L'élimination des cellules apoptotiques est un évènement critique pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et pour le contrôle des réponses immunes orchestrées par les phagocytes. A l'heure actuelle, les acteurs et en particulier les signaux « eat-me » impliqués ne sont pas encore entièrement caractérisés. C1q, élément de reconnaissance du complément, participe à la reconnaissance des structures altérées du soi et est un acteur majeur de la tolérance immune. Le travail a porté sur l'identification des signaux exposés au cours de l'apoptose et responsables de la fixation de C1q. Dans un premier temps, l'utilisation de la résonance plasmonique de surface a permis de montrer que C1q se fixe de façon précoce après induction de l'apoptose et que cette reconnaissance implique un composant membranaire. Dans un deuxième temps, différentes approches (biologie cellulaire, biochimie et biologie structurale) ont permis d'identifier la phosphatidylsérine et le désoxyribose de l'ADN comme cibles de C1q à la surface des cellules apoptotiques. Enfin, le rôle respectif au cours de l'apoptose de partenaires connus de C1q (calréticuline et p33) a été précisé. Etant donné la versatilité des propriétés de reconnaissance de C1q, cette molécule aurait donc la capacité originale de détecter et de collecter différents signaux, qui pris ensemble fourniraient un signal fort permettant l'élimination efficace des cellules apoptotiques.

Dans le travail portant sur l'immunorégulation de la réponse immunitaire dans le modèle expérimental d'asthme, nous avons montré que les basophiles étaient activés par des ARN double brin poly(A:U) et que cette stimulation exacerbait les réponses d'asthme. Nous avons ensuite étudié la modulation de l'asthme en utilisant des agonistes de la voie TLR/IL1R. Les résultats obtenus ont montré que le R848, agoniste de TLR7 qui induit les réponses immunitaires antivirales de type Th1, et l'IL-33 qui favorise les réponses Th2, activaient les cellules NKT dont la production rapide et modulée des cytokines pourrait avoir un effet modulateur dans l'asthme. Nous avons montré que les cellules NKT avaient une fonction régulatrice sur le développement et l'activité des cellules Th17. Enfin, nous avons décrit les effets protecteurs et suppresseurs induits par le R848 dans le modèle d'asthme et montré que ces effets suppresseurs étaient dépendants des cellules T régulatrices et du TGF-β.

L'instillation intravésicale de bacilles de Calmette et Guérin (BCG) comme traitement adjuvant du cancer de la vessie non invasif du muscle est l'un des seuls exemples de réussite d'une immunothérapie à la clinique, avec des taux de réponse de 50-70 %. S'il est établi que le succès de la thérapie repose sur des injections répétées de BCG vivant, administré peu après la résection chirurgicale de la tumeur, ses mécanismes d'action n'ont pas été définis précisément. Au cours de ma thèse, j'ai établi un modèle expérimental de souris pour étudier la dynamique de la réponse immune induite par l'administration intravésicale de BCG. Au vu d'un certain nombre de travaux chez l'homme, j'ai concentré mon attention sur l'établissement du processus inflammatoire aigu, ainsi que sur l'activation et le recrutement des lymphocytes T. Je démontre qu'une seule instillation de BCG est suffisante pour induire la dissémination du BCG dans les ganglions lymphatiques drainant la vessie et l'activation de lymphocytes T produisant de l'interféron gamma. Cependant, des instillations répétées de BCG vivant sont nécessaires pour obtenir une robuste infiltration de lymphocytes T dans la vessie. Toutefois, je montre qu'une immunisation préalable des souris par voie sous-cutanée conduit à un processus inflammatoire aigu accentué dès la première instillation et accélère le recrutement des lymphocytes T dans la vessie, par rapport au protocole standard. En outre, l'immunisation préalable des souris par voie sous-cutanée améliore de façon substantielle leur réponse à la BCG-thérapie, dans un modèle d'implantation orthotopique de cellules tumorales. Enfin, l'analyse de données cliniques révèle un avantage statistiquement significatif pour les patients qui ont la signature d'une réponse immune au BCG préalablement à la thérapie intravésicale. Par ailleurs, utilisant des données cliniques et expérimentales, j'ai contribué à la construction et au paramétrage d'un modèle mathématique stochastique décrivant les interactions entre le BCG, le système immunitaire, la vessie et les cellules tumorales. Nous avons tout d'abord montré qu'il était très improbable que l'extinction tumorale puisse être médiée seulement par l'immunité innée, car cela exigerait une capacité de tuer par effet bystander bien plus élevée que celle observée expérimentalement chez les cellules effectrices de l'immunité innée. Nous avons ensuite raffiné notre modèle pour qu'il prenne aussi en compte l'immunité adaptative. Nous avons alors utilisé ce deuxième modèle pour évaluer les paramètres cliniques optimaux pour la BCG thérapie, et parmi eux (i) le délai entre la résection chirurgicale et la première instillation, (ii) la dose de BCG, (iii) le temps de contact du BCG avec la vessie et (iv) l'intervalle de temps entre deux injections répétées de BCG. Tous ces paramètres ont un impact sur la probabilité d'extinction tumorale, et, notablement, la multiplication par deux du délai entre deux instillations améliorerait très favorablement le taux de réponse au traitement. L'ensemble de ces données contribue à éclairer sous un jour nouveau une immunothérapie utilisée en clinique depuis longtemps et prédit des stratégies qui pourraient contribuer à améliorer le soin des patients. Notamment, je suggère que la pratique d'un test tuberculinique sur les patients préalablement à la thérapie intravésicale, suivie de l'immunisation parentérale par le BCG des patients négatifs pour le test, pourrait être une méthode sûre et efficace pour améliorer la réponse clinique induite par les instillations intravésicales de BCG.

