Le bacille de la peste, Yersinia pestis, a une vie parasitaire au cours de laquelle il oscille le plus souvent d’un hôte mammifère à l’autre par l’intermédiaire des puces, et plus rarement par voie aéroportée. Comme tel, Yersinia pestis doit rapidement ressentir et répondre aux variations brutales de son environnement afin se maintenir dans la nature. C’est pourquoi, nous avons étudié le rôle des systèmes de régulation à deux composants dans la peste compte tenu que ces systèmes sont connus pour avoir un rôle clef dans l’adaptation des bactéries aux changements environnementaux. En plus du système PhoP-PhoQ dont l’importance chez le mammifère et la puce a été précédemment révélée, nous avons découvert que quatre systèmes sont requis pour le cycle de la peste. Plus particulièrement, l'un d'entre eux permet une colonisation optimale du tube digestif de la puce alors que les 3 autres systèmes sont impliqués dans la production de biofilm, un processus indispensable à une transmission optimale du bacille par les puces. Nous avons aussi découvert que le système OmpR-EnvZ est l’unique système, en plus du système PhoP-PhoQ, requis pour la production de la peste bubonique, septicémique et pulmonaire. Nos travaux, menés in vitro, ex-vivo et in vivo suggèrent que le rôle du système OmpR-EnvZ serait de protéger la bactérie contre les effecteurs toxiques sécrétés par les polynucléaires neutrophiles dans les tissus et, ceci tout au long du processus infectieux. / Plague bacillus, Yersinia pestis has a parasitic lifestyle in which it is mainly transmitted between mammilian hosts through the bite of infected fleas, and in rare cases through infected droplets. Thus, Yersinia pestis must rapidly sense and respond to wide and brutal changes of its environment in order to survive. We aimed at decipher the role of two component regulatory systems in plague, as they are known to be key players in bacterial adaptation to the environment. In addition to the already described PhoP-PhoQ system, we found out that four systems are required for plague cycle. We showed that one of these systems is important for an optimal colonization of the flea's digestive tract, while the three others are required for biofilm production, an essential step in the bacillus transmission by the fleas. We also found out that OmpR-EnvZ, in addition to PhoP-PhoQ, is the only one to be important to produce bubonic, septicemic and pulmonary plague. Our in vitro, ex-vivo and in vivo works suggest that the OmpR-EnvZ system would be to protect bacterial against toxic effectors that are produced by polymorphonuclear leukocytes all along the infectious process.

Neutrophils are critical for acute inflammatory responses initiated by infection or tissue injury. Multiple inflammatory genes and signaling pathways are activated rapidly to regulate neutrophil functions. Ikaros is a critical transcription factor involved in the regulation of myeloid cells differentiation. Transcription analysis of the hematopoietic cells in the absence of Ikaros indicates differences in expression of genes encoding signaling factors. However, the impact of Ikaros on signaling mechanisms in myeloid cells during inflammation remains to be defined. The aim of this study was to define whether the lack of Ikaros expression could perturb signaling and thereby, neutrophil function/response during inflammation. We studied purified neutrophils from the bone marrow of WT and Ikaros+/- mice. We found that the expression level of Ikaros is important and governs neutrophil apoptosis, NETosis, myeloperoxidase activity and ROS production in response to bacterial DNA. We also performed in vivo experiments using a mouse model of severe pneumonia. We show that partial deletion of Ikaros (Ikaros+/- mice) is associated with impaired elimination of bacteria. To define how the crippled expression of Ikaros could affect signaling in neutrophils, we performed a high-throughput microarray to identify variations in protein kinase activity. The microarray data suggest that multiple signaling pathways, including the P38 MAPK pathway, could be affected by Ikaros. Accordingly, we employed selective kinase inhibitors to further define the importance of these kinases in neutrophil function. Finally, our results indicate the critical role of Ikaros in the regulation of Toll Like Receptor 4 and 9 as well as the cytosolic DNA sensor IFI204 in neutrophils. This study provides novel information on the role of Ikaros in the regulation of neutrophil functions and a rational basis for the development of novel therapeutic approaches targeting Ikaros for the treatment of patients with infections, and sepsis in particular. / Les neutrophiles sont essentiels pour les réponses inflammatoires aiguës initiées par une infection ou une lésion tissulaire. De multiples gènes inflammatoires et des signaux sont activés rapidement pour réguler les fonctions des neutrophiles. Ikaros est un facteur de transcription critique impliqué dans la régulation de la différenciation des cellules myéloïdes. L'analyse de transcription des cellules hématopoïétiques en l'absence d'Ikaros indique des différences dans l'expression des gènes des facteurs de signalisation. Cependant, l'impact d'Ikaros sur les mécanismes de signalisation dans les cellules