Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-08-17T12:45:26Z No. of bitstreams: 1 Eduardo Levi Sousa Guarana.pdf: 2109954 bytes, checksum: f0acb1cbcb8908ca98a1cd46800161e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-17T12:45:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eduardo Levi Sousa Guarana.pdf: 2109954 bytes, checksum: f0acb1cbcb8908ca98a1cd46800161e4 (MD5) Previous issue date: 2011-02-18 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / This study aimed to evaluate the dynamics of the intramammary infection on different stages of lactation (beggining, middle and ending) and its impact in the physical-chemical composition of milk from Santa Inês ewes. Thirty four primiparous and multiparous Santa Inês ewes raised under semi-intensive and submitted to the same sanitary and nutritional management during all lactation period were studied. The moments of evaluation and sampling were approximately 10 days before parturition (colostrum formation phase), 15 days postpartum (dpp), 30 dpp, 60 dpp and 90 dpp (weaning), moments in which it was conducted clinical examination of the mammary gland. The bacteriological and susceptibility profile of isolates were performed at all times; and in the postpartum moments also perform the direct counting of somatic cells (SCC) and physico-chemical evaluation of milk (fat, protein and lactose contents, density, Dornic acidity, electric conductivity, pH and chloride content). Based on bacterial growth samples were characterized as being from healthy (G1) or infected mammary glands (G2) in the respective moments. Variance analysis was employed and the F statistics with its respective level of significance (p) was calculated; in the descriptive study of the variables studied it was used a frequency distribution (%).All ewes were seronegative for lentiviruses. It was observed an elevation (P<0,05) in the somatic cell count, characterizing the inflammatory process with consequent elevation, although mild, in the fat, protein and chloride contents, pH elevation and reduction in lactose content, and those alterations were more significant in the final stage of lactation. The pre-parturition phase showed a high percentage of bacterial isolation from apparently healthy mammary glands, as well as at the end of lactation. Coagulase-negative Staphylococcus was the most frequently isolated from subclinical cases, which prevailed. The value of somatic cell direct count and the percentage of bacterial isolation which characterize the intramammary infection showed elevated values insofar as it intensifies the reaction of the CMT. A high antimicrobial sensitivity to ampicilin, cefalotin and cefoxitin was verified for Gram-positive bacteria. As for Gram-negative bacteria a good sensitivity to ampicilin, cefoxitin and sulphazotrin was verified. / Objetivou-se neste estudo, avaliar a dinâmica da infecção intramamária nas diferentes fases da lactação (início, meio e final) e seu impacto sobre a composição físico-química do leite em ovelhas da raça Santa Inês. Foram acompanhadas 34 ovelhas primíparas e multíparas da raça Santa Inês criadas em sistema semi-intensivo e submetidas ao mesmo manejo higiênico-sanitário e nutricional durante todo o período de lactação, sendo avaliadas aproximadamente 10 dias antes do parto (fase de formação do colostro), 15 dias pós-parto (dpp), 30 dpp, 60 dpp e 90 dpp (desmame), momentos em que foi realizado exame clínico da glândula mamária. O cultivo bacteriológico e o perfil de sensibilidade dos isolados foram realizados em todos os momentos; e nos momentos pós-parto realizou-se também a contagem direta de células somáticas (CCS) e avaliação físico-química do leite (teor de gordura, proteína, lactose, densidade, acidez Dornic, condutividade elétrica, pH e teor de cloretos). Baseado no crescimento bacteriano, as amostras foram caracterizadas como provenientes de glândulas sadias (G1) ou infectadas (G2) nos respectivos momentos. Foi empregada a análise de variância e calculada a estatística F e seu respectivo nível de significância (p), e no estudo descritivo das variáveis estudadas empregou-se a distribuição de frequências (%). Todas as ovelhas foram negativas na sorologia para lentivírus. Foi observada elevação (P<0,05) na contagem de células somáticas caracterizando o processo inflamatório, com consequente elevação, apesar de pequena intensidade no teor de gordura, proteína e cloretos e pH, e redução no teor de lactose, sendo estas alterações mais marcantes na fase final de lactação. A fase que precede o parto apresentou alto percentual de isolamento bacteriano de glândulas aparentemente sadias, bem como, na fase inicial da lactação. O Staphylococcus coagulase negativo foi o agente mais frequentemente isolado dos casos subclínicos, que prevaleceram. O valor da contagem direta de células somáticas e o percentual de isolamento bacteriano, que caracterizam a infecção intramamária, apresentaram valores aumentados à medida que se intensifica a reação do CMT. Uma alta sensibilidade antimicrobiana foi verificada para as bactérias Gram positivas frente à ampicilina, cefalotina e cefoxitina e para as bactérias Gram negativas houve uma boa sensibilidade frente à ampicilina, cefoxitina e sulfazotrim.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-20T17:28:52Z No. of bitstreams: 1 Nivaldo de Azevedo Costa.pdf: 762873 bytes, checksum: 96d4b4fde0727128567693ca50f7bf2c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T17:28:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nivaldo de Azevedo Costa.pdf: 762873 bytes, checksum: 96d4b4fde0727128567693ca50f7bf2c (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The aim of the present study was to evaluate the alterations on the protein screen and serum cupper, iron and zinc levels of Santa Inês primiparous ewes with mastitis experimentally induced with Staphylococcus aureus. The right mammary gland of ten healthy ewes was inoculated with 1,0x104 ufc/mL. The clinical exam; eletrophoresis profile in poliacrilamide gel (SDS-PAGE), concentration of serum cupper, iron and zinc and plasma fibrinogen were measured before the inoculation (baseline moment) and in the following moments: 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 168, 180, 288 and 336 hours after the inoculation of the agent. All animals