KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) são -lactamases da classe A de Ambler globalmente disseminadas, com 10 variantes, sendo predominates KPC-2 e KPC-3. O objetivo deste trabalho foi estudar a genética e epidemiologia molecular de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos isoladas no Brasil. Sessenta e quatro enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos foram analisadas: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) e 1 Citrobacter freundii (Cf), de diferentes pacientes, em seis hospitais e em duas distintas regiões do Brasil. Identificação e testes de sensibilidade antimicrobiana foram realizados por sistemas semi-automáticos e métodos padronizados. A relação clonal foi estabelecido por Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) e também por tipagem por sequenciamento de multilocus no caso de K. pneumoniae. A presença de genes que codificam carbapenemases e -lactamases de espectro estendido foi pesquisada. A caracterização de blaKPC-2, do ambiente genético e de plasmídeos incluiu PCR e sequenciamento, análises de RFLP, S1-PFGE e hibridação. Os isolados Kp corresponderam a 5 pulsotipos, por PFGE, ligados a 6 tipos de sequência (ST): KPA-ST258 (n = 51 com 6 subtipos), KpA6-ST11 (n = 1), KPB-ST327 (n = 1), KPC-ST44 (n = 2), KPD-ST437 (n = 1) e KPE-ST48 (n = 1). Ecl foram agrupados em clones e e, Sm e Cf representam um clone cada. Todos os isolados foram resistentes aos -lactâmicos, sensíveis à colistina e tigeciclina e mostraram fenótipos variáveis contra aminoglicosídeos, quinolonas, nitrofurantoína e sulfametoxazol-trimetoprim. Heterorresistência a carbapenêmicos foi observada para isolados de Kp e Cf, conforme relatado anteriormente com produtores de KPC-2 e VIM. Esse estudo relata a disseminação do gene blaKPC-2 nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro facilitada por clones de K. pneumoniae pertencentes ao globalmente disseminado Complexo Clonal CC258 (ST258, ST437 e ST11) e uma diversidade de plasmídeos (IncFII-KpA, IncN-Kp e Ecl, IncL/M-Sm e Cf e, dois plasmídeos não-tipáveis carreando Tn4401a ou Tn4401b) disseminados com sucesso entre as enterobactérias. Constitui também a primeira descrição do ST258 no Brasil associada a um surto em um hospital universitário da cidade de Ribeirao Preto. Este trabalho apontou a alta diversidade de elementos genéticos disponíveis abrigando blaKPC-2. Isso poderia ampliar enormemente a disseminação desse gene no Brasil como também no continente. / KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) are globally spread -lactamases of the Ambler class A comprising 10 variants, KPC-2 and KPC-3 being predominant. The objective of this work was study the genetic and molecular epidemiology of carbapenem resistant-enterobacterial isolates in Brazil. Sixty-four carbapenem resistant isolates were analyzed: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) and 1 Citrobacter freundii (Cf) from different patients at six hospitals in two different Brazilian regions. Identification and antimicrobial susceptibility testing were accomplished by using semiautomatic systems and standard methods. Clonal relatedness was established by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) and also by multilocus sequence typing in the case K. pneumoniae isolates. The presence of genes encoding carbapenemases and extended spectrum -lactamases was searched. Characterization of blaKPC-2, genetic environment and plasmids included PCR and further sequencing, RFLP analyses, S1-PFGE and hybridization. The Kp isolates corresponded to 5 PFGE types linked to 6 sequence types (ST): KpA-ST258 (n=51 comprising 6 subtypes), KpA6-ST11 (n=1), KpB-ST327 (n=1), KpC-ST44 (n=2), KpD-ST437 (n=1) and KpE-ST48 (n=1). Ecl isolates were grouped in and clones and, Sm and Cf represent one clone each. All isolates were resistant to -lactams, susceptible to colistin and tigecycline and showed variable phenotype against aminoglycosides, quinolones, nitrofurantoin and trimethoprim-sulfamethoxazole. Heteroresistance to carbapenems was observed for Kp and Cf isolates, as previously reported to KPC-2 and VIM producers. This study reports the spread of blaKPC-2 in Sao Paulo and Rio de Janeiro states facilitated by globally spread CC258-K. pneumoniae clones (ST258, ST11, ST437) and a diversity of plasmids (IncFII-KpA, IncN-Kp and Ecl, IncL/M-Sm and Cf and, two untypeable plasmids carrying Tn4401a or Tn4401b) successfully disseminated among Enterobacteriaceae species. It also constitutes the first description of ST258 in Brazil which was associated with a hospital outbreak in Ribeirao Preto city. This work pointed out the high diversity of available genetic elements harboring blaKPC-2. This might greatly amplify the dissemination of KPC genetic in Brazil and within of the South America continent.

