A técnica de PCR pode ser empregada para a detecção e identificação de agentes patogênicos e, tem por isso grande aplicabilidade em estudos de epidemiologia molecular. Particularmente no que se refere às infecções por Leishmania spp., a detecção do seu agente é de suma importância em animais sorologicamente positivos, no caso de inquéritos para a detecção direta em vetores e em animais de vida livre, cujo anti-soro para provas sorodiagnósticas, não são disponíveis. A PCR ainda pode oferecer o recurso de identificação molecular do agente em pesquisa, quando marcadores filogeneticamente informativos são amplificados e seqüenciados. Neste sentido, foi realizado o presente trabalho, cujo objetivo foi avaliar o desempenho analítico e diagnóstico de PCRs baseadas em primers direcionados a marcadores universais para diagnosticar Leishmania spp. localizados em dois genomas da célula parasitária, a saber, kDNA (maxicírculo e minicírculo) e DNA nuclear. Foram avaliadas PCRs baseadas em primers direcionados ao (i) DNA de kinetoplasto (kDNA) minicirculo, ao gene codificador de Citocromo B e Citocromo C Oxidase subunidade II presentes no (ii) kDNA maxicírculo, e ao gene codificador Citicromo C, presente no (iii) DNA nuclear. Pelos resultados infere-se que a PCR direcionada ao kDNA de minicírculo apresentou uma sensibilidade analítica muito superior às PCRs direcionadas ao DNA maxicirculo e nuclear. Pelo menos uma combinação dos primers de cada marcador foi capaz de detectar DNA de todas as espécies da Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz (CLIOC), tornando-os uma ferramenta útil para identificação de espécies de Leishmania spp. A PCR direcionada ao kDNA de minicírculo apresentou uma sensibilidade diagnóstica também muito superior às PCRs direcionadas ao DNA maxicirculo e nuclear. Amostras de baço e medula óssea produzem informações complementares para diagnóstico post-mortem de Leishmania spp. em cães soropositivos. Finalmente, as amostras de aspirado de medula óssea demonstraram ser uma alternativa confirmatória para o diagnóstico laboratorial do agente em animais soropositivos assintomáticos. / The PCR technique can be employed for the detection and identification of pathogens, and therefore has wide application in molecular epidemiology studies. Particularly in relation to infection by Leishmania spp., the detection of its agent is important in seropositive animals, in the case of surveys for direct detection in vectors and in free-living animals, whose anti-serum for serodiagnosis test are not available. PCR can also offer the molecular identification of the agent, when phylogenetically informative markers are amplified and sequenced. In this sense, we performed the present study, whose aim was to evaluate the analytical and diagnostic performance of PCR based on universal primers that target markers to diagnose Leishmania spp located in two distinct genomes of the parasite cell, namely, kDNA (maxicírcle and minicircle) and nuclear DNA. PCRs were evaluated based on primers targeted to the kinetoplastids (i) DNA (kDNA) minicircles, the cytochrome B and cytochrome C oxidase subunit II genes present in the (ii) kDNA maxicircle and the gene encoding Citicromo C, present in (iii) nuclear DNA. Based on the results, the PCR directed to the kDNA minicircle showed an analytical sensitivity much higher than the PCR targeting the kDNA maxicircle and nuclear DNA. At least one combination of primers of each marker was able to detect DNA from all CLIOC - Leishmania collection of Oswald Cruz institute species, which qualifies a useful tool for species identification of Leishmania spp. The PCR targeted to minicircle kDNA also showed to have a diagnostic sensitivity much higher than PCRs directed to kDNA maxicircle and nuclear DNA. Spleen and bone marrow samples produces additional information post-mortem diagnosis of Leishmania spp. on seropositive dogs. Finally, samples of bone marrow aspirate are an alternative for confirmatory laboratory diagnosis of the agent in asymptomatic seropositive animals.

Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-10-20T15:45:49Z No. of bitstreams: 2 Tese - Liliane da Rocha Siriano - 2013.pdf: 1382106 bytes, checksum: d95d1cd146dc5c4ce2277e1d362553fe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-10-20T15:46:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Liliane da Rocha Siriano - 2013.pdf: 1382106 bytes, checksum: d95d1cd146dc5c4ce2277e1d362553fe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-20T15:46:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Liliane da Rocha Siriano - 2013.pdf: 1382106 bytes, checksum: d95d1cd146dc5c4ce2277e1d362553fe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-03-05 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / After more than a century the discovery of Chagas disease, which etiological agent parasite is called Trypanosoma cruzi, there is still much to be revealed about this disease. Polymorphism, how to play, the correlation between strain and the clinical, serological and molecular methods, gene transfer and its clinical consequences, treatment and cure are topics that involve major issues still not completely understood by researchers of this enigmatic disease. The control of donors in blood banks and the reduction of vector transmissions rates caused the congenital transmission to gain greater importance. In this study, monitoring women during pregnancy allowed the accompaniment of the newborn to nine months of age, at which stage it is expected that maternal antibodies have disappeared completely. To know the population of pregnant women infected by Trypanosoma cruzi, in the service of a Maternity Hospital, 1979 records were analyzed at an interval of three years (2010 to 2012). Socioeconomic and demographic profiles, as well as reproductive and serological features were studied. Had positive serology for American trypanosomiasis 3.1% of women (61/1.979) and a few of them reported abortions. Studies have shown that abortion in infected mothers who failed to transmit their infection to the fetus had no greater frequency of miscarriage, prematurity and perinatal mortality, but there was a greater tendency to stillbirth in mothers who transmitted the infection to their children. Thirty-eight infected by T. cruzi pregnant women (two with twin pregnancies) and their fetuses (forty) participated in a survey to verify integration of kDNA minicircle of this protozoan in their children. For serological diagnosis the three conventional techniques of ELISA, IFA and HAI were performed on all samples. All mothers confirmed the positivity of Chagas disease by serology. Two children had positive serological, parasitological and molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi, featuring congenital transmission, in addition to horizontal gene transfer. The polymerase chain reactions (PCR) were performed to identify the presence of nuclear DNA (nDNA) and mitochondrial (kDNA) in the samples studied. The amplifications were performed in triplicate with each primer pair for diagnostic confirmation. Amplification of nuclear material of T. cruzi occurred in 92.1% of mothers and 10% of children (4/40). In 70% of children and 92.1% of the mothers was no amplification of kinetoplast DNA of the parasite. Most integration events of minicircle kDNA occurred through mobile elements, with most of them the LINE-1 retrotransposon. The largest number of integrations was observed on chromosome X. / Após mais de um século da descoberta da doença de Chagas, cujo agente etiológico é o parasito denominado Trypanosoma cruzi, muito ainda há para ser desvendado sobre essa doença. O polimorfismo, a forma de reprodução, a correlação entre cepa e forma clínica, métodos sorológicos e moleculares, transferência gênica e suas consequências clínicas, tratamento e cura são tópicos que envolvem grandes questionamentos ainda não totalmente elucidados pelos pesquisadores desta enigmática doença. O controle de doadores em bancos de sangue e a diminuição nos índices de transmissão vetorial fizeram com que a transmissão congênita ganhasse uma maior importância. No presente estudo, o monitoramento das mulheres durante a gestação possibilitou o acompanhamento do recém-nascido até os nove meses de idade, fase na qual se espera que os anticorpos maternos tenham desaparecido por completo. Para se conhecer a população de gestantes infectadas por Trypanosoma cruzi, no serviço da Maternidade de um Hospital Universitário, 1.979 prontuários foram analisados num intervalo de três anos (2010 a 2012). Perfis socioeconômicos e demográficos, assim como as características reprodutivas e sorológicas foram estudados. Tiveram sorologia positiva para Tripanossomíase Americana 3,1% das mulheres (61/1.979) e poucas relataram aborto. Estudos sobre o aborto demonstraram que em mães infectadas que não transmitiram sua infecção ao feto não houve maior frequência de aborto, prematuridade e mortalidade perinatal, porém, houve uma maior tendência à natimortalidade nas mães que transmitiram a infecção aos seus filhos. Trinta e oito gestantes infectadas por T. cruzi (duas com gestações gemelares) e seus conceptos (quarenta) participaram de uma pesquisa para verificar a integração de minicírculos de kDNA deste protozoário em seus filhos. Para o diagnóstico sorológico as três técnicas convencionais de ELISA, IFI e HAI foram realizadas em todas as amostras. Todas as mães confirmaram a positividade da doença de Chagas pela sorologia. Duas crianças tiveram diagnóstico sorológico, parasitológico e molecular positivos para Trypanosoma cruzi, caracterizando a transmissão congênita, além da transferência gênica horizontal. As reações de polimerização em cadeia (PCR) foram realizadas visando identificar a presença de DNA nuclear (nDNA) e mitocondrial (kDNA) nas amostras estudadas. As amplificações foram realizadas em triplicata com cada par de primers, para confirmação diagnóstica. A amplificação do material nuclear de T. cruzi ocorreu em 92,1% das mães e em 10% das crianças (4/40). Em 70% das crianças e em 92,1% das mães houve amplificação do DNA do cinetoplasto do parasito. A maior parte dos eventos de integração de minicírculos de kDNA ocorreu por meio de elementos móveis, sendo a maioria deles o retrotransposon LINE-1. O maior número de integrações foi observado no cromossomo X.