experimentally infected presented clinical mastitis and subsequent loss of functionality of the gland. The protein screen showed 23 proteins fractions with molecular weights (MW) varying from 26.000 to 185.000 daltons (Da) allowing the recognition of positive and negative acute-phase proteins, class A and G immunoglobulin’s and some non-identified proteins. A significant increase (P<0,05) in haptoglobin and ceruloplasmin concentration, IgG and IgA was observed. Antitrypsin and acid glicoprotein concentrations (P<0,05) did not alter. The average levels of iron and zinc decreased (P<0,05)and the cupper values increased (P<0,05). A positive correlation between plasma fibrinogen and ceruloplasmin (r=0,74), haptoglobin (r=0,62) and IgA (r=0,62) was also identified. Results showed the importance of ceruloplasmin and haptoglobin as acute-phase proteins in intramammary infections of ewes and reiterate fibrinogen as an inflammatory marker because of its high correlation with specific proteins. The serum alterations of Cu, Fe and Zn revealed the action of inflammatory mediators triggered by S. aureus. / Este estudo teve por objetivo avaliar as alterações no proteinograma e nos níveis de cobre, ferro e zinco no soro de ovelhas primíparas, da raça Santa Inês, com mastite induzida experimentalmente com Staphylococcus aureus. A glândula mamária direita de dez ovelhas sadias foi inoculada com 1,0x104ufc/ml. O exame clínico e da glândula mamária, o perfil eletroforético em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), a determinação sérica do Cu, Fe e Zn e a concentração do fibrinogênio plasmático foram realizados antes da inoculação, estabelecendo-se o momento controle (baseline) e os seguintes a inoculação (12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h, 108h, 120h, 132h, 168h, 180h, 288h e 336h). Todas as ovelhas infectadas experimentalmente apresentaram quadro clínico de mastite, havendo perda da funcionalidade da glandula mamária. O proteinograma revelou o fracionamento de 23 proteínas, cujos pesos moleculares (PM) variaram de 26.000 a 185.000 dáltons (Da), permitindo a identificação de proteínas de fase aguda positiva e negativa, imunoglobulinas da classe G e A e algumas proteínas não identificadas. Foi observado aumento significativo (P<0,05) na concentração da haptoglobina e ceruloplasmina, assim como de IgG e IgA. Nãohouve alteração nos níveis de antitripisina e glicoproteina ácida (P>0,05). Verificou-se diminuição nos valores médios dos níveis de ferro e zinco (P<0,05) e elevação nos níveis do cobre (P<0,05). Foi demonstrado correlação positiva entre o fibrinogênio plasmático e a ceruloplasmina (r=0,74), a haptoglobina (r=0,62) e a IgA(r=0,62). Os resultados obtidos demonstraram a importancia da ceruloplasmina e da haptoglobina como proteínas de fase aguda nas infecções intramamárias de ovelhas, assim como ratifica o fibrinogênio como marcador inflamatório pela alta correlação observada com as proteínas especificas. As alterações séricas do Cu, Fe e Zn demonstraram a ação de mediadores inflamatórios, desencadeados pelo S.aureus.

Este estudo objetivou avaliar a: a) eficiência da antibioticoterapia associada à vacinação, de infecções intramamárias (IIM) causadas por Staphylococcus aureus (S. aureus) durante a lactação e secagem; b) variabilidade genética de S. aureus de acordo com a resposta ao tratamento, antibiograma e técnica de Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos Amplificados (AFLP). Para a avaliação da eficiência da terapia durante a lactação, foram selecionadas 117 vacas com mastite subclínica causada por S. aureus, a partir de 5 rebanhos leiteiros, as quais foram distribuídas aleatoriamente em três tratamentos: a) controle (sem tratamento), b) antibioticoterapia intramamária &#43; injetável, c) antibioticoterapia intramamária &#43; injetável &#43; vacinação contra S. aureus. Para avaliar a eficiência da antibioticoterapia associada à vacinação contra S. aureus na secagem, foram selecionadas 136 vacas com mastite subclínica causada por S. aureus, as quais foram distribuídas aleatoriamnte em quatro tratamentos: a) antibioticoterapia intramamária, b) antibioticoterapia intramamária &#43; injetável, c) antibioticoterapia intramamária &#43; vacina, d) antibioticoterapia intramamária &#43; injetável &#43; vacina. Para os protocolos de tratamento (lactação e secagem), foi utilizada a vacina antimastítica TopVac (Hipra, Espanha). O antibiótico injetável foi a enrofloxacina (Kinetomax&reg;, Bayer, Brasil), dose única (7,5 mg/kg). A antibioticoterapia intramamária durante a lactação foi realizada com ampicilina 75 mg &#43; cloxacilina 250 mg (Bovigam L, Bayer, Irlanda do Norte), e na secagem, com ampicilina 200 mg + cloxacilina 500 mg (Bovigam ®VS, Bayer, Irlanda do Norte). Um total de 117 isolados de S. aureus foram submetidos à técnica de AFLP. A taxa de cura dos quartos tratados com antibioticoterapia, durante a lactação e na secagem, foi de 80,5% (n = 82) e 91,5% (n = 106), respectivamente. A vacinação contra S. aureus não aumentou a taxa de cura do tratamento durante a lactação, porém reduziu a CCS das vacas vacinada em comparação com as vacas do tratamento controle. No tratamento durante a lactação, primíparas e vacas com apenas um quarto infectado apresentaram maior taxa de cura (79 e 70%, respectivamente) do que pluríparas e vacas com dois ou mais quartos infectados (11 e 17%, respectivamente), respectivamente. A resistência à penicilina não afetou a taxa de cura dos isolados de S. aureus. A probabilidade de um isolado não adaptado à glândula mamária ser multirresistente e resistente à oxacilina foi maior do que a de um isolado adaptado, porém a taxa de cura dos isolados não adaptados foi maior do que a de isolados adaptados. Em conclusão, a antibioticoterapia foi eficiente para tratamento de mastite subclínica causada por S. aureus durante a lactação e secagem, e o resultado de antibiograma foi associado à classificação dos isolados em adaptados e não adaptados, porém não foi associado à resposta a antibioticoterapia / The objectives of this study were to evaluate: a) treatment effectiveness, using antibiotics and vaccination, in cows with intramammary infections caused by S. aureus during lactation and dry period; b) the genetic variability of S. aureus strains according to treatment