Les immunoglobulines ne sont pas les seules protéines capables de reconnaissance spécifique. D’autres systèmes d’immunité adaptative existent et beaucoup d’autres protéines peuvent aussi générer des interactions spécifiques de hautes affinités. Ce sont des ossatures/squelettes protéiques intéressants pour concevoir de nouveaux interacteurs.Une nouvelle famille de protéines synthétiques, appelées AlphaReps, basée sur la famille des protéines à HEAT repeat contenant un motif structural répété en double hélice alpha, a été construite au laboratoire. Le motif répété, d’abord identifié chez une archée thermostable, a été idéalisé en concevant une séquence consensus, grâce à l’alignement de séquences de motifs naturels. Une banque de protéines a alors été construite à partir de ce motif. Toutes les protéines de la banque ont une structure générale similaire mais elles diffèrent par le nombre de motifs insérés et par les cinq résidus hautement diversifiés situés sur la face externe de la seconde hélice de chacun des motifs. Ces nouvelles protéines sont exprimées très efficacement chez E. Coli, solubles, sans pont disulfure et très stables (50-100 mg. L-1 de culture, Tm > 70°C).Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit s’intéresse à l’utilisation de ces nouvelles protéines synthétiques comme outils de reconnaissance moléculaire. Pour cela, plusieurs applications ont été développées. Dans la première partie, à l’aide de la technique du phage display, des interacteurs de hautes affinités pour la Green Fluorescent Protein ont pu être isolés au sein de la banque. Les interactions des protéines partenaires ont été caractérisées par la détermination des constantes d’affinité, ainsi que la résolution des structures cristallographiques de deux complexes contenant une AlphaRep spécifique et la GFP. Avec cette cible modèle, la possibilité d’utiliser les AlphaReps sélectionnées à l’intérieur des cellules eucaryotes vivantes pour reconnaître spécifiquement une cible protéique dans un milieu complexe a aussi été démontrée. L’utilisation des AlphaReps comme outils de diagnostique a été développée pour la détection de la cible membranaire FSHr (récepteur de l’hormone folliculo-stimulante), protéine surexprimée dans de nombreuses tumeurs. Ce projet a permis d’expérimenter des approches de sélections sur cellules entières, soulignant les progrès restant encore à accomplir pour la sélection contre des cibles plus complexes.La seconde partie de ce travail s’est intéressée à l’ingénierie et à l’évolution des AlphaReps. Ainsi, l’insertion de résidus variables sur le dernier motif (C-cap) de protéines de la banque a pu être validé. Une approche innovante de shuffling modulaire, adaptée à l’ossature AlphaRep a permis de cerner les limites de cette méthode et les améliorations à apporter pour être en mesure d’augmenter l’affinité d’interacteurs présélectionnés. La banque d’AlphaReps de phage display a également été transférée dans un vecteur de PCA (Protein Fragment Complementation Assay) utilisant la protéine scindée DHFR (Dihydrofolate Reductase) comme protéine rapportrice. Cela a permis de sélectionner des AlphaReps spécifiques pour des cibles non exploitables en phage display. L’utilisation de la cis-fusion entre une AlphaRep et sa cible, combinée à la technique de PCA, s’est révélée très efficace pour la sélection et la cristallisation de protéines réfractaires telles que la protéine ComD, ici présentée comme preuve de la réussite de cette approche.Les AlphaReps sont donc des protéines artificielles, parmi lesquelles des interacteurs spécifiques peuvent être isolés pour des cibles variées. Un large panel d’applications peut être envisagé comme le développement d’outils d’aide à la cristallogenèse ou celui d’outils de reconnaissance moléculaire in vivo. / Immunoglobulin fold is not the only basis for specific recognition proteins. Other adaptive immunity systems exist and many other proteins are also able to mediate specific high-affinity interactions. These are interesting scaffolds to generate alternative binding molecules.A new family of artificial proteins, named AlphaRep, based on HEAT repeat proteins containing an alpha-helical repeated motif, was designed in the laboratory. The repeated motif, first identified in a thermostable archae protein of unknown function was refined and idealized using a consensus design strategy. A library of artificial proteins based on this design was then constructed. All proteins from this library share the same general fold but differ both in the number of repeats and in a set of five highly randomized positions per repeat. The randomized side chains are located on the outside surface of the second helix. Sequences from this library are efficiently expressed as soluble, folded and very stable proteins (50-100 mg. L-1 of culture, Tm > 70°C).The work presented in this manuscript is focused on the use of