myéloïdes pendant l'inflammation reste à définir. Le but de cette étude était de définir si le manque d'expression d'Ikaros pouvait perturber la signalisation et ainsi la fonction / réponse des neutrophiles pendant l'inflammation. Nous avons utilisé les neutrophiles purifiés de la moelle osseuse des souris WT et Ikaros +/-. Nous avons trouvé que le niveau d'expression d'Ikaros est un facteur important pour contrôler l'apoptose des neutrophiles, la NETosis, l'activité de la myéloperoxydase et la production d’espèces d'oxygène réactives en réponse à l'ADN bactérien. Nous avons également fait des expériences in vivo en utilisant un modèle murin de pneumonie. Nous avons trouvé que la suppression partielle d'Ikaros (souris Ikaros +/-) est associée à l'élimination réduite des bactéries. Pour expliquer comment l'expression plus faible d'Ikaros pourrait affecter la signalisation dans les neutrophiles, nous avons fait une analyse ‘’ high-throughput microarray ‘’ pour identifier les variations de l'activité de la protéine kinase. Les données de microarray suggèrent que plusieurs signaux, comme le P38 MAPK, sont affectées par Ikaros. En conséquence, nous avons utilisé des inhibiteurs sélectifs des kinases pour mieux définir l'importance de ces kinases dans la fonction des neutrophiles. De plus les résultats présentés indiquent l’importance du facteur Ikaros pour la régulation de l’expression des ‘Toll Like Receptor’ 4 et 9, ainsi que du senseur d’ADN cytoplasmique IFI204 dans les neutrophiles. Cette étude présente de nouvelles informations sur le rôle d'Ikaros dans la régulation des fonctions des neutrophiles et une base rationnelle pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant Ikaros pour le traitement des patients avec d'infections et de septicémie en particulier.

Les cellules dendritiques classiques (cDC) jouent un rôle crucial dans l’efficacité des réponses immunitaires précoces conduisant au contrôle ou à la persistance virale. A cet égard, il a été montré que l’infection par le VIH induit des dysfonctions des cDC caractérisées par une inhibition de leur capacité à stimuler les cellules T et associées à la progression de la maladie. Parmi les mécanismes moléculaires impliqués dans ces dysfonctions, des études in vitro ont mis en évidence le rôle du récepteur inhibiteur LILRB2. Néanmoins, la dynamique d’expression de LILRB2 ainsi que son rôle dès les premiers stades de l'infection restent à démontrer. Chez des patients en primo-infection VIH-1, nous observons une augmentation de l’expression de LILRB2 et de ses ligands HLA-I à la surface des cDC. Par ailleurs, la cinétique d’expression de LILRB2 et CMH-I au cours de l’infection de macaques cynomolgus par le SIVmac251 montre une augmentation transitoire de l'expression de LILRB2 et du CMH-I sur les cDC du sang et des ganglions lymphatiques dès les premiers jours de l’infection. Parmi les mécanismes qui pourraient être impliqués dans la régulation de l’expression de LILRB2, nos résultats indiquent que la réplication du VIH-1, l'activation de voies TLR7/8 ainsi que la présence d’IL-10 et d’IFN-I induisent une forte expression de LILRB2. Enfin, cette expression exacerbée de LILRB2 sur les cDC semble être spécifique à l'infection par le VIH/SIV. En effet, l’infection de macaques cynomolgus par le virus chikungunya, qui est caractérisée par une réponse immunitaire antivirale robuste aboutissant à un contrôle de la virémie, est associée à une expression diminuée de LILRB2 sur les cDC dès les premiers jours de l’infection. L’ensemble de nos données suggèrent un rôle majeur de l’axe inhibiteur LILRB2/MHC-I dans les mécanismes de dérégulations des cDC qui pourrait participerait à l’inefficacité des réponses immunitaires adaptatives et à la persistance du VIH/SIV. / Conventional dendritic cells (cDCs) play a crucial role in setting up early immune responses leading to viral control or persistence. In this regard, it has been shown that HIV-1 infection induces cDC dysfunctions characterized by inhibitions in their ability to stimulate T-cells and associated with disease progression. In vitro studies have shown the implication of LILRB2 inhibitory receptor in cDC dysfunctions. However, the dynamic of LILRB2 expression and its role in the early stages of infection are yet to be characterized. In primary HIV-1 infected patients, we observe an increased expression of LILRB2 and its ligands, HLA-I, on the surface of cDCs. Kinetics of LILRB2 and MHC-I expressions during SIV infection of Cynomolgus macaques shows a transient increase in LILRB2 and MHC-I expressions on blood and lymph node cDCs during the first days of infection. We also show that HIV replication, activation of TLR7/8 pathways, and presence of IL-10 and IFN-I drive upregulated expression of LILRB2. Finally, this strong induced LILIRB2 expression seems specific to HIV/SIV infections. Indeed, chikungunya virus infection of cynomolgus macaques, which characterized by a robust antiviral immune response leading to viral control, is associated with decreased expression of LILRB2 on cDCs in the first days of infection. Taken together, our data suggest a major role of the LILRB2/HLA-I inhibitory axis, mediating cDC dysfunctions and thus contributing to inefficient adaptive immune responses and viral persistence.

