O melanoma é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à sua tendência de formar metástases. Esse tipo tumoral apresenta deleção de CDKN2A e amplificação de HDM2 em aproximadamente 50 % dos casos, mas apenas 10 % apresentam mutação em p53. Aproveitando-se do fato de a maioria dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, uma proteína supressora tumoral e fator de transcrição, utilizamos vetores adenovirais nos quais a expressão dos transgenes é controlada pelo p53 endógeno. Estes vetores foram aperfeiçoados com a inclusão de uma modificação na proteína fibra que permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células. Utilizando estes vetores, nosso laboratório mostrou que o tratamento combinado, mas não individual, de vetores virais codificando p19Arf e IFNbeta (interferon-beta) induziu elevados níveis de morte em células de melanoma de camundongo, B16F10. Assim, iniciamos novos estudos que têm como alvo explorar os mecanismos de morte celular e identificar genes críticos cuja expressão é alterada frente o tratamento combinado e que agem como mediadores da resposta celular para a estratégia de transferência gênica. Com este projeto, transferimos a combinação gênica (p19Arf + IFNbeta) para células B16F10 e analisamos o tipo de morte celular induzido. Assim, detectamos o aumento da presença de marcadores de morte celular conhecidos, tais como de apoptose (atividade de caspases e exposição de fosfatidilserina) e de necroptose (expressão de RIPK3 e TNFR1), e a diminuição de um marcador de autofagia (expressão de LC3-II). Além disso, mostramos que a detecção dos três marcadores clássicos de morte imunogênica (ATP, calreticulina e HMGB1) foi possível somente quando as células B16F10 foram tratadas com a combinacao de p19Arf + IFNbeta. Por fim, a avaliação do perfil de expressão gênica através de microarray de cDNA das células B16F10 tratadas com p19Arf + IFNbeta revelou expressão diferenciada de 1054 genes em comparação com células que receberam apenas somente um ou outro transgene. Em seguida, a expressão dos genes Nr3c1, RanBP9, Sin3A, Wdr46, FoxO1, Phlda3 e tp73 foi validada por qPCR e estudos funcionais foram iniciados para revelar a participação destes na resposta celular. Dessa forma, desvendamos importantes aspectos da resposta de células B16F10 frente ao tratamento com p19Arf e IFNbeta / Melanoma is a form of cancer with a high death rate due, in part, to its tendency to generate metastasis. These tumors carry deletion of CDKN2A and amplification of HDM2 in nearly 50 % of cases, but only 10 % have mutations in p53. Taking advantage of the fact that most melanoma cases retain wild type p53, a transcription factor and tumor suppressor protein, we used adenoviral vectors in which transgene expression is controlled by endogenous p53. These vectors were improved with a modification of the fiber protein that allows efficient transduction of a broad spectrum of cells. Using these vectors, our laboratory showed that the combined treatment with viral vectors encoding p19Arf and IFNbeta (interferon-beta) induced high levels of B16F10 (mouse melanoma) cell death, but not when treated with these vectors individually. Thus, we initiated studies to explore the mechanisms of cell death and to identify critical genes involved in the response of B16F10 cells to treatment with p19Arf + IFNbeta. Here, we transferred p19Arf + IFNbeta genes to B16F10 cells and analyzed the type of cell death induced. In this regard, we detected an increase of cell death markers, such as apoptosis (caspase activity and exposure of phosphatidylserine) and necroptosis (RIPK3 and TNFR1 expression) and a decrease of an autophagy marker (LC3-II expression). Furthermore, we showed that the detection of three classic immunogenic cell death markers (ATP, calreticulin and HMGB1) was possible only when B16F10 cells were treated with p19Arf + IFNbeta combination. Lastly, assessment of gene expression profile using cDNA microarray analysis of B16F10 cells treated with p19Arf + IFNbeta revealed differential expression of 1054 genes compared to cells that received only one of the transgenes. Expression of Nr3c1, RanBP9, Sin3a, Wdr46, FoxO1, Phlda3 and TP73 genes was validated by qPCR and functional studies were started to reveal participation of these genes in the cellular response. Thus, we exposed important aspects of the B16F10 cellular response to treatment with p19Arf and IFNbeta

Non-small-cell lung cancer (NSCLC) accounts for 80–85% of all lung cancers and is associated with significant mortality. As epidermal-growth-factor receptor (EGFR) is over-expressed in 80-90% of NSCLC, its inhibition via EGFR-Tyrosine Kinase inhibitors (EGFR-TKIs) is a main therapeutic strategy. However, patients with mutations in KRAS are resistant to EGFR-TKIs. A study in mutant KRAS-driven lung cancer in transgenic mice showed that tumor growth was dependent on the activity of focal adhesion kinase (FAK). Therefore, we hypothesized that KRAS-mutant NSCLC will be sensitive to FAK-TKIs and, given known FAK-EGFR cross-talk, FAK inhibition will sensitize KRAS-mutant NSCLC to EGFR-TKIs. We performed cell viability assays of WT versus mutant KRAS NSCLC cell lines following treatment with FAK-TKI alone or in combination with a clinically relevant EGFR-TKI. We found that KRAS-mutant cells were more sensitive to FAK-TKI than KRAS-WT NSCLC. In addition, we found that the combination treatment including FAK and EGFR TKIs resulted in reduced tumor cell viability as compared to treatment with either drug alone. This enhanced anti-tumor response could be due to FAK-TKI’s ability to down-regulate EGFR downstream targets. Our preliminary data suggests that in KRAS-mutant cells the drug combination appears to more effectively inhibit Akt activity than single drug treatment alone. This suggests an enhanced ability to impair cell survival following treatment with the drug combination. We also found that treatment with FAK TKI in KRAS mutant NSCLC cells resulted in increased activation of EGFR which was due in part to modulation of EGFR recycling and production of endogenous EGFR ligands. Thus, the combination of FAK- and EGFR-TKIs may be more effective in KRAS mutant NSCLC as treatment with EGFR-TKI overcomes the unexpected ‘side effect’ of treatment with FAK-TKI, namely activation of the EGFR pathway by this drug. The findings of our study are novel and have uncovered previously unrecognized outcomes of FAK inhibition on EGFR activity. Moreover, our data support the notion that the combination of FAK- and EGFR-TKIs could be an effective treatment for KRAS mutant NSCLC patients.