responses, antibiogram and the AFLP technique. To evaluate the effectiveness of the lactation therapy, 117 icows with S. aureus subclinical mastitis, from 5 herds, were randomly distributed into 3 treatments: a) control; b) Intramammary + Injectable; c) Intramammary + injectable + Vaccine. To evaluate the effectiveness of the dry off therapy, 136 cows with S. aureus subclinical mastitis were randomly distributed into 4 treatments: a) Intramammary; b) Intramammary + Injectable (INT + INJ); c) Intramammary + Vaccine (INT + VAC); d) Intramammary + Injectable + Vaccine (INT + INJ + VAC). For both therapies (lactation and dry off), the antimastitis vaccine was the TopVac (Hipra, Spain). The injetable antibiotic was enrofloxacin (Kinetomax®, Bayer S. A., Brasil) single dose (7,5 mg/kg). The intramammary therapy was, during lactation, with ampicillin 75 mg + cloxacilin 200 mg (Bovigam L, Bayer, North Ireland) and at dry off with ampicillin 250 mg + cloxacilin 500 mg (Bovigam ®VS, Bayer, North Ireland). S. aureus isolates (117) were submitted to the AFLP technique. The cure rate of quarters treated with antibiotics during lactation and dry period was 80,5% (n = 82) e 91,5% (n = 106), respectively. Vaccination against S. aureus didn&#39;t raise the cure rate during lactation, but lowered the SCC of vaccinated cows compared to control cows. In the lactation therapy, primiparous and cows with one infected quarter had higher cure rates (79 and 70%, respectively) than pluriparous and cows with more than one infected quarter (11 and 17%, respectively), respectively. Resistence to penicillin did not affect S. aureus isolates cure rate. The probability of a non adapted S. aureus isolate to be multiresistant and resistant to oxacilin was higher than an adapted isolate, but cure rates of non adapted isolates was higher than adapted isolates. In conclusion, antibiotic therapy was efficient to treat S. aureus subclinical mastitis during lactation and dry period, and the antibiogram result was associated with the isolates classification in adapted and non adapted, but was not associated with the response to therapy

No description available.

A mastite é a inflamação da glândula mamária cuja causa mais comum são as infecções bacterianas. É considerada a doença de maiores prejuízos e prevalência em vacas leiteiras. A forma subclínica da mastite é o tipo mais predominante de infecção intramamária (IIM), sendo Corynebacterium spp. um dos agentes mais frequentemente isolados. Portanto, os objetivos gerais deste estudo foram: 1) avaliar o efeito de IIMs subclínicas causadas por Corynebacterium spp. sobre a composição e a produção de leite de quartos mamários; 2) determinar o efeito da IIM causada por Corynebacterium spp. sobre o teor de gordura, proteína bruta, lactose, caseína, extrato seco total, extrato seco desengordurado do leite e contagem de células somáticas (CCS); 3) avaliar a técnica de Espectrometria de massas por Ionização e Dessorção à Laser Assistida por Matriz Tempo de Voo (MALDI/TOF-MS) para a identificação das espécies de Corynebacterium isoladas de quartos mamários. Foram utilizados 21 rebanhos leiteiros (n=1.242 animais), nos quais foram selecionadas vacas em lactação previamente identificadas com IIM causada por Corynebacterium spp. (n=285). Amostras de leite de quartos mamários de vacas previamente identificadas com IIM causada por Corynebacterium spp. (n=1.140) foram coletadas, identificadas por meio de cultura microbiológica e criopreservadas. Os isolados de Corynebacterium spp. (n=351) foram descongelados, recultivados e submetidos à identificação pela técnica de sequenciamento de genes 16S rRNA (standard gold) e MALDI/TOF-MS. Para a análise de MALDI/TOF-MS, os isolados bacterianos foram submetidos a protocolo de extração em tubo, baseado no uso de ácido fórmico. Do total de quartos mamários infectados por Corynebacterium spp. (n=190) identificados pelo sequenciamento de genes 16S rRNA, 46 quartos mamários apresentaram contralaterais sadios (controle). Para a coleta de amostras de leite para composição e CCS, as vacas foram submetidas à ordenha completa e individual dos quartos mamários. Foi avaliado o efeito de IIM causada por Corynebacterium spp. sobre a produção e a composição do leite, utilizando delineamento em parcelas subdivididas em faixas (strip-plot). Todos os quartos mamários infectados por Corynebacterium spp. (n=190) apresentaram média de CCS de 690x103células/mL. Dentre os quartos contralaterais, a CCS foi maior para os quartos com IIM causada por Corynebacterium spp. (194x103células/mL) que em quartos não infectados (81x103células/mL). Não houve efeito de Corynebacterium spp. sobre a produção de leite, gordura, proteína, caseína, lactose, sólidos totais e extrato seco desengordurado. Um total de 222 isolados foram identificados pela MALDI/TOF-MS como Corynebacterium spp., dos quais, Corynebacetium bovis foi o mais frequentemente isolado (n = 208). Espécies não-lipofíficas representaram 4,5% do total de isolados (n=10), destes C. auriscanis (n=3), C. xerosis (n=3), C. amycolatum (n=1), C. casei (n=1), C. efficiens (n=1), C. pseudotuberculosis (n=1). Apenas quatro amostras (1,8%) não foram identificadas ao nível de espécie, Corynebacterium spp. Houve equivalência de resultados de 95% entre as duas técnicas de identificação utilizadas. Em conclusão, IIMs causadas por Corynebacterium spp. não apresentam efeito sobre a produção e composição de leite, porém apresentam aumento significativo da CCS. Adicionalmente, a técnica de MALDI/TOF-MS com o uso da extração em tubo por ácido fórmico/acetonitrila foi aplicada com 91,57% de sensibilidade de identificação das espécies de Corynebacterium nos casos de mastite bovina subclínica, quando comparado aos resultados do sequenciamento de genes 16S rRNA. / Mastitis is an inflammation of the mammary glands which bacteria are the most common cause of infections. It is considered a disease with higher prevalence and losses in dairy cows. The subclinical form of mastitis is the most prevalent type of intramammary infection (IMI), and Corynebacterium spp., one of the agents most frequently isolated. Therefore, the main objectives of this study were: 1) to evaluate the effect of subclinical IMI caused by Corynebacterium spp. on milk composition and yield of mammary quarters; 2) to determine