Atualmente, no Brasil, a produção de enzimas do tipo KPC constitui o principal mecanismo de resistência aos carbapenêmicos em Klebsiella pneumoniae, contribuindo para a endemicidade hospitalar da espécie. No presente estudo, foi caracterizada a produção de KPC em 38 enterobactérias que foram diferençadas entre os grupos CESP (enterobactérias com produção induzida da βlactamase AmpC, ex., Enterobacter spp., Serratia marcescens e Morganella morganii) e não CESP (ex., Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e Proteus mirabilis). pertencendo a isolados recuperados de pacientes colonizados e/ou apresentando infecção urinária, pneumonia ou bacteremia, em três centros médicos de três diferentes regiões do Brasil (Amazonas, Mato grosso, Minas Gerais), durante 2008-2013. Os isolados apresentaram resistência para cefalosporinas de amplo espectro (86,8 - 94,7%), cefoxitina (86,8%), ertapenem (89,4%), imipenem (89,4%), meropenem (84,2%), amicacina (86,8%), ciprof1oxacina (84,2%), tigeciclina (42,1 %, CIM50= 2 µg/ml), sulfametoxazol/trimetoprim (SXT, 60,5%) e gentamicina (57,8%). Entre bactérias do grupo CESP, os isolados de S. marcescens apresentaram sensibilidade para fosfomicina (CIM50= 8 µg/mL) e sulfametoxazol-trimetoprim (CIM50= 1/19 µg/mL). A produção de carbapenemase foi confirmada pelo teste de Hodge modificado e por inibição por acido fenil borônico em 76,31 e 73,68% dos isolados do grupo CESP e não CESP, respectivamente. A presença do gene blaKPC-2 foi confirmada em 78,9% dos isolados clinicos e variantes do gene blaCTX-M foram identificados em 57,89% das cepas. Cepas de S. marcescens e E. aerogenes clonalmente relacionadas por ERIC-PCR foram associadas a surtos de infecção nosocomial. Resultados do presente estudo confirmam que a produção de KPC no Brasil, ocorre em uma grande variedade de espécies de enterobactérias sendo frequentemente associada com a co-produção de ESBLs do tipo CTX-M, o que poderia favorecer a endemicidade com o subseqüente estabelecimento de surtos de infecção. Um dado relevante, foi à alta resistência a fosfomicina (66,66%) associada à presença do gene fosA2 em cepas de E. aerogenes e K. pneumoniae produtores de KPC-2. / Currently, in Brazil, the production of KPC-type enzymes is considered the main mechanism of carbapenem resistance in Klebsiella pneumoniae, which has contributed for the nosocomial endemicity of this specie. In this study, the KPC production was characterized in 38 Enterobacteriaceae isolates differenced among CESP (Enterobacteriaceae with inducible production of AmpC-type β-lactamase, i.e., Enterobacter spp., Serratia marcescens and Morganella morganii) and not CESP (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e Proteus mirabilis) groups recovered from colonized patients and/or with urinary tract infection, pneumonia or bacteremia, in three medicai centers from different regions of Brazil (Amazonas, Mato Grosso, Minas Gerais) during 2011-2013. The isolates were resistant to broad-spectrum cephalosporins (86.8 - 94.7%), cefoxitin (86.8%), ertapenem (89.4%), imipenem (89.4%), meropenem (84.2%), amikacin (86.8%), ciprofloxacin (84.2%), tigecycline (42.1 %, MIC50 = 2 µg/mL), trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT, 60.5%) and gentamicin (57.8%). S. Marcescens isolates exhibited additional susceptibility to fosfomycin (MIC50 = 8 µg/mL) and sulfamethoxazole-trimethoprim (MIC50 = 1/19 µg/mL). Carbapenemase production was confirmed by Hodge modified test and inhibition by phenyl boronic acid in 76.31 and 73.68% of CESP and no CESP isolates, respectively. In fact, the presence of the blaKPC-2 gene was confirmed in 78.9% of enterobacterial isolates, whereas blaCTX-M ESBL gene variants were identified in 57.89% of the strains. S. Marcescens and E. aerogenes isolates were clonally related by ERIC-PCR being associated with outbreaks of nosocomial infection. Results of this study confirm that the production of KPC in Brazil occurs in a variety of species of Enterobacteriacea producing CTX-M-rype ESBLs, favoring the endemicity and the establisbment of outbreaks. A relevant finding was the high resistance to fosfomycin (66.66%) associated with the presence of the fosA2 gene in KPC-2-producing E. aerogenes and K. pneumoniae strains.

