Doctor en Bioquímica / Tanto los niveles intracelulares de Ca2+ ([Ca2+]i) como el transporte de la glucosa son fundamentales para la fisiología del cardiomiocito, sin embargo, aún no se ha investigado la interrelación entre ambos eventos. En esta tesis se investigó si insulina regula los niveles [Ca2+]i en el cardiomiocito, el mecanismo que participa y su papel en el transporte de glucosa vía GLUT4. Con este objetivo, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata se preincubaron con la sonda fluorescente para Ca2+ FLUO3-AM y se visualizaron los cambios en los niveles de Ca2+ por microscopia confocal. Las vías transduccionales que regulan los movimientos intracelulares de Ca2+ se intervinieron selectivamente con inhibidores químicos y herramientas genéticas. La captación de glucosa se evaluó utilizando [3H]-2-desoxiglucosa y los niveles de GLUT4 en la superficie celular se cuantificaron en cardiomiocitos no-permeabilizados transfectados con el plasmidio GLUT4-myc-eGFP. Los resultados mostraron que insulina indujo un rápido y transitorio aumento del [Ca2+]i en dos componentes. Los bloqueadores del canal L de Ca2+ nifedipino y del canal/receptor intracelular ryanodina sólo previnieron el primer componente componente. el segundo componente se redujo con: a) inhibidores selectivos del receptor de inositol-1,4,5-trifosfato: xestospongina C y 2 amino-etoxidifenilborato (2APB), b) disminución de la masa del receptor de IP3 vía siRNA y c) por transducción de un péptido inhibidor de señalización de las subunidades β de la proteína G (βark). La captación de glucosa inducida por insulina fue prevenida por el quelante del Ca2+ intracelular BAPTA-AM, 2 APB y βark, pero no por nifedipino ni ryanodina. De manera similar, la exposición del GLUT4-myc-eGFP en la membrana celular inducida por insulina fue inhibida por BAPTA-AM y xestospongina C, pero no por nifedipino. Sin embargo, este proceso también requirió la activación de PI3K y Akt para la segunda fase de liberación del [Ca2+]i y para la translocación del GLUT4. La transfección de un dominante negativo de PI3K inhibió parcialmente la exposición de GLUT4-myc-eGFP. En conclusión, insulina aumentó los niveles de [Ca2+]i vía IP3R en cultivos primarios de cardiomiocitos, regulando la captación de glucosa vía GLUT4. Esta nueva vía de señalización de insulina podría influenciar al metabolismo cardiaco en el miocardio adulto y estar modificada en condiciones metabólicas como son la obesidad, resistencia a insulina y diabetes / Intracellular calcium levels ([Ca2+]i) and glucose uptake are central to cardiomyocyte physiology, yet connections between them have not been studied. We investigated here whether insulin regulates [Ca2+]i in cultured cardiomyocytes, the participating mechanisms, and their influence on glucose uptake via glucose transporter 4 (GLUT4). Cultured neonatal rat cardiomyocytes were preloaded with the Ca2+ fluorescent dye FLUO3-AM and visualized by confocal microscopy. Ca2+ transport pathways were selectively targeted by chemical and molecular inhibition. Glucose uptake was assessed using [3H]2-deoxyglucose and surface GLUT4 levels were quantified in non-permeabilized cardiomyocytes transfected with GLUT4-myc-eGFP. Insulin stimulated a fast, two-component, transient increase in [Ca2+]i. Nifedipine and ryanodine prevented only the first component. The second one was reduced by inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3)-receptor selective inhibitors (xestospongin C, 2 amino-ethoxydiphenylborate), by type 2 IP3-receptor knockdown via siRNA, or by transfected G peptidic inhibitor ARKct. Insulin-stimulated glucose uptake was prevented by BAPTA-AM, 2-amino-ethoxydiphenylborate and ARK-ct, but not by nifedipine or ryanodine. Similarly, insulin-dependent exofacial exposure of GLUT4-myc-eGFP was inhibited by BAPTA-AM and xestospongin C but not by nifedipine. Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and Akt were also required for the second phase of Ca2+-release and GLUT4 translocation. Transfected dominant-negative PI3K inhibited the latter. In conclusion, in primary neonatal cardiomyocytes, insulin induces an important component of Ca2+ release via IP3-receptor. This component signals to glucose uptake via GLUT4, revealing a so far unrealized contribution of IP3-sensitive Ca2+ stores to insulin action. This pathway may influence cardiac metabolism in conditions yet to be explored in adult myocardium

ANGLÈS A grape-seed derived procyanidins extract (GSPE) was reported to mimic some of the physiological effects of insulin. However, GSPE showed some divergences when compared to insulin action, which suggests that procyanidins could be useful on a state of impaired insulin action. Therefore, the main purpose of this thesis was to understand how dietary procyanidins modulate glucose metabolism, mainly in adipose tissue and under an insulin resistant condition.Results show that a treatment of 25 mg GSPE/Kg bw for 30 days on cafeteria-diet-fed rats has a positive effect in improving some insulin resistance parameters and that white adipose tissue is also a clear target for procyanidins. Cell culture studies showed the ability of procyanidins for activating the insulin receptor and its ability for activating proteins kinases involved in the insulin signalling pathway. The GSPE study was completed showing that oligomeric structures of GSPE can reproduce the total GSPE effects. / CATALÀ A un extracte de procianidines de pinyol de raïm (GSPE) se l'hi han atribuït efectes mimètics d'algun dels efectes fisiològics de la insulina, però alhora la seva acció mostra algunes divergències respecte la pròpia hormona. Aquest fet suggereix un possible interès d'aquestes procianidines en patologies vinculades amb la resistència a la insulina. Per aquest motiu, l'objectiu principal d'aquesta tesi és entendre com les procianidines de la dieta modulen el metabolisme de la glucosa, principalment a teixit adipós i sota una condició de resistència a insulina. Els resultats obtinguts mostren que 30 dies de tractament amb 25 mg GSPE/Kg PC milloren la situació de resistència a insulina provocada per una dieta de cafeteria i evidencien que el teixit adipós és una clara diana per GSPE. En cèl·lules en cultiu s'observa com GSPE activa el receptor de la insulina i proteïnes de la via de senyalització de la insulina de manera diferent a la pròpia hormona. L'estudi es completa demostrant que les estructures oligomèriques de GSPE poden reproduir els efectes fins ara atribuïts a les procianidines.