the effect of IMI caused by Corynebacterium spp. on the concentration of fat, protein, lactose, casein, total solids, non fat dry milk and somatic cell count (SCC); 3) to evaluate the technique of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time-of-Flight - Mass Spectrometry (MALDI/TOF-MS) for species identification of Corynebacterium isolated from mammary glands. Twenty-one dairy herds were used (n = 1242 animals) on which lactating cows were selected previously identified with IMI caused by Corynebacterium spp. (n = 285). Samples of milk from mammary glands of cows previously identified with IMI caused by Corynebacterium spp. (n = 1140) were collected, identified by microbiological culture and cryopreserved. The strains of Corynebacterium spp. (n = 351) were thawed and recultivated wich were submitted for identification by the technique of sequencing 16S rRNA (gold standard) and MALDI/TOF-MS. For analysis of MALDI/TOF-MS, the isolates were subjected to tube-extraction protocol based on the use of formic acid and acetonitrile. Of the total number of mammary quarters infected by Corynebacterium spp. (n = 190) identified by sequencing 16S rRNA genes, 46 showed contralateral healthy mammary quarters (control). For the collection of milk composition samples and SCC, cows were submitted to a complete milking in individual mammary quarters. The effect of IMI caused by Corynebacterium spp. on milk yield and composition were analyzed using strip-plot design. All mammary quarters infected with Corynebacterium spp. (n = 190) had mean of CCS 690x103cells/mL. Among the contralateral quarters, CCS was higher in quarters with IMI caused by Corynebacterium spp. (194x103células/mL) comparing with uninfected quarters (81x103cells/mL). There was no effect of Corynebacterium spp. on milk yield, on the concentration of fat, protein, casein, lactose, total solids and solids not fat. A total of 222 isolates were identified by MALDI/TOFMS as Corynebacterium spp. of which, Corynebacetium bovis were the most isolated (n = 208). Species no-lipophilic represented 4.5% of isolates (n = 10) of these C. auriscanis (n = 3), C. xerosis (n = 3), C. amycolatum (n = 1), C. casei (n = 1), C. efficiens (n = 1), C. pseudotuberculosis (n = 1). Only four samples (1.8%) were not identified to the specie level. There were equivalence results of 95% between the two identification techniques used. In conclusion, IMI caused by Corynebacterium spp. have no effect on milk yield and composition, but exhibit a significant increase in CCS. Additionally, the technique of MALDI/TOF-MS using the tube-extraction by formic acid/acetonitrile was applied with 91.57% sensitivity for identifying the species of Corynebacterium on cases of bovine mastitis subclinical when compared to the results of genes sequencing 16S rRNA.

Staphylococcus coagulase negativa formam o grupo de agentes mais isolados de vacas com mastite em diversos países. No entanto, a grande variedade de espécies e a ausência de métodos de identificação simples e rápidos são fatores que limitam a avaliação do efeito da mastite causada por SCN sobre a produção e composição do leite. Portanto, os objetivos gerais deste estudo foram: 1) avaliar o efeito da infecção intramamária (IIM) subclínica causada por SCN sobre a composição e a produção de leite de quartos mamários; 2) determinar o efeito da IIM causada por SCN sobre a composição do leite e contagem de células somáticas (CCS); 3) avaliar a técnica de espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz tempo de voo (MALDI-TOF MS) para a identificação das espécies de SCN isoladas de vacas com mastite; 4) avaliar a frequência de espécies de SCN isoladas de vacas com mastite subclínica. Amostras compostas de leite foram coletadas de 1.242 vacas pertencentes a 21 rebanhos leiteiros. As coletas foram realizadas em duas etapas: na primeira, realizou-se coleta asséptica de amostras compostas para identificação dos agentes causadores de mastite; e na segunda, para as vacas com isolamento de SCN, a produção de leite foi mensurada e amostras de leite foram coletadas por quarto mamário para confirmação do diagnóstico microbiológico (SCN) e avaliação da composição e CCS. Os isolados de SCN foram diferenciados genotipicamente pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), associado com o polimorfismo de fragmentos de DNA obtidos por enzimas de restrição (RFLP) e por MALDI-TOF MS. Treze cepas de referência de espécies de SCN normalmente isoladas da mastite foram utilizadas como controle positivo para as duas metodologias de identificação. Um total de 108 quartos mamários foram identificados em nível de espécie pela técnica de PCR-RFLP. Destes, foram selecionados 41 pares de quartos mamários contralaterais com e sem IIM causada por SCN para avaliação do efeito de SCN sobre a produção e composição do leite. Quartos mamários com IIM causada por SCN apresentaram maior CCS (496,99 x 103 células/mL) que os quartos mamários contralaterais sadios (160,79 x 103 células/mL). A IIM causada por SCN não afetou a produção de leite e as concentrações de gordura, proteína, caseína, lactose, sólidos totais e extrato seco desengordurado. Do total de amostras identificadas em nível de espécie pela técnica de PCRRFLP (n=108), 103 (95,37%) foram identificadas pela MALDI-TOF MS em nível de espécie. Cinco isolados de SCN apresentaram identificação em nível de gênero (Staphylococcus spp.) pela MALDI-TOF MS. Todas as cepas de referência foram corretamente identificadas por ambas as metodologias de identificação. Staphylococcus chromogenes foi a espécie mais prevalente (n=80; 74,07%) em vacas com mastite, seguida de S. saprophyticus (n=6; 5,55%) e S. haemolyticus (n=5; 4,63%). Em conclusão, a IIM subclínica causada por SCN aumenta a CCS, porém não altera a produção e composição do leite. A técnica de MALDI-TOF MS é um método sensível (95,37%) e que pode ser utilizado na identificação de espécies de SCN causadoras de mastite. Staphylococcus chromogenes é a espécie mais prevalente em vacas com mastite subclínica causada por SCN. / Coagulase negative staphylococci (CNS) are the most isolated group of mastitis pathogens in many countries. However, the diversity of species and the absence of a simple and fast identification method are limiting factors for the evaluation of the effect