La persistance du VIH-1 est associée au maintien de l’inflammation chronique chez les patients infectés, malgré la mise en place de combinaison de traitements antirétroviraux. L’inflammation chronique est associée à un risque augmenté de développer des comorbidités, non associées au SIDA. Les polynucléaires neutrophiles (PNN) sont des cellules myéloïdes qui ont été impliqués dans de multiples maladies inflammatoires chroniques. Néanmoins, leur rôle dans l’infection par le VIH-1 est moins bien connue. Afin de pallier ce manque de connaissances, nous avons évalué l’hétérogénéité des PNNs dans le modèle macaque cynomolgus infecté par le SIVmac251. L’analyse phénotypique par cytométrie de masse a révélé la circulation de PNNs immatures en phase chronique de l’infection. En caractérisant l’hétérogénéité des PNNs au cours de l’infection par le SIV, nous avons observé une augmentation des fréquences des neutrophiles immatures et activés dans le sang dès la primo-infection. En phase chronique, les PNNs immatures et activés étaient toujours significativement augmentés dans le sang et la moelle osseuse. Au cours de l’infection, les PNNs avaient une fonction immunostimulatrice envers la prolifération et la sécrétion cytokinique des lymphocytaire T. L’initiation d’un traitement antirétroviral précoce a permis de restaurer le phénotype des PNNs. Les PNNs sont des cellules à fort potentiel pro-inflammatoire abondantes qui devraient être ainsi considérés comme de nouveaux effecteurs de l’inflammation chronique associée au VIH-1. / Even under combinational antiretroviral treatments (cART), HIV-1 persistence is associated with chronic inflammation in infected patients, leading to an increased risk of non-AIDS-related comorbidities. Polymorphonuclear neutrophils (PMN), have been less studied in HIV infection whereas they were associated with chronic inflammation diseases. To evaluate PMN heterogeneity in SIVmac251 nonhuman primate infection model, we first performed multiparameter single-cell phenotyping by mass cytometry giving a global vision of the immune system. This analysis demonstrated circulation of immature PMN with impaired during chronic infection. Then, we characterized neutrophils heterogeneity in the course of SIV infection. In primary infection, there was an increased frequency of CD10- immature and CD62L-low primed PMNs in peripheral blood. In chronic phase, CD10- immature PMNs were significantly higher in bone marrow and blood, maintaining a primed profile. During SIV infection, PMNs demonstrated variable immunomodulatory function against T cells proliferation and cytokine production. Early cART allowed to restore PMN phenotype. In this study, we provide unprecedented insight into PMN heterogeneity in the course of SIV infection. Since PMN represent 40-70% of circulating leukocytes and primed PMN are more potent to release pro-inflammatory cytokines and to transmigrate, they should be considered as a new player in HIV-1 chronic inflammation.