La résistance à la chimiothérapie constitue un frein majeur à son efficacité. Notre équipe a récemment pu montrer que le masitinib, un nouvel inhibiteur de protéines tyrosine kinases, possède une activité de resensibilisation des cellules tumorales résistantes à la chimiothérapie lorsqu'il est combiné à certaines chimio-drogues. L'objectif des travaux de cette thèse est de déterminer les voies de signalisation, modulées par l'action du masitinib, qui sont impliquées dans la resensibilisation aux chimiothérapies et amélioration de l'activité anti-tumorale.Dans la première partie de la thèse, nous avons pu identifier la nucléoside kinase dCK (désoxycytidine kinase), protéine activatrice d'un grand nombre de chimiothérapies, comme nouvelle cible du masitinib. Cette première étude nous a permis de mettre en évidence un nouveau concept thérapeutique: le masitinib, un composé chimique de type inhibiteur de protéines tyrosine kinases, peut jouer en même temps le rôle d'activateur de nucléoside kinase.Nous avons pu mettre en évidence dans la deuxième partie de la thèse que le traitement combiné entre l'épi-drogue décitabine et le masitinib peut être plus efficace pour la réexpression de certains gènes non ou peu induits par la décitabine seule.En conclusion, ces travaux nous ont permis de mettre en évidence l'interaction entre un inhibiteur de protéine tyrosine kinases et une nucléoside kinase, dans un concept d'activation enzymatique qui pourra certainement servir de base pour l'élaboration de nouvelles petites molécules chimiques spécifiques de l'activation de dCK ou d'autres nucléosides kinases nécessaires à l'activation des drogues de chimiothérapie. / Resistance to chemotherapy is considered as one of the major blockers of its efficacy. Recently, our team demonstrated that masitinib, a new tyrosine kinases inhibitor, possesse a resensitization activity of cell lines resistant to chemotherapy when associated with chemodrugs.The aim of this work is to determine signaling pathways, modulated by masitinib action, that could explain the resensitization to chemotherapy and improvement of anti-tumoral activity.In the first part of this work, we identified the nucleoside kinase dCK (deoxycytidine kinase), a chemotherapy activating protein, as a new target of masitinib. In summary, this first part of the work allowed us to describe a new and never described concept: masitinib, a small molecule belonging to tyrosine kinases group, can also play a role as nucleoside kinase activator.We were able to demonstrate through the second part of the work that the combined treatment of the epidrug decitabine and masitinib can be more effective than decitabine treatment for the re-expression of some genes non or weakly induced by decitabine when used alone.In conclusion, These data allowed us to introduce an interaction between a tyrosine kinases inhibitor and a nucleoside kinase, as an enzymatic activation new concept. This could be used as a base for the design of new small chemical molecules specific for dCK or other nucleoside kinases essential for the activation of chemodrugs. This concept will obviously help to imagine and evaluate more potential therapeutic combinations of chemodrugs and small chemical molecules to overcome the resistance to chemotherapy dependent on nucleoside kinases.

Chronic myeloid leukaemia (CML) is characterised by the constitutively active tyrosine kinase BCR-ABL. Standard treatment with tyrosine kinase inhibitors (TKI) in the chronic phase (CP) of CML conveys excellent long-term prognosis but is associated with side effects and costs. Treatment free remission (TFR) is possible in a proportion of patients discontinuing treatment after obtaining deep treatment responses but it is not fully known how to select the right patients for stopping attempts. Treatment of accelerated phase (AP) and blast crisis (BC) is more complicated and the prognosis more dismal. In this thesis, we have studied factors of importance for outcome in CML patients with focus on immunological factors and clinical management. In a cohort of 32 newly diagnosed CP-CML patients, evidence of active immune escape mechanisms were found. These declined with the course of TKI treatment and at the same time, effector lymphocyte responses were elicited. These anti-leukaemia immune responses might help in the long-term control of CML. Multiple plasma protein markers were also measured with three multiplex platforms in a smaller cohort of patients (n=14). Inflammatory cytokines and other plasma proteins were affected by TKI treatment and multiplexing seems useful for finding potential biomarkers with biologic or prognostic significance in CML. Patients progressing to AP/BC were studied in a population-based material from the Swedish CML register. Approximately 4% of TKI-treated CP-CML patients transformed to AP/BC within 2 years of diagnosis. Monitoring of treatment responses was suboptimal in 1/3 of these patients and the median survival was 1.4 years after diagnosis of AP/BC. Thus, minimising the risk of disease progression through strict adherence to guidelines for monitoring and treatment is essential. In a cohort of patients (n=50) discontinuing TKI treatment within a large European trial, musculoskeletal pain was reported by 30% of patients, starting within 1- 6 weeks of TKI discontinuation and spontaneously resolving over time in most cases. Patients (n=56) were also evaluated with a multiplex platform with a total of 162 inflammation- and cancer-related plasma proteins. No predictive protein biomarkers for successful TKI discontinuation could be found. However, profound effects of TKI-treatment were seen and plasma proteomics could be useful for understanding effects of long-term TKI-treatment.