A técnica de PCR pode ser empregada para a detecção e identificação de agentes patogênicos e, tem por isso grande aplicabilidade em estudos de epidemiologia molecular. Particularmente no que se refere às infecções por Leishmania spp., a detecção do seu agente é de suma importância em animais sorologicamente positivos, no caso de inquéritos para a detecção direta em vetores e em animais de vida livre, cujo anti-soro para provas sorodiagnósticas, não são disponíveis. A PCR ainda pode oferecer o recurso de identificação molecular do agente em pesquisa, quando marcadores filogeneticamente informativos são amplificados e seqüenciados. Neste sentido, foi realizado o presente trabalho, cujo objetivo foi avaliar o desempenho analítico e diagnóstico de PCRs baseadas em primers direcionados a marcadores universais para diagnosticar Leishmania spp. localizados em dois genomas da célula parasitária, a saber, kDNA (maxicírculo e minicírculo) e DNA nuclear. Foram avaliadas PCRs baseadas em primers direcionados ao (i) DNA de kinetoplasto (kDNA) minicirculo, ao gene codificador de Citocromo B e Citocromo C Oxidase subunidade II presentes no (ii) kDNA maxicírculo, e ao gene codificador Citicromo C, presente no (iii) DNA nuclear. Pelos resultados infere-se que a PCR direcionada ao kDNA de minicírculo apresentou uma sensibilidade analítica muito superior às PCRs direcionadas ao DNA maxicirculo e nuclear. Pelo menos uma combinação dos primers de cada marcador foi capaz de detectar DNA de todas as espécies da Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz (CLIOC), tornando-os uma ferramenta útil para identificação de espécies de Leishmania spp. A PCR direcionada ao kDNA de minicírculo apresentou uma sensibilidade diagnóstica também muito superior às PCRs direcionadas ao DNA maxicirculo e nuclear. Amostras de baço e medula óssea produzem informações complementares para diagnóstico post-mortem de Leishmania spp. em cães soropositivos. Finalmente, as amostras de aspirado de medula óssea demonstraram ser uma alternativa confirmatória para o diagnóstico laboratorial do agente em animais soropositivos assintomáticos. / The PCR technique can be employed for the detection and identification of pathogens, and therefore has wide application in molecular epidemiology studies. Particularly in relation to infection by Leishmania spp., the detection of its agent is important in seropositive animals, in the case of surveys for direct detection in vectors and in free-living animals, whose anti-serum for serodiagnosis test are not available. PCR can also offer the molecular identification of the agent, when phylogenetically informative markers are amplified and sequenced. In this sense, we performed the present study, whose aim was to evaluate the analytical and diagnostic performance of PCR based on universal primers that target markers to diagnose Leishmania spp located in two distinct genomes of the parasite cell, namely, kDNA (maxicírcle and minicircle) and nuclear DNA. PCRs were evaluated based on primers targeted to the kinetoplastids (i) DNA (kDNA) minicircles, the cytochrome B and cytochrome C oxidase subunit II genes present in the (ii) kDNA maxicircle and the gene encoding Citicromo C, present in (iii) nuclear DNA. Based on the results, the PCR directed to the kDNA minicircle showed an analytical sensitivity much higher than the PCR targeting the kDNA maxicircle and nuclear DNA. At least one combination of primers of each marker was able to detect DNA from all CLIOC - Leishmania collection of Oswald Cruz institute species, which qualifies a useful tool for species identification of Leishmania spp. The PCR targeted to minicircle kDNA also showed to have a diagnostic sensitivity much higher than PCRs directed to kDNA maxicircle and nuclear DNA. Spleen and bone marrow samples produces additional information post-mortem diagnosis of Leishmania spp. on seropositive dogs. Finally, samples of bone marrow aspirate are an alternative for confirmatory laboratory diagnosis of the agent in asymptomatic seropositive animals.

