La sonoporation, c'est-à-dire l'utilisation d'ultrasons pour augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire et permettre le transfert de molécules dans la cellule, est une méthode de transfection alternative intéressante. Cependant, même s'il est généralement admis que la cavitation acoustique joue un rôle important dans la sonoporation, les mécanismes physiques sous-jacents à ce phénomène ne sont pas totalement compris. Pour obtenir des informations sur les interactions entre les bulles, les cellules et le milieu environnant, nous avons développé un système de sonoporation adapté à la visualisation en temps-réel sous microscope et dédié aux cellules adhérentes. Le champ acoustique dans le puits cellulaire est composé d'ondes stationnaires et possède donc des positions d'équilibres pour les bulles au fond du puits, c'est-à-dire à proximité des cellules. Après avoir confirmé que les effets biologiques sont liés à la cavitation inertielle, un système de régulation de la cavitation inertielle a été implémenté pour augmenter la reproductibilité de la sonoporation. L'utilisation de cette régulation permet de s'affranchir des problèmes d'initiation et de maintien de l'activité de cavitation ainsi que de travailler sans ajout d'agents de contraste ultrasonore. Ce système permet de sonoporer des cellules adhérentes et ceci de manière plus reproductible lors de l'utilisation de la régulation qu'à intensité acoustique fixée. L'utilisation de la régulation permet également de s'affranchir de la température du milieu (à 24 ou 37 °C). De plus, la sonoporation des cellules ne semblent pas induire d'effets négatifs sur la reprise de croissance des cellules. L'utilisation de membrane modèle (des bicouches lipidiques fluorescentes) permet l'observation des interactions bulles-membrane, principalement sous la forme de dégâts de type fissures ou impacts présents à la fois sur les ventres et nœuds de pression acoustique. Ces positions particulières sont également le siège du détachement cellulaire et de la sonoporation / Sonoporation, the use of ultrasound to increase cell membrane permeability and allow the transfer of molecules into cells, is an interesting alternative method of transfection. However, even if it is generally admitted that acoustic cavitation plays an important role in sonoporation, the physical mechanisms acting during sonication are not fully understood. To obtain information on the interaction between bubbles, cells and the _owing medium during sonication, we designed a sonoporation device adapted to real-time microscope visualization and dedicated to adherent cells. The acoustic field in the well is composed by standing waves and provides cavitation bubble equilibrium positions at the bottom of the well, near cells. After biological effects have been confirmed to be linked to inertial cavitation, a regulation device on inertial cavitation has been implemented in order to improve reproducibility of sonoporation. This regulation allows overcoming problems linked to initiation and time stability of cavitation activity without adding ultrasound contrast agents in the medium. The sonoporation device allows the sonoporation of adherent cells, and this, with more reproducible results when using regulation instead of a fixed acoustic intensity. The cavitation control allows also to obtain the same biological effects at 24 and 37 °C. Furthermore, cell sonoporation does not apparently induce negative effects on cell growth. The use of a membrane model (fluorescent lipid bilayer) allows the observation of bubbles-membrane interactions, principally in the form of damages as cracks or impacts present at both nodal and anti-nodal positions of the acoustic field. Cell detachment and sonoporation appear also at these particular locations

L'application d'ultrasons sur une tumeur, où des liposomes se sont accumulés, permet potentiellement de libérer le médicament mais aussi d'en favoriser l'absorption dans les cellules. La cavitation inertielle ultrasonore est le phénomène pressenti pour la libération sous ultrasons de médicament encapsulé dans de petits liposomes solides. Elle est très dépendante des conditions expérimentales et peut-être intense et imprévisible. L'objectif principal du travail réalisé dans le cadre de cette thèse est de contrôler et quantifier la cavitation inertielle, pour induire le largage de médicaments encapsulés dans des liposomes. Dans cette optique, une dose de cavitation inertielle (DC), basée sur le filtrage du bruit large bande émis lors de ce régime de cavitation, est mise au point in vitro pour suivre le largage de médicament encapsulé. Sous divers régimes d'ultrasons pulsés, la DC a été validée en dosant chimiquement les radicaux hydroxyles générés lors de l'implosion des bulles. Les tests menés sur diverses formulations de liposomes contenant de la doxorubicine (dox) ont montrés une haute corrélation entre le taux de largage de dox et la DC permettant de conclure que la cavitation inertielle est impliquée dans ce largage. Le rôle de la température sur la production de radicaux hydroxyles et la libération de dox a également été exploré. Les expériences réalisées ont permis de sélectionner les formulations les plus sensibles aux ultrasons pour les tester sur des rats implantés avec des tumeurs prostatiques. Après plusieurs expériences in vivo menées avec différents dispositifs ultrasonores et formulations de liposomes, le bénéfice du traitement combiné a pu être démontré. / The sonication of a tumor, where liposomes have been accumulated, allows potentially to release encapsulated drug and to promote its absorption in cells. Ultrasonic inertial cavitation is supposed to be implicated in the release of drug encapsulated in small solid liposomes under ultrasonic exposure. Inertial cavitation is strongly dependent on experimental conditions and can be very intense and unpredictable. The main objective of this thesis was to control and quantify inertial cavitation in order to induce drug release from liposomes. In this purpose, an inertial cavitation dose (CD), based on broadband noise emission associated with inertial cavitation, was defined to monitor in vitro encapsulated drug release. The CD was chemically validated with the dosing of hydroxyl radicals generated by bubbles collapses under various pulsed ultrasound exposures. A high correlation between doxorubicin (dox) release rate from liposomes and CD was de monstrated for all liposomes formulations tested and under different pulsed ultrasound exposures. The role of temperature on hydroxyl radical production and dox release was also investigated. The performed experiments allowed selecting the liposomes formulations that are the most sensible to ultrasound in order to test them on rats implanted with prostatic tumors. After several campaigns of in vivo experiments performed with various ultrasonic setups and liposomes formulations, the benefit of the combined treatment was demonstrated.