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INTRODUÇÃO: O tratamento das infecções relacionadas à assistência à saúde, causadas por enterobactérias, representa um desafio crescente, em função do aumento da prevalência de resistência aos betalactâmicos, em particular às cefalosporinas de terceira e quarta gerações e carbapenêmicos. Os mecanismos de resistência mais relevantes a essas classes de antimicrobianos, em enterobactérias, é a produção de betalactamases de espectro ampliado e carbapenemases. Os objetivos do estudo foram: (1) determinar a frequência e caracterizar betalactamases de espectro ampliado (ESBL); (2) determinar a frequência e caracterizar o gene blaKPC-2; (3) avaliar a relação clonal entre isolados produtores de ESBL ou KPC, uma coleção de isolados do gênero Enterobacter cultivadas de casos de infecções relacionadas aos cuidados com a saúde diagnosticadas em pacientes atendidos em hospitais da cidade de São Paulo. MÉTODOS: Foram estudadas 141 isolados do gênero Enterobacter quanto à produção de ESBL pelo método de Jarlier e colaboradores, concentrações inibitórias mínimas para cefotaxima, cefepima e ceftazidima pelo método da diluição em ágar, halo de inibição para ertapenem pelo método de Kirby-Bauer e presença de genes que codificam ESBL ou KPC, por PCR. RESULTADOS: A frequência de isolados produtores de ESBL, quando utilizado o método de Jarlier e colaboradores foi de 22,7%. Os genes que codificam cefotaximases foram detectados em 34,4% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, e houve predomínio do grupo da CTX-M-8, enquanto os genes que codificam variantes SHV foram detectados em 18,7% dos produtores de ESBL. Os genes blaTEM-1 e blaOXA-1 foram detectados em 62,5%; 12,5% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, mas não são ESBLs. Não houve detecção do gene que codifica a enzima BES-1 na amostragem. O gene blaKPC-2 foi detectado em três dos 15 isolados produtores de ESBL e resistentes ao ertapenem. Os perfis obtidos por ERIC-PCR sugerem a disseminação de um clone de E. aerogenes entre instituições hospitalares. CONCLUSÕES: Os determinantes genéticos de ESBLs predominantes na amostragem analisada são derivados de blaCTX-M. A presença de grupos clonais em instituições hospitalares distintas, evidencia disseminação entre hospitais. A presença de KPC em Enterobacter é reportada pela primeira vez em São Paulo / INTRODUCTION: The treatment of healthcare associated infections caused by enterobacteria represents a growing challenge due to the increasing prevalence of beta-lactam resistance, particularly to third and fourth generations cephalosporins and carbapenems. The main mechanisms of resistance to these antimicrobial classes are the production of extended spectrum beta-lactamases and carbapenemases. The objectives of this study were: (1) determine the frequency and characterize extended spectrum beta-lactamases; (2) determine the frequency and characterize blaKPC; (3) evaluate the clonal relation among ESBL or KPC producers, in a collection of Enterobacter isolates cultivated from cases of healthcare associated infections in patients from hospitals located in the city of São Paulo. METHODS: A total of 141 Enterobacter isolates were studied concerning ESBL production using the method from Jarlier and colleagues, minimum inhibitory concentrations for cefotaxime, ceftazidime and cefepime by agar dilution method, inhibition zone for ertapenem by by Kirby-Bauer method and the presence of