those new synthetic proteins as molecular recognition tools. Then, different applications have been developed.In a first part, binders with high affinity for the green fluorescent protein were selected by phage display. Complexes were characterized. Affinity between partners was measured and structures of two of those complexes containing a specific AlphaRep and the protein target were solved by X-ray crystallography. Thanks to this model target, it was demonstrated that AlphaReps could be used in living cells for the specific recognition of the protein they have been selected for. AlphaReps have also been developed as a diagnostic tool to detect the membrane protein FSHr (Follicle stimulating Hormone receptor), shown to be overexpressed in various tumors. In this project, selections on entire cells have been performed, showing the limit of the selections approaches with complex targets.The second part of this work focused on engineering and evolutions of AlphaRep proteins. The insertion of randomized residues at specific positions in the last motif (C-cap) was validated. An innovative approach of modular shuffling, adjusted to the AlphaRep scaffold, was assessed. Limitations of this approach to perform affinity maturation of AlphaReps could then be understood. Finally, the AlphaRep Library was transferred to a PCA (Protein Fragment Complementation Assay) vector using the split DHFR (Dihydrofolate Reductase) as reporter protein. With this new selection system, specific Alphareps could be selected for protein targets not suitable for phage display selection. A cis-fusion strategy was employed to express the AlphaRep fused to its partner in order to increase the stability and solubility of the target as well as helping for its crystallogenesis. This approach, combined with the PCA selection, was successful to obtain crystals of the ComD protein (unstable protein), shown here as an example of success for this new method.AlphaReps are thus artificial proteins, among which specific binders can be isolated for various targets, showing a strong potential for a large range of applications from crystallogenesis helpers to in vivo molecular recognition tools.

Les travaux décrits dans ce mémoire ont pour objectif d’une part le développementd’une nouvelle famille de protéines artificielles et d’autre part la création de nouveaux sitesde fixation spécifiques dans ces protéines. L’objectif général était de développer une approchegénérale permettant d’obtenir rapidement des protéines reconnaissant toute macromoléculecible choisie. On peut voir ces protéines artificielles spécifiques comme des sortes d’anticorpsartificiels pour leur spécificité et leur affinité mais dont les propriétés physiques : stabilité,solubilité, efficacité d’expression, insensibilité à l’agrégation sont nettement plus favorablesque celles des anticorps et de leur dérivés.Le premier chapitre, présente la conception et la construction d’une bibliothèque deprotéines artificielles dite de première génération où les protéines sont formées par larépétition d’un motif idéalisé à partir d’une famille de motifs naturels appelés HEAT repeats.Toutes les protéines de la bibliothèque, dénommées αRep, sont conçues pour avoir la mêmearchitecture générale mais diffèrent les unes des autres par le nombre de motifs et par laséquence dans certaines positions rendues variables au sein de chaque motif. Cette banquenous a permis de valider l’architecture αRep choisie : Les protéines s’expriment sous formesoluble, sont très stables et adoptent la structure secondaire et tertiaire attendue quel que soitla séquence des positions hypervariables. Le second chapitre présente alors les approchessuivies pour l’amélioration de la qualité et de la diversité de la bibliothèque et a conduit à laconstruction d’une bibliothèque d’αRep de deuxième génération. Cette dernière bibliothèque(2 .1) repose sur le même schéma général mais contient une diversité ayant été optimiséelors de la conception puis améliorée expérimentalement par une procédure dite deFiltration/shuffling. Cette bibliothèque très diverse (1.7*109 clones indépendants) a été alorsexploitée pour y rechercher, par des méthodes d’exposition sur phages, de nouvelles αRepreconnaissant des protéines cibles préalablement choisies. L’ensemble des résultats montretrès clairement que des αRep reconnaissant spécifiquement, avec une affinité élevée, desprotéines cibles choisies arbitrairement peuvent être effectivement obtenues. Les structurestridimensionnelles de plusieurs complexes formés entre les αRep et leur cible a été résoluepermet de comprendre la nature et l’organisation précise de ces capacités de reconnaissancemoléculaire nouvellement créées. / The main objective of this work was to design, produce and characterize a new familyof artificial proteins and to introduce new tailored specific binding sites within this structuralframework. Our general