Orientador: Licio Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T23:24:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_ClaudioTeodorode_D.pdf: 4471060 bytes, checksum: dd3735f8ba5c9ced50fdeab6a4bf2faa (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Diabetes melhtus tipo 2 é uma doença de etiologia multifatorial que resulta da confluência de pelo maios dois fenômenos distintos, resistência à ação e falência na produção de insulina. Evidências recentes tem sugerido que mecanismos comuns podem participar dos eventos que precipitam o desenvolvimento tanto da resistência à insulina quanto da falência da célula beta pancreática. A caracterização destes eventos pode abrir perspectivas para abordagens terapêuticas unificadas visando corrigir simultaneamente os dois mais importantes distúrbios que participam da gênese desta doença. A proteína co-ativador la do receptor ativado por prolíferador de peroxissoma, ou PGC-la, cumpre alguns requisitos que permitem sua inclusão numa lista de possíveis participantes nos mecanismos acima expostos. Para avaliar o papel desta proteína na produção e na ação periférica da insulina, utilizou-se um oligonucleotídeo antisense capaz de reduzir significativamente a expressão da PGC-la. Através deste método observou-se que a PGC- la responde a estímulos simpáticos que promovem a inibição da secreção de insulina. Tais estímulos induzem o aumento da expressão desta proteína que por sua vez leva a um aumento da expressão da proteína desacopladora-2 (UCP-2) em ilhotas pancreáticas. O desacoplamento da respiração mitocondrial deve favorecer a redução da produção de ATP decorrente do metabolismo da glicose e desta forma reduzir a secreção de insulina. Por outro lado, em um modelo animal de obesidade e diabetes induzido por dieta hiperüpídica observou-se um aumento da expressão da PGC-la em fígado e tecido adiposo. A inibição da expressão da PGC-la nestes animais promoveu restauração da homeostase da glicose, aumento da secreção de insulina, melhora na sinalização de insulina em tecidos periféricos e surpreendentemente, regressão da esteatose hepática induzida por dieta. Portanto, a proteína PGC-la surge como promissor alvo para abordagem terapêutica em diabetes mellitus e doenças afins / Abstract: Type 2 diabetes mellitus is a multifactorial disease that results from the confluence of at least two distinct events, insulin resistance and failure of the pancreatic beta cell. Recent evidences suggest that common mechanisms may participate in the events that precipitate the development of both insulin resistance and beta cell disarrangement. The characterization of such events may offer new perspectives for a unified therapeutic approach for diabetes. The protein PGC-la fulfills some of the requirements to be included in a list of potential candidates for playing a role in the genesis of both the main mechanisms involved in the development of diabetes. To evaluate the role of this protein in the production and action of insulin we employed an antisense oligonucleotide to PGC-la, which is capable of significantly reducing the expression of this protein. Through this approach it was observed that PGC-la responds to sympathetic stimuli mat inhibit insulin secretion. Such stimuli induce the expression of PGC-la and subsequently of the uncoupling protein-2 (UCP-2). Once induced UCP-2 favors a reduction of ATP production from glucose metabolism and therefore reduces insulin secretion. In addition, the expression of PGC-la was increased in liver and adipose tissue of an animal model of diet-induced obesity and diabetes. The inhibition of PGC-la promoted an increase of insulin secretion, an increase of peripheral insulin action, an improvement of insulin signal transduction and, surprisingly the reversal of diet-induced hepatic steatosis. Thus, PGC-la appears as an attractive potential target for therapeutics in diabetes and related diseases / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Alex Rafacho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T03:03:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Protzek_AndreOtavioPeres_D.pdf: 8312725 bytes, checksum: 2126056342598338000e5d9925e59082 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os glicocorticoides (GC) são amplamente utilizados devido aos seus efeitos anti-inflamatórios. Porém, o tratamento com GC pode induzir efeitos deletérios sobre a homeostase glicêmica como a resistência à insulina (RI), intolerância à glicose e, dependendo do tempo e dose, pode levar a instalação do Diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Neste sentido, ratos têm sido vastamente utilizados como modelo animal para elucidar as compensações pancreáticas envolvidas na hiperinsulinemia induzida por GC e, poucos estudos enfocando os efeitos do tratamento com GC foram realizados em camundongos. Além disso, não é completamente elucidado se a hiperinsulinemia compensatória induzida pelo tratamento com GC esta associada com alteração do clearance de insulina. Assim, nossos objetivos foram avaliar se: as compensações do pâncreas endócrino em resposta ao tratamento com GC são similares entre camundongos e ratos e, identificar possíveis mecanismos que as expliquem; e se a hiperinsulinemia compensatória induzida pelo tratamento com GC em camundongos e ratos esta associada com alterações do clearance de insulina e a expressão da proteína insuling degrading enzyme (IDE) no fígado. Para isto, camundongos Swiss e ratos Wistar machos foram tratados com o glicocorticoide sintético dexametasona (1 mg/kg p.c.; 5 dias consecutivos). O tratamento com GC induziu RI, hiperinsulinemia e dislipidemia em ambas as espécies, embora mais pronunciado em ratos, que também apresentaram intolerância à glicose e hiperglicemia no jejum. Ambas as espécies tratadas com GC apresentaram incremento da secreção de insulina ex vivo estimulada com glicose, massa e proliferação de células ?, que foram associados com aumento da sinalização da via Ir-?