Le Virus Respiratoire Syncytial (VRS) est responsable de 70 % des cas de bronchiolite chez les enfants de moins de cinq ans. La survenue de bronchiolites sévères chez le nourrisson est un facteur de risque de développement d’asthme en grandissant. Aucun vaccin contre le VRS n’est disponible chez l’Homme. Le système immunitaire inné est la première ligne de défense de l’organisme contre les infections. De plus, en interaction avec la flore bactérienne commensale des poumons, l’immunité innée participe à la maturation de la réponse immunitaire adaptative qui confère à l’individu une protection sur le long terme vis-à-vis des pathogènes. Afin d’expliquer la susceptibilité néonatale au VRS, nous avons caractérisé un nouveau mécanisme de contrôle de la réponse innée antivirale lors de l’infection de souriceaux. Nous avons également testé une nouvelle approche de modulation de la réponse immunitaire au VRS par le microbiote pulmonaire. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes immunologiques et virologiques responsables de bronchiolites sévères en période néonatale permettra de développer des moyens de lutte sûrs et efficaces contre l’infection par le VRS. / Respiratory Syncytial Virus (RSV) is responsible for 70 % of bronchiolitis in children under five years old. Severe bronchiolitis in infants is a risk factor for asthma development. No vaccine against RSV is available in humans. The innate immune system is the first line of defense against infections. Moreover, in interaction with lung microbiota, innate immunity shapes adaptive immune response responsible for long-term protection against pathogens. To explain the susceptibility of young children to RSV, we characterized a novel regulatory mechanism of the innate antiviral response during neonatal RSV infection in the murine model. We also tested a new approach for modulating immune responses to RSV by the pulmonary microbiota. Thus, a better understanding of immunological and virological mechanisms responsible for severe bronchiolitis during the neonatal period will allow the development of safe and effective therapeutic strategies against RSV infection.

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La polyarthrite rhumatoïde (PR) est la maladie auto-immune la plus fréquente d'une prévalence de 1%. Les cellules résidentes de la cavité synoviale, les fibroblast-like synoviocytes (FLS), sont des acteurs majeurs de la PR. Leur activation par des récepteurs de l'immunité innée participe à l'acquisition d'un phénotype agressif menant à la destruction ostéo-articulaire. Dans cette étude, nous avons évalué le rôle régulateur de miARN sur les voies de signalisation des Toll-like receptors (TLR). L'activation de TLR2 et de TLR4 dans les FLS induit la diminution de l'expression de plusieurs miARN, dont miR-19a et b (miR-19), alors que TLR2 est surexprimé. Nous avons pu ainsi montrer que miR-19 régule Tlr2 et que la transfection de mir-19 dans les FLS activés induit une diminution de l'expression de TLR2 et de la synthèse d'IL-6 et de MMP-3. Mir-19 appartient au cluster miR-17~92, dont l'expression est abaissée dans les FLS. Il code pour 6 miARN dont miR-20a. miR-20a est également sous-régulé après activation de TLR2 et TLR4 dans les FLS et les THP-1. Nous avons montré que miR-20a régule directement l'expression d'Ask1, impliquée et surexprimée après activation de TLR4. La transfection de miR-20a in vitro nous a permis de montrer que miR-20a contrôle l'expression d'ASK1 et induit une inhibition de la synthèse de cytokines majeures de la PR dans les FLS et les THP-1. Des résultats équivalents ont été obtenus ex vivo chez la souris. Ces travaux ont permis d'identifier dans les FLS rhumatoïdes des miARN anti-inflammatoires dont la baisse d'expression permet une augmentation de l'expression de TLR2 et d'ASK1. Ces miARN pourraient donc constituer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Ce travail a contribué à la compréhension des bases moléculaires de l'immunité de l'huître creuse par la caractérisation la diversité de trois effecteurs antimicrobiens de C. gigas et par l'appréhension du rôle de cette diversité dans les mécanismes de défense. Des analyses phylogénétiques de deux peptides antimicrobiens (AMPs), Cg-Défensines (Cg-Defs) et Cg-Proline rich peptide (Cg-Prp), et d'une protéine de type Bactericidal Permeability Increasing protein, Cg-BPI, nous a permis montrer la grande diversité pour les 2 AMPs, qui est générée par plusieurs mécanismes génétiques et par des pressions de sélection directionnelles, suggèrant une diversité fonctionnelle des variants. L'importance biologique de cette diversité a été étudiée pour trois variants de Cg-Defs. Une forte activité antimicrobienne a été mise en évidence contre les bactéries à Gram positive, mais celle-ci diffère selon les variants. De plus, nous avons démontré que le mécanisme d'action des Cg-Defs contre S. aureus repose sur l'inhibition de la biosynthèse du peptidoglycane par le piegeage de son précurseur, le lipide II. Finalement, l'expression des transcrits et la localisation de ces effecteurs en réponse à une infection par un Vibrio pathogène ont montré un réseau