goal was to develop method allowing to rapidly generate newprotein binding specifically to any predefined target macromolecule. Binders based onartificial proteins can be viewed as antibody-like molecules but due to their different structurehave more favorable physical properties (expression, solubility, folding efficiency, stability)than antibodies and derivatives.The design and experimental assembly of a first generation artificial protein library isdescribed in part I. Proteins of this library are made by a repetition of a motif idealized from afamily of natural protein repeats (HEAT repeat). These artificial proteins, named αRep, havethe same general fold but the number of the repeated motif vary from protein to protein.Furthermore, a set of positions of each motif is highly variable within the library. Proteinisolated from this first generation library are well expressed, soluble, extremely stable andwere shown to have the designed secondary and tertiary structure.The methods used to improve the diversity and the experimental quality of the protein libraryare described in the second part of this thesis and have allowed us to create a secondgeneration αRep library. This library is based on the same general scheme but its diversitywas optimized by an improved design and experimental procedures known as filtration/shuffling.This highly diverse second generation library (1.7*109 independent clones) was usedto select variants with tailored binding specificities using phage display method. The resultsclearly show that news αReps binding tightly and specifically a range of arbitrarily definedprotein targets can be efficiently selected. The tertiary structure of complexes between αRepand their cognate target molecule were solved and allow to analyze the nature and detailedorganization of this newly engineered molecular recognition capacities.

La cellule eucaryote compartimentalise ses tâches au sein d’organelles communiquant les unes avec les autres au moyen de vésicules de transport. Le trafic vésiculaire est contrôlé par des petites protéines G de la superfamille Ras, activées par un changement de nucléotide guanidique catalysé par un facteur d’échange (GEF). En particulier, au niveau du cis-Golgi la petite protéine G Arf1 est activée par GBF1, permettant le transport rétrograde des vésicules COPI vers le réticulum endoplasmique. Récemment, GBF1 a été impliqué dans d’autres fonctions, notamment dans le cycle réplicatif de certains virus ou dans le métabolisme des gouttelettes lipidiques.Les gouttelettes lipidiques sont les organelles ubiquitaires du stockage des lipides et ont un rôle majeur dans l’homéostasie des lipides à l’échelle de la cellule. Le trafic intracellulaire des ces organelles dynamiques serait contrôlé par des petites protéines G. Notre équipe à montré dans une précédente étude que GBF1 est localisé sur les gouttelettes lipidiques et est impliqué dans le recrutement de PLIN2 et de la lipase ATGL sur les gouttelettes lipidiques. Cette thèse montre, par des études de biologie cellulaire et de microscopie, que GBF1 possède un domaine de fixation aux phospholipides via une hélice amphipatique. Cette hélice est nécessaire et suffisante pour l’association aux gouttelettes lipidiques in cellulo. La régulation de la localisation de GBF1 repose sur l’interaction avec Rab1B (cascade entre Rab1 et Arf1 dans la voie sécrétoire précoce) ainsi que sur les interactions intramoléculaires entre les différents domaines de GBF1. / The eukaryotic cell physically separates its functions within several membrane-bound organelles, which communicate using vesicles. Vesicular trafficking is under the control of small GTPases that exist as an inactive GDP-bound form and an active GTP-bound form. The switch between GDP and GTP is catalyzed by a guanine nucleotide exchange factor (GEF). On cis-Golgi membranes, Arf1, activated by the large GEF GBF1, recruits the COPI coat. COPI coated vesicles ensure the retrograde transport from the Golgi to the ER. Recently, GBF1 has been implicated in other pathways, such as the life cycle of various viruses and lipid droplet metabolism.Lipid droplets (LD), the major lipid storage organelle, play a major role in lipid homeostasis within the cell. LDs are connected to membrane trafficking and are therefore under the control of GTPases. In previous studies, our team showed that GBF1 localizes around LDs and that it is required for protein loading onto the LD surface. Here, data support the idea that GBF1 localizes to the LD surface. Using cell biology tools and microscopy, we identified, within GBF1, a lipid binding domain. In this domain, a single amphipathic helix is necessary and sufficient for LD targeting in cells. The regulation of GBF1 localization relies on interaction with Rab1 (data support a Rab1-Arf1 cascade between the ER and the Golgi) and on intramolecular interactions between GBF1 domains.