Les virus du Chikungunya (CHIKV) et de la dengue (DENV) sont deux virus émergents qui sévissent dans les régions tropicales et subtropicales du monde entier et qui sont transmis par les moustiques du genre Aedes. Ces dernières années, leur transmission a surtout progressé dans les zones urbaines et périurbaines touchant des millions d'individus et faisant de ces deux pathogènes des sujets majeurs de préoccupation pour la santé publique. Le Chikungunya et la Dengue sont des infections dites aiguës entrainant une mise en place rapide de la réponse immunitaire innée qui joue un rôle majeur dans le contrôle et l'évolution de la maladie. Les cellules Natural Killer (NK) représentent une population cellulaire clé de la réponse innée et jouent un rôle crucial dans les mécanismes de défense mis en place. A travers une étude ex vivo et in vitro, nous nous sommes intéressées à la caractérisation des cellules NK à travers (i) une étude phénotypique et fonctionnelle des cellules NK chez des patients infectés en phase aiguë par le CHIKV, DENV-2 ou par les deux virus et (ii) à la caractérisation des interactions entre les cellules NK et les cellules cibles infectées par le virus. L'ensemble de ces données contribue à mieux identifier l'implication des cellules NK dans le contrôle des infections par le CHIKV et DENV-2 permettant ainsi de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des dérèglements de la réponse immunitaire. Au cours des dernières épidémies, plusieurs cas de patients coinfectés par les deux virus ont été répertoriés. De plus, l'expansion géographique des moustiques Aedes pourrait amener à une augmentation du nombre de cas de coinfections sans que les mécanismes sous jacents aux coinfections ne soient étudiés. Afin de pouvoir réponse à certaines questions concernant ce phénomène, nous avons mis en place un modèle expérimental de coinfection par CHIKV et DENV-2 chez le macaque Rhésus.

L'invasion de l'hôte par un pathogène induit l'activation séquentielle des réponses immunitaires innées et adaptatives. La reconnaissance du pathogène par des récepteurs tels que les récepteurs de type Toll (TLRs) initie la réponse innée qui repose sur l'activation des lignées myéloïdes, la production de cytokines, de chémokines et de médiateurs pro-inflammatoires qui contribuent à l'éradication du pathogène. L'amplification incontrôlée de la réaction inflammatoire est délétère pour l'organisme. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation des réponses dépendant de TLR2, récepteur impliqué dans la reconnaissance de bactéries, parasites ou champignons, nous avons étudié la composition des complexes multimoléculaires d'activation au sein des radeaux lipidiques. En utilisant des approches protéomiques complémentaires, nous avons mis en évidence le rôle de la Src kinase Lyn et de la déshydrogénase IMPDHII après engagement des hétérodimères TLR2/TLR1 ou TLR2/TLR6. La tyrosine kinase Lyn est indispensable à l'activation de NF-kB après engagement de TLR2 et agit en phosphorylant la sous-unité p110 de la PI3-kinase (PI3-K). IMPDHII, cible de l'acide mycophénolique, est un régulateur négatif de la voie TLR2-NF-kB. IMPDHII interagit avec SHP1 pour inhiber la phosphorylation sur tyrosine de p85α, la sous-unité régulatrice de PI3-K, et prévenir la transactivation de NF-kB. Enfin, nous avons étudié le rôle d'un polymorphisme de IMPDHII dans la gravité du choc septique. Ces travaux affinent la compréhension de la régulation de la réponse dépendant de TLR2 et permettent d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prise en charge des infections graves.