genes coding for ESBLs or KPCs, by PCR. RESULTS: The frequency of ESBL producers using Jarlier´s method was 22.7%. Genes coding for cefotaximases were detected in 34.4% of isolates with a positive test for ESBl and CTX-M-8 group was predominant, but blaSHV variants were also detected in 18.7% of the ESBL producres. blaTEM-1, and blaOXA-1 genes were detected in 62.5%; 12.5% of all isolates with a positive phenotypic test for ESBL, but there are not ESBLs. The blaKPC-2 gene was detected in three among 15 ESBL producers that were also resistant to ertapenem. ERIC-PCR profiles suggest the dissemination of an E. aerogenes clone among hospitals. CONCLUSIONS: The predominant ESBL determinants in the sample analyzed derive from blaCTX-M. The presence of the same clonal groups in different hospitals indicates inter-hospital dissemination. The presence of KPC producing Enterobacter is reported for the first time in São Paulo

INTRODUÇÃO: O aumento da incidência de infecções causadas por bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos limita cada vez mais as opções terapêuticas, dificultando o tratamento e aumentando os índices de morbidade e mortalidade, além dos gastos em saúde. Ao longo dos últimos cinco anos, essa limitação tem levado ao reestabelecimento do uso de antimicrobianos consideradas ultrapassados, como as polimixinas. Este grupo passou a ser utilizado com cada vez mais frequência no tratamento de infecções causadas por microrganismos gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos. As enterobactérias, em particular a espécie Klebsiella pneumoniae, tem apresentado frequentemente esse perfil, porém, a resistência à polimixinas têm sido relatada, eliminando essa importante alternativa terapêutica. Apesar da importância do tema, são escassas as publicações sobre frequência de resistência às polimixinas em K. pneumoniae e a relação clonal entre isolados resistentes à polimixina B no Brasil. OBJETIVOS: Avaliar a relação genética, perfil de sensibilidade antimicrobiana e mecanismos de resistência às polimixinas em K. pneumoniae. MATERIAIS E MÉTODOS: A execução deste trabalho dividiu-se em duas partes principais: (i) levantamento de dados de culturas positivas para K. pneumoniae da rotina de pacientes hospitalizados em instituições atendidas pelo serviço de análises clínicas do Fleury Medicina e Saúde; (ii) confirmação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) para polimixina B, avaliação da relação clonal por eletroforese em campos pulsados (PFGE),e sequenciamento de múltiplos loci (MLST), avaliação da integridade do gene mgrB e da presença do gene mcr-1 por PCR entre isolados resistentes à polimixina B e aos carbapenêmicos (CPRKp). RESULTADOS e CONCLUSÕES: Na análise de 3.085 isolados de K. pneumoniae obtidos de pacientes internados em 11 hospitais da Grande São Paulo entre os anos de 2011 e 2015, foi evidenciado um aumento estatisticamente significativo na resistência aos carbapenêmicos de 6,8% em 2011 para 35,5% em 2015. Em 2015, KPC foi detectada em 96,2% dos isolados resistentes aos carbapenêmicos. A distribuição das concentrações inibitórias mínimas de polimixina B entre todos os isolados de K. pneumoniae evidenciou uma distribuição bimodal com a CIM de 2 mg/L como o valor de ponto de corte para a susceptibilidade à polimixina B; assim, 3,6% do número total de isolados sensíveis aos carbapenêmicos foram interpretados como resistentes enquanto essa proporção foi de 22,5% entre as resistentes aos carbapenêmicos (CRKp). Entre esses últimos isolados também houve um aumento estatisticamente significativo na tendência anual de resistência à polimixina B, de 0% em 2011 para 27,1% em 2015. Estas taxas variaram de 0,7% em 2011 para 3,9% até junho de 2014 entre os sensíveis aos carbapenêmicos. Entre os antimicrobianos alternativos, a amicacina e a tigeciclina foram os compostos mais ativos. A