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Etude du rôle de l' histone acétyl-transférase chameau de drosophile dans le développement des organes sensitifs et le contrôle de la signalisation hormonale

Hainaut, Matthieu 10 December 2012 (has links)
Les histones acetyl transférase sont une classe de protéines jouant un rôle primordial dans la modification de l'état de la structure chromatinienne. Leur capacité à réaliser des modifications post-traductionnelles des queues N-terminales d'histone contribue à l'élaboration du « code histone ». Son interprétation permet d'influer sur le recrutement de co-facteurs, l'activité des complexes de remodelage et la possibilité pour certaines d'être maintenues à travers les divisions cellulaires, mettant en évidence un mécanisme primordial dans le contrôle de l'expression des gènes. Le gène chm code pour l'une de ces protéines de la famille MYST. Découvert dans le laboratoire, son étude a révélé sa capacité à maintenir la transcription de gènes Hox, à moduler l'activité transcriptionnelle de Fos/Jun par l'acétylation de l'histone H4 aux loci des gènes cibles dans la voie de signalisation Jun N-terminal Kinase (JNK) et enfin de contrôler l'origine de réplication. Aux phénotypes majeurs des mutants zygotiques pour chm ; qui sont : un défaut de fermeture du thorax adulte et la mort au stade pupe pharate ; s'ajoute : l'apparition de soies sensorielles extra-numéraire en position dorsocentral et scutellaire, des phénotypes reliés à un défaut des voies hormonales (hormone juvénile, peptide insulinique) : anomalies lors de la métamorphose, accroissement de la susceptibilité aux stress durant le stade adulte. Mes travaux de thèse m'ont permis d'identifier la place de Chm dans la voie de régulation de la formation de cluster prérequis à l'apparition de soies sensorielles. / The histone acetyltransferase (HAT) Chameau (Chm) plays in various epigenetic mechanisms of transcription control : maintenance of Hox gene transcription ; modulation of Fos/Jun transcriptional activity by histone H4 acetylation at target gene loci; control of replication origins. Here, I will discuss about a neural function of Chm, which acts in few brain neurosecretory neurons to control the activity of neurohaemal organs. Genetic evidences for a neuroendocrine function of Chm are the following. On the one hand, chm inactivation causes phenotypes suggesting hormonal signaling defects : null mutation prevents abdominal differentiation and hatching – correlated to an juvenile hormone (JH) excess - chm late inactivation allows the emergence of adults that are highly susceptible to different types of stress (starvation, oxidative, infections) – related to a defect in insulin signaling. On the other hand, these two phenotype classes are rescued by providing back Chm in 6 neurons of the pars lateralis (CA-LPs, which innervate the CA) during development, and in 12 neurons of pars intercerabralis (IPCs, which produce insulin-like peptides and innervate the CC/CA complex) in adult. DNA chip experiments showed that chm mutation affects 6 functional classes of genes (defined by ‘biological process' Gene Ontology term) : (i) neurotransmission, synaptic activity; ii) hormones, JH and ecdysone; iii) nutritional control; iv) oxidative stress; v) life span; vi) immune defense. These classes match perfectly the phenotypes described above. Furthermore a significant fraction of these genes are similarly affected by the mutation of chm and by the inactivation of CA-LPs and IPCs neurons.
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Effets des fructo-oligosaccharides sur la sensibilité à l'insuline

Respondek, Frédérique 18 December 2012 (has links)
Une consommation de fibres alimentaires adéquate semble protéger du risque de développer un diabète de type 2 dont a contrario la prévalence ne cesse de progresser à travers le monde. Parmi les mécanismes d'action pouvant expliquer comment les fibres contribuent à l'homéostasie du glucose et à la sensibilité à l'insuline, l'implication du microbiote intestinal semble aujourd'hui très probable. Cependant il n'est pas toujours aisé de différencier ses effets de ceux pouvant découler d'une réduction de l'indice glycémique voir de ceux induits par des micronutriments parfois associés aux fibres. Les travaux de cette thèse ont permis de confirmer que les fructo-oligosaccharides (FOS), fibres prébiotiques peu visqueuses, peuvent améliorer la sensibilité à l'insuline de différents modèles animaux d'obésité induite par le régime alimentaire. La réduction de la sensibilité à l'insuline induite par le surpoids n'est pas complètement contrebalancée par les FOS mais leurs effets sont visibles même sans perte de poids associée. D'autre part une corrélation directe entre les modifications de la composition et des activités du microbiote intestinale induites par les FOS et le métabolisme de l'hôte a pu être mise en évidence. Au-delà d'une augmentation des bifidobactéries déjà bien documentée, les travaux de cette thèse ont révélé la modulation par les FOS d'autres clusters bactériens plus prépondérants au sein de l'écosystème digestif comme ceux des Clostridium leptum et Clostridium coccoides – Eubacterium rectale. En modulant ces populations, les FOS influencent le métabolisme des acides biliaires et le niveau d'hydroxylation d'acides gras monoinsaturés. / An adequate intake of dietary has proven to protect against the risk to develop type 2 diabetes, for which the prevalence is currently increasing all around the world. Among the different mechanisms that could explain how dietary fibres can contribute to insulin sensitivity and glucose homeostasis, involvement of the gut microbiota seems more than likely. However it is not always possible to differentiate the effects that linked to the microbiota from those induced a reduction of the glycaemic index or those induced by some micronutrients sometimes closely associated to dietary fibres. The experiments conducted during this PhD validate that fructo-oligosaccharides (FOS), poorly viscous prebiotic fibres, can enhance insulin sensitivity if different animal models of diet-induced obesity. Reduction of insulin sensitivity resulting from overweight status is not completely solved by FOS but their effect is not linked to weight loss. Moreover, a direct correlation between the modifications of the composition and activities of the intestinal microbiota triggered by FOS and metabolism of the host has been highlighted. This work reveals that more than a single increase of Bifidobacteria already well documented, FOS can alter other bacterial clusters more predominant within the digestive ecosystem like Clostridium leptum and Clostridium coccoides – Eubacterium rectale. By modulating these populations, FOS will alter the metabolism of biliary acids and the level of monounsaturated fatty acids hydroxylation.