of CNS mastitis effect on milk yield and composition of dairy cows. Therefore, the main objectives of this study were: 1) to evaluate the effect of subclinical intramammary infection (IMI) caused by CNS on milk yield and composition at mammary quarter level; 2) to determine the effect of IMI caused by CNS on the milk composition and somatic cell count (SCC); 3) to evaluate the technique of matrix-assisted laser desorption ionization - time-of-flight - mass spectrometry (MALDI/TOF-MS) for species identification of CNS isolated from mammary glands; 4) to evaluate the frequency of CNS species isolated from cows with subclinical mastitis. Milk samples were collected from 1,242 cows distributed in 21 dairy herds. Milk samples were collected in two visits to the farm: first, composite milk samples were aseptically collected for identification of mastitis causative pathogens; and the second, the milk yield was measured and milk samples were collected at mammary quarter level for cows with isolation of CNS to confirm the diagnosis and for analysis of milk composition and SCC. Isolates of CNS were genotypically differentiated by polymerase chain reaction (PCR) associated with restriction fragment length polymorphism assays and by MALDI-TOF MS. Thirteen CNS reference strains commonly isolated from mastitis were used as positive controls for the two identification methods. A total of 108 mammary quarters were genotipically identified by PCR-RFLP. Of these, 41 pairs of contralateral mammary quarters both with and without IIM caused by SCN were evaluated. Mammary quarters infected with CNS presented higher SCC (496.99 x 103 cells / mL) than contralateral healthy mammary quarters (160.79 x 103 cells / mL). Intramammary infection caused by CNS did not affect the milk yield and the concentrations of fat, protein, casein, lactose, total solids and solids not fat. Of the 108 samples identified by PCR-RFLP, 103 (95.37%) were also identified by MALDI-TOF MS with to the species level. Five CNS had reliable identification at genus level (Staphylococcus spp.). All the reference strains were correctly identified by both identification methods. The most prevalent species isolated from samples collected from cows with mastitis were Staphylococcus chromogenes (n = 80, 74.07%), followed by S. saprophyticus (n = 6, 5.55%) and S. haemolyticus (n = 5, 4.63%). In conclusion, subclinical mastitis caused by CNS increases the SCC, but do not affect the milk yield and composition. The MALDI-TOF MS is a sensitive method (95.37%) that can be used for the identification of CNS species causing mastitis. Staphylococcus chromogenes is the most prevalent CNS species isolated in the samples collected from cows with subclinical mastitis.

A mastite é a inflamação da glândula mamária cuja causa mais comum são as infecções bacterianas. É considerada a doença de maiores prejuízos e prevalência em vacas leiteiras. A forma subclínica da mastite é o tipo mais predominante de infecção intramamária (IIM), sendo Corynebacterium spp. um dos agentes mais frequentemente isolados. Portanto, os objetivos gerais deste estudo foram: 1) avaliar o efeito de IIMs subclínicas causadas por Corynebacterium spp. sobre a composição e a produção de leite de quartos mamários; 2) determinar o efeito da IIM causada por Corynebacterium spp. sobre o teor de gordura, proteína bruta, lactose, caseína, extrato seco total, extrato seco desengordurado do leite e contagem de células somáticas (CCS); 3) avaliar a técnica de Espectrometria de massas por Ionização e Dessorção à Laser Assistida por Matriz Tempo de Voo (MALDI/TOF-MS) para a identificação das espécies de Corynebacterium isoladas de quartos mamários. Foram utilizados 21 rebanhos leiteiros (n=1.242 animais), nos quais foram selecionadas vacas em lactação previamente identificadas com IIM causada por Corynebacterium spp. (n=285). Amostras de leite de quartos mamários de vacas previamente identificadas com IIM causada por Corynebacterium spp. (n=1.140) foram coletadas, identificadas por meio de cultura microbiológica e criopreservadas. Os isolados de Corynebacterium spp. (n=351) foram descongelados, recultivados e submetidos à identificação pela técnica de sequenciamento de genes 16S rRNA (standard gold) e MALDI/TOF-MS. Para a análise de MALDI/TOF-MS, os isolados bacterianos foram submetidos a protocolo de extração em tubo, baseado no uso de ácido fórmico. Do total de quartos mamários infectados por Corynebacterium spp. (n=190) identificados pelo sequenciamento de genes 16S rRNA, 46 quartos mamários apresentaram contralaterais sadios (controle). Para a coleta de amostras de leite para composição e CCS, as vacas foram submetidas à ordenha completa e individual dos quartos mamários. Foi avaliado o efeito de IIM causada por Corynebacterium spp. sobre a produção e a composição do leite, utilizando delineamento em parcelas subdivididas em faixas (strip-plot). Todos os quartos mamários infectados por Corynebacterium spp. (n=190) apresentaram média de CCS de 690x103células/mL. Dentre os quartos contralaterais, a CCS foi maior para os quartos com IIM causada por Corynebacterium spp. (194x103células/mL) que em quartos não infectados (81x103células/mL). Não houve efeito de Corynebacterium spp. sobre a produção de leite, gordura, proteína, caseína, lactose, sólidos totais e extrato seco desengordurado. Um total de 222 isolados foram identificados pela MALDI/TOF-MS como Corynebacterium spp., dos quais, Corynebacetium bovis foi o mais frequentemente isolado (n = 208). Espécies não-lipofíficas representaram 4,5% do total de isolados (n=10), destes C. auriscanis (n=3), C. xerosis (n=3), C. amycolatum (n=1), C. casei (n=1), C. efficiens (n=1), C. pseudotuberculosis (n=1). Apenas quatro amostras (1,8%) não foram identificadas ao nível de espécie, Corynebacterium spp. Houve equivalência de resultados de 95% entre as duas técnicas de identificação utilizadas. Em conclusão, IIMs causadas por Corynebacterium spp. não apresentam efeito sobre a produção e composição de leite, porém apresentam aumento significativo da CCS. Adicionalmente, a técnica de MALDI/TOF-MS com o uso da extração em tubo por ácido fórmico/acetonitrila foi aplicada com 91,57% de sensibilidade de identificação das espécies de Corynebacterium nos casos de mastite bovina subclínica, quando comparado aos