Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:11:26Z No. of bitstreams: 1 POLYANA SILVA PEREIRA.pdf: 2183990 bytes, checksum: f5a2198904653af5e6ed94add64d6d4e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:11:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 POLYANA SILVA PEREIRA.pdf: 2183990 bytes, checksum: f5a2198904653af5e6ed94add64d6d4e (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Klebsiella pneumoniae é um patógeno Gram-negativo da família Enterobacteriaceae, frequentemente associado às infecções. Isolados clínicos de K. pneumoniae usualmente apresentam resistência a classe dos beta-lactâmicos, devido a produção de carbapenemase do tipo KPC. Além da resistência a todos os beta-lactâmicos disponíveis, a KPC possui alta capacidade de disseminação, pois tem sido descrita em plasmídios associados à transposons (Tn4401). Foi descrita inicialmente nos EUA, e atualmente se tornou uma ameaça global. A sua primeira descrição no Brasil ocorreu em 2006 e desde então sua incidência tem crescido significativamente. Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar o polimorfismo genético, determinar o perfil de resistência a antimicrobianos, identificar o plasmídio carreador e a região flanqueadora do gene blaKPC de 165 amostras de K.pneumoniae produtoras de KPC provenientes de doze estados Brasileiros (AL, AM, CE, DF, ES, GO, MG, MA, PE, PI, RJ e SC) no período de 2006 a 2010. A confirmação da produção de KPC e identificação da variante alélica foram realizadas por PCR e sequenciamento. A susceptibilidade aos antimicrobianos foi determinada através de difusão em ágar (CLSI, 2011) e determinação da CIM por Etest® (ANVISA N°1/2010). PFGE e MLST foram utilizados para a análise epidemiológica. Avaliação da região flanqueadora do gene blaKPC foi realizada através de PCR para detecção do Tn4401. A identificação do plasmídio carreador do gene blaKPC foi realizada através de extração plasmidial (Kado e Liu, 1981) e hibridização (Sambrook e Russel, 2001). As amostras foram recuperadas principalmente a partir de sangue (39%) e urina (37%), e todas as cepas produziram KPC-2. Foi observada resistência a ciprofloxacina (95,7%), sulfametoxazol/trimetoprima (84,2%), amicacina (34%) e gentamicina (57%), fosfomicina (7,8%), polimixina B (11%) e tigeciclina (38%). A maioria das cepas se mostrou multirresistente, sendo três resistentes a todas as classes de antimicrobianos testadas. Através de PFGE, encontramos 28 grupos clonais, sendo três mais prevalentes: grupo A (40,6%- ES, RJ, SC e CE); grupo C (23% - CE, DF, MG, GO, PE e RJ); grupo Q (9,7%- AL, ES, DF e PI). Através de MLST, também se observou 28 clones, mostrando boa correlação. Os grupos clonais A/KpRj, C e Q foram designados por MLST como ST437, ST11 e ST340 respectivamente. Através de análise filogenética, observamos três complexos clonais entre nossas amostras: CC11 (ST11, ST340, ST437, ST757, ST855), CC16-17 e CC758-840. O CC11 apresenta grande importância epidemiológica, pois inclui dois STs que têm desempenhado papel de destaque em relação à disseminação do gene blaKPC: ST258 e ST11 (encontrado em nosso trabalho). O gene blaKPC-2 foi encontrado associado ao Tn4401, isoforma “a” em todas as amostras, e associado à plasmídios em 95,3% das amostras. Desses plasmídios, 92% eram de 40kb (IncN) e 8% de 55kb (IncL/M). Dessa forma, acreditamos que em nosso país esteja ocorrendo a disseminação do gene blaKPC tanto devido a dispersão de um mesmo plasmídio de aproximadamente 40kb do grupo de IncN entre cepas de diferentes STs, como também a disseminação de um mesmo complexo clonal (CC11), onde os clones A-KpRJ/ST437 e C/ST11 tem desempenhado importante. / Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative pathogen belonging to Enterobacteriaceae family, often associated with infections. Clinical isolates of K. pneumoniae usually show resistance to beta-lactams, due to production of KPC-type carbapenemase. In addition to resistance to all beta-lactams available, this carbapenamase has high capacity to spread, since it has been described in plasmids associated with transposons (Tn4401). KPC was first described in the U.S., and nowadays is considered a global threat. The first description of KPC in Brazil occurred