/AKT/mTOR e redução da via AMPK/ACC/AS160 em ilhotas isoladas. O clearance de insulina reduziu em camundongos e ratos tratados com GC, o que foi associado com redução da expressão de IDE no fígado. Desta forma, nossos resultados indicam que camundongos são menos sensíveis aos efeitos deletérios do tratamento com GC sobre a homeostase glicêmica, quando comparado com ratos. Ainda, camundongos e ratos apresentam compensações pancreáticas semelhantes (incremento da função e massa de células ?) em resposta ao tratamento com GC, que foi associado com aumento da sinalização da via canônica de insulina e redução da via não canônica em ilhotas isoladas. Além disso, a redução do clearance de insulina foi, ao menos em parte, devido a redução da expressão de IDE no fígado, o que contribuiu para a hiperinsulinemia compensatória em ambas as espécies tratadas com GC. Em conclusão, estes resultados corroboram a hipótese de que fármacos que inibam a expressão ou atividade da IDE no fígado podem ser uma intervenção anti-diabetogênica que auxilie na manutenção da homeostase glicêmica sem sobrecarregar as células ? / Abstract: Glucocorticoids (GCs) are widely used as anti-inflammatory agent, but they may induce adverse metabolic effects such as insulin resistance (IR), glucose intolerance, and occasionally, diabetes mellitus type 2. Healthy rats have been used as animal models to elucidate the islet compensatory mechanisms involved in these metabolic disturbances, and only a few studies, which have focused on the in vivo effects of GCs, have been conducted in mice models. Yet, whether the reduced insulin clearance also contributes to the compensatory hyperinsulinemia in GC-treated rodents is not fully understood. Here, we aimed to elucidate whether mice and rats share the pancreatic compensations that result in response to dexamethasone (DEX) treatment and also to identify the possible mechanisms that can explain its effects. Yet, we investigated whether the hyperinsulinemia induced by GC treatment in mice and rats is associated with altered hepatic insulin degrading enzyme (IDE) expression and insulin clearance. For this, male Swiss mice and Wistar rats were treated with the synthetic GC dexamethasone (1 mg/kg b.w.; 5 days). DEX treatment induced IR, hyperinsulinemia and dyslipidemia in both species (there was a higher magnitude in rats), but treatment had a greater effect in rats that had glucose intolerance and increased basal blood glucose compared to the control group. Ex vivo insulin secretion at different glucose concentrations was higher in both groups of DEX-treated rodents compared to their controls. Mice and rats showed a significant increase in ?-cell mass due to increased ?-cell proliferation, which was associated with upregulation of the Ir-?/AKT/mTOR and downregulation of AMPK/ACC/AS160 signaling. Insulin clearance reduced in GC-treated mice and rats, which were associated with reduced hepatic IDE expression. Thus, mice are less vulnerable than rats to the deleterious effect of GCs on glucose homeostasis. In addition, rats and mice share common islet compensations (increased ?-cell function and mass) in response to GC treatment, which were associated with increased canonical and decreased non-canonical insulin signaling. Farther, the reduced insulin clearance in GC-treated rodents was, at least in part, due to reduced hepatic IDE expression, which contributed to the compensatory hyperinsulinemia. These findings corroborate the idea that pharmacological interventions that inhibit hepatic IDE may be an alternative anti-diabetic agent that helps to maintain glucose homeostasis due to hyperinsulinemia instead of hypoglycemic agent, which increase the overload in the ?-cells and may lead to ?-cell failure and DM2 / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Elza Olga Ana Muscelli Berardi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T04:29:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_DanielaMiguel_M.pdf: 16961434 bytes, checksum: dce9038dadf9cdf1029b678411bb1cad (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A obesidade é um componente da síndrome plurimetabólica, tem prevalência crescente e está.associada a fatores de risco cardiovascular. Além disto, é o preditor mais importante de diabetes tipo 2. Entretanto, não apenas a obesidade, mas também a distribuição da gordura corporal tem sido associada à fatores de risco, tais como hipertensão arterial, diabetes melito, doença vascular cerebral e dislipidemia incluindo-se maiores triglicérides plasmáticos, Lp (a), Apolipoproteína A e B....Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Obesity, a component of the plurimetabolic syndrome, is reIated to cardiovascular disease, and is the most powerful predictor to type 2 diabetes. A body fat distribution with enhanced abdominal adiposity has been associated to hypertension, type 2 diabetes, vascular disease, hyper-cholesterolemia, changes in cholesterol fractions, Lp (a), Apolipoprotein A and B and triglyceride even in young individuais....Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T07:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalheira_JoseBarretoCampello_D.pdf: 29196532 bytes, checksum: 6adaf88914f9488a42fc234e6f8867f9 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Insulina e leptina atuam de forma semelhante e aditiva para controlar a homeostase energética. Entretanto, a base molecular desse sinergismo permanece desconhecida. A insulina sinaliza através de um receptor tirosina quinase que fosforila e ativa seus substratos (IRSs - substratos do receptor de insulina), enquanto a leptina e sua proteína tirosina quinase associada JAK2 (Janus Kinase 2) medeiam a fosforilação e ativação do fator de transcrição STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription). Para investigar se a insulina e a leptina ativam as mesmas vias de sinalização e para determinar se esses hormônios interagem em hipotálamo, ratos Wistar machos foram estudados após implante de cânula no terceiro ventrículo através de imunoprecipitação, immunoblotting e gel shift. A administração aguda intracerebroventricular (icv) de insulina resultou em aumento da fosforilação do receptor de insulina (IR), substrato 1 do receptor de insulina (JRS-l), substrato 2 do receptor de insulina (IRS-2) e MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase), além da associação entre os IRSs e a PI 3-quinase e a fosforilação em serina da Akt. A administração icv de leptina resultou na fosforilação em tirosina da JAK2, OBR, STAT3, IRS-1, IRS-2 e MAPK, bem como da associação entre os IRSs e a PI 3-quinase mas não foi observada a fosforilação da Akt. O estímulo simultâneo com os dois hormônios não aumentou a fosforilação do IRS-1, IRS-2, Akt e MAPK quando comparado com a administração isolada de insulina. Em contrapartida, a insulina induziu a fosforilação da JAK2 e do receptor de leptina (OBR) que, em presença de leptina, aumentou a interação entre o STAT3 e o OBR com conseqüente aumento da ativação do STAT3. A leptina ativou as vias de sinalização classicamente induzidas pela insulina no hipotálamo, e essas vias se intercruzaram, mas foram utilizadas de forma distinta que quando utilizadas pela insulina. Por outro lado a insulina modulou positivamente a via de sinalização da leptina. Esses resultados proporcionam uma base molecular para os efeitos coordenados da insulina e leptina no controle do apetite e peso corporal. Para demonstrar interdependência entre as vias de sinalização da insulina e leptina em hipotálamo de ratos, a transmissão do sinal de insulina em direção às vias da PI 3-quinase e MAPK foi comparada em hipotálamo de ratos zucker obesos (modelo animal de resistência insulina causado pela mutação do receptor de leptina) e controle. A infusão icv de insulina reduziu a ingestão alimentar de ratos controle, o que não foi observado nos animais obesos. Constatamos redução da fosforilação do IR, IRS-1, IRS-2, da associação entre a subunidade p85 da PI 3-quinase com as proteínas IRSs, bem como da fosforilação em serina da Akt no hipotálamo de ratos obesos comparado com os ratos magros. Em contraste, a insulina estimulou a fosforilação em tirosina da MAPK de forma similar em ratos magros e obesos. Assim, documentamos resistência à sinalização da insulina em tecidos hipotalâmicos de ratos Zucker obesos. Esses resultados fortalecem a hipótese de que a insulina tem suas ações anti-obesidade através da via da PI 3-quinase e que a diminuição do sinal por esta via no hipotálamo pode contribuir para o desenvolvimento de obesidade em estados de resistência à insulina. Originalmente, pensava-se que o hipotálamo era o único tecido a expressar a forma longa do receptor de leptina. Entretanto, evidências recentes sugerem que órgãos periféricos, entre eles o figado, também expressam a forma longa do receptor. Assim, na segunda parte deste estudo investigamos os efeitos rápidos e diretos da leptina em figado e determinamos se a leptina interage com a insulina nesse órgão. Em figado de ratos a injeção aguda de leptina ou insulina estimulou a fosforilação da JAK2, STAT3 e STAT5b. A leptina foi menos efetiva que a insulina em estimular as proteínas IRS e a associação destas com a PI 3-quinase. O tratamento simultâneo com os dois hormônios não modificou a fosforilação máxima do STAT3, IRS-l, IRS-2 e Akt, mas causou aumento significativo da fosforilação da JAK2 e do STAT5b quando comparado com a administração isolada de insulina ou leptina. Assim, detectamos uma inter-relação positiva nas vias de sinalização desses hormônios nas proteínas JAK2 e STAT5b em figado de ratos. Concluindo, estes estudos caracterizaram as vias de transmissão do sinal de leptina em hipotálamo e figado, evidenciando mecanismos para a integração da sinalização de insulina e leptina bem como a modulação destas vias em modelo animal de resistência à insulina e leptina nesses tecidos / Abstract: Insulin and leptin have overlapping effects in the control of energy homeostasis and glucose metabolism, but the molecular basis of this synergism is unknown. Insulin signals through a receptor tyrosine kinase that phosphorylates and activates the docking proteins IRSs (insulin receptor substrates), whereas the leptin receptor and its associated protein tyrosine kinase JAK2 (Janus kinase 2) mediate phosphorylation and activation of the transcription factor STAT3 (signal transducer and activator oftranscription). To investigate whether insulin and leptin share common intracellular signal transduction pathways and to determine whether these hormonal signaling systems modulate each other's action in rat hypothalamus male Wistar rats were studied after chronic implantation of an intracerebroventricular (i.c.v.) catheter into the third ventricle. Immunoprecipitation, immunoblotting and EMSA assays were used to examine the activation of insulin and leptin signaling molecules in the rat hypothalamus. Acute i.c.v. administration of insulin resulted in a time-dependent increase in tyrosine phosphorylation of the insulin receptor (IR), insulin receptor substrate 1 (IRS-1), insulin receptor substrate 2 (IRS-2) and MAPK (mitogen activated proein kinase), PI 3 kinase docking and serine phosphorylation of Akt. The i.c.v. administration of leptin resulted in tyrosine phosphorylation of JAK2, IRS-1, IRS-2 and MAPK and PI 3 kinase docking but no phosphorylation of Akt was observed. Simultaneous stimulation with both hormones did not increment tyrosine phosphorylation of IRS-1, IRS-2, Akt