Unter Verwendung eines mathematischen Hämatopoese-Modells werden verschiedene Fragen adressiert, die im Zusammenhang mit einer möglichen Optimierung der gegenwärtigen Therapie chronischer myeloischer Leukämie (CML) stehen. Es handelt sich um ein agentenbasiertes Modell, das heißt, jede Zelle wird als einzelnes Objekt repräsentiert und gemäß festgelegter Regeln im Computer simuliert. Es werden proliferative von ruhenden Stammzellen unterschieden, wobei sich der Proliferationszustand reversibel ändern kann. Das Modell basiert auf der Annahme, dass sich normale und maligne Stammzellen in einem Wettbewerb um gemeinsame Ressourcen befinden, wobei der CML-Klon einen kompetitiven Vorteil besitzt. Es ist ungeklärt, ob Tyrosinkinaseinhibitoren wie Imatinib (IM) in der Lage sind, die Erkrankung zu heilen. Es gibt Evidenz, dass residuale leukämische Stammzellen im Knochenmark persistieren, welche in einem Ruhezustand (G0-Phase des Zellzyklus) von IM nicht eradiziert werden können. Proliferativ aktive Zellen sind der IM-Wirkung hingegen ausgesetzt. Das Modell sagt voraus, unter welchen Bedingungen eine Kombinationsstrategie von IM mit stammzellaktivierenden Substanzen Synergieeffekte hervorbringen könnte. Ein verwandtes Problem ist die Frage, in welchen Fällen nach Reduktion der Tumorlast auf ein mittels hochsensitiver Messmethoden undetektierbares Niveau ein Therapieabbruch gerechtfertigt ist. Basierend auf dem dynamischen Modell wird in dieser Arbeit ein Prädiktor vorgeschlagen, der vorhersagt, ob ein Patient nach Abbruch der Therapie einen molekularen Rückfall zu erwarten hat. Zusätzlich wird approximativ ein modellunabhängiger Prädiktor angegeben, der die Vorhersage nur auf Basis klinisch messbarer Größen gestattet.

Hintergrund und Fragestellung: Seit der Zulassung des Tyrosinkinase-Inhibitors (TKI) Imatinib im Jahre 2001 hat sich die Therapie der chronisch myeloischen Leukämie (CML) grundlegend verändert. Imatinib inhibiert die konstitutiv aktive Tyrosinkinase BCR-ABL, welche die verstärkte Proliferation der leukämischen Zellen und die Entwicklung der CML bedingt. Das sehr gute klinische Ansprechen auf eine Imatinib-Behandlung resultierte in einer beschleunigten Zulassung dieses TKI auch bei pädiatrischen Patienten im Jahre 2003. Aufgrund von Punktmutationen und/oder strukturellen Änderungen innerhalb des BCR-ABL Fusionsproteins können sich Resistenzen gegenüber Imatinib entwickeln. Deshalb wurden Zweit- und Drittgenerations TKI wie Dasatinib und Bosutinib entwickelt. Imatinib wirkt nicht hoch spezifisch und hemmt neben BCR-ABL auch weitere Tyrosinkinasen, wie z.B. c-KIT, PDGF-R und c-FMS, welche am Knochenstoffwechsel beteiligt sind. Die Stimulation des Rezeptors c-FMS bewirkt die Differenzierung monozytärer Vorläuferzellen in knochenabbauende Osteoklasten. Zusätzlich unterliegt die Entwicklung der knochenaufbauenden Osteoblasten spezifischen Signalkaskaden an denen PDGF-R und c-Abl beteiligt sind. Als Nebenwirkung einer TKI-Therapie beeinträchtigt die Inhibition dieser Signaltransduktionswege somit das Knochen-“Remodelling“, indem die Entwicklung und funktionelle Aktivität von Osteoklasten reduziert wird. Gleichzeitig wird die Aktivität von Osteoblasten gestärkt, aber deren Proliferation inhibiert. Diese Dysbalance von Knochenaufbau und -abbau mit gestörter Kalziumhomöostase bedingt bei erwachsenen CML-Patienten veränderte endokrinologische Parameter des Kalziumhaushaltes, eine vermehrte Knochenmineralisation und eine erhöhte trabekuläre Knochendichte. Dagegen wurden bei pädiatrischen CML-Patienten unter Imatinib-Therapie Längenwachstumsstörungen beobachtet, welche bezüglich des Wirkmechanismuses von Imatinib auf den wachsenden Knochen bis heute noch nicht im Detail geklärt sind. Spekulativ ist auch, ob Zweit- und Drittgenerations-TKI ebenso wie Imatinib den Knochenstoffwechsel bei pädiatrischen Patienten stören. Angelehnt an ein erfolgreiches Applikationsschema bei erwachsenen CML-Patienten steht zusätzlich die Frage im Raum, ob eine intermittierende Gabe von TKIs (einen Monat Therapie, einen Monat Pause) eine Minderung der Nebenwirkung auf den Knochen bewirken könnte, ohne die Wirkung auf die CML-Behandlung zu beeinträchtigen. Vor diesem Hintergrund wurde ein Nagermodel etabliert, um Nebenwirkungen auf den Knochenstoffwechsel unter TKI-Exposition zu analysieren. Junge, wachsende Ratten wurden hierzu vom präpubertären Alter bis zur Adoleszenz kontinuierlich oder intermittierend mit den TKIs Imatinib, Dasatinib und Bosutinib exponiert und die Wirkung auf das wachsende Skelettsystem untersucht. Methoden: 4 Wochen alte männliche Wistar Ratten wurden über einen Zeitraum von 10 Wochen chronisch mit jeweils einem der drei im Trinkwasser gelösten TKIs exponiert. Neben einer unbehandelten Kontrollkohorte erhielt eine Gruppe jeweils eine Standarddosis und eine hohe Dosis (entsprechend der doppelten Standarddosis) des entsprechenden TKIs kontinuierlich. Eine weitere Gruppe erhielt die hohe Dosis intermittierend (an drei aufeinanderfolgenden Tagen TKI, danach vier Tage nur Wasser). Die Konzentrationen im Trinkwasser betrugen für Imatinib 1 mM und 2 mM und für Dasatinib und Bosutinib jeweils 50 µM und 100 µM. Nach zweiwöchiger (präpubertär), vierwöchiger (pubertäres Stadium) und zehnwöchiger Exposition (postpubertär) wurden die Tiere aller Gruppen nekropsiert und Röhrenknochen, Lendenwirbel und Blut asserviert. Zur Beurteilung des Knochenmetabolismus wurden folgende Parameter erhoben: Knochenlängen, Knochendichten mittels pQCT, trabekuläre Strukturen mittels µCT, Knochenfestigkeit mittels des 3-Punkt-Biege-Test