Dans l’objectif de limiter les effets destructeurs de l’implosion de bulles de cavitation ultrasonore, un régime d’oscillations stables de bulles doit potentiellement être visé pour des applications thérapeutiques sensibles comme l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique. Cependant, garantir une activité d’oscillations stables est difficile de par le caractère stochastique de la cavitation ultrasonore, et de la coexistence de bulles oscillantes (cavitation stable) et implosantes (cavitation inertielle) au sein d’un nuage de bulles. Il est donc nécessaire de contrôler spatialement et temporellement le phénomène de cavitation en discriminant les régimes de cavitation stable ou inertielle, au cours de la durée d’un tir ultrasonore, et ce en régime pulsé. Dans une première étude, la dynamique d’un nuage de bulles monodisperses et uniformément réparties dans l’espace met en évidence l’effet de l’interaction entre bulles sur le seuil de cavitation stable : il s’abaisse en pression et la fréquence de résonance des bulles se décale en fonction de la densité de bulle. Il est ainsi montré qu’il existe une densité de bulle optimale pour l’émission de la composante sous-harmonique. Ensuite, une stratégie de contrôle est développée, basée sur une boucle de rétroaction régulant la signature acoustique d’un régime donné de cavitation. L’utilisation de la stratégie d’asservissement permet de discriminer les régimes de cavitation stable et inertielle au cours du temps, mais aussi de garantir une activité de cavitation plus stable temporellement, plus reproductible, et ce pour des énergies acoustiques moyennes délivrées inférieures. Enfin, le processus de contrôle est utilisé expérimentalement pour des applications in-vitro de sonoporation cellulaire. Tout d’abord, une étude de sonoporation en cavitation inertielle régulée met en évidence l’amélioration de la reproductibilité des taux de sonoporation obtenus, et la possibilité de s’affranchir de l’utilisation d’agents de contraste comme agents de nucléation. Ensuite, une étude en cavitation stable régulée met en évidence la possibilité de sonoporer des cellules en limitant les activités de cavitation inertielle, et donc potentiellement en limitant la lyse cellulaire / In the aim of limiting the destructive behavior of collapsing cavitation bubbles, an exclusively stable cavitation state is targeted for sensitive therapeutics applications like blood-brain barrier opening. Ensuring a stable cavitation regime is complex because of (i) the coexistence of stably oscillating bubbles and collapsing bubbles in the same bubble cloud, and (ii) the stochastic behavior of the phenomenon during time. Therefore, it is necessary to control spatially and temporally the cavitation activity, by discriminating the stable from the inertial regime. Firstly, the theoretical study of the dynamics of a monodisperse and homogeneous cloud shows a modification of the stable cavitation threshold as a function of the bubble density: the subharmonics emission threshold is lowered and the resonance frequency is shifted. The study leads also to the expression of a particular microbubbles density leading to optimized subharmonics emission. Secondly, a real-time control strategy based on a feedback loop process on subharmonics emission is designed. The use of this strategy allows discriminating the two cavitation states during time, and ensures a better reproducibility, time-stability and an acoustic energy gain. The control device is used for cells sonoporation in-vitro. In a first study, the sonoporation by inertial cavitation control is performed in a stationary ultrasonic field configuration. This leads to high sonoporation efficiency coupled to the possibility of counterbalancing the use of supplementary nuclei (encapsulated microbubbles). In a second one, the stable cavitation control applied in a focused ultrasound configuration field pinpoints the possibility of sonoporating cells without inertial cavitation, and then to limit cell lysis

