The group immunized with irradiated venom showed antibodies profile higher than the group immunized with natural venom. The neutralization capacity of the serum produced from the IrV was fivefold higher when compared to the serum produced with NV. The clinical and weight evaluation showed that the ovines in post-weaning phase did not have their physiological profiles altered, and showed an excellent increase in weight during the experimental period. These results indicate a new perspective for the utilization of ovines, aiming the commercial production of anticrotalic serum, which may be applied in the treatment of human and animal envenomation. The cost for its production may be reduced by the posterior utilization of hyperimmunized ovines in human feeding.