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The physical role of the germline RNA helicases (GLHs) in caenorhabditis elegans

Smith, Pliny Andrews, January 2001 (has links)
Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2001. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 217-230). Also available on the Internet.
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Regulation of procoagulant activity of cell surface tissue factor

Popescu, Narcis Ioan. January 2010 (has links) (PDF)
Thesis (Ph. D.)--University of Oklahoma. / Bibliography: leaves 173-211.
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Medidas das atividades da Dissulfeto Isomerase Proteica: uma análise crítica / Methods for measuring Protein Disulfide Isomerase activities: a critical overview

Monica Massako Watanabe 09 October 2014 (has links)
A Dissulfeto Isomerase Proteína (PDI) é uma chaperona redox essencial responsável pela inserção correta das ligações dissulfeto em proteínas nascentes no retículo endoplasmático. Nesta localização celular, bem como em outras regiões, como na superfície celular, a PDI atua na manutenção da homeostase redox e sinalização. Houve substanciosa evolução no conhecimento sobre a estrutura e funções da PDI, graças a estudos in vitro que utilizam a PDI purificada, quimeras ou seus domínios isolados. Nestas abordagens experimentais, as medidas das atividades redutase e chaperona da PDI são realizadas de forma relativamente simples. Entretanto, medir a atividade isomerase, que é a atividade autêntica da família das PDIs, é tecnicamente bastante complexo. Em células e tecidos, o papel da PDI tem sido descrito com base principalmente em estratégias experimentais de ganho e perda de função. Todavia, ainda há pouca informação na correlação entre os resultados funcionais com a medida das atividades da PDI. Este trabalho compila os principais métodos descritos para medir as quatro atividades da PDI: tiol redutase, tiol oxidase, tiol isomerase e chaperona, com ênfase na descrição de controles e interferentes críticos, como os tampões que contém surfactantes. Ainda, discutir-se-á criticamente os resultados obtidos quando da transposição destes métodos para amostras de homogenatos (celular ou tecidual) / Protein disulfide isomerase is an essential redox chaperone from endoplasmic reticulum, responsible for correct disulfide bond insertion in nascent proteins. At the endoplasmic reticulum and other locations including the cell surface, PDI accounts for redox homeostasis and signaling. Knowledge about PDI structure and function evolved substantially from in vitro studies using purified PDI and chimeras. In these experimental scenarios, PDI reductase and chaperone are readily approachable. However, isomerase activity, the hallmark of PDI family, is significantly complex. Assessment of PDI roles in cells and tissues mainly relies on gain- or loss-of-function experiments. However, there is limited information regarding correlation of these results with PDI activities. In this manuscript, we put together the main methods described for measuring the four PDI activities: thiol reductase, thiol oxidase, thiol isomerase and chaperone, with emphasis on controls and critical interferents, such as detergent-containing buffers. We also discuss the transposition of these methods from purified PDI to cellular or in vivo samples, with critical thoughts about the interpretation of results
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Roles of Secreted Virulence Factors in Pathogenicity of Haemophilus Influenzae: A Dissertation

Rosadini, Charles V. 12 May 2011 (has links)
Haemophilus influenzae is a pathogenic Gram-negative bacterium that colonizes the upper respiratory tract of humans and can cause otitis media, upper and lower respiratory infections, and meningitis. Factors important for H. influenzae to colonize humans and cause disease are not fully understood. Different bacterial pathogens are armed with virulence mechanisms unique to their specific strategies for interacting with their hosts. Many of the proteins mediating these interactions are secreted and contain disulfide bonds required for function or stability. I postulated that identifying the set of secreted proteins in H. influenzae that require periplasmic disulfide bonds would provide better understanding of this bacterium's pathogenic mechanisms. In this thesis, the periplasmic disulfide bond oxidoreductase protein, DsbA, was found to be essential for colonization and virulence of H. influenzae. Mutants of dsbA were also found to be sensitive to the bactericidal effects of serum. However, the DsbA-dependent proteins important for pathogenesis of this organism have not been previously identified. To find them, putative targets of the periplasmic disulfide bond pathway were identified and examined for factors which might be important for mediating critical virulence aspects. By doing so, novel virulence factors were discovered including those important for heme and zinc acquisition, as well as resistance to complement. Overall, the work presented here provides insight into requirements for H. influenzae to survive within various host environments.