in 2006 and since then its incidence has greatly increased. Thus, the objective of this study was to analyze the genetic polymorphism, determine the antimicrobial resistance profile, and identify the carrier plasmid and the flanking region of the blaKPC gene of 165 KPC-producing K.pneumoniae from twelve Brazilian states (AL, AM, CE, DF, ES, GO, MG, MA, PE, PI, RJ and SC) in the period of years 2006 to 2010. Confirmation of KPC production and identification of the allele variant were performed by PCR and sequencing. The antimicrobial susceptibility was determined by agar diffusion (CLSI, 2011) and MIC determination by Etest® (ANVISA 1/ 2010). PFGE and MLST were used for epidemiological analysis. Evaluation of flanking region surrounding the blaKPC gene was performed by PCR for the detection of Tn4401. The identification of the plasmid carrying the blaKPC gene was performed by plasmid extraction (Kado and Liu, 1981) and hybridization (Sambrook and Russell, 2001). The isolates were mainly recovered from blood (39%) and urine (37%), and all strains produced KPC-2. Resistance was observed to ciprofloxacin (95,7%), sulfamethoxazole/trimethoprim (84.2%), amikacin (34%), gentamicin (57%), fosfomycin (7.8%), polymyxin B (11%) and tigecycline (38%). Most of the strains showed multidrug resistant pattern, and three of them were resistant to all classes of antimicrobials tested. By PFGE, we found 28 clonal groups, three being the most prevalent: group A (40.6% - ES, RJ, SC and EC), group C (23% - CE, DF, MG, GO, RJ and EP); group Q (9.7% - AL, ES, DF and PI). By MLST, we also found 28 profiles, showing good consistency between these two methodologies. The clonal group A/KpRj, C and Q were designated by MLST as ST437, ST11 and ST340 respectively. Phylogenetic analysis showed three clonal complexes: CC11 (ST11, ST340, ST437, ST757, ST855), CC16-17 and CC758-840. The CC11 has great epidemiological importance, because it includes two STs that have been playing a prominent role in the spread of the blaKPC gene: ST258 and ST11 (found in our work). The blaKPC-2 gene was found associated with Tn4401, isoform "a" in all samples, and associated with plasmids in 95.3% of them. Of these plasmids, 92% had 40kb belonging to the IncN group and 8% had 55kb (IncL/M). Thus, we believe that our country is experiencing the spread of the gene blaKPC both associated with the dispersion of a single plasmid of approximately 40kb of the IncN group among strains of different STs, but also by the spread of the same clonal complex (CC11), where the clones A-KpRJ/ST437 and C/ST11 has played an important role.

BRAGA, J.M. Prevalência e sensibilidade antimicrobiana de escherichia coli e klebsiella pneumoniae isoladas de infecções nosocomiais no hospital regional norte em sobral/ce e detecção genética de blatem, blashv blactx-m e blages em espécimes produtores de betalactamase de espectro estendido (esbl). 2016. 101f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2016. / Submitted by Mestrado Ciências da Saúde (ppgcsufcsobral@gmail.com) on 2017-05-25T14:15:01Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_jmbraga.pdf: 4368780 bytes, checksum: f1881d9ef6d76e8cb665b910b9dcd076 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-05-26T18:41:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_jmbraga.pdf: 4368780 bytes, checksum: f1881d9ef6d76e8cb665b910b9dcd076 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-26T18:41:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_jmbraga.pdf: 4368780 bytes, checksum: f1881d9ef6d76e8cb665b910b9dcd076 (MD5) Previous issue date: 2016-12-01 / Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae are Gram-negative bacilli account for a significant portion of infections in hospitals. Its importance has increased due to increased production of beta-lactamases of extended spectrum (ESBL). These enzymes are produced by some Gram negative bacilli and mediate resistance to beta-lactams, such as cephalosporins and aztreonam. In these pathogens, the majority of the ESBL identified are TEM, SHV and CTX-M types. This study aimed to analyze the prevalence and antimicrobial susceptibility of E. coli and K. pneumoniae isolated from nosocomial infections in North Regional Hospital