Le réseau de signalisation qui répond à l’insuline et aux nutriments est conservé chez les métazoaires, où il joue un rôle central dans le contrôle du métabolisme et de la croissance. Les nutriments assimilés sont soit directement utilisés pour la croissance tissulaire, soit stockés principalement sous forme de triglycérides. Chez la drosophile, l’activation de ce réseau de signalisation dans le corps gras, un organe qui remplit à la fois les fonctions hépatiques et destockage, induit une augmentation du stockage de lipides sous forme de nombreuses gouttelettes lipidiques (LDs). A l’inverse, la carence alimentaire se traduit par une augmentation de la taille des LDs et une diminution de lipides stockés. La kinase TOR (TargetOf Rapamycine) et son substrat S6 Kinase (S6K) jouent un rôle central dans cette régulation.Chez la drosophile, ces 2 kinases (dTOR et dS6K) contrôlent les aspects autonome-cellulaireset hormonaux de la croissance. En dépit de nombreuses études sur divers organismes modèles,destinées à comprendre les mécanismes régulateurs de S6K, rien n’est connu à ce jour sur lecontrôle de sa dégradation.Nous avons utilisé une banque de lignées exprimant des ARN interférant (RNAi) contre unegrande quantité de gènes de la drosophile, pour réaliser 3 des cribles génétiques destinés à identifier de nouveaux régulateurs du métabolisme et de la croissance. Dans le premier crible,les RNAi ont été induits dans la glande prothoracique, siège de la production de l’hormonestéroïde ecdysone connue pour réguler la croissance et les étapes du développement, souscontrôle de la nutrition et de la signalisation dTOR. Sur 7000 gènes criblés, 620 ont étéidentifiés comme nécessaire à la production d’ecdysone. Dans le second crible, nous avonsexprimé les RNAi de 4000 gènes dans le corps gras pour rechercher ceux qui induisaient uneaugmentation de la taille des LDs. L’objectif était d’identifier des gènes impliqués dans la réponse à la carence alimentaire, et nous avons ainsi retenu 24 candidats intéressants. Le troisième crible représente la majeure partie du travail de thèse, où nous avons criblé les RNAi susceptibles de modifier un phénotype de croissance induit par dS6K. Sur 7000 gènes testés,nous en avons retenu 45 qui ont ensuite été utilisés pour générer un diagramme d’interaction en utilisant les informations disponibles dans les banques de données. Les candidats les plus intéressants ont ensuite été analysés en culture de cellules pour identifier ceux qui régulent l’activité de dS6K et ceux qui régulent sont niveau d’expression. Parmi ces derniers, nousavons identifié le gène codant pour Archipelago (Ago), connue pour contrôler la dégradationrégulée des protéines-cibles au niveau du protéasome. Nous avons réalisé de nombreusesexpériences qui montrent que ago et dS6K interagissent génétiquement. En outre, il est indiquédans les banques de données que ces protéines interagissent entre elles par la technique des 2-hybrides en levure. Tous ces résultats révèlent que Ago régule la dégradation de dS6K, etposent les premières pierres de ce niveau de régulation. / The evolutionary conserved insulin and nutrient signaling network regulates growth andmetabolism. Nutrients are directly utilized for growth or stored, mostly as triglycerides. InDrosophila, activation of insulin/nutrient signaling in the fat body (the fly equivalent of liverand adipose tissue), causes an increase in fat stores composed of several small-size lipiddroplets (LDs). Conversely, fasting produces an increase in LD size and a decrease in fatcontents. The TOR kinase and its substrate S6 kinase (S6K) play a central role in this response,and particularly in Drosophila, they have been shown to orchestrate cell-autonomous andhormone-controlled growth. However, despite extensive research studies on different modelorganisms (mouse, fly, worm) to decipher the molecular and physiological functions of S6K,nothing is known about how its degradation is regulated.Taking advantage of the inducible RNA interfering (RNAi) library from NIG (Japan), we haveperformed three genetic screens to identify novel regulators of steroidogenesis, lipidmetabolism and dS6K-dependent growth. First, RNAi lines were screened in the ring gland; anorgan that controls the progression of the developmental steps by producing the steroidhormone ecdysone. Out of 7,000 genes screened, 620 positive candidates were identified toproduce developmental arrest and/or overgrowth phenotypes. Then, we challenged 4,000 genesby RNAi screening able to recapitulate the larger sized LD phenotype as obtained uponstarvation, leading to the identification of 24 potential candidates. Finally, the RNAi lines werescreened for their ability to enhance a growth phenotype dependent