Atualmente, um dos grandes problemas relacionados à leishmaniose é a falta de um diagnóstico específico capaz de indentificar e diferenciar espécies de Leishmania com rapidez e precisão. O desenvolvimento de métodos moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), possibilita que o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) possa se tornar mais preciso e, eventualmente, de fácil execução, uma vez que limitações importantes relacionadas à sensibilidade e especificidade desta técnica ainda são descritas, principalmente quando se utiliza amostras clínicas. Com o intuito de melhor avaliar a eficiência da PCR para o diagnóstico da LVC, foram selecionadas diferentes amostras clínicas (baço, aspirado de linfonodo, pele sem lesão, pele com lesão e amostras de sangue) de 26 cães com sorologia positiva para leishmaniose submetidos à eutanásia pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica do município de Embu das Artes - SP. Realizamos uma análise comparativa entre a PCR-RFLP kDNA-HaeIII e PCR-RFLP hsp70-BsaJI/EcoRII com dois métodos diagnósticos tradicionais (parasitológico direto, e cultura in vitro). Amostras clínicas de 28 cães com sorologia negativa para LVC da mesma região foram utilizadas como controle negativo das reações. Notamos que a PCR aprensentou maior sensibilidade em todas as amostras clínicas testadas quando comparadas aos métodos tradicionais. Os resultados apontam que a PCR-RFLP kDNA-HaeIII é a mais eficiente para o diagnóstico da LVC, com um índice de 96,15% de positividade nas amostras de pele com lesão. Quanto à discriminação da espécie de Leishmania envolvida na infecção, nossos resultados de PCR-RFLP kDNA-HaeIII indicam Leishmania chagasi-infantum como o agente etiológico envolvido na infecção e transmissão canina na cidade de Embu das Artes. Por outro lado, a análise da PCR em Tempo Real (qPCR), mostrou que algumas amostras de sangue não apresentavam o padrão associado à Leishmania chagasi-infantum, podendo indicar uma co-infecção com outras parasitoses caninas. Nosso grupo também acompanhou 184 crianças de 4 a 10 anos de idade (população de risco) residentes da mesma região de transmissão autóctone da doença canina, como também foi realizado um levantamento das espécies de flebotomíneos da região (pela SUCEN). Até o momento, não foi encontrado nenhum caso da doença humana, nem a principal espécie transmissora do parasito (Lutzomiya longipalpis). Acreditamos que esses resultados possam contribuir significativamente para aprimorar o diagnóstico e a identificação das espécies Leishmania na LVC. / Currently, one of the major problems related to leishmaniasis is the lack of a specific diagnosis capable of identifying and differentiating Leishmania species quickly and accurately. The development of molecular methods such as Polymerase Chain Reaction ( PCR ) allows the diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) to become more accurate and eventually, easy to perform, since that important limitations in terms of sensitivity and specificity of this technique are being described especially when using clinical samples. In order to better evaluate the efficiency of PCR for the diagnosis of CVL, we selected different clinical samples (spleen, lymph node aspirate, skin with and without lesions and blood samples) from 26 dogs with positive serology for leishmaniasis submitted to euthanasia by the Agency of Epidemiological Surveillance of Embu das Artes - SP. Therefore, we performed a comparative analysis between the kDNAPCR-RFLP HaeIII and hsp70PCR-RFLP BsaJI/EcoRII with two traditional diagnostic methods (direct parasitological test, and in vitro culture). Additionally, clinical samples from 28 dogs with negative serology for CVL in the same region were used as negative reactions control. We noted that the PCR showed greater sensitivity in all clinical samples tested when compared with traditional methods. The results indicate that the kDNAPCR-RFLP HaeIII is the most efficient test for the diagnosis of CVL, with a positivity index of 96.15 % in skin lesions samples. Related to the discrimination of the Leishmania species involved in the infection, our results of kDNAPCR-RFLP HaeIII indicate Leishmania infantum chagasi as the agent involved in canine infection in Embu das Artes city. Moreover, the analysis of real-time PCR (qPCR) showed that some blood samples has not showed the same pattern associated with Leishmania infantum chagasi suggesting a possible co-infection with other canine parasite. Our group also followed 184 children between 4 to 10 years old (risk population) living in the same region of autochthonous transmission of canine disease, as well a survey was conducted on the sandfly species in the region (by SUCEN). So far, we found no human infection, nor the main species involved in the transmission of the parasite (Lutzomyia longipalpis). We believe that these results can significantly contribute to the improvement of the diagnosis and identification of Leishmania species involved in the CVL worldwide.