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Effet aigü d'une insulinothérapie intensive sur le métabolisme des lipoparticules riches en triglycérides(TRL) intestinales chez le patient diabétique de type 2

Nogueira, Juan Patricio 13 December 2011 (has links)
La mortalité cardiovasculaire représente la première cause de mortalité chez les sujets diabétiques de type 2. La dyslipidémie de ces patients caractérisée par le quatuor : hypertriglycéridémie, baisse du HDL-cholestérol, augmentation du nombre de LDL petites et denses et hyperlipidémie postprandiale, constitue un facteur de risque prépondérant. Cette dyslipidémie est en grande partie expliquée par l’accumulation sanguine des lipoparticules riches en triglycérides (TRL) d’origine hépatique (VLDL) et intestinale (chylomicrons). L’hyperproduction des chylomicrons, déjà connue pour les VLDL, est une composante nouvellement reconnue d’insulinorésistance. L’action inhibitrice aigüe de l’insuline sur la production des VLDL est absente chez le sujet diabétique de type 2. Dans notre étude, nous avons montré l’absence d’effet aigu de l’insuline sur la production des chylomicrons chez les sujets diabétiques de type 2 grâce à une étude cinétique utilisant un isotope stable (D3-leucine). / The cardiovascular mortality represents the first cause of mortality in human type 2 diabetes. The typical diabetic dyslipidemia characterized by the quartet: high triglyceride levels, low HDL-cholesterol, increased number of small and dense LDL particles and postprandial hyperlipidemia, is a major cardiovascular risk factor. This dyslipidemia is mainly explained by the accumulation of triglyceride-rich lipoproteins (TRL) from liver (VLDL) and intestine (chylomicrons).The overproduction of chylomicrons, as is known for VLDL, is a newly characteristic of insulin resistant states. The acute inhibitory effect of insulin on VLDL production is absent in type 2 diabetic patients. In our study, we have shown the absence of acute inhibitory effect of insulin on chylomicron production in type 2 diabetic patients, using a kinetic study with stable isotope (D3-leucine).