Chikungunya est un alphavirus transmis par les moustiques (Aedes) et qui provoque de la fièvre, des éruptions cutanées, des myalgies et des arthralgies. La maladie (CHIKVD) est transitoire, mais des formes sévères menant à des arthrites chroniques incapacitantes ont été signalées. Nous avons dans un premier temps étudié prospectivement les paramètres cliniques et immunologiques associés à la maladie chez des patients hospitalisés et identifiés comme étant 'guéris' ou 'chronique' à M12 après l'infection. Dans la deuxième partie, nous avons observé in vitro les mécanismes et le rôle de l'apoptose dans le processus infectieux permettant au virus de persister dans les sanctuaires tissulaires. En phase aiguë, une forte réponse immune dominée par une activation des cellules NK/dendritique/cellules T, la production d'anticorps spécifiques et une faible production de cytokines Th1 > Th2 a été observée mais sans aucune différence significative entre les deux groupes. Cependant, la virémie initiale s'est révélée beaucoup plus élevée dans le groupe chronique est nous avons pu identifier du matériel viral dans les macrophages du tissu synovial d'un patient chronique post-CHIKVD (M18). Dans la deuxième partie de l'étude, nous avons constaté que CHIKV est capable d'induire l'apoptose par la voie intrinsèque et extrinsèque et également par un mécanisme 'bystander'. De plus, nous avons observé que le CHIKV présent dans des corps (blebs) apoptotiques était capable d'infecter les cellules voisines (Hela et macrophage MM6). Notre étude a permis de mettre en évidence pour la première fois que CHIKV contrôle et détourne à son profit les mécanismes de défense anti-infectieux.

L’IL-17 est une cytokine essentielle dans la défense de l’organisme contre de nombreuses bactéries pathogènes extracellulaires, comme Siaphylococcus aureus qui est un agent majeur des mammites des ruminants, en agissant en particulier sur les cellules épithéliales. L’objectif du travail était de tester l’hypothèse d’un rôle de i’IL-17 dans la protection de la mamelle en caractérisant la réponse des cellules épithéliales mammaires bovines (CEMb) à l’IL-17A et à l’IL-17F. Ces cytokines bovines ont été utilisées seules ou en combinaison avec des agonistes du système immunitaire inné produits par S. aureus, le muramyl dipeptide (MDP) et l’acide lipotéichoïque (LTA). Une première étude a montré que le LTA et le MDP exercent un effet synergique dans la mamelle et sur les CEMb en culture. Le tissu mammaire et les CEMb expriment le récepteur pour l’IL-l7A et F, et les CEMb ont répondu à i’lL-l7A et l’IL-l7F, bien que de façon modérée. Les réponses ont été sensiblement augmentées par la combinaison de l’IL-17 avec le LTA ou le MDP. Les réponses se caractérisent par une production de chimiokines capables d’attirer les polynucléaires neutrophiles et les leucocytes mononucléés, ainsi que par une surexpression de gènes à activités antibactériennes. Par contre, les CEMb ne produisent pas de cytokines inflammatoires. Ces résultats indiquent que i’IL-l7 est adaptée à un fonctionnement en milieu septique et ales capacités pour jouer un rôle dans la protection de la mamelle contre les infections staphylococciques. / Through its activity on epithelial cells, interleukin-17 is a pivotai cytokine for the host defense against several extracellular pathogens, such as Siaphylococcus aureus that is a major agent of mastitis of ruminants. The investigation aimed at evaluating the role of IL-17 in udder protection by characterizing the response of bovine mammary epithelial cells (bMEC) to IL-17A and IL-17F. These bovine cytokines were used either alone or in combination with one of two innate immune system agonists associated with S. aureus, muramyldipeptide (MDP) or lipoteichoic acid (LTA). The first study showed that LTA synergized with MDP to recruit neutrophils in the mammary gland and to stimulate bMEC. A second study established that mammary tissue and bMEC in culture express the IL-17 receptor, and that bMEC respond to IL-17A and IL-17F, although with a moderate intensity. The response was noticeably augmented by the combination of IL-17 with LTA or MDP. The response was characterized by the production of chemokines able to attract neutrophils but also mononuclear leukocytes, as well as by an overexpression of genes endowed with antibacterial activity. Remarkably, bMEC did not release pro inflammatory cytokines. These results indicate that IL-17A and IL-17F are well suited for operating in a septic environment and have the potential to play a role in udder protection against staphylococcal infections.