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Processamento intracelular da fibrilina-1 mutada na síndrome de Marfan: escape do controle de qualidade pela dissulfeto isomerase proteica / Mutated fibrillin-1 intracellular processing in Marfan syndrome: bypass of a protein disulfide isomerase-mediated quality control

Santos, Thayna Meirelles 02 September 2014 (has links)
A Síndrome de Marfan (SMF) é a enfermidade hereditária mais comum dentre as que afetam o sistema conjuntivo, causada por mutações da glicoproteína fibrilina-1, o principal componente estrutural das microfibrilas elásticas da matriz extracelular. As manifestações fenotípicas da SMF são sistêmicas e acometem tipicamente os sistemas ocular, esquelético e cardiovascular, este uma importante causa de morbi-mortalidade. Entretanto, não está claro como a mutação induz a doença. Estudos anteriores sugerem anomalias morfológicas do retículo endoplasmático (RE) ou retenção intracelular da fibrilina-1 nos estágios avançados da SMF. Entretanto, a contribuição do enovelamento da fibrilina-1 mutada e do estresse do RE na fisiopatologia celular da SMF não é conhecida. Proteínas mal-enoveladas podem levar à retenção intracelular e/ou aumento da degradação através da via de degradação associada ao RE (ERAD), além da indução da resposta a proteínas mal-enoveladas (UPR), ambas com potencial contribuição à fisiopatologia de doenças, incluindo a SMF. Assim, estudamos em fibroblastos embrionários isolados de camundongos (MEFs) com SMF se a fibrilina-1 mutada é reconhecida pelo controle de qualidade do RE pelo seu mal- enovelamento e induz estresse do RE por sua retenção intracelular. Demonstramos que a mutação na fibrilina-1 per se não promoveu chaperonas marcadoras de UPR ou geração de oxidantes. Além disso, não levou a uma maior sensibilização das células à indução exógena de estresse do RE, nem promoveu maior morte celular após inibição do proteassoma. Além disso, não foi observada retenção intracelular da fibrilina-1 nas células SMF, e mesmo após inibição da via secretora ou indução de estresse do RE, a inibição da secreção da fibrilina-1 foi similar nos MEFs SMF e wild-type (WT). A dissulfeto isomerase proteica (PDI), uma importante chaperona redox do RE, interage com fibrilina-1, e seu silenciamento levou a um aumento na secreção da fibrilina-1 pelos MEFs WT, mas não SMF. Além disso, o silenciamento da PDI promoveu a desorganização da matriz extracelular depositada de fibrilina-1 nos MEFs WT, enquanto nos MEFs SMF, a desorganização basal da matriz não foi adicionalmente alterada. Em paralelo, investigações in vivo mostraram que o estresse do RE não é induzido em camundongos SMF com 1 ou 3 meses de idade, apesar de manifestações fenotípicas evidentes. Entretanto, concomitante à progressão da doença, detectamos a ocorrência de estresse do RE nas aortas ascendentes dos camundongos aos 6 meses. Esta detecção foi exclusiva desta região da aorta e não ocorreu em outros órgãos afetados ou não afetados pela SMF. Assim, a manifestação do fenótipo clássico da SMF não requer uma perda da homeostase do RE diretamente induzida pela fibrilina-1 mutada. Ao contrário, esta é capaz de evadir mecanismos de controle de qualidade mediados pela PDI, sendo secretada normalmente. Assim, esta evasão do controle de qualidade pela PDI é uma condição permissiva essencial para o fenótipo da SMF. Por outro lado, o estresse do RE é uma característica evolutiva do aneurisma da aorta ascendente na SMF concomitante ao agravamento do fenótipo neste tecido / Marfan syndrome (MFS) is the most common connective tissue hereditary disease, caused by mutations in the glycoprotein fibrillin-1, the main structural component of extracellular matrix elastic microfibrils. MFS phenotypic manifestations are systemic and typically involve the ocular, skeletal and cardiovascular systems, the latter a major cause of morbidity/mortality. However, how gene mutation induxes disease is yet unclear. Previous studies suggest endoplasmic reticulum (ER) morphological abnormalities or fibrillin-1 intracellular retention in advanced MFS stages. However, the contribution of mutated fibrillin-1 folding and ER stress to MFS cellular pathophysiology is unknown. Un/misfolded proteins may associate with their intracellular retention and/or increased degradation through ER-associated degradation (ERAD), in addition to inducing the unfolded protein response (UPR), both sharing potential contributions to disease pathophysiology, including MFS. Thus, we studied in embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from WT and MFS mice, if mutated fibrillin-1 can be recognized by ER quality control as a misfolded protein, able to induce ER stress due to its intracellular retention. We showed that fibrillin-1 mutation by itself did not promote UPR chaperone markers or