und endokrinologische Parameter im Serum mittels ELISA. Zusätzlich wurde der jeweilige TKI Serum-Spiegel bestimmt. Ergebnisse: Die Gewichtsentwicklung, körperliche Entwicklung und das Sozialverhalten zeigten keine Unterschiede beim Vergleich von Kontrollkohorten mit exponierten Tieren. Die kontinuierliche Exposition mit Imatinib und Dasatinib bewirkte dosisabhängig eine Reduktion der Knochenlängen der Femura und der Tibiae. Bosutinib zeigte diesen Effekt nicht. Die intermittierende Exposition mit hoher Dosis resultierte in einer Knochenlängenreduktion, welche exakt dem Effekt der Standarddosis entsprach. Weiterhin resultierte aus der Exposition mit Imatinib oder Dasatinib eine Verminderung der trabekulären Knochendichten der Femura und Tibiae im präpubertären Stadium. Ratten, welche hoch dosiert Imatinib erhielten, zeigten diese Reduktion ebenfalls im pubertären Stadium, nicht jedoch unter Dasatinib- und Bosutinib-Exposition. Postpubertär unterschieden sich die trabekulären Dichten von Femura und Tibiae der exponierten Gruppen nicht von den Kontrollkohorten. Auf die kortikale Knochendichte und die kortikale Dicke dieser Röhrenknochen zeigte sich kein messbarer Effekt der TKI. Dennoch trat - nur nach Exposition der hohen Imatinibdosis - eine signifikant verminderte femorale Bruchfestigkeit postpubertär auf. Am Lendenwirbelkörper war pubertär und postpubertär die Höhe unter Imatinib-Exposition vermindert, während die Gesamt- und kortikale Knochendichte präpubertär erhöht war bei tendenziell erniedrigter trabekulärer Knochendichte. Die kortikale Dicke wurde durch alle TKI nicht beeinflusst. Dasatinib und Bosutinib bewirkten keinen Effekt auf die Wirbelhöhe, aber eine tendenzielle Minderung der trabekulären Knochendichte. Der serologisch erfassbare Knochenresorptionsmarker „tatrate resistant acidic phosphatase“ (TRAP) war unter kontinuierlicher Exposition mit hoher Dosis von Imatinib zu allen Zeitpunkten erniedrigt. Postpubertär zeigte sich dieser Effekt auch unter Standard- und Hochdosis von Bosutinib. Der Knochenformationsmarker Osteocalcin war unter Imatinib bei allen Kohorten zu allen Analysezeitpunkten erniedrigt, während Dasatinib und Bosutinib keinen Effekt auf diesen Parameter zeigten. Die erfassten Serum-Hormonparameter (Wachstumshormon, Parathormon) lagen unter der Exposition mit Imatinib als erhöhte Wachstumshormonspiegel pubertär und als verminderte Parathormonspiegel prä- und pubertär vor. Unter der Exposition mit Dasatinib kam es ebenfalls pubertär zu einer Erhöhung der Wachstumshormonspiegel und präpubertär zu einer tendenziellen Erhöhung der Parathormonspiegel. Postpubertär normalisierten sich beide Parameter unter der Exposition mit Imatinib und Dasatinib wieder. Unter Bosutinib konnte nur postpubertär erniedrigte Parathormonspiegel ermittelt werden. Eine intermittierende TKI-Exposition resultierte in einem Aufholwachstum und einer teilweise Normalisierung der knochenspezifischen Serumparameter. Als wichtige unerwartete Nebenwirkung zeigte sich unter Langzeitexposition mit Imatinib und Dasatinib eine Zunahme des Herzgewichtes. Unter Imatinib resultierten daraus keine klinischen Auffälligkeiten, während unter Dasatinib eine Herzinsuffizienz zum Tod eines Tieres führte. Bosutinib zeigte keine weiteren makropathologisch erfassbaren Nebenwirkungen. Bis heute sind keine kardialen Nebenwirkungen bei pädiatrischen Patienten nach mehrjähriger TKI-Therapie publiziert. Schlussfolgerung: Das etablierte juvenile Nagertiermodell ist gut geeignet, um die Nebenwirkungen einer Langzeitexposition von TKI auf den wachsenden Knochen zu erfassen. Bei Kindern und Adoleszenten klinisch beschriebene Wachstumsretardierungen unter Imatinib ließen sich zweifelsfrei bei Ratten verifizieren. Bei fehlenden klinischen Daten von Kindern zu Dasatinib präjudiziert das Modell, dass Dasatinib so wie Imatinib den gleichen, Bosutinib hingegen kaum einen Effekt auf den Knochen ausübt. Eine intermittierende Gabe der TKI scheint die Nebenwirkungen auf den Knochen abzumildern und könnte eine neue Möglichkeit der TKI-Therapie für pädiatrische Patienten darstellen. Aus dem Tiermodell der Langzeit-exponierten juvenilen Ratte lässt sich ableiten, dass beim wachsenden Kind unter jahrelanger TKI-Therapie klinisch sorgfältig der Knochenstoffwechsel und das Längenwachstum überwacht und unter Dasatinib zusätzlich kardiale Nebenwirkungen beachten werden sollten.:I. Abkürzungsverzeichnis II. Abbildungsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Tabellenverzeichnis des Anhangs 1. Einleitung 1.1 Die chronisch myeloische Leukämie 1.1.1 Pathogenese 1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der chronisch myeloischen Leukämie 1.1.3 Die chronisch myeloische Leukämie im Erwachsenenalter 1.1.4 Die chronisch myeloische Leukämie im Kindes- und Jugendalter 1.1.5 Entwicklung der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2 Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2.1 Wirkmechanismus von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.2.2 Tyrosinkinase-Inhibitoren der nächsten Generation 1.2.3 „Off-target“ Effekte von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.3 Das menschliche Skelett 1.3.1 „Remodelling“ des Knochens 1.3.2 Knochenstoffwechselparameter 1.3.2.1 Anabole Parameter des Knochenaufbaus Osteocalcin und Amino-terminales-Propeptid des Typ-I-Kollagens 1.3.2.2 Katabole Parameter des Knochenabbaus Carboxy-terminales Telopeptid des Typ-I-Kollagens und Tatrat-resistente saure Phosphatase 1.3.2.3 Endokrine Parameter des Knochenstoffwechsels Wachstumshormon und Parathormon 1.4 