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-09-26T19:33:26Z No. of bitstreams: 1 DissJPPS.pdf: 2939420 bytes, checksum: 44366c4d259a65ba75e54d36b01b8483 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:57:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJPPS.pdf: 2939420 bytes, checksum: 44366c4d259a65ba75e54d36b01b8483 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:57:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJPPS.pdf: 2939420 bytes, checksum: 44366c4d259a65ba75e54d36b01b8483 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T19:57:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissJPPS.pdf: 2939420 bytes, checksum: 44366c4d259a65ba75e54d36b01b8483 (MD5) Previous issue date: 2016-03-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Knowledge about horizontal gene transfer has been proposed even before the determination of the molecular structure of DNA. It has been experimentally shown that micro-homologies rich in adenine and cytosine mediates the integration of Trypanosoma cruzi’s kDNA minicircle, in the vertebrate genome. After human genome sequencing, the genome characterization of different organisms has been one of the main driving forces of science, providing a quantity of biological data for modern biomedical research, unprecedented in the history of science. However, even though traditional DNA mapping algorithms are highly accurate, they operate at a much lower rate than that needed for the next generation sequencers to accumulate new data. This great asymmetry between data generation and analysis capability requires the rapid evolution of mapping and reading algorithms so that this large volume of information can be worked through targeted searches. Thus, this work proposes an efficient, fast and easy way to search and locate multiple signatures of indicators that allow exogenous kDNA integration in the human genome, by creating a set of scripts for in silico analysis adapted to large files sequences. Three scripts based in R language were developed: to permute the elements (nucleic acids or amino acids codes); for search, grouping and plotting matches in genome; and for counting total matches and chromosomal window. All adenine and cytosine signatures were properly identified in the human genome, but no point more susceptible to T. cruzi kDNA integration was identified. With the obtained data, a genetic map was created, listing all matchings in each cytogenetic band, but it was not possible to identify which chromosome was more prone to mutations, since the bigger the chromosome is, the higher the quantity of matches are. / Com o sequenciamento do genoma humano e tantas outras espécies, abre-se agora uma nova janela de oportunidades analíticas. Podemos pensar em fazer buscas orientadas dentro dessa massa enorme de dados publicados em bancos de dados biológicos. Tendo isso em foco, buscamos estruturar uma forma automatizada de busca dentro do genoma humano, pela qual pudéssemos inferir sobre os sítios mais prováveis de integração de DNA exógeno. Para isso utilizamos como modelo os trabalhos que indicam que a doença de Chagas é produzida pela introgressão do kDNA de Trypanosoma cruzi no genoma hospedeiro, por meio de herança genética horizontal. Já foi demonstrado experimentalmente que micro-homologias ricas em adenina e citosina medeiam as integrações de minicírculos de kDNA do T. cruzi, no genoma de vertebrados. Deste modo, o presente trabalho propõe uma maneira eficiente, fácil e rápida para a busca e localização de múltiplas assinaturas dos sinalizadores que propiciam a introgressão do kDNA exógeno no genoma humano, através da criação de um conjunto de scripts para análises in silico, adaptados a grandes arquivos de sequências. Foram desenvolvidos três scripts, baseados na linguagem R: para permutação de elementos (ácidos nucleicos ou aminoácidos); para busca, agrupamento e plotagem das correspondências em genoma; e para contagem total de correspondências e contagem por janela cromossômica. Todas as assinaturas compostas por adenina e citosina (motivos CA’s) foram devidamente identificadas no genoma humano, porém não foi identificado nenhum ponto mais suscetível à integração do kDNA de T. cruzi. Com os dados obtidos, um mapa genético foi criado, listando as correspondências em cada banda citogenética, porém não foi possível identificar qual cromossomo possui maior propensão à mutações, já que quanto maior o cromossomo, maior é a quantidade de correspondências presentes.

Atualmente, um dos grandes problemas relacionados à leishmaniose é a falta de um diagnóstico específico capaz de indentificar e diferenciar espécies de Leishmania com rapidez e precisão. O desenvolvimento de métodos moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), possibilita que o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) possa se tornar mais preciso e, eventualmente, de fácil execução, uma vez que limitações importantes relacionadas à sensibilidade e especificidade desta técnica ainda são descritas, principalmente quando se utiliza amostras clínicas. Com o intuito de melhor avaliar a eficiência da PCR para o diagnóstico da LVC, foram selecionadas diferentes amostras clínicas (baço, aspirado de linfonodo, pele sem lesão, pele com lesão e amostras de sangue) de 26 cães com sorologia positiva para leishmaniose submetidos à eutanásia pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica do município de Embu das Artes - SP. Realizamos uma análise comparativa entre a PCR-RFLP kDNA-HaeIII e PCR-RFLP hsp70-BsaJI/EcoRII com dois métodos diagnósticos tradicionais (parasitológico direto, e cultura in vitro). Amostras clínicas de 28 cães com sorologia negativa para LVC da mesma região foram utilizadas como controle negativo das reações. Notamos que a PCR aprensentou maior sensibilidade em todas as amostras clínicas testadas quando comparadas aos métodos tradicionais. Os resultados apontam que a PCR-RFLP kDNA-HaeIII é a mais eficiente para o diagnóstico da LVC, com um índice de 96,15% de positividade nas amostras de pele com lesão. Quanto à discriminação da espécie de Leishmania envolvida na infecção, nossos resultados de PCR-RFLP kDNA-HaeIII indicam Leishmania chagasi-infantum como o agente etiológico envolvido na infecção e transmissão canina na cidade de Embu das Artes. Por outro lado, a análise da PCR em Tempo Real (qPCR), mostrou que algumas amostras de sangue não apresentavam o padrão associado