in Sobral/CE, Brazil, from March 2015 to March 2016, and to detect blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaVIM and blaGES genes of isolates which exhibited ESBL phenotype. A total of 245 isolates (132 E. coli and 113 K. pneumoniae) were analyzed. Of these, 145 (59.1%) had ESBL phenotype and 44 were characterized genetically by presence of blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaVIM and blaGES genes. The rates of E.coli and Klebsiella pneumoniae ESBL producers were 49.2% and 70.8%, respectively. This research revealed that ESBL-producing E. coli strains were more sensitive to meropenem (100%), amikacin (96.9%), colistin (90.8%) and tigecycline (90.8%), and more resistant to ampicillin (100%), ceftriaxone (100%) and cefepime (96.9%). On the other hand, K. pneumoniae ESBL producers were more sensitive to colistin (100%), amikacin (96.2%) and meropenem (93.7%), and more resistant to ceftriaxone (100%), ceftazidime (100%), cefepime (98.7%) and ampicillin (98.7%). The blaCTX-M gene was detected in 14 (31.8%) isolates, blaTEM and blaSHV genes were detected both in 3 specimens (6.8%), the blaGES gene was detected in only one isolate (2.2%), while blaKPC and blaVIM genes were not detected. Our findings show high levels of resistance to beta-lactam antibiotics, as well as increasing linear trend for ESBL production by the studied species. The gene with the highest detection rates among the isolates was blaCTX-M gene, which is certainly the most important ESBL gene today. We detected one strain of Klebsiella pneumoniae harboring blaGES and blaCTX-M genes, being of our knowledge the first report in Brazil, which demonstrates the great potential for worldwide spread of resistance genes between Gram-negative bacillus. / Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae são bacilos Gram-negativos responsáveis por uma parcela significante de infecções em ambiente hospitalar. Sua importância aumentou devido ao surgimento de espécimes produtoras de betalactamases de espectro estendido (ESBL). Essas enzimas são produzidas por alguns bacilos Gram-negativos e conferem resistência aos betalactâmicos, como cefalosporinas e aztreonam. Nesses patógenos, a maioria das ESBL identificadas é do tipo TEM, SHV e CTX-M. Este estudo teve como objetivo analisar a prevalência e a sensibilidade antimicrobiana de E.coli e K. pneumoniae isoladas de infecções nosocomiais do Hospital Regional Norte, Sobral/CE, Brasil no período de março de 2015 a março de 2016, assim como realizar a detecção dos genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaVIM e blaGES nos isolados que exibiram fenótipo ESBL. No total, 245 isolados (132 E. coli e 113 K. pneumoniae) foram analisados. Destes, 145 (59,1%) apresentaram fenótipo ESBL e 44 foram caracterizados geneticamente quanto à detecção dos genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaVIM e blaGES. As taxas de produção de ESBL por E.coli e K. pneumoniae foram 49,2% e 70,8%, respectivamente. Essa pesquisa revelou que E.coli produtoras de ESBL foram mais sensíveis ao meropenem (100%), amicacina (96,9%), colistina (90,8%) e tigeciclina (90,8%), e mais resistentes à ampicilina (100%), ceftriaxona (100%) e cefepima (96,9%). Já K. pneumoniae produtoras de ESBL foram mais sensíveis à colistina (100%), amicacina (96,2%) e meropenem (93,7%), e mais resistentes à ceftriaxona (100%), ceftazidima (100%), cefepima (98,7%) e ampicilina (98,7%). O gene blaCTX-M foi detectado em 12 (27,2%) isolados, os genes blaTEM e blaSHV foram detectados em 3 espécimes cada um (6,8%), o gene blaGES foi detectado em apenas um isolado (2,2%), enquanto os genes blaKPC e blaVIM não foram detectados. Nossos achados revelam altos índices de resistência aos betalactâmicos, assim como tendência linear crescente para produção de ESBL pelas espécies estudadas. O gene com maiores taxas de detecção entre os isolados foi o gene blaCTX-M que, certamente, é o gene ESBL mais importante clinicamente na atualidade. Nós detectamos um isolado de Klebsiella pneumoniae contendo o gene blaGES e blaCTX-M, sendo do nosso conhecimento o primeiro relato no Brasil, o que demonstra o grande potencial de disseminação mundial de genes de resistência entre bacilos Gram-negativos.