Einfluss von Tyrosinkinase Inhibitoren auf das Knochen-„Remodelling“ 2. Zielsetzung und Fragestellung 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Versuchstiere 3.1.2 Tierversuchsaufbau 3.1.3 Herstellung der Trinklösungen 3.2 Methoden 3.2.1 Lösungen und Arbeitsmaterialien 3.2.2 Geräte 3.2.3 Knochen-/Organpräparation und Verwendung 3.2.4 Serumgewinnung 3.2.5 Serumspiegelbestimmung der Tyrosinkinase-Inhibitoren 3.2.5.1 Imatinib 3.2.5.2 Dasatinib 3.2.5.3 Bosutinib 3.2.6 Bestimmungen von Knochenstoffwechselmarkern im Serum 3.2.7 Bestimmungen der Längen der Röhrenknochen und der Höhen der Lendenwirbelkörper 3.2.8 Computertomographisch gestützte Untersuchungen der Knochen 3.2.8.1 Knochendichtemessungen der unentkalkten Knochen mittels.. peripherer quantitativer Computertomographie 3.2.8.2 Messungen der unentkalkten Knochen mittels mikro-Computertomographie 3.2.9 Biomechanik am unentkalkten Knochen 3.2.10 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Entwicklung und Sozialverhalten der Versuchstiere unter Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.2 Todesfälle unter 10-wöchiger Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.3 Gewichtsentwicklungen der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.4 Trinkverhalten der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.5 Aufgenommene Mengen an Tyrosinkinase-Inhibitoren und Serumspiegel 4.6 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 4.6.1 Knochenlängen der Femura und Tibiae 4.6.2 Breiten der Epiphysenfugen der Femura und Tibiae 4.6.3 Dichte und Geometrie der unentkalkten Femura und Tibiae 4.6.4 Trabekelstrukturanalyse der unentkalkten Femura 4.6.5 Biomechanik der unentkalkten Femura 4.7 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel L2 4.7.1 Höhen der Lendenwirbelkörper 4.7.2 Dichte und Geometrie der unentkalkten Lendenwirbelkörper 4.8 Serumparameter des Knochenstoffwechsels während der Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.8.1 Parameter des Knochenaufbaus 4.8.2 Parameter des Knochenabbaus 4.9 Längenwachstumsbezogene Serumparameter des Hormonhaushaltes 4.10 Weitere beobachtete Nebenwirkungen während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5. Diskussion 5.1 Das Tiermodell der Ratte 5.2 Chronische Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren über das Trinkwasser..… 5.2.1 Trinkmengen und Entwicklungen der Versuchstiere 5.2.2 Zugeführte Dosis an Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.2.3 Serumkonzentrationen der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.3 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 5.3.1 Längen der Röhrenknochen und Breiten der Epiphysenfugen 5.3.2 Knochendichten und trabekuläre Strukturen der Röhrenknochen 5.3.3 Biomechanik der Femura 5.4 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel 5.5 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf den Knochenstoffwechsel 5.5.1 Veränderungen bei der Knochenresorption 5.5.2 Veränderungen bei der Knochenformation 5.5.3 Spezifische Effekte der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.6 Hormonelle Regulationen des Knochen-„Remodelling“ während der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.7 Nicht skelettbezogene Nebenwirkungen der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.8 Klinischer Bezug zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie im Kindes-und Jugendalter 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang 9. Danksagung / Background: Since its approval in 2001 the tyrosine kinase inhibitor (TKI) imatinib has revolutionized the therapy of chronic myeloid leukaemia (CML). Imatinib inhibits the constitutively active tyrosine kinase (TK) BCR-ABL causing the increased proliferation of the leukemic cells and the progress of CML. According to improved survival rates imatinib has been licensed as frontline therapy also for paediatric CML in 2003. However, due to point mutations or structural changes within the BCR-ABL fusion protein resistance to imatinib occurs. Therefore 2nd and 3rd generation TKI like dasatinib and bosutinib have been developed. Beside BCR-ABL, Imatinib exerts also off-target effects on further TKs like c-KIT, PDGF-R, c-FMS which are involved in bone metabolism. Stimulation of the receptor c-FMS leads to the differentiation of monocytic progenitors to bone resorbing osteoclasts. In addition, the development of bone forming osteoblasts underlies specific signalling cascades involving PDGF-R and c-Abl. As a side effect of TKI therapy these specific signalling cascades are inhibited impairing bone remodelling by reducing the development and functional activity of osteoclasts. Simultaneously osteoblasts’ differentiation is promoted while their proliferation is inhibited. This dysbalance of bone formation and resorption results in altered endocrinological serum markers of the calcium homeostasis, increased bone mineralization, and increased trabecular bone density in adult CML patients. In contrast paediatric CML patients show longitudinal growth retardations under imatinib therapy, however, the detailed action of imatinib on the growing bone is not clarified yet. Additionally, it is unclear if 2nd and 3rd generation TKI will also disturb bone metabolism in paediatric CML patients. Based on an effective treatment strategy in adult CML patients, it is also questioned if intermittent TKI treatment (one month “on”, one month “off”) could minimise side effects on the bone without impairing CML therapy. On this background a rodent model was established to study side effects of TKI treatment on bone