of the Drosophila S6K(dS6K). Out of 7,000 genes screened, 45 genes were identified as potential negative regulatorsof dS6K. These genes were further used to design a novel protein-protein interaction networkcentered on dS6K through the available data from yeast-2-hybrid (Y2H) assay. The most potentinteractors were then analyzed by treatment of cultured S2 cells with the corresponding doublestrand RNA (dRNA). Western blotting thus, allowed us to discriminate between the geneproducts that regulate dS6K levels versus those that regulate its phosphorylation, as a hallmarkfor its kinase activity. Interestingly, archipelago (ago), which encodes a component of an SCFubiquitinligase known to regulate the degradation of dMyc, Cyclin E and Notch, was identifiedas a negative regulator of dS6K-dependent growth. Based on the Y2H available data showingthat Ago and dS6K interact each other and the presence of a putative Ago-interaction motif indS6K, we hypothesized that Ago causes an ubiquitin-mediated degradation of dS6K. Ourmolecular data showed that loss of ago caused an elevated level of dS6K, which confirms arole of Ago in controlling dS6K degradation. Altogether our findings emphasize the importanceof the saturating screening strategies in Drosophila to identify novel regulators of metabolicand signaling pathways.

VIH-1, l’agent étiologique du Syndrome de l’Immunodéficience Acquise, est un rétrovirus qui infecte les cellules immunitaires et détourne leur machinerie cellulaire pour se répliquer rapidement. Lors de l’infection, le génome ARN est rétrotranscrit en ADN par la transcriptase inverse virale (RT), puis l’insertion du génome proviral dans l’ADN de la cellule hôte est une étape obligatoire du cycle viral catalysée par l’enzyme virale Intégrase (IN). L’interaction de l’IN avec son cofacteur essentiel, la protéine nucléaire LEDGF/p75, dirige l’intégration à l’intérieur de gènes dans des régions fortement exprimées de la chromatine, ce qui permet la production efficace de nouveaux virions. Les Inhibiteurs Allostériques Intégrase-LEDGF (INLAIs) sont une nouvelle classe de molécules antirétrovirales se liant à l’IN au site de liaison de LEDGF/p75. Conçus pour inhiber compétitivement l’interaction protéine-protéine IN-LEDGF/p75, ils inhibent également les activités enzymatiques de l’Intégrase et augmentent son niveau de multimérisation.Nous avons étudié plusieurs nouvelles séries d’INLAIs de la société Mutabilis, et avons pu démontrer que ces molécules inhibent l’intégration, mais ont aussi un effet antirétroviral plus puissant et indépendant de LEDGF/p75 post-intégration au cours de la maturation des virions, qui conduit à la production de virus non infectieux, ayant une morphologie excentrique caractérisée par un défaut d’encapsidation du génome viral. Lors de l’infection de cellules par ces virus, le cycle viral s’arrête à l’étape de rétrotranscription du génome viral. Nous avons montré que ces virions contiennent pourtant un génome viral stable et fonctionnel, une RT active et l’ARNtLys3 qui sert d’amorce à la rétrotranscription, et ont également conservé leur immunoréactivité pour les lymphocytes B et T. En évaluant l’impact du polymorphisme de l’IN au voisinage du site de liaison, nous avons identifié le variant polymorphe Ala125, pour lequel l’INLAI MUT-A perd concomitamment son effet sur la maturation des virions et sur la multimérisation de l’IN, tandis qu’il inhibe aussi bien l’intégration et l’interaction IN-LEDGF, prouvant que l’effet tardif des INLAIs est associé à l’induction de la multimérisation de l’IN. Nous avons pu associer la multimérisation de l’IN à une déstabilisation du dimère par les INLAIs en analysant les co-structures de MUT-A avec les intégrases polymorphes. Les INLAIs, outre leur intérêt thérapeutique sont de remarquables réactifs qui ont permis de démontrer le rôle essentiel de l’intégrase à trois étapes clés du cycle viral du VIH-1 : la rétrotranscription, l’intégration et la maturation des virions. / HIV-1, the causative agent of AIDS, is a retrovirus that infects immune cells and hijacks their cell machinery to achieve rapid replication. In the course of infection, the RNA genome is reverse transcribed into DNA by the viral Reverse Transcriptase (RT) before the obligatory insertion of the proviral genome into the host cell DNA catalyzed by the viral enzyme Integrase (IN). The interaction of IN with its essential cofactor, the nuclear protein LEDGF/p75, targets integration within gene introns in highly transcribed chromatine regions, which allows efficient production of new virions. IN-LEDGF Allosteric Inhibitors (INLAIs) are a novel class of antiretroviral molecules binding IN at the LEDGF/p75-binding site. Designed to competitively inhibit