complexe des profils d'expression des différents antimicrobiens, au niveau des populations hémocytaires et des tissus d'huître, suggérant une interaction entre les antimicrobiens du fait de leur colocalization. La combinaison entre les familles ou entre les variants d'une même famille produit de fortes activités synergiques qui élargissent les spectres d'activité. Ainsi, la diversité produit par la coévolution entre hôte et pathogènes pourrait améliorer l'activité des AMPs d'huître, lui conférant une plus grande protection contre les pathogènes de son environnement. / This work contributed to the knowledge of the molecular bases of oyster immunity by the characterization of the diversity of three antimicrobials of C. gigas and the understanding of the role played by their diversity in the oyster antimicrobial response. Phylogenetic analyses of two antimicrobial peptides (AMPs), Cg-Defensins (Cg-Defs) and Cg-Proline rich peptide (Cg-Prp), and one Bactericidal Permeability Increasing protein, Cg-BPI, led us to the identification of a high diversity for both AMPs. Further analyses showed that this diversity is generated by gene duplication, allelic recombination and directional selection pressures, suggesting their functional diversification. The biological meaning of AMP diversity was investigated for the three major variants of Cg-Defs, which revealed a strong but variable potency against Gram-positive bacteria. We evidenced that oyster defensins kill S. aureus through binding to the cell wall precursor lipid II, resulting in the inhibition of peptidoglycan biosynthesis. Finally, transcript expression and localization of oyster antimicrobials after a pathogenic infection evidenced a complex network in their expression profiles in hemocyte populations and oyster tissues, suggesting a potential interplay between antimicrobials as a result of their colocalization. Indeed, the combination of oyster antimicrobials produced strong synergistic activities that enlarged their antimicrobial spectra. Thus, the diversity of oyster antimicrobials may provide significant means in acquiring functional divergence, probably concerned in the evolutionary arms race between hosts and their pathogens.From our data, it would provide oysters with a higher protection against the potential pathogens from their environment.

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Depuis leur radiation après le Carbonifère, il y a 325 millions d’années, les insectes ont colonisé la majorité des milieux terrestres. Ce grand pouvoir colonisateur est en partie dû à leur association avec des bactéries symbiotiques intracellulaires, nommés endosymbiotes. Ces derniers complémentent le régime alimentaire de l’insecte et lui permettent de survivre sur des milieux nutritionnellement pauvres ou déséquilibrés. Les endosymbiotes sont transmis maternellement, ce qui assure la pérennité de l’association au cours des générations. Ils sont maintenus dans des cellules spécialisées, les bactériocytes, qui forment à leur tour un organe, le bactériome. L’étude des spécificités moléculaires et cellulaires des bactériocytes est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes de régulation des endosymbiotes. Toutefois, la caractérisation de ces spécificités reste peu élucidée. Afin d’approcher les spécificités moléculaire, cellulaire et immunitaire du bactériome, ainsi que la réponse immunitaire systémique du charançon dirigée contre un pathogène, nous avons construit et séquencé 7 banques d’ADNc provenant du charançon des céréales : Sitophilus oryzae (Coléoptère, Curculionide). L’analyse in silico des banques, appuyée par une étude transcriptomique, a montré que le bactériome présente une forte expression de gènes impliqués dans la survie et le développement cellulaire, et dans le trafic vésiculaire. Le bactériome présente aussi une réponse immunitaire spécifique et modulée, puisqu’à l’exception d’un peptide antimicrobien, la coléoptéricine-A, les effecteurs de l’immunité ne sont pas (ou peu) exprimés. Par ailleurs, nous avons montré que la réponse immunitaire des larves de charançon aux infections bactériennes serait modulée en présence des endosymbiotes. Le deuxième volet de cette thèse s’est focalisé sur le stade adulte du charançon, chez qui les bactéries symbiotiques sont hébergées dans des bactériomes situés à l’apex des caeca mésentériques qui tapissent l’intestin moyen de l’insecte. Cette association est éphémère chez l’adulte qui perd ses endosymbiotes 15 jours après la mue imaginale. Nous avons recherché les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cette élimination, ainsi que les causes écophysiologiques et évolutives sous-jacentes. Par des approches histologiques et transcriptomiques, nous avons démontré que l’élimination des symbiotes est la conséquence de l’activation simultanée de l’apoptose et de l’autophagie. Par ailleurs, nous avons montré que l’élimination du symbiote survient après la formation ultime de la cuticule par l’insecte adulte, et que cette élimination symbiotique était corrélée à une diminution des besoins nutritionnels de l’insecte, notamment en acides aminés aromatiques. / Résumé