oxidant generation. Moreover, it did not sensitize cells to exogenous ER stress nor affected cell survival curves after proteasome inhibition. Furthermore, no intracellular retention of fibrillin-1 was observed in MFS cells, and even after secretory pathway inhibition or ER stress induction, fibrillin-1 secretion inhibition was similar in MFS and wild-type (WT) MEFs. Protein disulfide isomerase (PDI), an important ER redox chaperone, interacts with fibrillin-1 and its silencing induced an increased fibrillin-1 secretion in WT, but not MFS MEFs. Besides, PDI silencing promoted fibrillin-1 extracellular matrix disorganization in WT MEFs, whereas in MFS MEFs, the basal matrix disorganization was not further modified. Parallel in vivo evaluations demonstrated that ER stress is also not induced in 1 and 3 month-old mice MFS, despite evident phenotypical manifestations. However, concomitant to accelerated disease progression at 6 months, ER stress was detectable in ascendant aorta, but not in other disease-affected or unaffected organs. Thus, classic MFS phenotype manifestations do not require loss of ER homeostasis directly induced by mutated fibrillin-1. Contrarily, the latter can evade a PDI-mediated quality control mechanism to be normally secreted. Therefore, evading such PDI-mediated quality control is an essential permissive condition for enabling the MFS phenotype. On the other hand, ER stress is an evolutive feature of MFS ascendant aorta aneurysm concomitant to phenotype progression in this tissue
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Processamento intracelular da fibrilina-1 mutada na síndrome de Marfan: escape do controle de qualidade pela dissulfeto isomerase proteica / Mutated fibrillin-1 intracellular processing in Marfan syndrome: bypass of a protein disulfide isomerase-mediated quality control

Thayna Meirelles Santos 02 September 2014 (has links)
A Síndrome de Marfan (SMF) é a enfermidade hereditária mais comum dentre as que afetam o sistema conjuntivo, causada por mutações da glicoproteína fibrilina-1, o principal componente estrutural das microfibrilas elásticas da matriz extracelular. As manifestações fenotípicas da SMF são sistêmicas e acometem tipicamente os sistemas ocular, esquelético e cardiovascular, este uma importante causa de morbi-mortalidade. Entretanto, não está claro como a mutação induz a doença. Estudos anteriores sugerem anomalias morfológicas do retículo endoplasmático (RE) ou retenção intracelular da fibrilina-1 nos estágios avançados da SMF. Entretanto, a contribuição do enovelamento da fibrilina-1 mutada e do estresse do RE na fisiopatologia celular da SMF não é conhecida. Proteínas mal-enoveladas podem levar à retenção intracelular e/ou aumento da degradação através da via de degradação associada ao RE (ERAD), além da indução da resposta a proteínas mal-enoveladas (UPR), ambas com potencial contribuição à fisiopatologia de doenças, incluindo a SMF. Assim, estudamos em fibroblastos embrionários isolados de camundongos (MEFs) com SMF se a fibrilina-1 mutada é reconhecida pelo controle de qualidade do RE pelo seu mal- enovelamento e induz estresse do RE por sua retenção intracelular. Demonstramos que a mutação na fibrilina-1 per se não promoveu chaperonas marcadoras de UPR ou geração de oxidantes. Além disso, não levou a uma maior sensibilização das células à indução exógena de estresse do RE, nem promoveu maior morte celular após inibição do proteassoma. Além disso, não foi observada retenção intracelular da fibrilina-1 nas células SMF, e mesmo após inibição da via secretora ou indução de estresse do RE, a inibição da secreção da fibrilina-1 foi similar nos MEFs SMF e wild-type (WT). A dissulfeto isomerase proteica (PDI), uma importante chaperona redox do RE, interage com fibrilina-1, e seu silenciamento levou a um aumento na secreção da fibrilina-1 pelos MEFs WT, mas não SMF. Além disso, o silenciamento da PDI promoveu a desorganização da matriz extracelular depositada de fibrilina-1 nos MEFs WT, enquanto nos MEFs SMF, a desorganização basal da matriz não foi adicionalmente alterada. Em paralelo, investigações in vivo mostraram que o estresse do RE não é induzido em camundongos SMF com 1 ou 3 meses de idade, apesar de manifestações fenotípicas evidentes. Entretanto, concomitante à progressão da doença, detectamos a ocorrência de estresse do RE nas aortas ascendentes dos camundongos aos 6 meses. Esta detecção foi exclusiva desta região da aorta e não ocorreu em outros órgãos afetados ou não afetados pela SMF. Assim, a manifestação do fenótipo clássico da SMF não requer uma perda da homeostase do RE diretamente induzida pela fibrilina-1 mutada. Ao contrário, esta é capaz de evadir mecanismos de controle de qualidade mediados pela PDI, sendo secretada normalmente. Assim, esta evasão do controle de qualidade pela PDI é