à Leishmania chagasi-infantum, podendo indicar uma co-infecção com outras parasitoses caninas. Nosso grupo também acompanhou 184 crianças de 4 a 10 anos de idade (população de risco) residentes da mesma região de transmissão autóctone da doença canina, como também foi realizado um levantamento das espécies de flebotomíneos da região (pela SUCEN). Até o momento, não foi encontrado nenhum caso da doença humana, nem a principal espécie transmissora do parasito (Lutzomiya longipalpis). Acreditamos que esses resultados possam contribuir significativamente para aprimorar o diagnóstico e a identificação das espécies Leishmania na LVC. / Currently, one of the major problems related to leishmaniasis is the lack of a specific diagnosis capable of identifying and differentiating Leishmania species quickly and accurately. The development of molecular methods such as Polymerase Chain Reaction ( PCR ) allows the diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) to become more accurate and eventually, easy to perform, since that important limitations in terms of sensitivity and specificity of this technique are being described especially when using clinical samples. In order to better evaluate the efficiency of PCR for the diagnosis of CVL, we selected different clinical samples (spleen, lymph node aspirate, skin with and without lesions and blood samples) from 26 dogs with positive serology for leishmaniasis submitted to euthanasia by the Agency of Epidemiological Surveillance of Embu das Artes - SP. Therefore, we performed a comparative analysis between the kDNAPCR-RFLP HaeIII and hsp70PCR-RFLP BsaJI/EcoRII with two traditional diagnostic methods (direct parasitological test, and in vitro culture). Additionally, clinical samples from 28 dogs with negative serology for CVL in the same region were used as negative reactions control. We noted that the PCR showed greater sensitivity in all clinical samples tested when compared with traditional methods. The results indicate that the kDNAPCR-RFLP HaeIII is the most efficient test for the diagnosis of CVL, with a positivity index of 96.15 % in skin lesions samples. Related to the discrimination of the Leishmania species involved in the infection, our results of kDNAPCR-RFLP HaeIII indicate Leishmania infantum chagasi as the agent involved in canine infection in Embu das Artes city. Moreover, the analysis of real-time PCR (qPCR) showed that some blood samples has not showed the same pattern associated with Leishmania infantum chagasi suggesting a possible co-infection with other canine parasite. Our group also followed 184 children between 4 to 10 years old (risk population) living in the same region of autochthonous transmission of canine disease, as well a survey was conducted on the sandfly species in the region (by SUCEN). So far, we found no human infection, nor the main species involved in the transmission of the parasite (Lutzomyia longipalpis). We believe that these results can significantly contribute to the improvement of the diagnosis and identification of Leishmania species involved in the CVL worldwide.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-18T20:17:52Z No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-18T20:17:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é endêmica na América Latina, afetando mais de 15 milhões de pessoas. Como seu tratamento apresenta eficácia limitada e considerável toxicidade novas drogas são necessárias. Neste contexto, com a colaboração de grupos de química medicinal, nosso objetivo é a investigação da atividade tripanocida, seletividade, alvos celulares e mecanismos de ação de diamidinas aromáticas (DAs) e análogos. Inicialmente avaliamos o efeito tripanocida de onze DAs sobre as formas tripomastigotas e amastigotas intracelulares, assim como sua toxicidade para células de mamíferos e localização intracelular no parasito. Entre estes onze compostos, 2, 5 e 7 foram os mais ativos, com valores de IC50 na faixa micromolar e um alto índice de seletividade sobre as duas formas de T. cruzi. Através de microscopia de fluorescência (MF) foi possível localizar todos os compostos em organelas ricas em DNA, núcleo e mitocôndria (kDNA) e a análise ultraestrutural utilizando os compostos 5 e 7 revelou que estes compostos levam a danos mitocondriais, incluindo desorganização do kDNA em formas tripomastigotas. O acúmulo das diamidinas foi maior no kDNA do que no núcleo, porém tal acúmulo não está correlacionado a uma maior atividade tripanocida. A seguir, visando um melhor entendimento do mecanismo de ação de diamidinas e análogos, investigamos uma possível correlação entre as propriedades de ligação ao kDNA de treze compostos com a atividade tripanocida, através de estudos de desnaturação térmica (Tm) e dicroísmo circular (DiC). Nossos resultados mostram tanto com kDNA purificado de epimastigotas como com uma sequência conservada de 22-mer presente em minicírculos de T. cruzi, que a forte interação de amidinas ao kDNA não é o fator determinante para desencadear sua atividade tripanocida. Nosso próximo passo foi a avaliação de alterações topológicas induzidas por dez compostos aromáticos sobre o kDNA de T. cruzi através de alteração da mobilidade em gel e MF. Os estudos eletroforéticos foram conduzidos pela incubação de fragmentos de kDNA, obtidos pela digestão com as endonucleases EcoRI e CvQI, com os compostos por análise em gel de poliacrilamida. As diamidinas DB889 e DB185 induziram consideráveis alterações na mobilidade dos fragmentos. Além disso, incubando a rede intacta e purificada de kDNA com a DB75 e monitorando o efeito por MF, obervarmos a capacidade desta DA de induzir um grande aumento da área da rede. Em resumo, nossos resultados revelam que diamidinas e congêneres são capazes de induzir profundas alterações na topologia do kDNA do T. cruzi sugerindo que esta estrutura pode ser um dos possíveis alvos destes compostos. Entretanto, a localização preferencial dos compostos no kDNA, assim como sua afinidade à esta estrutura e capacidade de alterar a mobilidade dos fragmentos em géis de poliacrilamida não está correlacionada com sua atividade tripanocida. Estes dados sugerem fortemente que outros fatores podem estar envolvidos no mecanismo de ação destes compostos, operando de modo primário ou secundário a interação composto:kDNA. Outros estudos serão necessários para melhor identificar os mecanismos envolvidos na ação destes compostos, visando contribuir para o desenho racional de compostos líderes para o tratamento da doença de Chagas. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, is endemic in Latin America, affecting more de 15 million people. Due to the limited efficacy and considerable toxicity, the therapy for Chagas disease is far from being considerable ideal and thus alternative drugs are urgently needed. In this context, with the collaborations of medicinal chemistry groups, our aim was to investigate the trypanocidal activity, selectivity, cellular targets and mechanisms of action of aromatic diamidines (ADs) and analogues. First, we tested the trypanocidal effect of eleven ADs upon intracellular amastigotes and trypomastigotes, their toxicity towards mammalian cells and their sub-cellular localization. Compounds 2, 5 and 7 were the most active, presenting IC50 values on the micromolar range and displaying high selectivity indexes for both T. cruzi forms. Using fluorescence microscopy (FM), all the compounds were localized in organelles rich in DNA, nucleus and mitochondrion (kDNA) and in bloodstream forms treated with the compounds 5 and 7 we observed ultrastructural damages on mitochondrial organelle, including kDNA disorganization. The accumulation of the diamidines was higher in the kDNA than in the nucleus, but such accumulation could not be correlated with a higher trypanocidal activity. Next, aiming to better understand the mechanism of action of diamidines and analogues, we investigated the possible correlation between kDNA binding properties of thirteen compounds with their anti-T. cruzi effect, through thermal denaturation (T m) and circular dichroism (CiD) studies. Our data demonstrated using the purified kDNA of epimastigotes or a conserved synthetic parasite sequence of 22-mer present in T. cruzi minicircles, that the strong interaction of the amidines with the kDNA is not a determinant factor to the triggering of the trypanocidal activity. Our next step was the evaluation of topological changes induced by ten aromatic compounds on T. cruzi kDNA, through gel mobility shifts and FM. The eletrophoretic studies were conducted by the incubation of kDNA fragments obtained by digestion with the endonucleases EcoRI e CvQI with the compounds and analysis by poliacrylamide gel. The diamidines DB889 and DB185 induced substantial mobility shifts in the fragmented bands. Additionally, by FM of whole kDNA network incubated with DB75 we observed the ability of this diamidine to cause a striking expansion of the kDNA network area. Taken together our results suggest that diamidines and related compounds provoke profound alterations in the normal topology of T. cruzi kDNA suggesting that this structure may represent one of the potential targets of these compounds. However, the compound preferential accumulation in kDNA, as well as their affinity and capability of inducing topological changes in that structure is not correlated with their anti-T. cruzi activity. These findings strongly suggest that other molecular mechanisms may be also operating primarily or secondarily to the drug:KDNA interaction. Further studies are needed to better identify the mechanisms involved in the activity of this class of chemical, aiming to contribute to the rational design of lead compounds for the treatment of Chagas disease .

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-28T16:26:07Z No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / A doença de Chagas é considerada uma das principais endemias da América Latina, existindo cerca de oito milhões de pessoas infectadas com o Trypanosoma cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. A associação entre a transferência gênica lateral de minicírculos de kDNA do T. cruzi para o genoma hospedeiro e o surgimento de manifestações clínicas da doença de Chagas está descrita na literatura. Entretanto os mecanismos que levariam ao desenvolvimento das reações autoimunes ainda precisam ser elucidados. No presente estudo, desenvolveu-se um protocolo de PCR quantitativa (qPCR) que permitiu a quantificação das integrações de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro, confirmando, dessa forma, a transferência dos minicírculos ao genoma de célula hospedeira. Verificou-se que há um acúmulo das integrações ao longo do tempo em células J774.A1. À medida que ocorre a inserção dos minicírculos de kDNA no genoma hospedeiro, observa-se alteração da temperatura de dissociação das amostras, indicando mudança na composição ou no tamanho dos fragmentos integrados. De fato, a clonagem e o sequenciamento dos amplicons demonstrou o truncamento da região variável do kDNA. O Benznidazol é capaz de eliminar a infecção, porém não previne a integração e o acúmulo das sequências de kDNA. Já o AZT, droga inibidora de retrotransposição, mostra-se efetivo no controle dos eventos de integração. Os experimentos in vivo corroboraram os achados in vitro, demonstrando uma maior quantidade de integrações em animais que se encontravam na fase crônica da doença de