análise por PFGE de 60 isolados de CPRKp obtidos de pacientes distintos nos anos de 2014 e 2015 evidenciou dois grandes grupos clonais: CPRKp1 e CPRKp2, os quais segundo a análise por MLST pertencem, respectivamente, aos grupos ST11 e ST437, ambos do complexo clonal 258. Foi observado o mesmo grupo ST entre isolados obtidos dentro de um mesmo hospital e também entre diferentes hospitais, públicos e privados. O mecanismo de resistência mais comum entre os isolados de CPRKp foi a presença de sequências de inserção interrompendo o gene mgrB. O gene mcr-1 não foi detectado em nenhum dos isolados. / INTRODUCTION: The increasing incidence of infections caused by bacteria resistant to multiple antimicrobials increasingly limits therapeutic options, making treatment difficult and increasing the morbidity and mortality and health spending. Over the past five years, this limitation has led to the reestablishment of the use of antimicrobials deemed outdated, such as polymyxins. This group is now used with increasing frequency to treat infections caused by carbapenem-resistant gram-negative microorganisms. Enterobacteria, especially Klebsiella pneumoniae, have often presented this profile, however, resistance to polymyxins have been also reported, eliminating this important therapeutic alternative. Despite the importance of this issue, the publications are scarce on the polymyxins resistance frequency in K. pneumoniae and clonal relationship among isolates resistant to polymyxin B in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the genetic relationship, antimicrobial susceptibility profile and polymyxin B resistance mechanisms in K. pneumoniae. MATERIALS AND METHODS: The execution of this work was divided into two main parts: (i) survey data on routine cultures positive for K. pneumoniae from patients hospitalized in institutions attended by the clinical analysis service of Fleury Health and Medicine; (ii) confirmation of to polymyxin B minimum inhibitory concentrations (MIC), evaluation of clonal relationship by electrophoresis pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), evaluation of the integrity of the mgrB gene and the presence of mcr-1 gene by PCR among isolates resistant to polymyxin B and carbapenems (CPRKp). RESULTS AND CONCLUSIONS: The analysis of 3,085 K. pneumoniae isolates obtained from inpatients from 11 hospitals in the São Paulo urban area between 2011 and 2015, has shown a statistically significant increase in carbapenem resistance from 6.8% in 2011 to 35.5% in 2015. In 2015, KPC was detected in 96.2% of isolates resistant to carbapenems. The polymyxin B MIC distribution of all Klebsiella pneumoniae showed a bimodal distribution with the MIC of 2 mg/L as the cutoff value for polymyxin B susceptibility; thus, 3.6% of the total number of isolates susceptible to carbapenems were interpreted as resistant while this proportion was 22.5% among carbapenem-resistant isolates (CRKp). Among these isolates there was also a statistically significant increase in the annual trend of polymyxin B resistance, from 0% in 2011 to 27.1% in 2015. These rates ranged from 0.7% in 2011 to 3.9% by June 2014 between carbapenem-susceptible isolates. Among alternative antimicrobials, amikacin and tigecycline were the most active compounds. The analysis by PFGE of 60 CPRKp isolates obtained from different patients in the years 2014 and 2015 showed two major clonal groups: CPRKp1 and CPRKp2, which according to the analysis by MLST belong respectively to ST11 and ST437 groups, both from clonal complex 258. We observed the same ST group of isolates obtained within a hospital and between different public and private hospitals. The most common mechanism of polymyxin B resistance among CPRKp isolates was the presence of insertion sequences interrupting the mgrB gene. The mcr-1 gene was not detected in any of the isolates.