uma condição permissiva essencial para o fenótipo da SMF. Por outro lado, o estresse do RE é uma característica evolutiva do aneurisma da aorta ascendente na SMF concomitante ao agravamento do fenótipo neste tecido / Marfan syndrome (MFS) is the most common connective tissue hereditary disease, caused by mutations in the glycoprotein fibrillin-1, the main structural component of extracellular matrix elastic microfibrils. MFS phenotypic manifestations are systemic and typically involve the ocular, skeletal and cardiovascular systems, the latter a major cause of morbidity/mortality. However, how gene mutation induxes disease is yet unclear. Previous studies suggest endoplasmic reticulum (ER) morphological abnormalities or fibrillin-1 intracellular retention in advanced MFS stages. However, the contribution of mutated fibrillin-1 folding and ER stress to MFS cellular pathophysiology is unknown. Un/misfolded proteins may associate with their intracellular retention and/or increased degradation through ER-associated degradation (ERAD), in addition to inducing the unfolded protein response (UPR), both sharing potential contributions to disease pathophysiology, including MFS. Thus, we studied in embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from WT and MFS mice, if mutated fibrillin-1 can be recognized by ER quality control as a misfolded protein, able to induce ER stress due to its intracellular retention. We showed that fibrillin-1 mutation by itself did not promote UPR chaperone markers or oxidant generation. Moreover, it did not sensitize cells to exogenous ER stress nor affected cell survival curves after proteasome inhibition. Furthermore, no intracellular retention of fibrillin-1 was observed in MFS cells, and even after secretory pathway inhibition or ER stress induction, fibrillin-1 secretion inhibition was similar in MFS and wild-type (WT) MEFs. Protein disulfide isomerase (PDI), an important ER redox chaperone, interacts with fibrillin-1 and its silencing induced an increased fibrillin-1 secretion in WT, but not MFS MEFs. Besides, PDI silencing promoted fibrillin-1 extracellular matrix disorganization in WT MEFs, whereas in MFS MEFs, the basal matrix disorganization was not further modified. Parallel in vivo evaluations demonstrated that ER stress is also not induced in 1 and 3 month-old mice MFS, despite evident phenotypical manifestations. However, concomitant to accelerated disease progression at 6 months, ER stress was detectable in ascendant aorta, but not in other disease-affected or unaffected organs. Thus, classic MFS phenotype manifestations do not require loss of ER homeostasis directly induced by mutated fibrillin-1. Contrarily, the latter can evade a PDI-mediated quality control mechanism to be normally secreted. Therefore, evading such PDI-mediated quality control is an essential permissive condition for enabling the MFS phenotype. On the other hand, ER stress is an evolutive feature of MFS ascendant aorta aneurysm concomitant to phenotype progression in this tissue
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Identification and enzyme studies of rare amino acid biosynthesis from Streptomyces cattleya

Chan, K. K. Jason January 2013 (has links)
This thesis is focussed on the biosynthesis of three toxins: fluoroacetate, 4-fluoro-L-theronine and β-ethynyl-L-serine which are biosynthesised by the soil bacteria Streptomyces cattleya. The two fluorinated metabolites originate from a common biosynthetic pathway and the thesis describes studies carried out on an aldose-ketose isomerase enzyme of the pathway. The biosynthetic origin of β-ethynyl-L-serine is not known. A total synthesis of this acetylenic amino acid is descibed along with the development of a new analytical method for identifying the metabolite and for future isotope-labelling based biosynthetic studies. Chapter 1 presents the background of this research. It is focussed on the biosynthesis of fluoroacetate and 4-fluoro-L-threonine by S. cattleya and it also introduces alkyne-containing natural products and their biosynthesis. Chapter 2 describes the work carried out on crystallisation of the aldose-ketose isomerase of the fluorometabolite pathway in S. cattleya. Crystals of the isomerase were obtained and they were diffracted by X-ray, however a structure could not be solved. Chapter 3 contains site-directed mutagenesis studies of the isomerase from S. cattleya. Chapter 4 describes an enantioselective total synthesis of β-ethynyl-L-serine. A robust analytical technique based on derivatisation using 'Click' chemistry and LC-MS was developed for the detection of this amino acid directly from the fermentation broth. Chapter 5 details the experimental procedures for compounds synthesised in this thesis and the biological procedures for gene cloning and protein purification.