and MAPK when compared with isolated administration of insulin. In addition insulin induced JAK2 tyrosine phosphorylation and leptin receptor phosphorylation, which in the presence of leptin, augmented the interaction between STAT3 and this receptor. Insulin also increased the leptin-induced phosphorylation of STAT3 and its activation. Leptin rapidly activates classically insulin signaling pathways directly at the level of hypothalamus, and these pathways overlap with, but are distinct from, those engaged by insulin. On the other side, insulin modulates the leptin signal transduction pathway, and may provide a molecular basis for the coordinated effects of insulin and leptin in feeding behavior and weight control. To demonstrate the interdependence between insulin and leptin signaling in rat hypothalamus in vivo insulin signaling through the phosphatidylinositol 3-kinase (pI 3-kinase), mitogen-activated protein (MAP) kinase were compared in the hypothalamictissues of lean (Fa/?) and obese Zucker (falfa) rats (animal model of insulin resistance, which has a defect in the leptin receptor). Icv insulin infusion reduced food intake in Iean rats but no effect was observed in obese Zucker rats. Pretreatment with PI 3-kinase inhibitors prevents insulin-induced anorexia in lean rats. Insulin-stimulated tyrosine phosphorylation of insulin receptor (IR), IR substrates (IRS-1, IRS-2), the associations of p85 subunit of PI 3-kinase to the IRS proteins and serine phosphorylation of Akt in the hypothalamus of obese rats were significantly decreased compared with the lean rats. In contrast, insulin stimulated tyrosine phosphorylation of MAP kinase was similar in lean and obese rats. This segment of the study provides direct measurements of insulin signaIing in hypothalamic tissues, and document selective resistance to insulin signaling in the hypothalamus of obese Zucker rats at the molecular leveI. These findings have provided support for the hypothesis that insulin may have anti-obesity actions mediated by the PI 3-kinase pathway and that the impaired PI 3-kinase signal pathway in the hypothalamus may Iead to the development of obesity in insulin resistance and diabetic patients. Originally, it was thought that the hypothalamus was the only tissue expressing OBRb. However, recent evidence at the level of messenger RNA expression and cellular function suggest that peripheral organs including liver also express OBRb. Therefore the second part of the study was designed to investigate the rapid and potentially direct effects of leptin on signal transduction in liver and to determine whether insulin and leptin share common intracellular signal transduction pathways. Chronic leptin treatment markedly enhances the action of insulin on hepatic glucose production out of proportion to the body weight loss and increased insulin sensitivity. In the present experiments the cross-talk between insulin and leptin was evaluated in rat liver. Leptin, upon stimulation of JAK2 tyrosine phosphorylation, induced JAK2 coimmunoprecipitation with STAT3, STAT5b, IRS-1 and IRS-2. This phenomenon parallels the leptin-induced tyrosine phosphorylation of STAT3, STAT5b, IRS-1 and IRS-2. Acutely injected insulin stimulated a mild increase in tyrosine phosphorylation of JAK2, STAT3 and STAT5b. Leptin was less effective than insulin at stimulating IRSs phosphorylation and their associations with PI 3-kinase. Simultaneous treatment with both hormones promoted no change in maximal phosphorylation of STAT3, IRS-l, IRS-2 and Akt, but led to marked increase in tyrosine phosphorylation of JAK2 and STAT5b when compared with isolated administration of insulin or leptin. Thus, there is a positive cross-talk between insulin and leptin signaling pathways at the level of JAK2 and STAT5b in rat liver. We have characterized the leptin signaling pathway in hypothalamus and liver and demonstrate various mechanisms for the integration between insulin and leptin in these tissues. We have also showed that the cross-talk between these hormones is tissue dependent and that the effects of this interaction affects the energetic homeostasis and glucose metabolism in the various steps / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:29:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guarilha_AlessandraLiaGasparetti_D.pdf: 7883483 bytes, checksum: cefd0ee77fd363b470280f9b8a380ff9 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A exposição de animais homeotérmicos ao mo é utilizada como um método reprodutível para se obter um modelo animal de hipoinsulinemiaacompanhada por elevada mobilização periférica de glicose. No presente estudo, avaliaram-se as etapas iniciais e intermediárias da via de sinalização da insulina em tecidos periféricos de ratos expostos ao mo. Avaliou-se ainda, a comunicação intracelular entre o receptor (33-adrenérgicoe as vias de sinalização da insulina em tecido adiposo marrom de ratos expostos ao mo e tratados, ou não, com compostos agonista ou antagonista (33-adrenérgicos.A exposição de ratos ao mo promoveu a redução da secreção de insulina, acompanhada de um elevado clearance de glicose e maior captação de glicose por tecido muscular esquelético, adiposo branco e adiposo marrom. Tais fenômenos foram acompanhados por inibição da ativação da maior parte dos componentes da via de sinalização da insulina em tecido muscular esquelético e adiposo branco; por estimulação da maior parte dos componentes da via de sinalização da insulina em tecido adiposo marrom; e por efeitos variados (estímulo, inibição e não-modulação) de componentes da via de sinalização da insulina em figado. Por fim, este estudo demonstrou que a exposição ao mo ativa a sinalização (33-adrenérgicaem tecido adiposo marrom. Tal ativação leva à modulação da atividade de vários componentes da via de sinalização da