A resistência bacteriana a antibióticos é um grave e crescente problema de saúde pública de âmbito mundial. O principal, e mais eficiente, mecanismo de resistência aos &#946-lactâmicos em bacilos Gram-negativos é a produção de &#946-lactamases, que possuem a capacidade de hidrolisar o anel &#946-lactâmicos e consequentemente inativar essa classe de antibióticos. Vale ressaltar, que atualmente os antibióticos &#946-lactâmicos são os mais utilizados clinicamente, particularmente em infecções graves. Dentre as &#946-lactamases existentes destacam-se as carbapenemases, enzimas capazes de inativar a maioria dos antibióticos &#946-lactâmicos. Uma grande preocupação é o fato dessas enzimas, em sua maioria, serem codificadas por plasmídeos, o que propicia a disseminação desses genes de resistência; portanto, é de extrema importância a realização de um rápido e efetivo monitoramento da presença de patógenos portadores desses genes de resistência, para que assim se possa prevenir a disseminação desses determinantes. Foram incluídos neste estudo 230 amostras únicas de Acinetobacter e Pseudomonas aeruginosa resistentes a imipenem detectados em pacientes internados em hospitais privados da cidade de São Paulo durante o período de fevereiro a outubro de 2013. As amostras foram avaliadas quanto à hidrólise de imipenem por espectrofotometria, quanto à presença de genes de carbapenemases por PCR e sequenciamento, e quanto à clonalidade por eletroforese em campos pulsados (PFGE) ou ERIC-PCR. Foram realizados ensaios de conjugação, transformação e sequenciamento completo de plasmídeos. Dentre as amostras de Acinetobacter spp. 80% (88) foram capazes de hidrolisar o imipenem. Dentre esses 76,1% (67) foram positivos para blaOXA-51-like, 19,3% (17) foram positivos para blaOXA-72. blaOXA-23, blaOXA-482 e blaIMP-1 foram detectados isoladamente em isolados distintos. O gene blaIMP-1 foi detectado em A. ursingii inserido em integron de classe 1 e representa a primeira descrição no Brasil. Uma nova carbapenemase OXA-482-like foi detectada em A. baumanii. Utilizando-se ERIC-PCR, observou-se uma grande diversidade de grupos clonais, com o máximo de quatro isolados por grupo. Dentre as amostras de P. aeruginosa, apenas 35,3% foram capazes de hidrolisar o imipenem. Dessas amostras, 14 possuíam o gene blaSPM-1, e isolados únicos possuíam, individualmente, os genes blaIMP, blaVIM, blaKPC-2 ou blaGES-23. O gene blaKPC-2 foi detectado inserido em contexto genético diferente dos descritos anteriormente, em plasmídeo IncU de 32 Kb, mobilizável, mas não conjugativo. Esta é a primeira descrição da sequencia completa de plasmídeo albergando o gene blaKPC-2 em P. aeruginosa no Brasil. Nas demais amostras (20) com atividade hidrolítica, não foram detectados genes de carbapenemase conhecidos, o que sugere a presença de genes de carbapenemase ainda não descritos. Em três amostras foi possível obter transformantes com plasmídeos, resistentes a carbapenêmicos. As amostras com blaSPM-1 apresentaram perfis de PFGE estreitamente relacionados. Em contraste, os perfis de PFGE das amostras com potenciais novas carbapenemases apresentaram índice de similaridade de Dice inferior ix a 80%, evidenciando grande diversidade clonal. Nossos achados evidenciam que a carbapenemase não intrínseca predominante em Acinetobacterem hospitais privados da cidade de São Paulo é OXA-72, e em hospitais privados há uma grande diversidade clonal. Em P. aeruginosa, a carbapenemase predominante é SPM-1, cuja disseminação é mediada por um único clone. Há potencialmente um número significativo de novas carbapenemases em Acinetobacter e P. aeruginosa, algumas delas mediadas por plasmídeos. / Bacterial resistance to antibiotics is a serious and growing public health problem worldwide. The main and most efficient