resultados do sequenciamento de genes 16S rRNA. / Mastitis is an inflammation of the mammary glands which bacteria are the most common cause of infections. It is considered a disease with higher prevalence and losses in dairy cows. The subclinical form of mastitis is the most prevalent type of intramammary infection (IMI), and Corynebacterium spp., one of the agents most frequently isolated. Therefore, the main objectives of this study were: 1) to evaluate the effect of subclinical IMI caused by Corynebacterium spp. on milk composition and yield of mammary quarters; 2) to determine the effect of IMI caused by Corynebacterium spp. on the concentration of fat, protein, lactose, casein, total solids, non fat dry milk and somatic cell count (SCC); 3) to evaluate the technique of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time-of-Flight - Mass Spectrometry (MALDI/TOF-MS) for species identification of Corynebacterium isolated from mammary glands. Twenty-one dairy herds were used (n = 1242 animals) on which lactating cows were selected previously identified with IMI caused by Corynebacterium spp. (n = 285). Samples of milk from mammary glands of cows previously identified with IMI caused by Corynebacterium spp. (n = 1140) were collected, identified by microbiological culture and cryopreserved. The strains of Corynebacterium spp. (n = 351) were thawed and recultivated wich were submitted for identification by the technique of sequencing 16S rRNA (gold standard) and MALDI/TOF-MS. For analysis of MALDI/TOF-MS, the isolates were subjected to tube-extraction protocol based on the use of formic acid and acetonitrile. Of the total number of mammary quarters infected by Corynebacterium spp. (n = 190) identified by sequencing 16S rRNA genes, 46 showed contralateral healthy mammary quarters (control). For the collection of milk composition samples and SCC, cows were submitted to a complete milking in individual mammary quarters. The effect of IMI caused by Corynebacterium spp. on milk yield and composition were analyzed using strip-plot design. All mammary quarters infected with Corynebacterium spp. (n = 190) had mean of CCS 690x103cells/mL. Among the contralateral quarters, CCS was higher in quarters with IMI caused by Corynebacterium spp. (194x103células/mL) comparing with uninfected quarters (81x103cells/mL). There was no effect of Corynebacterium spp. on milk yield, on the concentration of fat, protein, casein, lactose, total solids and solids not fat. A total of 222 isolates were identified by MALDI/TOFMS as Corynebacterium spp. of which, Corynebacetium bovis were the most isolated (n = 208). Species no-lipophilic represented 4.5% of isolates (n = 10) of these C. auriscanis (n = 3), C. xerosis (n = 3), C. amycolatum (n = 1), C. casei (n = 1), C. efficiens (n = 1), C. pseudotuberculosis (n = 1). Only four samples (1.8%) were not identified to the specie level. There were equivalence results of 95% between the two identification techniques used. In conclusion, IMI caused by Corynebacterium spp. have no effect on milk yield and composition, but exhibit a significant increase in CCS. Additionally, the technique of MALDI/TOF-MS using the tube-extraction by formic acid/acetonitrile was applied with 91.57% sensitivity for identifying the species of Corynebacterium on cases of bovine mastitis subclinical when compared to the results of genes sequencing 16S rRNA.

Staphylococcus coagulase negativa formam o grupo de agentes mais isolados de vacas com mastite em diversos países. No entanto, a grande variedade de espécies e a ausência de métodos de identificação simples e rápidos são fatores que limitam a avaliação do efeito da mastite causada por SCN sobre a produção e composição do leite. Portanto, os objetivos gerais deste estudo foram: 1) avaliar o efeito da infecção intramamária (IIM) subclínica causada por SCN sobre a composição e a produção de leite de quartos mamários; 2) determinar o efeito da IIM causada por SCN sobre a composição do leite e contagem de células somáticas (CCS); 3) avaliar a técnica de espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz tempo de voo (MALDI-TOF MS) para a identificação das espécies de SCN isoladas de vacas com mastite; 4) avaliar a frequência de espécies de SCN isoladas de vacas com mastite subclínica. Amostras compostas de leite foram coletadas de 1.242 vacas pertencentes a 21 rebanhos leiteiros. As coletas foram realizadas em duas etapas: na primeira, realizou-se coleta asséptica de amostras compostas para identificação dos agentes causadores de mastite; e na segunda, para as vacas com isolamento de SCN, a produção de leite foi mensurada e amostras de leite foram coletadas por quarto mamário para confirmação do diagnóstico microbiológico (SCN) e avaliação da composição e CCS. Os isolados de SCN foram diferenciados genotipicamente pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), associado com o polimorfismo de fragmentos de DNA obtidos por enzimas de restrição (RFLP) e por MALDI-TOF MS. Treze cepas de referência de espécies de SCN normalmente isoladas da mastite foram utilizadas como controle positivo para as duas metodologias de identificação. Um total de 108 quartos mamários foram identificados em nível de espécie pela técnica de PCR-RFLP. Destes, foram selecionados 41 pares de quartos mamários contralaterais com e sem IIM causada por SCN para avaliação do efeito de SCN sobre a produção e composição do leite. Quartos mamários com IIM causada por SCN apresentaram maior CCS (496,99 x 103 células/mL) que os quartos mamários contralaterais sadios (160,79 x 103 células/mL). A IIM causada por SCN não afetou a produção de leite e as concentrações de gordura, proteína, caseína, lactose, sólidos totais e extrato seco desengordurado. Do total de amostras identificadas em nível de espécie pela técnica de PCRRFLP (n=108), 103 (95,37%) foram identificadas pela MALDI-TOF MS em nível de espécie. Cinco isolados de SCN apresentaram identificação em nível de gênero (Staphylococcus spp.) pela MALDI-TOF MS. Todas as cepas de referência foram corretamente identificadas por ambas as metodologias de identificação. Staphylococcus chromogenes foi a espécie mais prevalente (n=80; 74,07%) em vacas com mastite, seguida de S. saprophyticus (n=6; 5,55%) e S. haemolyticus (n=5; 4,63%). Em conclusão, a IIM