Chagas. Outros estudos são necessários para determinar o papel do acúmulo de integrações de kDNA e a severidade das manifestações clínicas. Entretanto, o real significado de tais mutações não fica restrito à doença de Chagas, mas, sim, estende-se ao longo do processo da evolução, em que a aquisição de DNA exógeno ajudaria a impulsionar um fluxo genético introdutor de complexidade crescente às espécies. / Chagas' disease is considered a major endemic disease in Latin America, and there are approximately eight million people infected with Trypanosoma cruzi worldwide, especially in Latin America. The association between lateral gene transfer of T. cruzi kDNA minicircle into host genome and the onset of clinical manifestations of Chagas disease is described in the literature. However, the mechanisms that lead to autoimmune reactions are to need to be elucidated. In the present study, we have developed a protocol quantitative PCR (qPCR), which permitted quantitation of kDNA minicircle integrations T. cruzi into the host genome, confirming thus the transfer of the minicircle into the genome of the host J774.A1 cells. It was found that there is an accumulation of integrations over time J774.A1 cells. As kDNA insertions occur, there is change in melting curve, indicating change in composition or size of the integrated fragments. In fact, cloning and sequencing of amplicons showed loss of nucleotides in kDNA variable region. Benznidazole is able to eliminate the infection, but does not prevent the integration and accumulation of kDNA sequences. AZT, an inhibitory drug for retro transposition, shows to be effective in controlling integration events. In vivo experiments confirmed in vitro findings, showing a greater amount of integrations in animals that were in the chronic phase of Chagas disease. Further studies are needed to determine the role of kDNA accumulation in severity of clinical manifestations. However, the real significance of such date is not restricted to Chagas disease, but rather extends throughout the evolutionary process, where the acquisition of exogenous DNA would help boost a genetic flow introducing higher complexity to species.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6315_1.pdf: 1356784 bytes, checksum: ed82e0e5c10b92208b91c8e8a95cb0f7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / A investigação da possibilidade de diagnóstico para a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), a partir de sangue venoso e através da Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction = PCR), foi realizada em duas amostras de populações de área endêmica do Estado de Pernambuco, Brasil. Foi coletado um total de 119 amostras de sangue venoso, sendo 63 do município do Cabo de Santo Agostinho e 56 do município de Triunfo. Inicialmente, realizaram-se alguns experimentos para padronização da técnica de PCR, e os primers escolhidos amplificaram o fragmento de 750 pares de bases pertencente ao minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) da Leishmania Viannia braziliensis, espécie identificada com esta patologia em Pernambuco. Os resultados revelaram 48,7% de indivíduos positivos para a PCR, dos quais 31% tinham sido tratados e considerados clinicamente curados por apresentarem a lesão cicatrizada. Esses achados demonstram que: a) o sangue venoso pode ser utilizado como ferramenta para diagnóstico; b) a ausência de lesão nem sempre corresponde a uma PCR negativa; c) a existência de DNA circulante de parasita em indivíduos tratados, chama atenção para a possível presença do mesmo e conseqüente risco de recidiva; d) o tratamento preconizado não parece ser capaz de eliminar completamente os parasitas

Trypanosoma brucei is the causative agent of Human African Trypanosomiasis (HAT), also known as African sleeping sickness. T. brucei is unique in several ways that distinguish this organism from other eukaryotes. One of the unique features of T. brucei is the organism’s mitochondrial DNA, which is organized in a complex structure called kinetoplast DNA (kDNA). Since kDNA is unique to the kinetoplastids, kDNA may serve as a good drug target against T. brucei. Previews studies have shown that kDNA has 4 different family A mitochondrial DNA polymerases. Three of these mitochondrial DNA polymerases (POLIB, POLIC, and POLID) are essential components of kDNA synthesis and replication. POLID and POLIC dynamically localize throughout the cell cycle. POLID is found dispersed in the matrix before the kDNA has undergone replication and is re-localized at the antipodal sites when the kDNA is dividing. POLIC is found in the kinetoflagellar zone (KFZ) at low concentrations when the kDNA is not replicating and relocalizes to the antipodal sites when dividing. Based on the dynamic localization of these two DNA polymerases, we hypothesize that POLIB undergoes dynamic localization at some point during the cell cycle stage. Here, a POLIB/PTP single expressor cell line was analyzed by immunofluorescence microscopy in an unsynchronized population. We characterized the localization pattern of POLIB-PTP at different cell cycle stages and found different localization patterns throughout cell cycle. Cells at 1N1K (the majority of cell in an unsynchronized population) have single foci, but at 1N1Kdiv two different patterns are mainly observed, diffuse and segregated. When the kDNAs are separated POLIB-PTP is again seen as a distinct foci in each kDNA. By doing TdT labeling and a quantitative analysis, we found that at early stages of minicircles replication POLIB-PTP start relocalizing to the kDNA disk with a diffuse pattern being the main. By the time the minicircles are being reattached in the disk (late TdT), POLIB is seen in the disk as a bilobe shape.