metabolism. Juvenile growing rats where exposed from prepubertal age till adolescence continuously or intermittently to imatinib, dasatinib, and bosutinib and the effects on the growing skeleton were analysed. Methods: Four weeks old male Wistar rats were chronically exposed to varying concentrations of one of the three TKIs via the drinking water for 10 weeks. Besides untreated controls a standard dosage group and a high dosage group (equalling the twofold standard dose) received every TKI continuously, while an additional group received the high dosage TKI in an intermittent fashion (3 days per week: “on” TKI; 4 days water without TKI). The concentrations applied were 1 mM and 2 mM for imatinib and 50 µM and 100 µM each for dasatinib and bosutinib, respectively. After 2 weeks (prepubertal), 4 weeks (pubertal stage), and 10 weeks (postpubertal) of exposure, respectively, animals were sacrificed and long bones, lumbar vertebra and blood were isolated. To evaluate bone metabolism the following parameters were analysed: bone length, bone mineral density (BMD) by pQCT, trabecular structure by µCT, bone strength by 3-point bending test, and endocrinological parameters by ELISA. Additionally, serum levels of TKIs were investigated. Results: In comparison to controls no alterations of exposed animals’ bodyweight, overall development and social behaviour were observed. Continuous exposure of imatinib and dasatinib led dose dependently to reduced femoral and tibial length. No such effect was observed under bosutinib. Intermitted exposure of high-dose TKIs resulted in reduced effects on femoral and tibial length identical to the effect observed in groups receiving just standard dose. Furthermore, exposure of imatinib and dasatinib lowered femoral and tibial trabecular BMD prepubertally. Rats receiving high dose imatinib showed reduced femoral and tibial trabecular BMD at pubertal stage, while this effect was not observed under dasatinib and bosutinib exposure. Postpubertally, femoral and tibial trabecular BMD of all exposed groups did not differ from controls. Femoral and tibial cortical BMD and cortical thickness were not affected by TKI exposure. However, under high dose imatinib exposure femoral mechanical breaking strength was reduced postpubertally. In vertebra the height was reduced under imatinib exposure pubertally and postpubertally, while the total and cortical BMD were increased prepubertally and trabecular BMD tended to be reduced. Cortical thickness was not affected by any TKI tested. Dasatinib and bosutinib exhibited no effect on the height of the vertebra but trabecular BMD tended to be reduced. The serum bone resorption marker ‘tartrate resistant acidic phosphatase’ (TRAP) was found reduced under continuous exposure of high dose of imatinib at all time points tested. Postpubertally, the same effect was detected after standard and high dosage of bosutinib. The bone formation marker osteocalcin was reduced in all groups and at all time points tested under imatinib exposure, whereas no such effect was observed for dasatinib and bosutinib. Serum bone related hormone markers (growth hormone (GH) and parathyroid hormone (PTH)) revealed under imatinib exposure increased GH levels pubertally whereas PTH was reduced pre- und pubertally. During dasatinib exposure GH levels were elevated pubertally and PTH levels were increased prepubertally. Postpubertally, both parameters normalised again under imatinib and dasatinib exposure. During bosutinib exposure reduced PTH levels were detected postpubertally only. Intermitted TKI exposure resulted in catch-up growth and partial normalisation of bone specific serum parameters. As major unexpected side effect during exposure increasing heart weights could be observed under long-time imatinib and dasatinib exposure. No clinical changes were observed under imatinib, whereas dasatinib led to cardiac insufficiency leading to death of one animal. Bosutinib showed no additional macrospathologic assessable side effects. To date no cardiac side effects were published in paediatric patients under prolonged TKI therapy. Conclusion: The established juvenile rat model is appropriate to examine side effects of long-term TKI exposure on the growing bone. Published longitudinal growth retardation in children and adolescents under imatinib treatment could be unequivocally mimicked in this rat model. Due to not yet available clinical experience with dasatinib in paediatric patients, this model predicts that dasatinib alters bone metabolism like imatinib whereas bosutinib shows less detectable effects. Intermitted TKI treatment may reduce side effects on the growing bone and therefore could represent a new opportunity of TKI therapy for paediatric patients. Summing up, TKI long-term exposure in this juvenile rat model challenges physicians to diligently monitor bone metabolism in not outgrown paediatric patients during long-term TKI treatment and additionally assess cardiac side effects under dasatinib exposure.:I. Abkürzungsverzeichnis II. Abbildungsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Tabellenverzeichnis des Anhangs 1. Einleitung 1.1 Die chronisch myeloische Leukämie 1.1.1 Pathogenese 1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der chronisch myeloischen Leukämie 1.1.3 Die chronisch myeloische Leukämie im Erwachsenenalter 1.1.4 Die chronisch myeloische Leukämie im Kindes- und Jugendalter 1.1.5 Entwicklung der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2 Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2.1 Wirkmechanismus