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Mecanismo associados à  perda da regulação da nox1 NADPH oxidase pela dissulfeto isomerase proteica em células com ativação sustentada da via ras / Mechanisms associated with loss of regulation of NADPH oxidase nox1 by protein disulfide isomerase in cells with sustained activation of the ras pathway

Bessa, Tiphany Coralie de 29 March 2018 (has links)
Dissulfeto isomerase proteica como a PDIA1 tem sido implicada na progressão do câncer, porém os mecanismos envolvidos ainda não foram claramente identificados. Previamente, nós demonstramos um importante efeito da PDIA1 induzindo a superexpressão da Nox1 NADPH oxidase, associada à geração de espécie reativas de oxigênio (ROS). Uma vez que a perda na regulação de ROS envolve o crescimento tumoral, nós propusemos que a PDIA1 atua como um mecanismo regulador proximal na produção de ROS em tumores. No presente estudo, nós focamos no câncer colorretal (CRC) com distintos efeitos na ativação de KRas. Resultados provenientes de bancos de dados de RNAsec e validação direta, indicam um significante aumento na expressão de PDIA1 em CRC com alta ativação constitutiva da Kras (HCT116) vs. ativação intermediária (HKE3) ou basal (Caco2). A PDIA1 sustenta a produção de superóxido dependente da Nox1 em CRC; entretanto, observamos pela primeira vez uma ação dupla da PDIA1 correlacionada ao nível de ativação da Ras: em células Caco2 e HKE3, experimentos de perda de função indicam que o PDIA1 sustenta a produção de superóxido dependente de Nox1; no entanto, em células HCT116, PDIA1 limita a produção de superóxido pela Nox1. Este comportamento da PDIA1 é associado ao aumento da expressão / atividade da Rac1. A transfecção do mutante constitutivamente ativo Rac1G12V em células HKE3 faz com que a PDIA1 se torne restritiva a produção de superóxido dependente de Nox1, paralelamente, em células HCT116 tratadas com inibidor da Rac1, PDIA1 se torna favorável à produção de superóxido. Um screening em importantes vias de sinalização celular em HKE3 mostrou que a perda de função da PDIA1 promove inativação da GSK3? em paralelo à diminuicão da ativacção de Stat3; em HCT116 em estado basal, GSK3beta é inativada enquanto Stat3 está ativa, já o silenciamento da PDIA1 não resulta em nenhum efeito adicional. As implicações funcionais do silenciamento da PDIA1 incluíram uma diminuição da proliferação e migração celular em HKE3, não detectável em HCT116. Além disso, a PDIA1 parece sustentar a transição epitélio-mesenquimal (EMT), uma vez que após o silenciamento da PDIA1, observamos um aumento da expressão da E-caderina em HKE3 e uma diminuição em HCT116. Assim, a superativação da Ras se associa a uma alteração no padrão de regulação da Nox1 pela PDIA1. A supressão do efeito regulador da PDIA1 pela Kras é provavelmente devido a uma ativação sustentada da Rac1. Portanto, PDIA1 pode exercer um papel redox-dependente adaptativo crucial relacionado à progressão tumoral / Protein disulfide isomerases such as PDIA1 have been implicated in cancer progression, but the underlying mechanisms are unclear. We showed previously important PDIA1 effects enabling vascular Nox1 NADPH oxidase expression and associated generation of reactive oxygen species (ROS). Since deregulated ROS production underlies tumor growth, we proposed that PDIA1 acts as an upstream regulatory mechanism of tumor-associated ROS production. We focused on colorectal cancer (CRC) with distinct levels of KRas activation. Our results from RNAseq databanks and direct validation indicate significant increase in PDIA1 expression in CRC with constitutive high (HCT116) vs. moderate (HKE3) or basal (e.g. Caco2) Ras activity. PDIA1 supported Nox1-dependent superoxide production in CRC; however, we observed for the first time a dual effect correlated with Ras level activity: in Caco2 and HKE3 cells, loss-of-function experiments indicate that PDIA1 sustains Nox1-dependent superoxide production; however, in HCT116 cells, PDIA1 restricted Nox1-dependent superoxide production. This PDIA1 behavior in HCT116 is associated with increased Rac1 expression/activity. Transfection of Rac1G12V active mutant into HKE3 cells