subclínica causada por SCN aumenta a CCS, porém não altera a produção e composição do leite. A técnica de MALDI-TOF MS é um método sensível (95,37%) e que pode ser utilizado na identificação de espécies de SCN causadoras de mastite. Staphylococcus chromogenes é a espécie mais prevalente em vacas com mastite subclínica causada por SCN. / Coagulase negative staphylococci (CNS) are the most isolated group of mastitis pathogens in many countries. However, the diversity of species and the absence of a simple and fast identification method are limiting factors for the evaluation of the effect of CNS mastitis effect on milk yield and composition of dairy cows. Therefore, the main objectives of this study were: 1) to evaluate the effect of subclinical intramammary infection (IMI) caused by CNS on milk yield and composition at mammary quarter level; 2) to determine the effect of IMI caused by CNS on the milk composition and somatic cell count (SCC); 3) to evaluate the technique of matrix-assisted laser desorption ionization - time-of-flight - mass spectrometry (MALDI/TOF-MS) for species identification of CNS isolated from mammary glands; 4) to evaluate the frequency of CNS species isolated from cows with subclinical mastitis. Milk samples were collected from 1,242 cows distributed in 21 dairy herds. Milk samples were collected in two visits to the farm: first, composite milk samples were aseptically collected for identification of mastitis causative pathogens; and the second, the milk yield was measured and milk samples were collected at mammary quarter level for cows with isolation of CNS to confirm the diagnosis and for analysis of milk composition and SCC. Isolates of CNS were genotypically differentiated by polymerase chain reaction (PCR) associated with restriction fragment length polymorphism assays and by MALDI-TOF MS. Thirteen CNS reference strains commonly isolated from mastitis were used as positive controls for the two identification methods. A total of 108 mammary quarters were genotipically identified by PCR-RFLP. Of these, 41 pairs of contralateral mammary quarters both with and without IIM caused by SCN were evaluated. Mammary quarters infected with CNS presented higher SCC (496.99 x 103 cells / mL) than contralateral healthy mammary quarters (160.79 x 103 cells / mL). Intramammary infection caused by CNS did not affect the milk yield and the concentrations of fat, protein, casein, lactose, total solids and solids not fat. Of the 108 samples identified by PCR-RFLP, 103 (95.37%) were also identified by MALDI-TOF MS with to the species level. Five CNS had reliable identification at genus level (Staphylococcus spp.). All the reference strains were correctly identified by both identification methods. The most prevalent species isolated from samples collected from cows with mastitis were Staphylococcus chromogenes (n = 80, 74.07%), followed by S. saprophyticus (n = 6, 5.55%) and S. haemolyticus (n = 5, 4.63%). In conclusion, subclinical mastitis caused by CNS increases the SCC, but do not affect the milk yield and composition. The MALDI-TOF MS is a sensitive method (95.37%) that can be used for the identification of CNS species causing mastitis. Staphylococcus chromogenes is the most prevalent CNS species isolated in the samples collected from cows with subclinical mastitis.

A mastite bovina é considerada a doença de maior impacto nos rebanhos leiteiros, exercendo efeito econômico negativo sobre a produtividade e perdas significativas à indústria de laticínios. Tendo em vista os impactos na sanidade animal e os prejuízos econômicos acarretados, o objetivo deste estudo foi caracterizar de forma mais abrangente a comunidade microbiana presente em rebanhos leiteiros com mastite subclínica utilizado o sequenciamento parcial do gene 16S ribossomal RNA (rRNA). Especificamente, foram caracterizadas as comunidades bacterianas presentes em amostras de leite vindas de três fazendas comerciais, sendo que cada fazenda contribuiu com amostras com alta contagem de células somáticas (CCS > 200.000 cel./mL) e com baixa contagem (CCS < 200.000 cel./mL) perfazendo um total de 57 animais. O DNA total foi extraído e amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores da região V3 e V4 do gene 16S rRNA. O sequenciamento foi realizado utilizando a tecnologia de sequenciamento de nova geração através do equipamento MiSeq (Illumina - San Diego, EUA). Para efeito de comparação, alíquotas de todas as amostras foram destinadas ao cultivo microbiológico para identificação de bactérias causadoras da mastite. Os fragmentos amplicons de todas as amostras foram submetidos a uma série de análises computacionais utilizando o programa QIIME. Após a avaliação adicional das sequências em nível de espécie, verificou-se que em geral as bactérias diagnosticadas por cultura geralmente não corresponderam com as sequências mais abundantes detectadas pelo sequenciamento. A análise da composição da microbiota de amostras de leite provenientes de animais saudáveis revelou a presença de uma grande diversidade de espécies bacterianas, mesmo que nenhuma bactéria tenha sido detectada por técnica de cultura. A espécie bacteriana mais abundante em todas as amostras foi Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus também foi detectada na grande maioria das amostras As diferenças na composição microbiana foram observadas entre as amostras quando a comparação foi feita de forma individual. Estas diferenças foram notórias em composição taxonômica e foram refletidas por intermédio das estimativas de alfa e beta diversidade. Quando a comparação foi realizada por separação de grupos com alta e baixa CCS, essa diferença não foi tão evidente. Com este estudo será possível compreender a diversidade dos microrganismos presentes na glândula mamária de animais saudáveis e com mastite subclínica. Essas informações podem ser úteis podendo contribuir no planejamento de medidas terapêuticas e preventivas mais eficazes da doença. / Bovine mastitis is considered the most impact disease in dairy herds, exerting negative economic effect on productivity and significant losses to the dairy industry. In view of the impact on animal health and carted economic losses, the objective of this study was to characterize more comprehensively the microbial community present in dairy herds with