von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.2.2 Tyrosinkinase-Inhibitoren der nächsten Generation 1.2.3 „Off-target“ Effekte von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.3 Das menschliche Skelett 1.3.1 „Remodelling“ des Knochens 1.3.2 Knochenstoffwechselparameter 1.3.2.1 Anabole Parameter des Knochenaufbaus Osteocalcin und Amino-terminales-Propeptid des Typ-I-Kollagens 1.3.2.2 Katabole Parameter des Knochenabbaus Carboxy-terminales Telopeptid des Typ-I-Kollagens und Tatrat-resistente saure Phosphatase 1.3.2.3 Endokrine Parameter des Knochenstoffwechsels Wachstumshormon und Parathormon 1.4 Einfluss von Tyrosinkinase Inhibitoren auf das Knochen-„Remodelling“ 2. Zielsetzung und Fragestellung 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Versuchstiere 3.1.2 Tierversuchsaufbau 3.1.3 Herstellung der Trinklösungen 3.2 Methoden 3.2.1 Lösungen und Arbeitsmaterialien 3.2.2 Geräte 3.2.3 Knochen-/Organpräparation und Verwendung 3.2.4 Serumgewinnung 3.2.5 Serumspiegelbestimmung der Tyrosinkinase-Inhibitoren 3.2.5.1 Imatinib 3.2.5.2 Dasatinib 3.2.5.3 Bosutinib 3.2.6 Bestimmungen von Knochenstoffwechselmarkern im Serum 3.2.7 Bestimmungen der Längen der Röhrenknochen und der Höhen der Lendenwirbelkörper 3.2.8 Computertomographisch gestützte Untersuchungen der Knochen 3.2.8.1 Knochendichtemessungen der unentkalkten Knochen mittels.. peripherer quantitativer Computertomographie 3.2.8.2 Messungen der unentkalkten Knochen mittels mikro-Computertomographie 3.2.9 Biomechanik am unentkalkten Knochen 3.2.10 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Entwicklung und Sozialverhalten der Versuchstiere unter Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.2 Todesfälle unter 10-wöchiger Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.3 Gewichtsentwicklungen der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.4 Trinkverhalten der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.5 Aufgenommene Mengen an Tyrosinkinase-Inhibitoren und Serumspiegel 4.6 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 4.6.1 Knochenlängen der Femura und Tibiae 4.6.2 Breiten der Epiphysenfugen der Femura und Tibiae 4.6.3 Dichte und Geometrie der unentkalkten Femura und Tibiae 4.6.4 Trabekelstrukturanalyse der unentkalkten Femura 4.6.5 Biomechanik der unentkalkten Femura 4.7 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel L2 4.7.1 Höhen der Lendenwirbelkörper 4.7.2 Dichte und Geometrie der unentkalkten Lendenwirbelkörper 4.8 Serumparameter des Knochenstoffwechsels während der Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.8.1 Parameter des Knochenaufbaus 4.8.2 Parameter des Knochenabbaus 4.9 Längenwachstumsbezogene Serumparameter des Hormonhaushaltes 4.10 Weitere beobachtete Nebenwirkungen während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5. Diskussion 5.1 Das Tiermodell der Ratte 5.2 Chronische Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren über das Trinkwasser..… 5.2.1 Trinkmengen und Entwicklungen der Versuchstiere 5.2.2 Zugeführte Dosis an Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.2.3 Serumkonzentrationen der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.3 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 5.3.1 Längen der Röhrenknochen und Breiten der Epiphysenfugen 5.3.2 Knochendichten und trabekuläre Strukturen der Röhrenknochen 5.3.3 Biomechanik der Femura 5.4 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel 5.5 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf den Knochenstoffwechsel 5.5.1 Veränderungen bei der Knochenresorption 5.5.2 Veränderungen bei der Knochenformation 5.5.3 Spezifische Effekte der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.6 Hormonelle Regulationen des Knochen-„Remodelling“ während der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.7 Nicht skelettbezogene Nebenwirkungen der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.8 Klinischer Bezug zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie im Kindes-und Jugendalter 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang 9. Danksagung

The regulation of muscle stem cell (MuSC) asymmetric division plays an essential role in controlling the growth and repair of skeletal muscle. Perturbations in MuSC function have been demonstrated in disease and aging contexts such as Duchenne’s Muscular Dystrophy (DMD) and sarcopenia. We developed and optimized a high content analysis platform combining lineage tracing, myofiber culture, imaging, and bioinformatic analysis to determine modulators of muscle stem cell division. We discover kinase domain receptor (KDR) as a positive modulator of MuSC asymmetric division and confirmed its expression in satellite cells by ddPCR and immunofluorescence. Knockdown of KDR significantly reduces the numbers of asymmetric divisions, whereas ligand stimulation of KDR increases the numbers of asymmetric divisions. KDR signaling is impaired in dystrophin- deficient satellite cells and requires a polarized cell environment established by the dystrophin glycoprotein complex (DGC) to direct asymmetric division. Mice lacking KDR in MuSCs exhibit reduced numbers of satellite cells due to precocious differentiation, and deficits in regeneration consistent with impaired asymmetric division and reduced generation of progenitors. Therefore, our experiments identify KDR signaling as playing an essential role in MuSC function in muscle regeneration. These findings further our understanding of muscle stem cell biology, and in particular, the role of asymmetric division under homeostatic and regenerative conditions.