A la naissance, le système immunitaire des nouveau-nés est encore en plein développement. La première partie du travail de thèse a consisté à étudier les spécificités du système immunitaire intestinal des nouveau-nés qui conduisent à leur plus grande susceptibilité à l’infection par Cryptosporidium parvum. Ce protozoaire constitue un excellent modèle pour étudier les réponses immunitaires mucosales. En effet, son développement est restreint à l’épithélium intestinal et est strictement relié au statut immunitaire de son hôte ce qui explique que cet agent zoonotique affecte tout particulièrement les nouveau-nés et les immunodéficients. Nous avons démontré que les cellules dendritiques (DC) CD103+ étaient indispensables au contrôle de la phase aigüe de l’infection et que leur faible représentation dans la lamina propria de l’iléon chez les nouveau-nés était responsable de leur susceptibilité à l’infection. Nous avons identifié avec précision le mécanisme CXCR3 dépendant permettant le recrutement des DC CD1O3+ dans la muqueuse infecté et leur capacité à produire de l’IL-12 et de l’IFNdz, deux cytokines majeures impliquées dans le mécanisme de protection. La deuxième partie de ce travail a consisté à utiliser une stratégie d’immunostimulation basée sur l’utilisation de ligands de TLR capables d’activer fortement les cellules dendritiques du nouveau-né. Cette approche permet un contrôle rapide et très efficace d’une infection par C. parvum. / At birth, the neonatal immune system is still developing. In the first part of the thesis we investigated the characteristics of the intestinal immune system of neonates that lead to their greater susceptibility to infection by Cryptosporidium parvum. This protozoan is an excellent model for studying mucosal immune responses. Indeed, its development is restricted to the intestinal epithelium and is strictly related to the immune status of its host which explains the particular susceptibility of neonates and immunocompromised to this zoonotic agent. We have demonstrated that CD103+ dendritic cells (DC) are essential for the control of the acute phase of infection and their low representation in the ileal lamina propria of neonates was responsible for their higher susceptibility to infection. We have accurately identified the CXCR3-dependent mechanism for the recruitment of DC CD1O3+ in the infected mucosa and their ability to produce IL -12 and IFNdz, two major cytokines involved in the mechanism of protection. The second part of this work was to use an immunostimulatory strategy based on administration of TLR ligands that can strongly activate neonatal DC of the intestine. This approach allows a fast and highly effective control of an ongoing C. parvum infection.

Au cours des récentes épidémies, l’infection par le virus Zika (ZIKV) est à l’origine de microcéphalies chez le fœtus, d’avortements spontanés et du syndrome de Guillain–Barré chez l’adulte. L’infection par ZIKV représente donc un problème de santé publique. Il est nécessaire de comprendre la biologie de ce virus et quelles sont les réponses cellulaires impliquées. Dans les cellules infectées, les virus sont détectés par des récepteurs de la réponse immunitaire innée, tels que les Toll-like receptors (TLR). Cette reconnaissance conduit à la production de molécules antivirales, tel que l’interféron (IFN) de type I et III. De récents travaux montrent que l’activation de la voie TLR3 contribuerait au contrôle de la propagation de ZIKV et sa pathogénèse. Nous avons mis en place une approche pour cartographier les interactions génétiques entre le génome viral et différents régulateurs et effecteurs de cette réponse antivirale, incluant les étapes de reconnaissance du virus par TLR3. Cette approche est basée sur une combinaison de biologie moléculaire et d’évolution expérimentale qui repose sur le taux élevé de mutation de ZIKV et sa rapide faculté d’adaptation. J’ai pu mettre en avant l’apparition d’un phénotype de ZIKV face aux défenses antivirales de lignées cellulaires humaines qui se caractérise par une résistance à l’activation de la voie TLR3 et une meilleure propagation du virus après 5 passages. J’ai été capable d’observer que la population virale adaptée présente une perte d’activation des réponses antivirales (i.e. ISG15, MxA) 3h post-infection. La mise au point et la validation de l’approche CirSeq permet une analyse de précision des données de séquençage haut-débit, et permettra ainsi de prédire l’évolution de mécanismes d’échappement viral. / Zika virus (ZIKV) infection causes neurological diseases and birth defects representing an important threat for human health. Recent studies demonstrated that interferon (IFN) response is pivotal for the control of ZIKV spread, its in utero transmission and protects against ZIKV-induced neurological diseases. It is necessary to understand the biology of this virus and what are the cellular responses involved. In infected cells, viruses are detected by receptors of the innate immune response, such as Toll-like receptors (TLRs). This recognition leads to the production of antiviral molecules, such as type I and III interferon (IFN). Recent work shows that activation of the TLR3 pathway contributes to controlling the spread of ZIKV and its pathogenesis. We have implemented an approach to map the interactions between the viral genome and different regulators and effectors of this antiviral response, including the TLR3 virus recognition steps. This approach is based on a combination of molecular biology and experimental evolution based on the high mutation rate of ZIKV and its rapid adaptation. I was able to highlight the appearance of a phenotype of ZIKV against the antiviral defenses of human cell lines that triggered resistance to activation of the TLR3 pathway and a better spread of the virus after 5 iterative passages. I was able to observe that the adapted viral population exhibited a loss of activation of antiviral responses (i.e. ISG15, MxA) 3h after infection. The implementation and validation of the CirSeq approach allows an analysis of the accuracy of high throughput sequencing data, as well as predicting the evolution of viral escape mechanisms.