subclinical mastitis using the partial sequencing of 16S ribosomal RNA gene (rRNA). Specifically, the bacterial communities present in samples of milk coming from three commercial farms were identified, and each farm contributed samples with high somatic cell count (SCC> 200,000 cel./mL) and low count (SCC <200,000 cel./ml) for a total of 57 animals. Total DNA was extracted and amplified with primers of the V3 and V4 region of the 16S rRNA gene. Sequencing was performed using the new generation of sequencing technology through MiSeq equipment (Illumina - San Diego, USA). For comparison, aliquots of all samples were intended for microbiological culture for identification of bacteria which cause mastitis. The amplicon fragments of all samples were subjected to a series of computer analyzes using the QIIME program. After further evaluation of the sequences at the species level, it was found that in general the bacteria do not generally diagnosed by culture corresponded to the most abundant sequences identified by sequencing. The analysis of milk samples from microbial composition from healthy animals revealed the presence of a diversity of bacterial species, even though no bacteria have been detected by culture technique. The most abundant bacterial species in all samples was Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus was also detected in most samples differences in microbial composition were found between the samples when a comparison was made individually. These differences were noticeable in taxonomic composition and were reflected by means of the estimates of alpha and beta diversity. When comparison was performed by separation of high and low groups with CCS, this difference was not so evident. This study will be possible to understand the diversity of microorganisms present in the mammary gland of healthy animals and with subclinical mastitis. This information can be useful and can contribute in the planning of more effective therapeutic and preventive measures of the disease.

O grupo de estafilococos não-aureus (SNA), frequentemente isolados de quartos mamários com mastite subclínica, ápice do teto e ambiente, possue variabilidade ecológica que desafia a compreensão da patogenia a estes atribuída. Os fatores espécie-específicos associados à essa infecção ainda não foram identificados e a susceptibilidade difere entre vacas e quartos e promove diferentes perfis de infecção. Com o objetivo de avaliar a resistência à fagocitose e atividade microbicida, comparou-se a viabilidade, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a fagocitose de neutrófilos sanguíneos de vacas primíparas e multíparas frente a distintos isolados viáveis de estafilococos. Utilizou-se doze vacas sadias (seis primíparas e seis multíparas) em terço médio de lactação e SO isolados viáveis de estafilococos (38 SNA e 12 Staphylococcus aureus) de diferentes nichos ecológicos. A viabilidade de neutrófilos (P = 0,55), produção de ERO (P = 0,12) e atividade funcional dos fagócitos (P = 0,33) foram semelhantes entre as primíparas e multíparas testadas . Contudo, foram observadas diferenças (P &le;0,05) entre os distintos grupos de espécies e estirpes de estafilococos quanto ao estímulo da produção intracelular de ERO pelos neutrófilos e à fagocitose. S. chromogenes de origens distintas, ápice do teto (P = 0,01), infecção intramamária transiente (P < 0,01) e infecção intramamárias persistente (P < 0,01) estimularam mais a produção de ERO pelos neutrófilos do que as outras espécies. Todos isolados foram fagocitados pelos neutrófilos, mas S. chromogenes resistiram mais eficientemente que as outras espécies de SNA, principalmente, S. chromogenes isolados do ápice do teto (P < 0,01). S. haemolyticus isolados do ápice do teta (P = 0,02) e infecção intramamária transiente (P < 0,01), assim como, S. fleurettii (P < 0,01), foram substancialmente fagocitados do mesmo modo que S. aureus isolado de suabe nasa\\ (P = 0,03). Mais evidente do que possíveis variações entre as respostas mamárias de primíparas e multíparas é a variação entre os SNA. Quanto mais adaptado à mama, maior resistência à fagocitose. / The group of non-aureus staphylococci (NAS), often isolated from mammary quarters with subclinical mastitis, teat apex and environment, has ecological variability that challenges the understanding of the pathogenesis attributed to them. The species-specific factors associated with this infection have not yet been identified and the susceptibility differs between cows and quarters and promotes different infection profiles. In order to evaluate the resistance to phagocytosis and I or microbicidal activity of these pathogens, the viability , intracellular production of reactive oxygen species (ROS) and blood neutrophil phagocytosis of primiparous and multiparous cows were compared to different viable isolates of staphylococci. Twelve healthy cows (six primiparous and six multiparous) were used in the middle third of lactation and 50 viable isolates of staphylococci (38 SNA and 12 Staphylococcus aureus) from different ecological niches. Neutrophil viability (P = 0.55), ROS production (P = 0.12) and phagocyte functional activity (P = 0.33) were similar among the primiparous and multiparous groups tested. However, differences (P &lt;0.05) between the different groups of species and strains of staphylococci were observed for the stimulation of intracellular ROS production by neutrophils and phagocytosis. S. chromogenes of different origins, ceiling apex (P =0.01), transient intramammary infection (P &lt;0.01) and persistent intramammary infection (P &lt;0 .01) further stimulated the production of ROS by neutrophils than species. All isolates were phagocytosed by neutrophils, but S. chromogenes resisted more efficiently than the other SNA species, especially S. chromogenes isolated from the apex of the ceiling (P &lt;0.01). S. haemolyticus isolated from apex to ceiling (P =0.02) and transient (P &lt;0.01) intramammary infection, as well as S. fleurettii (P &lt;0.01), were substantially phagocytosed in the same manner as S. aureus isolated from nasal swab (P = 0.03). More evident than possible variations between mammary responses of primiparous and multiparous is the variation between ANS. The more adapted to the breast, the greater resistance to phagocytosis.