insulina neste tecido. Entretanto, fatores independentes da sinalização (33-adrenérgica parecem contribuir para a complexa regulação do sinal da insulina obseIVada em tecido adiposo marrom de ratos expostos ao mo. Em conclusão, o presente estudo revelou alguns dos intrincados mecanismos pelos quais a exposição ao mo controla a atividade da insulina em animais homeotérmicos, podendo favorecer a identificação de potenciais alvos para a ação terapêutica em doenças onde a resistência à insulina desempenha papel central / Abstract: Cold exposure provides a reproducible model of improved glucose turnover accompanied by reduced blood levels of insulin. In the present study, the initial and intermediate steps of the insulin-signaling pathway in peripheral tissues of rats exposed to cold environment were evaluated. Also, the intracellular connection between insulin and ~3-adrenergic signaling in brown adipose tissue of cold exposed rats treated, or not, with ~3-adrenergic agonist or antagonist compounds were evaluated. During cold exposure, insulin secretion was significantly impaired, while whole body glucose clearance rates were significantly improved. This was accompanied by an increased glucose uptake by skeletal muscle, white adipose tissue and brown adipose tissue. These phenomena were paralleled by an apparent molecular resistance to insulin in skeletal muscle and white adipose tissue; by improved molecular response to insulin in brown adipose tissue; and by ambiguous effects (stimulation, inhibition and not modulation) of regulation of the insulin-signaling pathway in liver. Finally, cold exposure activated the ~3-adrenergic signaling in brown adipose tissue. It leads to modulation of activity of several components of the insulin signal transduction pathway in this tissue. However, ~3-adrenergic receptor independent mechanisms seem to contribute to the complex regulation of the insulin signaling observed in brown adipose tissue of rats exposed to cold. In conclusion, the present study revealed some of the complex mechanisms that participate in the cold-exposure-induced control of the insulin action in homeothermic animals. These results may favour the identification of novel potential targets for therapeutics in diabetes and related disorders / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

Objetivo: determinar la presencia de Resistencia a la Insulina (RI) y del Síndrome Metabólico (SM) en mujeres adultas con sobrepeso y obesidad. Material y métodos: se estudiaron 60 mujeres adultas, comprendidas entre los 20 a 40 años de edad. A todas se les tomó el peso y la talla para calcular su Índice de Masa Corporal (IMC) y poder incorporarlas al grupo con sobrepeso (entre 25.1 a 29.9 kg/m2) y obesidad (de 30 a más kg/m2). Así mismo se les midió la circunferencia de la cintura (CC) en la línea axilar media entre el borde inferior de la última costilla y el reborde superior de la espina ilíaca. Los indicadores bioquímicos dosados son: glicemia basal, insulina basal, colesterol total, triglicéridos, colesterol HDL, LDL y VLDL. La determinación de la RI se hizo mediante el Índice HOMA, considerando como valor diagnóstico igual o mayor de 2.7. Para el SM lo recomendado por el ATP IIIResultados: la presencia de RI alcanza a un 4 y 31.4% en las mujeres con sobrepeso y obesidad respectivamente. El SM está presente en el 28% de las mujeres con sobrepeso y en el 30% de las obesas. En relación a la CC, las mujeres que tienen una CC por encima del 50 percentil, el 33.3% presentan RI y el 37% SM. Por el contrario las que tienen una CC por debajo del 50 percentil el 3.7% tienen RI y el 27% SM. Las que presentan una CC por encima del 50 percentil tienen un promedio de insulinemia de 10.28 uUI/ml, mientras las que se encuentran por debajo del 50 percentil tienen 6.32 Uui/ml. El valor del 50 percentil para la población estudiada es de 110 cm. Dentro de los factores de riesgo de acuerdo a grupos de edad, las de mayor edad (30 a 40 años) presentan mayor riesgo por la presencia de SM y CC que las de menor edad (20 a 30 años). El IMC y la CC muestran una correlación significativa. Conclusiones: el riesgo que de por sí representa el tener un IMC y una CC por encima de los valores normales se ve incrementado por la presencia de alteraciones metabólicas que de alguna manera van a condicionar problemas cardiovasculares. La tendencia epidemiológica de estas enfermedades augura un aumento sostenido en función del tiempo, siempre y cuando no se tomen medidas para enfrentar esta situación. Recomendaciones: Promover medidas que giren alrededor de cambios en los estilos de vida, sustentados en una alimentación adecuada y en una promoción sostenida de actividad física. / --- Objective: To determine the presence of Insuline Resistance (IR) and Metabollic Syndrome (MS) in adult female with overweight and obesity. Material and Methods: 60 adults female aged 20 to 40 years were studied. All were weighed and heighted to calculate their Body Mass Index (BMI) in order to include them to the group with overweight (between 25.1 to 29.9 kg/m2) and obesity (30 and over kg/m2). Likewise their waist circumference (WC) was taken midway between the tenth rib and the iliac crest. The biochemical ratios dosed were: basal glycemia, basal insuline, total cholesterol, trigliceridos, cholesterol HDL, LDL and VLDL. The IR determination was made through HOMA index, considering as diagnosis value equal or higher than 2.7. For the MS it was used the ATPIII recommendation.Results: The presence of IR reaches to 4 and 31.4% in females with overweight and obesity respectively. The MS is present in 28% of females with overweight and in 30% of obese. As to WC, females who have WC over 50 percentile, 33.3% report IR and 37% MS. On the contrary, those who have WC under 50 percentile, 3.7% record IR and 