Made available in DSpace on 2014-11-18T16:06:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69898.pdf: 2105551 bytes, checksum: 65da981b8abb9d10633ef76ca3b773c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-05T15:54:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 carolina_tavares_ioc_mest_2014.pdf: 2105551 bytes, checksum: 65da981b8abb9d10633ef76ca3b773c0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A produção de carbapenemases do tipo KPC tem se tornado um importante mecanismo de resistência aos carbapenemas na família Enterobacteriaceae. Embora seja descrita predominantemente em Klebsiella pneumoniae, a enzima KPC também tem sido encontrada em diferentes espécies de Enterobacteriaceae. Contudo, pouco se sabe sobre a epidemiologia da disseminação do gene blaKPC-2 nestas outras espécies. No Brasil, a enzima KPC foi relatada inicialmente em K. pneumoniae no Recife, em 2006, mas atualmente já se encontra disseminada pelo país, onde sua incidência tem aumentado significativamente. Portanto, o objetivo desse trabalho foi realizar a caracterização molecular de amostras brasileiras produtoras de KPC pertencentes a diferentes espécies de Enterobacteriaceae (excluindo K. pneumoniae), isoladas de diferentes estados brasileiros no período de 2009 a 2011. O perfil de resistência foi avaliado por difusão em ágar e E-test. A variante alélica de blaKPC, assim como a participação do transposon Tn4401 e a análise da presença de outros genes de beta-lactamases (TEM, SHV e CTX-M) foram realizadas por PCR e sequenciamento. Análise plasmidial e hibridação foram realizadas para determinar o ambiente genético do gene blaKPC. Para a tipagem molecular foi realizado PFGE e MLST (somente para Escherichia coli) Foram encaminhadas ao Laboratório de Pesquisa em Infecção Hospitalar da Fundação Oswaldo Cruz, 83 amostras produtoras de KPC-2 (correspondendo as espécies: Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Pantoea agglomerans, Providencia stuartii, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, Morganella morganii e Serratia marcescens) provenientes de 9 estados das regiões sudeste, nordeste e centro-oeste do país. Em amostras KPC positivas, foram encontrados altos percentuais de resistência à maioria dos antimicrobianos testados, inclusive tigeciclina (36,1% não sensíveis) e polimixina B (16,5%). As espécies mais resistentes foram E. aerogenes, E. cloacae, C. freundii e K. oxytoca. A associação de KPC com outras beta-lactamases foi encontrada em 53% das amostras (45,8% produtoras de TEM, 6% produtoras de SHV e 22,9% produtoras de CTX-M). O gene blaKPC-2 foi encontrado associado a uma estrutura parcial do transposon Tn4401 com diferentes isoformas. Todas as amostras apresentaram o gene blaKPC-2 inserido em plasmídios de vários tamanhos e grupos de incompatibilidade Observamos grande diversidade genética entre todas as espécies estudadas, mas encontramos, para algumas espécies, a presença de alguns grupos clonais prevalentes em determinados estados. A maioria das amostras de E. aerogenes pertenciam ao grupo clonal A e foram isoladas no DF e GO persistindo por 11 meses, sugerindo a possibilidade de um surto. Dessa forma, este estudo demonstrou a disseminação do gene blaKPC-2 em 9 Enterobacteriaceae de diferentes regiões do Brasil, incluindo espécies nas quais o gene não havia sido previamente descrito, como P. agglomerans e P. Stuartii. Evidenciou ainda as diversas ferramentas moleculares que o gene blaKPC-2 se beneficia para disseminar entre espécies de Enterobacteriaceae / The production of Klebsiella pneumonia e carbapenemase ( KPC ) - type enzymes has become an important mechanism of carbapenem resistance in the Family Enterobacteriaceae. Although it is predominantly d escribed in Klebsiella pneumoniae , the KPC enzyme h as also been found in different species of Enterobacteriaceae . Moreover , little is known about the epidemiology of the dissemination of bla KPC gene in other Enterobacteriaceae species . In Brazil, KPC was i nitially described in K. pneumoniae in Recife, state of Pernambuco, in 2006, but currently this enzyme is already d isseminated throughout the country, where its incidence has increased significantly. Thus, this study aimed to perform the molecular characte rization of KPC - producing brazilian isolates belonging to different species of Enterobacteriaceae (non - K. pneumoniae ) originated from different Brazilian states between 2009 and 2011. The resistance profile was evaluated by disc - diffusion method and E - test . The allelic variant of the bla KPC gene, as well as the participation of Tn 4401 and the presence of other beta - lactamase genes (TEM, SHV and CTX - M) were analyzed by PCR and genome sequencing. Plasmid analysis and hibridization were used to determine the g enetic environment of the bla KPC gene. Molecular typing was done by PFGE and MLST (only for Escherichia coli ). Eighty three unique clinical isolates of Enterobacteriaceae KPC - 2 - producers were referred to the Laboratório de Pesquisa em Infecção Hospitalar f rom Fundação Oswaldo Cruz , corresponding to 9 different species ( Enterobacter aerogenes , Enterobacter cloacae , Escherichia coli , Pantoea agglomerans , Providencia stuartii , Citrobacter freundii , Klebsiella oxytoca , Morganella morganii and Serratia marcescen s ) isolated from 9 states located in northeast, southeast and central regions of Brazil . High resistance rates towards most of the antimicrobial agents tested, including tigecycline (36.1% nonsusceptible) and polymyxin B (16.5%) were detected. E. aerogenes , E. cloacae , C. freundii and K. oxytoca were the most resistant species. The association of the bla KPC - 2 gene with other beta - lactamase genes was found in 53% of the isolates (45.8% producing TEM, 6% producing SHV and 22.9% producing CTX - M). The bla KPC - 2 gene was found associated with a partial Tn 4401 structure with different isoforms. All of the isolates had the bla KPC - 2 gene inserted within plasmids of different sizes and incompatibility groups. We found great clonal diversity among all of the studied sp ecies, but we found the presence of a few prevalent clonal groups in some regions. The majority of E. aerogenes isolates belonged to clonal group A, isolated from the central regions of Brazil (GO and DF), persisting for 11 months, suggesting the possibili ty of an outbreak. Therefore, this study demonstrated the dissemination of the bla KPC - 2 gene among different Enterobacteriaceae in Brazil, includingspecies in which this gene was not previously reported, such as P. agglomerans and P. stuartii . The study al so showed the different molecular tools in which the bla KPC - 2 gene benefits to disseminate between Enterobacteriaceae.