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Adaptive changes of human islets to an obesogenic environment in the mouse / Adaptation des ilots humains à l’environnement de l’obésité

Gargani, Sofia 17 September 2013 (has links)
Dans les conditions normales, les organismes maintiennent une masse cellulaire endocrine stable tout au long de leur vie. En cas d’obésité, la masse de cellules b pancréatiques est capable de maintenir des taux de glucose plasmatique en augmentant la sécrétion en insuline. L’incapacité de ces cellules à fournir de l’insuline entraîne alors l’apparition d’une hyperglycémie et d’un diabète de type II. Cliniquement, la majorité des individus obèses ne développent pas de diabète car les îlots pallient à cette résistance à l’insuline. La preuve de l’adaptation de la masse d’îlots humains à l’obésité, in vivo, n’a pas été clairement décrite et, de plus, peu d’informations existent sur les mécanismes et les types cellulaires impliqués. Actuellement, la mise en évidence de l’augmentation de la masse des cellules b chez les humains obèses repose uniquement sur des études histologiques.But : Au cours de cette thèse, nous avons cherché, dans un premier temps (partie 1), à évaluer la morphologie des îlots pancréatiques et la distribution des cellules a et b chez des donneurs en état de mort cérébrale normaux, en surpoids et obèses. Dans un second temps (partie 2), nous avons étudié l’adaptation au cours du temps des îlots humains à un environnement obésogène. Nous avons montré ainsi que les îlots humains non diabétiques s’adaptent in vivo à l’obésité en modifiant la masse de cellules b, leur fonction et leur expression génique. En suite (partie 3), on a identifié le mécanisme de transdifférenciation des cellules alpha et beta en utilisant la méthode de lineage tracing. Finalement (partie 4), on a déterminé la différence sur l’expression de gène des ilots humains greffé chez les souris sous régime control ou régime riche en graisse en utilisant les puces d’ARN (Illumina).Methodes et Resultats: Des coupes de pancréas humains inclues en paraffines ont été analysées. Les donneurs obèses étaient caractérisés par une augmentation de la masse endocrine totale, de la taille des îlots, de la graisse intra-pancréatique et du ratio b:a dans les îlots, mais avec une diminution du ratio a:b dans les îlots. Au cours de l’étude longitudinale, des souris Rag2-/- non diabétiques ont été greffées sous la capsule rénale avec des îlots humains issus de donneurs en état de mort cérébrale (donneurs non diabétiques ou donneurs avec un dysfonctionnement métabolique déclaré). Les animaux ont été nourris pendant 2 semaines avec soit un régime contrôle soit un régime riche en graisse (high fat diet HFD). Un suivi du poids, du taux des triglycérides, de la glycémie et du C-peptide a été mis en place. Après sacrifice des souris, les greffons et les pancréas endogènes ont été analysés pour le volume endocrine, la distribution des cellules b et a et les mécanismes de régénération des cellules pancréatiques. Après 12 semaines sous régime gras, les souris montraient toutes les caractéristiques typiques de l’obésité, à savoir, une augmentation du poids, un doublement de la graisse abdominale, des triglycérides, de la glycémie et une sensibilité à l’insuline réduite. De plus, l’apparition sur ces animaux d’un doublement rapide de la quantité de C-peptide humain dans le sérum murin nous indique la mise en place d’une compensation fonctionnelle. Une analyse histologique des greffons a permis de mettre en évidence une adaptation de la masse endocrine des îlots avec une augmentation des cellules b. D’autres analyses ont identifié la prolifération et la néogénèse comme les mécanismes responsables de ce doublement de la masse endocrine humaine.Discussion: Ce nouveau modèle animal permet d’étudier, in vivo sur une longue période, l’adaptation des îlots humains à un environnement obésogène murin. Il peut être utilisé comme un outil dans le décryptage des voies de signalisation impliquées dans l’expansion des cellules b humaines et permettre également l’identification des facteurs prédisposant ces cellules à subir une décompensation. / Under normal healthy conditions, organisms maintain a dynamic endocrinecell mass throughout life. Pancreatic beta cell mass are able to maintain plasma glucose levels increasing insulin secretion in conditions as obesity.Beta cell inability to compensate in insulin demand provokes hyperglycemia and Type 2 Diabetes. Clinically, most obese individuals do not develop diabetes because islets compensate for insulin resistance. Direct evidence that human islet mass adapts longitudinally to obesity in vivo was lacking and, moreover, little information was available on the mechanismsand cell type(s) involved.Current evidence for increased beta cell mass in obese humans (vs lean) is based entirely on postmortem histology.Aim: In this thesis, firstly (Part 1) we performed a descriptive cross sectional study by evaluating the pancreatic islet morphology and alpha and beta cell distribution from our archived human pancreatic sections of obese and normal subjects. Secondly, (Part 2) we explored the longitudinal adaptation of human islets to an obesogenic environment and showed direct evidence that non-diabetic human islets adapt bothendocrine and beta cell mass, function and gene expression to obesity in vivo. Thirdly (Part 3) we performed lineage tracing to determine which cell type alpha or beta give rise to the increase islet mass in obesity. Finally (Part 4) in this diet induced obesity model we developed, we looked at the differential gene expression with Illumina gene chips in a kinetic study on human islets which were laser capture microdissected at 6, 8 and 10 weeks on control or high fat diet.Methods: Archived human pancreatic sections were immunostained for endocrine, beta, alpha, fat. In the obese/immunodeficient mouse model, non-diabetic Rag2–/– mice were transplanted under kidney capsule with human islets from human brain-deceased donors (non-diabetics donors and donors with overt metabolic dysfunction). Animals were fed for 12 weeks with a control or high-fat diet (HFD), and followed for weight, serum triacylglycerol, fasting blood glucose and human C-peptide. After the mice were killed, human grafts and the endogenous pancreas were analyzed for endocrine volume, distribution of beta and alpha cells, and mechanisms of regeneration.Results: The cross-sectional study, performed on archived human paraffin embedded sections of normal weight, overweight, or obese subjects showed that obese donors were characterized by an increased total endocrine mass, bigger individual islet size, increased intrapancreatic fat, increased β to  cell ratio and decreased :β cell ratio in islets. In the longitudinal study, concomitant with the increased weight gain, doubling of abdominal fat, increased serum triacylglycerol and reduced insulin sensitivity in 12 week HFD animals we reported that human islet grafts showed functional compensation, measured as a more than doubling of fasting human C-peptide in mouse serum, and histological adaptation of islet endocrine mass including increased beta cells. Further analysis of the human grafts revealed proliferation and neogenesis as the responsible mechanisms for the doubling of the human endocrine mass.Discussion: This novel model allows, for the first time, longitudinal studies of human islet adaptation to an obese murine environment and may be instrumental in deciphering pathways involved in human beta cell expansion, as well as in helping to identify factors predisposing human beta cells to undergo decompensation.