<p dir="ltr">Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths, and although important therapy advancements have been achieved, ~1.6 million people die from lung cancer annually. Non-small cell lung cancer (NSCLC), which makes up ~85% of lung cancer cases, is mainly treated with radiotherapy, chemotherapies, and targeted agents. Targeted agents are selected based on the mutation spectrum of the tumor. In NSCLC the epidermal growth factor receptor (EGFR) is commonly mutated and, leads to increased proliferation and cell survival. The standard-of-care treatment for patients with activating mutations in EGFR is treatment with tyrosine kinase inhibitors (TKI), such as erlotinib. While tumors initially respond to TKIs, after 1-2 years most patients develop resistance. In ~60% of TKI resistant tumors, resistance is the result of a secondary mutation in EGFR, whereas in the remaining 20%, tumors turn on bypass track-signals to overcome inhibition of the EGFR pathway. However, 15-20% of the cases the mechanisms underlying resistance are unknown. Most studies focus on the gain of function of oncogenes as mediators of resistance; however, little is known about the role that tumor suppressors play in TKI resistance. Hence, we performed a genome-wide CRISPR Cas9 knock-out screen to identify genes that when knocked-out would drive erlotinib resistance, and KMT5C was identified as the top candidate. KMT5C is a histone methyltransferase that trimethylates H4K20 (H4K20me3), enabling the establishment of constitutive and facultative heterochromatin. Data from human samples suggests that the <i>KMT5C</i> transcript is globally downregulated in NSCLC and in tumor samples resistant to the third generation TKI osimertinib. Additionally, loss of the modification H4K20me3, influences prognosis of NSCLC, indicating that loss of KMT5C function is a crucial mechanism in carcinogenesis. Here we describe how loss of KMT5C leads to increased transcription of the oncogene MET, due to a loss in H4K20me3-mediated repression of a long non-coding RNA transcription (LINC01510) upstream of MET. This mechanism was found to be partially responsible in driving TKI resistance in EGFR mutant cells. Historically, KMT5C has been associated with generation of constitutive heterochromatin (cHC); however, recent reports, including our own, indicate that KMT5C also regulates transcription in regions outside of cHC. Our preliminary evidence suggests that deposition of H42K0me3 via KMT5C in regions outside of cHC, is less stable than in cHC regions. This novel finding led us to hypothesize that regulation of KMT5C and H42K0me3 at different regions of heterochromatin is a dynamic process.</p>

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23775号 / 医博第4821号 / 新制||医||1057(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 河本 宏, 教授 永井 純正, 教授 濵﨑 洋子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Recent clinical findings in chronic myeloid leukemia (CML) patients suggest that the risk of molecular recurrence after stopping tyrosine kinase inhibitor (TKI) treatment substantially depends on an individual’s leukemia-specific immune response. However, it is still not possible to prospectively identify patients that will remain in treatment-free remission (TFR). Here, we used an ordinary differential equation (ODE) model for CML, which explicitly includes an anti-leukemic immunological effect and applied it to 21 CML patients for whom BCR-ABL1/ABL1 time courses had been quantified before and after TKI cessation. Immunological control was conceptually necessary to explain TFR as observed in about half of the patients. Fitting the model simulations to data, we identified patient-specific parameters and classified patients into three different groups according to their predicted immune system configuration ('immunological landscapes”). While one class of patients required complete CML eradication to achieve TFR, other patients were able to control residual leukemia levels after treatment cessation. Among them were a third class of patients, that maintained TFR only if an optimal balance between leukemia abundance and immunological activation was achieved before treatment cessation. Model simulations further suggested that changes in the BCR-ABL1 dynamics resulting from TKI dose reduction convey information about the patient-specific immune system and allow prediction of outcome after treatment cessation. This inference of individual immunological configurations based on treatment alterations can also be applied to other cancer types in which the endogenous immune system supports maintenance therapy, long-term disease control or even cure.