Streptococcus pneumoniae est un pathogène humain majeur causant des pneumonies, méningites et septicémies. Pour assurer sa survie et sa dissémination le pneumocoque déploie un ensemble de facteurs de virulence favorisant l'invasion des tissus et l'évasion du système immunitaire. Une classe particulière de protéines dites « moonlighting », ne sont associées à aucun système d'export connu et pourtant se trouvent localisées en surface du pneumocoque. Les protéines « moonlighting » sont des protéines cytoplasmiques conservées, localisées dans divers compartiments cellulaires et présentant des fonctions additionnelles. La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) est retrouvée en surface de nombreuses cellules et exerce divers rôles dans les processus de virulence d'organismes pathogènes. La GAPDH de surface du pneumocoque agit comme un facteur de virulence en recrutant le plasminogène / la plasmine de l'hôte, ce qui facilite l'invasion bactérienne à travers la matrice extracellulaire et les barrières endothéliales et épithéliales. Cependant, les mécanismes permettant l'export et la fixation de la GAPDH à la surface de la bactérie n'avaient pas encore été découverts. Ce travail démontre que la GAPDH est relarguée par lyse cellulaire et s'associe au peptidoglycane. C1q, un composant clé de la voie classique du complément, est un acteur majeur dans la réponse aux infections microbiennes et peut également détecter des éléments nocifs du soi-altéré comme les cellules apoptotiques. L'usage d'approches expérimentales complémentaires a permis d'identifier la GAPDH comme un partenaire de C1q quand elle est exposée en surface de S. pneumoniae et de cellules apoptotiques humaines. Néanmoins et de manière plutôt inattendue, seule la GAPDH du pneumocoque active la cascade du complément à la différence de la protéine homologue humaine. Ces résultats encouragent la poursuite d'études afin de comprendre comment la reconnaissance par C1q de deux protéines très proches peut conduire à de telles différences sur ses propriétés d'activation du complément. / Streptococcus pneumoniae is a major human pathogen, which causes pneumonia, meningitis and septicemia. To insure its survival and dissemination, the pneumococcus deploys an array of virulence factors promoting invasion of tissues and evasion from the immune system. A particular class of proteins not associated with any known export system, the moonlighting proteins, is found at the pneumococcal surface. Moonlighting proteins are conserved cytoplasmic metabolic enzymes or molecular chaperones localized in various cellular compartments and exhibiting additional functions. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is found at the surface of numerous eukaryotic and prokaryotic cells, and display diverse roles in the virulence processes of pathogenic organisms. The pneumococcal surface GAPDH acts as a virulence factor by binding to host plasminogen/plasmin, which facilitates the bacterial invasion through the extracellular matrix and the endothelial and epithelial cell barriers. However, the mechanisms leading to the GAPDH export and binding to the bacterial surface had not been deciphered yet. This work demonstrates that the GAPDH is released upon cell lysis and associates with the peptidoglycan. C1q, a key component of the classical complement pathway, is a major player in the response to microbial infection and has been shown to detect noxious altered-self substances such as apoptotic cells. The use of complementary experimental approaches allowed the identification of the GAPDH as a C1q partner when exposed at the surface of S. pneumoniae and human apoptotic cells. However, and rather unexpectedly, the pneumococcal GAPDH activates the complement cascade unlike the human one. Those results encourage further studies in order to understand how C1q recognition of two closely related proteins can lead to such striking differences on its complement activation properties.