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Contrôle glycémique informatisé en réanimation / Computerized glucose control in the Intensive Care Unit

Kalfon, Pierre 10 June 2014 (has links)
L'hyperglycémie est très souvent présente chez le patient de réanimation, liée à une insulinorésistance et une production accrue de glucose par le foie. La relation entre hyperglycémie en réanimation et pronostic défavorable était déjà établie lorsque Van den Berghe et al montra une réduction de mortalité associée à une insulinothérapie intensive visant à normaliser la glycémie. Du fait de l'impossibilité à reproduire cet effet bénéfique et de la mise en évidence d'une surmortalité associée à un contrôle glycémique strict par rapport à un contrôle visant une glycémie < 10mmol/L (étude NICE-SUGAR), le premier objectif de cette thèse fut de rechercher à l'aide d'une étude multicentrique (étude CGAO-REA) une association entre utilisation d'un logiciel facilitant le contrôle glycémique strict et réduction de mortalité. Malgré le résultat négatif de l'étude CGAO-REA, l'intérêt d'un système informatisé demeure en raison de la complexité du contrôle glycémique. Sont ainsi discutés les sujets suivants appliqués à la réanimation : aléas du contrôle glycémique, méthodes de mesure de la glycémie, contrôleurs glycémiques, insulinorésistance, variabilité glycémique, impact du statut diabétique et systèmes informatisés. Le deuxième objectif de cette thèse est de détailler les nouveaux objectifs du contrôle glycémique en réanimation et d'en présenter l'évolution et les perspectives. En s'inspirant des diabétologues engagés dans le développement d'un pancréas artificiel et en généralisant les évaluations in silico, des équipes pluridisciplinaires pourraient construire une station de contrôle informatisée afin d'obtenir un contrôle glycémique optimisé et individualisé en réanimation. / Stress-induced hyperglycemia is common in critically ill patients due to insulin resistance and increased hepatic output of glucose. The relationship between stress hyperglycemia and poor outcome for patients hospitalized in the intensive care unit (ICU) was already established when Van den Berghe et al demonstrated that tight glucose control (TGC) by intensive insulin therapy was associated with decreased mortality and rate of complications in surgical ICU patients. Because further randomized controlled studies have failed to replicate any mortality benefit and have even shown an increased mortality (the NICE -SUGAR study), the primary objective of this thesis was to test the hypothesis that TGC with a computerized decision-support system (CDSS) reduces the mortality in adult critically ill patients as compared to conventional glucose control targeting BG levels to <10 mmol/L (the CGAO-REA study). We discussed several aspects of glucose control in the ICU (integration in the clinical workflow, confounding issues in BG measurements, insulin resistance, glucose variability, impact of diabetic status) and reviewed existing computerized tools. Despite the negative result of the CGAO-REA study, the interest for CDSSs remains because meanwhile new therapeutic goals for glucose control in the ICU have emerged. The second objective of this thesis is to present ongoing developments. Based on research programs targeting an artificial pancreas for diabetic patients, in silico trials, multidisciplinary approaches integrating human factors, a computerized glucose control station could be developed to allow clinicians to achieve an optimized, individualized glucose control in the ICU.
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Caractérisation de la fonction des β-arrestines dans les cellules β pancréatiques : recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le diabète de type 2 / Characterization of the function of β-arrestins in pancreatic β-cells : new therapeutic research strategies for type 2 diabetes.