27% MS. Those with a WC over 50 percentile have an insulinemia average of 10.28 uUI/ml, while the ones which are under the 50 percentile have 6.32 uUI/ml. The value of 50 percentile for the population studied is 110 cm. The risk factors within group of ages, the adult ones (30 to 40 years) appear which higher risk due to the presence of MS and WC, than the younger (20 to 30 years). The BMI and WC show a correlation significantly statistic with insulin and HOMA. Conclusions: The risk that itself represents to have a BMI and WC over normal values is increased by the presence of metabolic alterations, which in some way will condition cardiovascular problems. The epidemiologic tendency of these diseases previews a sustained increase along time, if no measures are taken to confront this situation. Recommendations These measures are widely known and are around changes in lifestyles, sustained in an adequate feeding and a sustained promotion of physical activity.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magister en Bioquímica en el área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La hipertrofia cardiaca es un proceso fisiopatológico que busca compensar un incremento en la carga de trabajo del corazón. Este proceso se caracteriza por un incremento en el tamaño de los cardiomiocitos, células encargadas de la contracción del corazón, llevando a un aumento en el tamaño de este órgano. En un principio la hipertrofia busca mejorar la función cardiaca, fenómeno conocido como hipertrofia adaptativa. Si esta condición se mantiene en el tiempo se produce hipertrofia patológica, que se caracteriza por ser irreversible y predisponer al desarrollo de arritmias, insuficiencia cardiaca y muerte súbita. Al mismo tiempo, el corazón hipertrófico presenta importantes cambios en su metabolismo energético, homeostasis del Ca2+ y un estado de resistencia a la insulina. La insulina es una hormona fundamental para la regulación del metabolismo energético del organismo y es clave en el control de los niveles plasmáticos de glucosa. En el corazón, su principal función es promover la entrada de glucosa al cardiomiocito y favorecer su uso como fuente energética, promoviendo la glicólisis y su posterior oxidación en la mitocondria. La resistencia a insulina en el corazón como la observada en hipertrofia, se asocia a una menor capacidad de trabajo y constituye un factor de riesgo para insuficiencia cardiaca y muerte post-isquemia, por lo que conocer con mayor profundidad sus características moleculares es de gran importancia. Recientemente se ha descrito que la salida de Ca2+ desde el retículo endoplasmático (principal reservorio intracelular de Ca2+) a través de los receptores/canales de inositol-1,4,5-trifosfato es un elemento clave para la acción metabólica de insulina, incluida la captación de glucosa. Por otro lado, se sabe que la mitocondria regula las señales mediadas por Ca2+, actuando como un amortiguador e incorporando Ca2+ luego de un incremento de sus niveles en el citoplasma. A su vez, este Ca2+ es un importante regulador del metabolismo mitocondrial. A pesar de su capacidad para generar una liberación de Ca2+ al citoplasma, se desconoce si insulina regula el metabolismo mitocondrial mediante un incremento en los niveles de Ca2+ en la mitocondria. Por otro lado, se desconoce si la resistencia a insulina generada por hipertrofia ocurre a consecuencia de una menor liberación de Ca2+ en respuesta a esta hormona. A fin de responder estas interrogantes, el principal objetivo de esta tesis consistió en evaluar si los cardiomiocitos hipertróficos presentan una menor señal de Ca2+ citoplasmático y/o mitocondrial en respuesta a insulina comparado con cardiomiocitos controles. Para evaluar esta posibilidad, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata se estimularon con noradrenalina, un estímulo clásico para generar hipertrofia patológica, por 24 h y luego se midió la señal de Ca2+ en respuesta a insulina. Para comprobar que estos cardiomiocitos presentaban una menor respuesta a insulina se evaluaron la fosforilación de Akt, un marcador de los efectos metabólicos de esta hormona, y el consumo de oxígeno, un marcador de la actividad metabólica mitocondrial. Se observó una reducción de ambos parámetros en cardiomiocitos hipertróficos en respuesta a insulina. La señal de Ca2+ en respuesta a insulina se midió mediante microscopía confocal y sondas fluorescentes sensibles al Ca2+ destinadas específicamente al citoplasma y la mitocondria. Los cardiomiocitos hipertróficos mostraron una marcada reducción en el incremento del Ca2+ mitocondrial en respuesta a insulina, mientras que el incremento en el Ca2+ citoplasmático no se modificó. Mediante un estudio de colocalización usando microscopia confocal y sondas fluorescentes organelo-especificas, se determinó que la menor entrada de Ca2+ a la mitocondria se podría deber a un alejamiento entre el retículo endoplasmático y la mitocondria. Luego, mediante el uso de rojo rutenio, un inhibidor de la entrada de Ca2+ a la mitocondria, se determinó que este evento es necesario para la fosforilación de Akt y para el incremento en el consumo de oxígeno en respuesta a insulina. De esta forma, el incremento en el Ca2+ mitocondrial surge como un importante intermediario en la respuesta a insulina que regula la respuesta metabólica inducida por esta hormona, mientras que el bloqueo en el traspaso de Ca2+ a la mitocondria podría ser un importante mecanismo patológico que reduce la respuesta a insulina / Cardiac hypertrophy is a pathophysiological process that aims to compensate an increase in the working load of the heart. This process is characterized by an increase in cardiomyocyte size, the cells in charge of heart contraction, leading to an enlargement of this organ. In the beginning, hypertrophy aims to improve cardiac