IN-LEDGF/p75 protein-protein interaction, they are also capable of inhibiting IN enzymatic activities and raising the IN multimerization level.We studied several new INLAI series from the company Mutabilis. We could demonstrate that these molecules inhibit integration, but also have a more potent, LEDGF-independent, antiretroviral effect during virion maturation, resulting in the production of non-infectious virions. Virions produced upon INLAI treatment have an eccentric morphology characterized by an encapsidation defect of the viral genome, and lead to an infection block at reverse transcription. Yet, we showed that these virions package a stable and functional viral genome, an active RT and the tRNALys3 primer for reverse transcription, and also keep their immunoreactivity towards B- and T-cell lymphocytes. When evaluating the influence of polymorphism at the edge of the binding site, we identified the IN Ala125 polymorphic variant which causes the concomitant loss of MUT-A effect on virion maturation and IN multimerization, whereas inhibition of integration and IN-LEDGF interaction are maintained. This proves that INLAIs exert their late stage effect through induction of IN multimerization. We could associate IN multimerization to INLAI-induced dimer destabilization by analyzing MUT-A co-structures with polymorphic integrases. Beside their therapeutic interest INLAIs are highly valuable reagents that allowed to demonstrate the essential role of integrase at three key steps of the HIV-1 replication cycle, reverse transcription, integration and virus maturation.

L'annotation génomique identifie l'ensemble des éléments significatifs présents sur l'ADN génomique, le support du programme de fonctionnement de l'organisme. Elle prédit leurs fonctions biologiques et leurs relations. L'annotation d'un génome complet est soumise à diverses contraintes: elle doit être réalisée rapidement et représenter l'organisme comme système biologique fonctionnel cohérent. Nous proposons une méthode de vérification de la qualité de l'annotation génomique, basée sur un ensemble de règles de cohérence définies d'après les connaissances et contraintes biologiques admises par la communauté scientifique. Ces règles vérifient la complétude de l'annotation (présence des éléments vitaux pour l'organisme) et son absence d'erreur (sens biologique correct des éléments décrits). Notre méthode est appliquée dans le cadre du projet Génolevures, un projet de génomique comparée chez les levures hémiascomycètes. Nous avons mis en place un système d'annotation facilitant le travail d'annotation manuelle par les experts. L'intégration de nos règles dans ce système permet de garantir la bonne qualité de l'annotation produite. Nous avons choisi de valider expérimentalement l'application de ces règles en étudiant les interactions protéine-protéine chez les levures Saccharomyces cerevisiae et Yarrowia lipolytica par la technique de l'électrophorèse en gel de polyacrylamide en bleu natif et SDS (BN/SDS PAGE). Les résultats obtenus apportent de nouvelles connaissances chez les levures étudiées. Ils démontrent l'universalité de certaines règles et le bien fondé de la stratégie d'annotation.

L'intégration de l'ADN viral dans le génome des cellules hôtes est une étape obligatoire du cycle de réplication des rétrovirus. L'intégrase (IN) catalyse le processus global d'intégration en deux étapes distinctes et consécutives. La première des deux réactions, le 3'-processing, consiste en une coupure spécifique d'un dinucléotide au niveau des deux extrémités 3'-OH de l'ADN viral. L'IN transfère ensuite de manière concertée ces deux extrémités au sein de l'ADN cible. Nous avons, par des techniques basées sur l'anisotropie de fluorescence, caractérisé les paramètres structuraux et cinétiques du 3'-processing catalysé par l'IN du VIH-1. Nous avons montré d'une part que cette activité dépend de la taille des complexes IN / ADN. Nous avons trouvé que le dimère d'IN est la forme multimérique la plus active tandis que les complexes de haut poids moléculaire sont relativement peu efficaces. D'autre part, la structuration du domaine N-ter joue un rôle clé dans l'assemblage coopératif de ce dimère en présence de Mg2+ comme cofacteur cationique. Ce rôle n'est pas essentiel en présence de Mn2+. L'étude de l'IN de PFV-1, un spumavirus, plus soluble, nous a permis de mettre en évidence une reconnaissance préférentielle de l'extrémité processée de l'ADN viral par cette IN, cette propriété n'avait jamais été observée pour l'IN du VIH-1 car elle était masquée par sa propension à l'agrégation. Nous avons également montré que ces deux IN rétrovirales réalisent le 3'-processing suivant un mécanisme catalytique lent de type « single turn-over ».