induced PDIA1 to become restrictive of Nox1-dependent superoxide; accordingly, in HCT116 cells treated with Rac1 inhibitor, PDIA1 became supportive of superoxide production. Screening of cell signaling routes affected by PDIA1 silencing showed induced GSK3beta inactivation and parallel decrease of active Stat3 in HKE3 cells; in baseline HCT116 cells, GSK3beta was inactivated and Stat3 active, whereas PDIA1 silencing had no further effect. Functional implications of PDIA1 silencing included a decrease of cell proliferation and migration in HKE3, not detectable in HCT116 cells. Also, PDIA1 may support epithelial-mesenchymal transition (EMT), since after PDIA1 silencing, E-cadherin expression increased in HKE3 and decreased in HCT116. Thus, Ras overaction associates with a switched in PDIA1 pattern regulation of Nox1. Ras-induced PDIA1 bypass may involve direct Rac1 activation. Therefore, PDIA1 may be a crucial regulator of redox-dependent adaptive processes related to cancer progression
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Dissulfeto isomerase proteica como via integrativa entre estresse oxidativo e resposta a proteínas mal-enoveladas na reparação à lesão vascular / Protein disulfide isomerase as an integrative way between oxidative stress and unfolded protein response during vascular repair to injury

Tanaka, Leonardo Yuji 23 January 2014 (has links)
O remodelamento vascular é um determinante fundamental do lúmen em doenças vasculares, porém os mecanismos envolvidos não estão completamente elucidados. Nós investigamos o papel da chaperona redox residente do retículo endoplasmático Dissulfeto Isomerase Proteica (PDI) e sua fração localizada na superfície celular (peri/epicelular=pecPDI) no calibre e arquitetura vascular durante reparação à lesão. Em artérias ilíacas de coelho submetidas à lesão in vivo, houve importante aumento do mRNA e expressão proteica (~25x aumento 14 dias pós-lesão vs. controle) da PDI. O silenciamento da PDI por siRNA (cultura de órgãos) acentuou o estresse do retículo e apoptose, diferentemente da inibição da pecPDI com anticorpo neutralizante (PDI Ab). Bloqueio in vivo da pecPDI por aplicação de gel perivascular contendo PDI Ab no 12° dia após lesão, com análise após 48 h, promoveu ca.25% redução no calibre vascular analisado por arteriografia e diminuição similar na área total do vaso detectada por tomografia de coerência óptica. Neste processo, não ocorreu alteração no tamanho da neoíntima, indicando assim, que PDI Ab acentuou remodelamento constrictivo. Neutralização da pecPDI promoveu importantes alterações na arquitetura da matriz de colágeno e citoesqueleto, resultando em fibras com orientação invertida e desorganizadas. Diminuição na produção de espécies reativas de oxigênio e óxidos de nitrogênio também ocorreu. Análise de propriedades viscoelásticas nas artérias indicou redução na ductilidade vascular, evidenciada pela menor distância para ruptura. As alterações subcelulares no citoesqueleto observadas in vivo após PDI Ab foram recapituladas em um modelo de estiramento cíclico em células musculares lisas vasculares, com importante redução na formação das fibras de estresse. Em modelo de migração randômica de células musculares lisas, a exposição a PDI Ab reduziu a resiliência de regulação da polaridade. Embora a neutralização da pecPDI não tenha afetado a atividade global de RhoA, ela promoveu alterações no padrão de marcação em resposta ao estiramento, na redistribuição de RhoA na superfície celular e na associação com regiões contendo caveolina. Além disso, em aterosclerose nativa em humanos, a expressão da PDI correlacionou-se inversamente com remodelamento constrictivo. Dessa forma, PDI é fortemente expressa após a lesão e sua fração peri/epicelular remodela a arquitetura da matriz e citoesqueleto, promovendo um efeito anti-remodelamento constrictivo / Whole-vessel remodeling is a critical lumen caliber determinant in vascular disease, but underlying mechanisms are poorly understood. We investigated the role of endoplasmic reticulum chaperone Protein Disulfide Isomerase(PDI) and cell-surface PDI(peri/epicellular=pecPDI) pool in vascular caliber and architecture during