Entre membros da Família Enterobacteriaceae a produção de β-lactamases de espectro estendido (ESBL – Extended-Spectrum β-lactamase) se constitui em um importante mecanismo de resistência a antibióticos β-lactâmicos. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência de ESBL em diferentes gêneros da Família Enterobacteriaceae em um hospital universitário no sul do Brasil. Além disso, avaliou-se o teste de triagem proposto pelo CLSI, o teste que utiliza discos combinados e técnica de PCR para detecção de ESBL na Família Enterobacteriaceae. De forma complementar, foi feita pesquisa de KPC em amostras com resistência (plena ou intermediária) ao ertapenem. Foram analisados 731 isolados da Família Enterobacteriaceae, obtidos a partir de amostras clínicas de pacientes hospitalizados. A prevalência de isolados produtores de ESBL na Família Enterobacteriaceae foi de 26,8% (196/731). Destacam-se Providencia spp. com uma prevalência de 91,7% (11/12), seguida de Klebsiella pneumoniae com 56,7% (59/104) e Enterobacter spp. com 40,7% (48/118). Entre os antibióticos utilizados no Teste Confirmatório Fenotípico, a cefepima foi o substrato que detectou o maior percentual dos isolados (90,6% - 183/202) como produtores de ESBL. Utilizando a técnica de PCR foi possível detectar blaTEM em 89,6% (208/232), blaSHV em 59% (137/232) e blaCTX-M em 37,9% (88/232) dos isolados. Comparando o perfil de suscetibilidade global das amostras ESBL com as demais amostras consideradas como não produtoras de ESBL, notou-se um grande decréscimo na sensibilidade de todos antimicrobianos testados (p < 0,05) nas ESBL positivas. Apenas os carbapenêmicos (Imipenem e Meropenem) apresentaram total eficácia in vitro. Outros antibióticos com maior percentual de sensibilidade para isolados produtores de ESBL foram Amicacina, Doxaciclina e Piperacilina/Tazobactam com 35,1%, 29,9% e 28,0% de sensibilidade, respectivamente. Entre os microrganismos com teste de triagem para ESBL positivo, 39 apresentaram resistência (plena ou intermediária) ao ertapenem, mas em nenhuma destas amostras foi detectado o gene blaKPC por técnica de PCR.