Obeid, Joëlle 29 November 2018 (has links)
Les pertes de la fonction et de la masse des cellules beta pancréatiques jouent un rôle central dans le diabète de type 2 (DT2). Les beta-arrestines 1 et 2 (ARRB1 et ARRB2), sont impliquées dans la sécrétion et/ou la survie des cellules beta pancréatiques.Dans une première étude, afin de caractériser précisément la fonction d’ARRB1 dans les cellules beta pancréatiques, nous avons eu pour objectif de générer des souris invalidées spécifiquement dans ces cellules en utilisant le système Cre/lox sous le contrôle du promoteur Ins1. Des études avaient été publiées à partir des deux lignées Ins1Cre-/+ et Arrb1f/f. Nous avons généré et travaillé sur les souris Arrb1f/f :Ins1Cre-/+. Le phénotype des souris Arrb1f/f :Ins1Cre-/+ était faible et surtout non reproductible comparé aux souris Arrb1f/f :Ins1Cre-/- utilisées comme témoins. Le faible niveau d’expression d'Arrb1 dans les cellules beta et le manque d'anticorps spécifique pour l'immunocytochimie ont rendu difficile la vérification de l'absence d'expression de ARRB1 dans ces cellules. Après séquençage du gène modifié Arrb1 des souris “floxées“, nous avons pu montrer que l'insertion du premier site loxP avait induit un décalage du cadre de lecture introduisant un codon stop et, par conséquent, la non-expression du gène Arrb1. Étant donné que les souris Arrb1 “floxées“ utilisées comme témoins étaient déjà knockout (KO), le projet utilisant ces souris a dû être arrêté.Notre équipe a rapporté l'implication d'ARRB2 dans la régulation de la masse des cellules bêta pancréatique, mais son rôle dans la signalisation du récepteur du Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1R), une cible thérapeutique majeure du DT2, n'avait pas encore été exploré.Nous avons montré, dans une deuxième étude, une meilleure tolérance orale au glucose ainsi qu’une augmentation de la sécrétion d’insuline chez les souris Arrb2 KO par rapport aux souris témoins sur les îlots en présence des concentrations physiologiques circulantes de GLP-1. Ceci est corrélé à une production d’AMPc et un recrutement de la PKA plus élevés dans les cellules beta Arrb2 KO. A l’inverse, l’activation des kinases ERK1/2 est diminuée indiquant un recrutement majeur des ERK1/2 par ARRB2 au GLP-1R. En parallèle, j’ai montré que les taux de ARRB1 et ARRB2 des îlots pancréatiques sont altérés par des conditions diabétogènes et diabétiques. Mes résultats démontrent clairement un rôle critique de ARRB2 dans la signalisation du GLP-1R. Un défaut d’expression de la protéine pourrait participer au déficit des mécanismes de compensation de la masse fonctionnelle des cellules beta conduisant au DT2. / The loss of function and mass of pancreatic beta-cells play a central role in type 2 diabetes (T2D). Beta-arrestin 1 and 2 (ARRB1 and ARRB2) are involved in insulin secretion and/or beta-cell survival. In a first study, in order to characterize the role of ARRB1 in beta-cells, we aimed to invalidate the Arrb1 gene specifically in these cells using the Cre/lox system under the control of the Ins1 promoter. Studies had been published with both Ins1Cre-/+ and Arrb1f/f lines. We generated Arrb1f/f:Ins1Cre-/+ mice. The phenotype of Arrb1f/f :Ins1Cre-/+ mice was weak with a lack of reproducibility compared to Arrb1f/f :Ins1Cre-/- mice used as controls. The low expression level of Arrb1 in beta-cells and the lack of specific antibody for immunocytochemistry made it difficult to verify the absence of expression of ARRB1 in these cells. After sequencing the modified Arrb1 gene of the “floxed” mice, we observed that the insertion of the first loxP site induced a shift in the reading frame introducing a stop codon and, consequently, the non-expression of the Arrb1 gene. Since the “floxed“ Arrb1 mice used as controls were already knockout (KO), the project using these mice was stopped.Our team has reported the involvement of ARRB2 in the regulation of beta-cell mass, but its role in Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) receptor signaling, a major therapeutic target for T2D, remained to be explored. In a second study, we showed a better glucose tolerance and an increase in insulin secretion from isolated islets in Arrb2KO compared to control mice in the presence of physiological circulating concentrations of GLP-1. This was correlated with higher cAMP production and PKA activation in Arrb2KO beta-cells. By contrast, the activation of ERK1/2 kinases was decreased indicating a major recruitment of ERK1/2 by ARRB2 to GLP-1R. In parallel, we showed that the expression levels of ARRB1 and ARRB2 in pancreatic islets were altered in diabetogenic and diabetic conditions. My results clearly demonstrate a critical role of ARRB2 in GLP-1R singaling which could impact the function, maintenance and plasticity of beta-cell mass in response to GLP-1. A lack of expression of ARRB2 could participate in the deficit of compensatory mechanisms of the functional beta-cell mass leading to T2D.