vascular repair after injury(AI). After rabbit iliac artery balloon injury, there was marked increase in PDI mRNA and protein (25-fold vs. basal at day 14AI), with increase in both intracellular and pecPDI. Silencing PDI by siRNA (organ culture) induced ER stress augmentation and apoptosis, contrarily to pecPDI neutralization with PDI-antibody(PDI Ab). PecPDI neutralization in vivo with PDIAb-containing perivascular gel from days 12-14AI promoted ca.25% decrease in vascular caliber at arteriography and similar decreases in total vessel circumference at optical coherence tomography, without changing neointima, indicating increased constrictive remodeling. PecPDI neutralization promoted marked changes in collagen and cytoskeleton architecture, with inverted fiber orientation and disorganization. Decreased ROS and nitrogen oxide production also occurred. Viscoelastic artery properties assessment showed decreased ductility, evidenced by decreased distance to rupture. Subcellular cytoskeletal disruption by PDI Ab was recapitulated in vascular smooth muscle cell stretch model, with marked decrease in stress fiber buildup. Also, PDI Ab incubation promoted decreased regulation resilience of vascular smooth muscle migration properties. While pecPDI neutralization did not affect global RhoA activity, there was altered RhoA redistribution to the cell surface and association with caveolin-containing clusters, which mislocalized after stretch. In human coronary atheromas, PDI expression inversely correlated with constrictive remodeling. Thus, strongly-expressed PDI after injury reshapes matrix and cytoskeleton architecture to support an anticonstrictive remodeling effect
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Conception, synthèse et évaluation d’inhibiteurs phosphoanalogues d’aldose-cétose isomérases / Conception, synthesis and evaluation of phosphoanalogues inhibitors of aldose-ketose isomerases

Courtiol-Legourd, Stéphanie 05 April 2013 (has links)
Les aldose-cétose isomérases sont des enzymes catalysant l’isomérisation réversible entre un aldose et un cétose. Nous avons étudiés trois d’entre-elles : les phosphoribose isomérases (RPI), les phosphomannose isomérases (PMI) et les phosphoglucose isomérases (PGI). Ces enzymes interviennent dans différentes voies métaboliques comme la glycolyse, la néoglucogenèse, la voie des pentoses phosphates ou le métabolisme du mannose. Il a été montré qu’elles jouent un rôle important pour assurer la survie et le développement de plusieurs parasites responsables de maladies comme la leishmaniose, la mucoviscidose, la tuberculose, le paludisme ou la maladie du sommeil. Ces enzymes sont donc des cibles thérapeutiques potentielles. Ainsi, les puissants inhibiteurs de ces enzymes peuvent donc être des agents thérapeutiques efficaces pour combattre ces maladies. Les réactions catalysées par ces enzymes impliquent des intermédiaires de haute énergie (IHE) de type 1,2-cis-ènediol(ate). La synthèse d’analogues de ces intermédiaires a permis d’obtenir au laboratoire, les meilleurs inhibiteurs connus de ces enzymes, l’acide 5-phospho-D-arabononohydroxamique (5PAH, meilleur inhibiteur des PMI et PGI) et le 5-phospho-D-ribonate (5PRA, meilleur inhibiteur des RPI). Cependant, ces inhibiteurs possèdent une fonction phosphate facilement hydrolysable en milieu physiologique. Ce qui les rend inactifs in vivo. Au cours de ce travail de thèse, des phosphoanalogues du 5PAH, du 5-phospho-D-ribose (R5P, le substrat des RPI) et du 5PRA possédant une fonction malonate, phosphonate, phosphorothiate, sulfate et sulfonate à la place de la fonction phosphate ont été obtenus par des voies de synthèse multi-étapes faisant intervenir le D-arabinose ou le D-ribose comme produit de départ. Les propriétés inhibitrices de ces composés ont ensuite été déterminées et leur stabilité en milieu physiologique évaluée. Le phosphoanalogue du 5PAH de type malonate, l’acide 5-désoxy-5-dicarboxyméthyl-D-arabinonohydroxamique (5DCAH) est un inhibiteur moyen et stable de la PMI d’Escherichia Coli. Parmi les phosphoanalogues du R5P, les composés de type sulfate et sulfonate, respectivement, le 5-sulfate-D-ribose (5SR) et 