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Banca: Hélio Langoni / Banca: Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães / Resumo: O presente trabalho objetivou o isolamento de Klebsiella pneumoniae do ambiente de sala de ordenha e do ambiente dos animais, incluindo a sala de pré-ordenha, piquetes e, em algumas propriedades os galpões de "free stall", do reto e membros posteriores dos animais, do leite do tanque de refrigeração e do leite dos tetos positivos ao teste do Califórnia Mastitis Test (CMT), pesquisar cepas produtoras de β-lactamases de espectro ampliado (ESβL) e, a partir da identificação clonal, verificar a semelhança entre as cepas. Em 28 (2,14%) amostras de leite coletadas dos animais foi detectada a presença de Klebsiella pneumoniae como patógeno responsável pela infecção intramamária (IMI). A partir de swabs ambientais, da pele dos animais e do leite oriundo do tanque de expansão das dez propriedades, foram isoladas 79 cepas de K. pneumoniae. Os resultados da prova de detecção fenotípica da produção de enzimas do tipo ESβL foram positivos em oito (7,47%) das cepas bacterianas isoladas. No Brasil ainda não há relatos de coliformes produtores destas enzimas oriundos de animais de produção, e no presente estudo uma das cepas foi isolada do tanque de expansão, representando um potencial perigo à saúde pública. Pelo resultado da PFGE, observou-se grande diversidade genética da bactéria dentro da propriedade e entre as propriedades. Demonstrou-se que patógenos ambientais multirresistentes estão presentes em rebanhos bovinos leiteiros, não apenas isolados de quadros de infecção intramamária como também de galpões de free stall, membros posteriores dos animais, sala de ordenha e tanque de expansão. Confirmou-se também, a alta variabilidade genética da K. pneumoniae em rebanhos bovinos leiteiros mesmo dentro de um mesmo rebanho, e a importância da PFGE como recurso na epidemiologia molecular / Abstract: The present study aimed the isolation of Klebsiella pneumoniae from the milk parlor and the animal's environment, including the pre milking room, paddocks and, in some properties the free stall, animal's rectum and hind limbs, bulk tank milk and from all teats positive to the California Mastitis Test (CMT), search for strains producers of extended spectrum β-lactamases (ESβL) and, by the clonal identification, verify if similarities between the strains ocurred. In 2.14% (28) of the milk samples collected from the animals it was detected the presence of Klebsiella pneumoniae as the pathogen responsible for the intramammary infection (IMI). From environmental swabs and bulk milk tank of the ten properties, it was isolated 79 strains of K. pneumoniae. The results of phenotypic detection of the ESβL enzymes production were positive in eight (7.47%) bacterial strains isolated. It is important to know that, in Brazil there are no reports of coliforms producers of these enzymes isolated from livestock animals, and in the present study one of the strains was isolated from the bulk tank milk, representing a potential hazard to public health. The results of PFGE showed high genetic diversity of the bacteria within and between the dairy farms. It was demonstrated that environmental multidrug resistant pathogens are present in dairy herds, isolated from intramammary infections cases, free stall parlors, animal's hindlimbs, milking parlor and bulk tank milk. This study also confirmed the high genetic diversity of K. pneumoniae in dairy herds within the same herd, and the importance of PFGE as a molecular epidemiology tool. Keywords: environment, extended-spectrum β-lactamases (ESβL), Klebsiella pneumoniae, mastitis, milk, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) / Mestre

Entre membros da Família Enterobacteriaceae a produção de β-lactamases de espectro estendido (ESBL – Extended-Spectrum β-lactamase) se constitui em um importante mecanismo de resistência a antibióticos β-lactâmicos. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência de ESBL em diferentes gêneros da Família Enterobacteriaceae em um hospital universitário no sul do Brasil. Além disso, avaliou-se o teste de triagem proposto pelo CLSI, o teste que utiliza discos combinados e técnica de PCR para detecção de ESBL na Família Enterobacteriaceae. De forma complementar, foi feita pesquisa de KPC em amostras com resistência (plena ou intermediária) ao ertapenem. Foram analisados 731 isolados da Família Enterobacteriaceae, obtidos a partir de amostras clínicas de pacientes hospitalizados. A prevalência de isolados produtores de ESBL na Família Enterobacteriaceae foi de 26,8% (196/731). Destacam-se Providencia spp. com uma prevalência de 91,7% (11/12), seguida de Klebsiella pneumoniae com 56,7% (59/104) e Enterobacter spp. com 40,7% (48/118). Entre os antibióticos utilizados no Teste Confirmatório Fenotípico, a cefepima foi o substrato que detectou o maior percentual dos isolados (90,6% - 183/202) como produtores de ESBL. Utilizando a técnica de PCR foi possível detectar blaTEM em 89,6% (208/232), blaSHV em 59% (137/232) e blaCTX-M em 37,9% (88/232) dos isolados. Comparando o perfil de suscetibilidade global das amostras ESBL com as demais amostras consideradas como não produtoras de ESBL, notou-se um grande decréscimo na sensibilidade de todos antimicrobianos testados (p < 0,05) nas ESBL positivas. Apenas os carbapenêmicos (Imipenem e Meropenem) apresentaram total eficácia in vitro. Outros antibióticos com maior percentual de sensibilidade para isolados produtores de ESBL foram Amicacina, Doxaciclina e Piperacilina/Tazobactam com 35,1%, 29,9% e 28,0% de sensibilidade, respectivamente. Entre os microrganismos com teste de triagem para ESBL positivo, 39 apresentaram resistência (plena ou intermediária) ao ertapenem, mas em nenhuma destas amostras foi detectado o gene blaKPC por técnica de PCR.