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Contrôler l'agrégation de l'insuline à la surface des matériaux via des interactions avec des peptides et la lumière / Controlling surface mediated insulin aggregation by peptides and light

Chouchane, Karim 20 October 2017 (has links)
Le repliement et la stabilité des protéines dépendent des conditions physico-chimiques de leur environnement. En particulier, le pH, la température, l’agitation et les interactions avec d’autres macromolécules ou avec les interfaces (liquide–surfaces des matériaux ; air-liquide ; etc.) sont connues pour induire des phénomènes de dénaturation et d’agrégation des protéines.Le contrôle de la stabilité des protéines thérapeutiques représente un enjeu médical et économique pour l’industrie pharmaceutique. L’insuline, qui est la protéine thérapeutique la plus produite, est connue in vitro pour former des fibres amyloïdes induites par les surfaces hydrophobes. Les agrégations amyloïdes sont également impliquées dans un certain nombre de pathologies, notamment humaines et animales présentant de forts enjeux de santé publique et économiques.Cette thèse traite en particulier de l’agrégation amyloïde à la surface des matériaux en utilisant l’insuline comme protéine modèle. Les travaux précédents réalisés par notre équipe ont démontré que des peptides de courte longueur avaient la capacité de modifier très significativement la cinétique d’agrégation induite par la surface des matériaux, et ce à des concentrations sub-stœchiométriques par rapport à l'insuline. En particulier les peptides adoptant une conformation secondaire en feuillet beta une fois adsorbés sur les surfaces hydrophobes, induisent une réduction drastique de la durée de nucléation de fibres amyloïdes d’insuline.Dans les travaux présentés ici nous avons découvert des séquences peptidiques présentant, toujours à des concentrations sub-stœchiométriques, deux effets antagonistes sur la cinétique de l’agrégation amyloïde de l’insuline. Le premier effet, coopératif et localisé à la surface de matériaux hydrophobes, résulte en une accélération de la nucléation. A l’inverse le second effet provient des peptides en solution et résulte en une puissante inhibition à la fois de la nucléation et de l’élongation des fibres.Nous avons premièrement caractérisé quantitativement ces effets pour un ensemble de peptides possédant des séquences de type (LK)nL, et investigué les mécanismes à l’origine du phénomène accélérateur. Des mesures quantitatives de fluorescence (Thioflavine T, marquage fluorescent du peptide) ont permis de montrer que l’adsorption coopérative des peptides sur la surface du matériau était responsable de l’accélération de la vitesse de nucléation. Pour l’effet inhibiteur, provenant des peptides en solution, nous avons démontré que cet effet résulte de la liaison des peptides sur l’insuline fibrillaire et qu’il est médié par les charge.De surcroit nous avons étudié la localisation de la nucléation et de l’apparition des premiers agrégats par microscopie à fluorescence. Nous avons observé que les zones situées à l’interface triple matériau-air-solution et subissant une contrainte de cisaillement élevé étaient les sites préférentiels d’apparition des premiers agrégats amyloïdes et donc très probablement les régions dominantes en termes de nucléation.Nous avons enfin développé une technique permettant une croissance localisée, patternable et induite par la lumière d’agrégats amyloïde d’insuline sur une surface de verre. Cette voie d’agrégation singulière ne présente pas de phase de nucléation apparente et dépend strictement de la présence de Thioflavine T. Nous avons montré que la Thioflavine T insérée entre les feuillets béta et qui peut être excitée à 440 nm fournit localement l’énergie nécessaire pour la transition de conformation de l’insuline native adsorbée vers l’état agrégé. Cette méthode permet d’obtenir une croissance différentielle entre des zones de surface hydrophile et hydrophobe. / The folding and stability of proteins depend on the physico-chemical conditions of their environment. Especially pH, temperature, stirring and interactions with other macromolecules or with interfaces (liquid-material surfaces; air-liquid; etc.) are known to induce protein denaturation and aggregation phenomena.The control of therapeutic protein stability represents a medical and economic challenge for the pharmaceutic industry. For instance insulin, which is the most s model produced therapeutic protein, is known to form amyloid aggregates in vitro induced by hydrophobic surfaces. Amyloid aggregates are also involved in several pathologies including human and animal diseases of high economic and public health impact.This thesis focuses on amyloid aggregation at material surfaces using insulin as a model protein. Previous work from our team have demonstrated that short peptides have the ability to significantly interfere with the kinetics of surface-driven amyloid aggregation and this at sub-stoichiometric concentrations with respect to insulin. In particular peptides adopting a beta-sheet secondary structure when adsorbed on hydrophobic surfaces, were able to reduce the nucleation time of insulin aggregation.In the present work we have discovered peptide sequences presenting, again at sub-stoichiometric concentrations, two antagonistic effects on insulin aggregation kinetics. The first consists in a cooperative reduction of the nucleation time and operates via peptides bound to the material surface. The second, on the other hand, results in a powerful inhibition of both nucleation and fiber elongation via peptides remaining in solution.We have first quantitatively characterized these effects on a set of peptides presenting alternate primary sequences of the type (LK)nL, and investigated the underlying mechanisms promoting insulin nucleation. Quantitative fluorescence measurements (Thioflavin T, fluorescent labelling of the peptide) have shown that the cooperative adsorption of peptides on hydrophobic material surfaces was responsible for the reduction of the insulin nucleation time. We have then shown that the inhibitory effect results from the binding of peptides in solution to fibrillar insulin aggregates and that this effect is mediated by charges.In addition we studied the localization of the insulin nucleation and of the appearance of the first aggregates using fluorescence microscopy. We observed the preferential appearance of the first ThT positive aggregates at the solid-liquid-air triple interface undergoing high shear stress, making these regions the predominant nucleation sites.We eventually developed a technique allowing a localized and patterned growth of light-induced insulin aggregates on glass surfaces. This atypical aggregation pathway does not present any observable lag time and depends strictly on Thioflavin T. We have shown that the ThT inserted between the cross beta-sheets and which can be excited at 440 nm locally provides the energy required for the conformational transition of the native insulin into the aggregated one. This method can be used to obtain a differential amyloid growth between surface area of different hydrophobicity.