Il a été montré que la cavitation acoustique pouvait se révéler utile dans l'administration de médicaments pour de nombreuses applications biologiques et médicales. Cette thèse commence par une présentation de la cavitation ultrasonore et des mécanismes d'action mis en jeu pour la délivrance de médicaments. A la fin de ce cette synthèse, un dispositif à deux transducteurs ultrasonores disposés de manière confocale est présenté pour résoudre certains des problèmes actuels dans le domaine. Il est ensuite mis en oeuvre dans différentes études de faisabilité. La thèse est organisée en 5 chapitres : 1. L'utilisation de la cavitation acoustique dans un contexte biomédical est présentée ici dans une revue générale. Ce chapitre comprend l'état de l'art pour la génération de cavitation, les techniques expérimentales qui sont actuellement mises en oeuvre pour la mesure de la cavitation, et les approches cliniques et précliniques pour l'utilisation de la cavitation in vivo pour différents types de tissu biologique. 2. Le dispositif ultrasonore utilisé pour toutes les études de cette thèse est ensuite décrit. Il est caractérisé acoustiquement et comparé avec un simple transducteur dans le but de démontrer son efficacité pour la génération de la cavitation. Cette comparaison est d'abord faite par une quantification chimique du niveau de cavitation. A puissance constante, le dispositif à deux transducteurs confocaux est bien plus efficace pour générer de la cavitation. Les causes de cette observation, notamment la réduction de la propagation non-linéaire et la stabilisation du nuage des bulles par les forces Bjerknes, sont ensuite étudiées par des mesures acoustiques, des simulations de pression en régime linéaire et un suivi par une caméra ultra rapide des nuages de bulles induits. 3. Le prototype confocal est utilisé in vivo sur des tumeurs sous cutanées en conjonction avec des liposomes. Dans un premier temps, des essais sous IRM démontrent la possibilité de larguer le contenu des liposomes localement par la cavitation inertielle délivrée par le dispositif. Une seconde étude avec une formulation liposomale de doxorubicine a permis de démontrer l'amélioration de la réponse thérapeutique de la chimiothérapie après application de la cavitation inertielle.. 4. Une étude de faisabilité de l'interférence de l'ARN (RNAi) sur un petit nombre d'animaux est réalisée avec le dispositif confocal et des molécules de siRNA encapsulées dans des liposomes Les expériences sont conduites in vivo avec une xénogreffe de tumeur de sein humain. Après une phase de réglage des paramètres ultrasonores pour limiter la toxicité du traitement, on observe une inhibition significative du gène ciblé. 5. Une deuxième étude de faisabilité est réalisée pour étudier la potentialisation de la chimiothérapie avec l'évérolimus dans un modèle de chondrosarcome de rat. Les traitements ultrasonores et les chimiothérapies sont répétés. Sur un petit nombre d'animaux, on montre l'innocuité du traitement ultrasonore, et l'efficacité en conjonction avec l'agent anti tumoraux, évérolimus / Acoustic cavitation has been shown to be a useful tool in drug delivery for many different biological tissues and indications, and this thesis aims to contribute to the knowledge of cavitation from a drug delivery perspective. This thesis seeks to synthesize the current knowledge and practice concerning acoustic cavitation in a biomedical context, and to present a high intensity confocal ultrasound (US) prototype to address some of the current problems in the field and to give a proof of concept for the therapeutic efficacy of such a prototype. The thesis is organized in 5 chapters: 1. The use of acoustic cavitation in a biomedical context is presented here in a general review. This review comprises the state of the art for cavitation generation, experimental techniques currently being implemented for the measurement of cavitation, and the clinical and preclinical approaches to the use of cavitation in vivo on a tissue by tissue basis. 2. The high intensity confocal US prototype used for all studies in this thesis is presented here. It is characterized in terms of the advantages it gives for the generation of cavitation. Enhancement of cavitation is first demonstrated chemometrically with a fluorescent dosimeter compared to a single transducer at the ultrasonic focus. The mechanisms for cavitation enhancement are then investigated with acoustic measurements, linear pressure simulations, and high speed camera data. 3. The confocal US prototype in used in conjunction with a liposomal formulation of doxorubicin is performed in which a therapeutic enhancement of tumor inhibition is presented. The mechanism of this enhancement is investigated with liposomally encapsulated lanthanide contrast agents and magnetic resonance imaging. 4. A small scale proof of concept for the use of RNA interference using the confocal prototype, and liposomally encapsulated siRNA molecules. The experiments are performed In vivo with a xenograft of human breast tumor. This study also includes data for the safety of the US exposure on a mouse treated one time. 5. Another small scale proof of concept of the use of the confocal device on potentiating chemotherapy with the drug everolimus in a rat chondrosarcoma model. The studies presented here also investigate the use of multiple US exposures on the same tumor in a combined drug / US treatment regimen