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-26T17:18:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese doutorado Alexsandra Scavuzzi.pdf: 8878953 bytes, checksum: 50dba197129c93a6d62fed598bc1f2d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T17:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese doutorado Alexsandra Scavuzzi.pdf: 8878953 bytes, checksum: 50dba197129c93a6d62fed598bc1f2d1 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Foi investigada a ocorrência de genes de resistência a quinolonas (qnrA, qnrB e qnrS), a presença de mutações em gyrA, gyrB e parC, a expressão de bombas de efluxo (acrB e acrF) e mutações no gene ramR, como também foi avaliado alterações ultraestruturais provocadas pela polimixina B, meropenem e pela associação entre polimixina B e meropenem em isolados de Klebsiella pneumoniae portadores de blaKPC-2 provenientes de infecção e colonização, em pacientes de hospitais de Recife-PE, Brasil. Trinta isolados de K. pneumoniae foram selecionados para este estudo, destes, seis isolados foram selecionados para seqüenciamento de DNA e dois foram selecionados para detecção de alterações ultraestruturais. A detecção dos genes qnr, acrB e acrF foram realizadas por PCR seguidas por sequenciamento de DNA. As mutações em ramR e nas QRDRs de gyrA, gyrB e parC foram detectadas por sequenciamento, a expressão das bombas de efluxo foi determinada por RT-PCR e as alterações ultraestruturais foram detectadas por microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Dos isolados analisados, 73,3% (n=22) apresentaram o gene qnrB, sendo detectadas por seqüenciamento as variantes qnrB1 e qnrB12. Esse é o primeiro relato publicado da presença de genes qnrB1 e qnrB12 com blaKPC-2 em K. pneumoniae, como também o primeiro relato mundial da presença do gene qnrB12 em K. pneumoniae. Foram observadas mutações em gyrA S83 em dois isolados e mutação em ramR em um isolado. Todos os isolados apresentaram genes para as bombas de efluxo acrB e acrF. A RT-PCR realizada mostrou que as bombas estavam sendo expressas. Quando submetidos à concentração clinicamente relevante para meropenem, a análsie de microscopia eletrônica mostrou que os isolados apresentaram alterações morfológicas, retração do material citoplasmático, incapacidade de divisão celular, rompimento da parede celular e extravasamento do conteúdo citoplasmático. Quando submetidos à concentração clinicamente relevante de polimixina B os isolados apresentaram perda de membrana celular, retração do material citoplasmático, extravasamento do conteúdo citoplasmático e presença de compartimento membranares. Quando submetidos à concentração clinicamente relevante de meropenem associado com polimixina B, os isolados apresentaram uma maior intensidade das alterações ultraestruturais visualizadas. Portanto, foi observada uma maior alteração celular quando os isolados eram submetidos à associação de meropenem e polimixina. Os resultados obtidos são preocupantes porque foram detectados isolados de K. pneumoniae portadores do gene blaKPC-2, qnrB, mutação em gyrA, expressão de bombas de efluxo acrB e acrF e mutação em ramR, infectando e colonizando pacientes, podendo ser importantes reservatórios para disseminação de diversos mecanismos de resistência no ambiente hospitalar.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-17T12:39:08Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial (Cap.I,II,III,IV e VII) - Polyane Lima - PPGIBA.pdf: 832056 bytes, checksum: a70651fc03df55df1e12db3ec2f97adb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-17T12:39:21Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial (Cap.I,II,III,IV e VII) - Polyane Lima - PPGIBA.pdf: 832056 bytes, checksum: a70651fc03df55df1e12db3ec2f97adb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-17T12:39:21Z (GMT). 