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Caractérisation de l'élément de réponse à l'insuline sur la région promotrice du gène aviaire de la stéaroyl CoA désaturase I

Arfa, Omar January 2008 (has links) (PDF)
La Stéaroyl-CoA Désaturase I (SCD-I) est une enzyme hépatique impliquée dans la synthèse des acides gras monoinsaturés. Une forte activité de l'enzyme SCD-I ainsi qu'une altération du ratio acides gras saturés : insaturés est retrouvée dans diverses pathologies telles que l'obésité, le diabète de type II et le cancer. Principalement transcriptionnelle, la régulation de SCD-I est sous le contrôle de divers facteurs nutritionnels (ex: glucose) et hormonaux (ex: insuline). L'étude tente ici de localiser l'élément de réponse à l'insuline au niveau du promoteur du gène de la SCD-l et d'identifier les facteurs de transcriptions spécifiques qui s'y fixent. Pour cela, des hépatocytes embryonnaires de poulets (CEH) sont transfectés avec différentes constructions contenant des délétions du promoteur du gène aviaire SCD-l (délétions SCD1-1 à SCD1-6) clonées en amont du gène rapporteur de la luciférase (pGL2 basic vector). La mesure de l'activité luciférase après stimulation par l'insuline a permis de distinguer deux éléments de réponse au niveau du promoteur du gène SCDl. L'analyse des séquences consensus de ces éléments a permis de déterminer différents facteurs de transcription (ex: SRE, NF-Y, USF et Sp1) pouvant médier la régulation transcriptionnelle du gène par l'insuline. Des amorces spécifiques ciblant les régions consensus de l'élément le plus en 3' ainsi que la technique de retard sur gel en présence d'extraits nucléaires stimulés ou non par l'insuline, ont permis de vérifier que les séquences contenant les sites de fixation de SREBP-l et NF-Y fixent ces facteurs de transcription seulement en présence d'insuline. L'utilisation d'anticorps spécifiques dirigés contre ces protéines et la perte de l'activité luciférase après transfection de construction dépourvue de ces mêmes régions (délétion SCDI-7) après stimulation par l'insuline ont permis de confirmer l'implication des facteurs de transcription SREBP-l et NF-Y dans cette régulation. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Lipogenèse de novo, stéaroyl-CoA désaturase 1, Foie, Insuline, Facteurs de transcription, SREBP-1, NF-Y.
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Caractérisation des mécanismes d'action de la kinase mTOR et des acides gras polyinsaturés sur la transcription du gène de la stéroyl CoA désaturase-1 au niveau hépatique

Prévost, Michèle January 2010 (has links) (PDF)
Une des enzymes clés de la lipogenèse hépatique, la stéaroyl-CoA désaturase 1 (SCD1), qui est impliquée dans la biosynthèse des acides gras monoinsaturés, semble jouer un rôle important dans le développement de l'obésité et de ses désordres métaboliques associés. En fait, une modification du ratio d'acides gras saturés versus acides gras mono-insaturés a été impliquée dans le développement de l'obésité, du diabète de type II et des maladies cardiovasculaires. L'expression de Scd1 est sous la dépendance de diverses hormones qui sont fortement modulées par la diète. L'insuline, dont la concentration augmente après un repas, permet d'activer la transcription du gène Scd1, tandis qu'une diète riche en acides gras polyinsaturés (PUFAs) permet d'inhiber son effet. La régulation de Scd1 est accomplie, entre autres, par la présence d'un élément de réponse à l'insuline sur le promoteur qui fixe les facteurs de transcription (TF) SREBP-1 et NF-Y et par l'activation de voies de signalisation spécifiques impliquant la voie PI3-K/mTOR. Ce projet vise à établir les mécanismes d'action des PUFAs et leurs liens potentiels avec PI3-K/mTOR au niveau hépatique. Grâce à des analyses de retard sur gel, nous avons démontré que l'insuline régulait la fixation de ces TFs sur le promoteur Scd1 et que cette fixation était modulée par les inhibiteurs de cette voie et par l'acide arachidonique. De plus, nous avons évalué par PCR en temps réel le rôle de l'insuline, et donc PI3-K/mTOR, ainsi que celui de l'acide arachidonique sur le niveau d'expression de Scdl et de ses TFs. Nos résultats démontrent au niveau hépatique que la voie PI3-K/mTOR cible des TFs spécifiques sur le promoteur Scd1 activant ainsi l'expression de ce gène en réponse à l'insuline et que les PUFAs permettent de contrer ses effets. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Lipogenèse de nova, SCD1, Insuline, mTOR, PUFA, SREBP-1, NF-Y.