function, a process known as adaptative hypertrophy. If it is maintained in time it can turn into a pathological hypertrophy, which is irreversible and predisposes to arrhythmia, heart failure and sudden death. At the same time, the hypertrophic heart shows significant changes on energy metabolism, Ca2+ handling and an insulin resistant condition. Insulin is a key regulator of energy metabolism and plasma glucose levels. In the heart, its main function is to promote glucose entry to the cardiomyocytes and its use as an energy source through the activation of glycolysis and oxidation in the mitochondria. Insulin resistance observed in cardiac hypertrophy is associated with a reduced working capacity and is a risk factor for heart failure and post-ischemic cell death. That is the reason why a better understanding of its molecular characteristics is of great relevance. Recently, it has been described that Ca2+ exit from the endoplasmic reticulum (the main reserve of intracellular Ca2+) through inositol 1,4,5-triphosphate receptor/channel is a key element for insulin action, including glucose uptake. In addition, it is known that mitochondrion is very important in the regulation of Ca2+ signals, acting as a buffer and up taking Ca2+ after an increase in its cytoplasmic levels, especially following a release through this channel. At the same time, this Ca2+ is an important regulator of mitochondrial metabolism. In spite of its Ca2+-releasing capacity, it is not known if insulin regulates mitochondrial metabolism through an increase in mitochondrial Ca2+ levels. Additionally, it is also unknown if the insulin resistance generated by hypertrophy occurs in response to a reduced Ca2+ release in response to this hormone. In order to answer these queries, the main objective of this thesis consisted in evaluating if hypertrophic cardiomyocytes show a reduced mitochondrial and/or cytoplasmic Ca2+ signal after insulin stimulation compared to normal cardiomyocytes. To evaluate this possibility, neonatal rat cardiomyocytes where stimulated with norepinephrine, a classic stimulus to generate pathologic hypertrophy, for 24 h and then the Ca2+ signal in response to insulin was measured. In order to confirm the reduced insulin response of these cardiomyocytes, Akt phosphorilation, a marker of the metabolic action of insulin, and oxygen consumption, a measure of mitochondrial metabolic activity, were evaluated after insulin stimulation. Both parameters showed a reduction in hypertrophic cardiomyocytes in response to insulin. Insulin Ca2+-signal was measured by confocal microscopy and cytoplasm and mitochondrion-selective Ca2+- sensitive fluorescent probes. Hypertrophic cardiomyocytes showed a reduction in mitochondrial Ca2+ increase after insulin stimulation, whereas cytoplasmic Ca2+ increase was unaffected. By a colocalization analysis using confocal microscopy and organelle-specific fluorescent probes, it was determined that a reduction in contacts between both organelles could explain the reduction in Ca2+ transfer in hypertrophic cardiomyocytes. Finally, pharmacological blocking of Ca2+ entry to the mitochondria through the use of ruthenium red showed that this process was necessary to the increase of Akt phosphorilation and oxygen consumption after insulin stimulation. In this way, mitochondrial Ca2+ uptake comes as a novel and significant mediator in the regulation of insulin response, while the blockade of Ca2+ transfer to the mitochondria could by an important pathological mechanism that leads to insulin resistance / FONDAP; FONDECYT

El presente trabajo se basa en el diseño y síntesis de un complejo de oxovanadio (IV) con el ligando polimérico α,β-poli(DL-ácido aspártico). Esta macromolécula sintética reúne las características apropiadas para fungir como un vehículo polimérico del agente insulino mimético oxovanadio(IV). Es biodegradable, biocompatible, no tóxica, hidrosoluble y posee grupos carboxílicos capaces de coordinar al metal. La idea de usar un polímero como agente quelante en lugar de los usuales ligandos orgánicos resulta atractiva puesto que el aumento del peso molecular produce un cambio radical en la farmacocinética de la droga. El carácter hidrosoluble del polímero permite una rápida y eficaz distribución del agente activo en los fluidos corporales y gracias a su efecto protector estabiliza al agente activo, aumenta su concentración y tiempo de permanencia en el sistema circulatorio, liberándolo de modo lento y controlado. El complejo polimérico vanadilo-α,β-poli(DL-ácido aspártico) ha sido sintetizado por reacción de metátesis entre el polímero parcialmente desprotonado y sulfato de vanadilo en solución acuosa diluida. El ligando polimérico, fue sintetizado a partir de la polisuccinimida (PSI) según una combinación de los métodos reportados por Shinoda, Neuse y Kim, mientras que el polímero precursor fue sintetizado por una modificación del método de Neri y colaboradores, basado en una policondensación térmica del monómero DL-ácido aspártico, catalizada por ácido fosfórico. El rendimiento de la síntesis del PSI y del ligando es 85 a 89 % y 84 a 94 %, respectivamente. Por otro lado, el rendimiento de la síntesis del complejo es 9 a 12 %. Además, el polímero precursor fue caracterizado por resonancia magnética nuclear y por espectroscopía infrarroja; mientras que, el ligando y el complejo fueron caracterizados además de las técnicas mencionadas por UV-visible. Por otro lado, el peso molecular del PSI (61,5 - 68 kDa) y del ligando (27 - 30 kDa) fue determinado por cromatografía de permeación por gel (GPC) y por viscosimetría intrínseca, respectivamente. Por último, la estructura octaédrica del complejo en solución fue determinada por UV-visible y su contenido de vanadio, determinado por ICP, se encuentra en el rango de 12,45 a 16,79 %. / Tesis