Les fonctions de la majorité des protéines sont subordonnées à l'interaction avec un ou plusieurs partenaires : acides nucléiques, autres protéines... La plupart de ces interactions sont transitoires, difficiles à détecter expérimentalement et leurs structures sont souvent impossible à obtenir. C'est pourquoi la prédiction in silico de l'existence de ces interactions et la structure du complexe résultant ont été l'objet de nombreuses études depuis plus d'une décennie maintenant. Pour autant les protéines sont des objets complexes et les méthodes informatiques classiques sont trop "gourmandes" en temps pour l'exploration à grande échelle de l'interactome des différents organismes. Dans ce contexte de développement d'une méthode de docking protéine-protéine haut débit nous présenterons ici l'implémentation d'une nouvelle méthode d'amarrage, celle-ci est basée sur : l'utilisation de deux types de formalismes : Les tessellations de Voronoï et Laguerre permettant la manipulation de modèles géométriques simplifiés permettant une bonne modélisation des complexes et des temps de calcul plus raisonnable qu'en représentation atomique. L'utilisation et l'optimisation d'algorithmes d'apprentissage (algorithmes génétiques) permettant d'isoler les conformations les plus pertinentes entre deux partenaires protéiques. Une méthode d'évaluation basée sur le clustering de méta-attributs calculés au niveau de l'interface permettant de trier au mieux ce sous-ensemble de conformations candidates.

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d'être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l'hypothèse qu'ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l'accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu'ABCG2 transporte de l'hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d'ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d'ABCG2, ECL3, composé d'environ 70 acides aminés. L'affinité d'ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l'albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l'hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L'ensemble de ce travail a donc permis d'une part de mieux comprendre le rôle d'ABCG2 dans la régulation de l'homéostasie des porphyrines, notamment l'hème, et d'autre part, de façon originale, d'identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s'effectue.

Cette étude présente des contributions en traitement statistique du signal avec des applications biomédicales. La thèse est divisée en deux parties. La première partie traite de la détection des hotspots à l'interface des protéines. Les hotspots sont les résidus dont les contributions énergétiques sont les plus importantes dans l'interaction entre protéines. Les forêts aléatoires (Random Forests) sont utilisées pour la classification. Une nouvelle famille de descripteurs de hotspot est également introduite. Ces descripteurs sont basés seulement sur la séquence primaire unidimensionnelle d'acides aminés constituant la protéine. Aucune information sur la structure tridimensionnelle de la protéine ou le complexe n'est nécessaire. Ces descripteurs, capitalisant les caractéristiques fréquentielle des protéines, nous permettent de savoir la façon dont la séquence primaire d'une protéine peut déterminer sa structure tridimensionnelle et sa fonction. Dans la deuxième partie, le RDT (Random Distortion Testing), un test robuste d'hypothèse, est considéré. Son application en détection du signal a montré que le RDT peut résister aux imperfections du modèle d'observation. Nous avons également proposé une extension séquentielle du RDT. Cette extension s'appelle le RDT Séquentiel. Trois problèmes classiques de détection d¿écart/distorsion du signal sont reformulés et résolus dans le cadre du RDT. En utilisant le RDT et le RDT Séquentiel, nous étudions la détection d'AutoPEEP (auto-Positive End Expiratory Pressure), une anomalie fréquente en ventilation mécanique. C'est la première étude de ce type dans la littérature. L'extension à la détection d'autres types d'asynchronie est également étudiée et discutée. Ces détecteurs d'AutoPEEP et d'asynchronies sont les éléments principaux de la plateforme de suivi de manière automatique et continue l'interface patient-ventilateur en ventilation mécanique.