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Hormonal regulation of Stearoyl-CoA Desaturase 1 (SCD1) at hepatic level and its role in adipose tissue

Mauvoisin, Daniel 09 1900 (has links) (PDF)
La Stearoyl-CoA Désaturase-l (SCD1) est l'enzyme catalysant la synthèse des acides gras monoinsaturés, synthétisant le palmitoléyl-CoA (C16:1) et l'oléoyl-CoA (C18:1) à partir respectivement du palmitoyl-CoA (C16:0) et du stéaroyl-CoA (C18:0). Ces acides gras entrent ensuite dans la composition des triglycérides et des phospholipides membranaires. L'altération de la composition des phospholipides a été impliquée dans de nombreuses maladies incluant l'obésité et le syndrome métabolique associé. SCD1 est fortement exprimée au niveau du foie et du tissu adipeux. Elle est étroitement régulée par de nombreux facteurs nutritionnels et hormonaux principalement au niveau transcriptionnel mais aussi via une dégradation protéique rapide. Ceci permet à la cellule d'adapter l'activité enzymatique de SCD1 à la demande physiologique. Au niveau hépatique, l'insuline et la leptine sont impliquées respectivement dans la stimulation et l'inhibition de l'expression de SCD1. Leur fixation sur leur récepteur respectif précède l'activation de nombreuses voies de signalisation, qu'elles partagent pour la plupart, comme la voie 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PI3K) et la voie des Mitogen Activated Protein Kinase Extracellular Regulated Kinase 1/2 (MAPK ERK1/2). Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de caractériser les mécanismes impliqués dans l'action de l'insuline et de la leptine sur l'expression de SCD1. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence l'implication de la voie PI3K Mammalian Target Of Rapamycin (mTor) et des facteurs de transcription Sterol Response Element Binding Protein-1 (SREBP-1) et Nuclear Factor Y (NF-Y) dans la stimulation de l'expression de SCD1 par l'insuline. Dans un deuxième temps, nous avons démontré l'implication de la voie des MAPK ERK1/2 dans l'inhibition de l'expression de SCD1 par la leptine. Nos résultats suggèrent aussi un rôle important du facteur de transcription Stimulating Protein 1 (Sp1) dans ce phénomène. Au niveau transcriptionnel, l'action de l'insuline et de la leptine semble indépendante l'une de l'autre. Cependant, il apparaît globalement que l'effet inhibiteur de la leptine supplante l'effet activateur de l'insuline au niveau de l'expression de SCD1. Le tissu adipeux est le lieu de stockage principal des triglycérides. L'analyse de la composition de ces triglycérides révèle que le C18:1 constitue l'acide gras le plus abondant. Des travaux réalisés sur des modèles animaux suggèrent fortement qu'une activité élevée de SCDl au niveau du tissu adipeux est fortement corrélée avec l'adiposité et l'obésité. Dans une troisième partie, nous avons donc testé l'hypothèse que la désaturation induite par SCD1 est positivement reliée à l'expansion du tissu adipeux. Nous avons montré que, indépendamment de leur apport en acides gras, le taux de C18:0 était diminuée dans le tissu adipeux omental de femmes atteintes d'obésité viscérale. De plus, chez ces patientes, ne présentant pas de syndrome métabolique, l'indice de désaturation (C18:1/C18:0) était augmenté. Nous avons aussi montré une association entre le niveau d'adiposité de ces patientes et la diminution du niveau de C18:0. L'adiposité de ces femmes a aussi été associée à l'augmentation de l'indice de. désaturation (C18:1/C18:0) et à l'augmentation du niveau d'expression de SCD1. En conclusion, nos travaux attestent la complexité de la régulation de l'expression de SCD1. Nos études confirment aussi le rôle clé de SCD1 au niveau du métabolisme lipidique, du développement de l'obésité et du syndrome métabolique associé. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Désaturase, SCD1, Insuline, Leptine, Protéines kinases, PI3K, mTor, MAPK, ERK1/2, SREBP-1, NF-Y, Sp1, foie, tissu adipeux.

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