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Thus, we investigated the immunomodulatory effect of 16:1 n-9 on experimental infection with K. pneumoniae. In this study, we performed in vitro LPS stimulation and 16:1 n-9 treatment using AMJ2-C11 lineage macrophages and bone marrow derived macrophages (BMDM). Although both macrophages presented different biology, we observed for BMDM the decrease production of inflammatory mediators such as NO, IL-6, KC, MCP-1 after the treatment with 16:1 n-9. In efferocytosis process of neutrophils infected with K. pneumoniae, the treatment with 16:1 n-9 increased phagocytosis by MDMO and IL-1β production, and decreased IL-10. In vivo experiments, mice infected with lethal dose of K. pneumoniae and treated with 16: 1 n-9 (100 μg/mL) had increased survival. The immunomodulatory effects of 16:1 n-9 during the experimental infection by K. pneumoniae were characterized for decrease in neutrophil recruitment in the acute phase of infection, and increased mononuclear cells in the chronic phase, indicating action on resolution of inflammation. The effect on the production of inflammatory, proteic and lipid mediators has also been described, and the data contribute to the resolution effect, however it is not efficient in eliminating the infectious agent. In addition, treatment with 16:1 n-9 had a great influence on the metabolism of eicosanoids. Thereby, we suggest that 16:1 n-9 treatment in pneumonia is potential in resolving an inflammatory process, without immunosuppressive effects, and can be used only as an adjuvant of other pharmacological therapies. / Klebsiella pneumoniae é uma bactéria gram-negativa, oportunistas, podendo causar pneumonia, consequentemente lesão pulmonar intensa e mortalidade correlacionadas com exacerbação da resposta inflamatória. Estudos buscam terapias alternativas para controlar os eventos envolvidos na inflamação, aumentando a resolução e reduzindo o risco de lesão tecidual. Recentemente, um isômero do Ácido palmitoleico, 16:1 n-9 foi descrito em monócitos circulantes e em macrófagos derivados de monócitos, com potencial antiinflamatório. Dessa forma, investigamos o efeito imunomodulador de 16:1 n-9 na infecção experimental por K. pneumoniae. Neste estudo, realizamos experimentos in vitro, com estímulo de LPS e tratamento com 16:1 n-9 em macrófagos de linhagem AMJ2-C11 e macrófagos derivados de medula óssea (MDMO) e observamos que apesar da biologia dos macrófagos serem diferentes, o tratamento diminui a produção de mediadores inflamatórios, como NO, IL-6, KC, MCP-1 nos MDMO. No processo de eferocitose de neutrófilos infectados com K. pneumoniae, o tratamento com 16:1 n-9, aumentou a fagocitose por MDMO e potencializou a produção de IL-1β e diminuiu IL-10. Nos nossos experimentos in vivo, camundongos infectados com dose-letal de K. pneumoniae e tratados com 16:1 n-9 (100 μg/mL) tiveram sobrevida aumentada. Quando analisamos os efeitos imunomoduladores do 16:1 n-9 durante a infecção experimental por K. pneumoniae, observamos a diminuição no recrutamento de neutrófilos na fase aguda da infecção, e aumento das células mononucleares na fase tardia da infecção, que nos indicaram ação na resolução da inflamação. O efeito na produção dos mediadores inflamatórios, proteicos e lipídicos também foram descritos, e os dados colaboram com o efeito de resolução, apesar de não ser eficiente na eliminação do agente infeccioso. Por outro lado, o tratamento com 16:1 n-9 teve grande influência no metabolismo de eicosanoides. Assim, sugerimos que o tratamento com 16:1 n- 9 na pneumonia apresenta-se com capacidade de resolução em processo inflamatório, não sendo imunossupressor, mas podendo ser utilizado apenas como um adjuvante de outras terapias farmacológicas.

Bestrophins are a family of calcium (Ca²⁺) -activated chloride (Cl⁻) channels (CaCCs) with functional importance in eye physiology. Mutations to the VMD2 gene, which encodes the Best1 protein, cause an array of degenerative eye disorders called bestrophinopathies, which result from aberrant CaCC activity of the Best1 channel in the pigmented epithelium of the retina. While there are four bestrophin paralogs in mammals (Best1-4), the only current structures are of Best1 homologs. The structure of the prokaryotic homolog of Best1 from Klebsiella pneumonia (KpBest) was previously solved in this lab, representing the first structure of a Best1 homolog at the time. This initial study laid the foundational groundwork in the field and contributed significant knowledge to understanding the bestrophin structure-function relationship. Nevertheless, significant questions remain regarding bestrophin function, such as the molecular determinants underlying its Ca²⁺-dependent gating and anion selectivity. This dissertation uses single-particle cryogenic electron microscopy paired with electrophysiology to probe the structure-function relationship of mammalian bestrophins under different buffer conditions and reveals conformational dynamics involved in gating of wild-type channels. Key regions of the channel contributing to its function are described at the atomic level leading to development of a gating model to explain Ca²⁺-dependent activation and inactivation in mammalian bestrophins.

This master thesis deals with typing of Klebsiella pneumoniae isolates. The first part of the thesis introduces molecular typing methods. Then bacterial genomes and Klebsiella pneumoniae are characterized. Following part describes data validation, assembly of genomes and proposed algorithm for finding genes with high variability. In last part obtained results are presented and validated on other genomes of Klebsiella pneumoniae.