5-désoxy-5-sulfonométhyl-D-ribose (5SMR) sont de bons inhibiteurs de trois RPI (la RPI d’épinard, la RPI d’Escherichia Coli et la RPI de Micobacterium tuberculosis). Seul le composé de type sulfonate est stable en milieu physiologique. Le phosphoanalogue de type malonate, le 5-désoxy-5-dicarboxyméthyl-D-ribose (5DCR) est un inhibiteur moyen de ces trois RPI. En revanche, les phosphoanalogues de type phosphorothioate et phosphonate, respectivement, le 5-désoxy-5-phosphorothioate-D-ribose (5PTR) et 5-désoxy-5-phosphonométhyl-D-ribose (5PMR) sont de mauvais inhibiteurs. Le phosphoanalogue de type phosphonate du 5PRA, le 5-désoxy-5-phosphonométhyl-D-ribonate (5PMRA) est un bon inhibiteur de la RPI de Micobacterium tuberculosis. De plus, ce composé est stable en milieu physiologique. Il est en revanche un mauvais inhibiteur de la RPI d’épinard et d’Escherichia Coli. Ces résultats sont particulièrement prometteurs puisque le 5PMRA est à ce jour le meilleur inhibiteur stable et spécifique de la RPI de Micobacterium tuberculosis. / Aldose-ketose isomerases are enzymes which catalyze the interconversion of an aldose and a ketose. We have studied three of them: phosphoribose isomerase (RPI), phosphomannose isomerase (PMI) and phosphoglucose isomerase (PGI). These enzymes play a major role in various metabolic pathways as glycolysis, neoglucogenesis, the pentoses phosphates pathways or the mannose metabolism. It has been shown to have a crucial role for the survival and development of several microorganisms responsible for diseases as the leishmaniose, the cystic fibrosis, the tuberculosis, the malaria or the insomnia. These enzymes are thus potential therapeutic targets. Consequently, strong inhibitors of these enzymes could provide efficient therapeutic tools against these deseases. The reactions catalyzed by these enzymes involve intermediaries of high energy (IHE) of 1,2-cis-enediol(ate) type. The synthesis of analogues of these intermediaries allowed to obtain in the laboratory, the best inhibitors known for these enzymes, the acid 5-phospho-D-arabononohydroxamique (5PAH, the best inhibitor of the PMI and PGI) and the 5-phospho-D-ribonate (5PRA, the best inhibitor of the RPI). However, these inhibitors possess a phosphate group which is easily hydrolysable in physiological environment, what makes them inactive in vivo. During this work of thesis, phosphoanalogues of the 5PAH, the 5-phospho-D-ribose (R5P, the substrate of the RPI) and of the 5PRA possessing a malonate, phosphonate, phosphorothiate, sulphate and sulfonate were obtained by multi-steps synthesis bringing in D-arabinose or D-ribose as starting product. The inhibitive properties of these compounds were then determined and their stability in physiological environment evaluated. The phosphoanalogue of the 5PAH of malonate type, the acid 5-desoxy-5-dicarboxyméthyl-D-arabinonohydroxamique (5DCAH) is a modest and stable inhibitor of the PMI of Escherichia Coli. Among the phosphoanalogues of the R5P, the compounds of sulphate and sulfonate types, respectively, the 5-sulfate-D-ribose (5SR) and 5-desoxy-sulfonomethyl-D-ribose (5SMR), are good inhibitors of three RPI (the RPI of spinach, the RPI of Escherichia Coli and the RPI of Micobacterium tuberculosis). Only the compound of sulfonate type is stable in physiological environment. The phosphoanalogue of malonate type, the 5-desoxy-5-dicarboxymethyl-D-ribose (5DCR) is a modest inhibitor of this three RPI. On the other hand, the phosphoanalogues of phosphorothioate and phosphonate types, respectively, the 5-desoxy-5-phosphorothioate-D-ribose (5PTR) and the 5-desoxy-5-phosphonomethyl-D-ribose (5PMR), are bad inhibitors. The phosphoanalogue of phosphonate type of the 5PRA, the 5-desoxy-5-phosphonomethyl-D-ribonate (5PMRA), is a good inhibitor of the RPI of Micobacterium tuberculosis. Furthermore, this compound is stable in physiological environment. It is on the other hand a bad inhibitor of the RPI of spinach and Escherichia Coli. These results are particularly promising because the 5PMRA is this day the best stable and specific inhibitor of the RPI of Micobacterium tuberculosis.

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