mechanism of resistance to &#946-lactams in Gram-negative bacilli is the production of &#946-lactamases, which have the ability to hydrolyze the &#946-lactam ring and consequently inactivate this class of antibiotics. It is worth mentioning that currently &#946-lactam antibiotics are the most used clinically, particularly in severe infections. Among the existing &#946-lactamases, carbapenemases are capable of inactivating most &#946-lactam antibiotics. A major concern is that these enzymes are mostly encoded by plasmids, which facilitates the spread of these resistance genes; therefore, it is of extreme importance to carry out a rapid and effective monitoring of the presence of pathogens bearing these resistance genes, in order to prevent the dissemination of these determinants. This study included 230 unique samples of imipenem-resistant Acinetobacterand Pseudomonas aeruginosa detected in patients hospitalized in private hospitals in the city of São Paulo during the period from February to October 2013. The samples were evaluated for the imipenem hydrolysis by spectrophotometry, the presence of carbapenemase genes by PCR and sequencing, and concerning clonality by pulsed field electrophoresis (PFGE) or ERIC-PCR. Conjugation, transformation and complete sequencing of plasmids were performed. Among Acinetobacter spp. samples, 80% (88) were able to hydrolyze imipenem. Among these, 76.1% (67) were positive for blaOXA-51-like genes and 19.3% (17) were positive for blaOXA-72. The blaOXA-23, blaOXA-482 and blaIMP-1 genes were detected alone in distinct isolates. The blaIMP-1 gene was detected in A. ursingii inserted in class 1 integron and represents the first description in Brazil. A novel OXA-482-like carbapenemase was detected in A. baumanii. Using ERIC-PCR, a great diversity of clonal groups was observed, with a maximum of four isolates per group. Among P. aeruginosa samples, only 35.3% were able to hydrolyze imipenem. Of these samples, 14 had the blaSPM-1 gene, and single isolates individually possessed the blaIMP, blaVIM, blaKPC-2 or blaGES-23 genes. The blaKPC-2 gene was found inserted in a genetic context different from those described previously, in a mobilizable, but not conjugative, 32 Kb IncU plasmid. This is the first description of the complete nucleotide sequence of a plasmid harboring the blaKPC-2 gene in P. aeruginosa in Brazil. In the remaining samples (20) with hydrolytic activity, no known carbapenemase genes were detected, suggesting the presence of carbapenemase genes not yet described. In three samples it was possible to obtain transformants with plasmids, resistant to carbapenems. Samples with blaSPM-1 showed closely related PFGE profiles. In contrast, the PFGE profiles of the samples with potential new carbapenemases showed Dice similarity index lower than 80%, evidencing a great clonal diversity. Our findings show that the predominant non-intrinsic carbapenemase in Acinetobacter in the city of São Paulo is OXA-72, and in private hospitals there is great clonal diversity. In P. aeruginosa, the predominant carbapenemase is SPM-1, the spread of this enzyme is mediated by a single clone. There are potentially a significant number of new carbapenemases in Acinetobacter and P. aeruginosa, some of them plasmid mediated.

Bacterial resistance is one of the worldwide public health issues. This work aimed to genetically characterize species of the family Enterobacteriaceae phenotipic producing ESBL and KPC obtained from patients of Alagoas. Bacteria were identified by semi-automated tests. Confirmed as producing ESBL and KPC by phenotypic screening tests. The antimicrobial in vitro susceptibility test was performed by disk-diffusion method. DNA was extracted by boiling method at 95ºC. The resistance genes blaTEM, blaCTX-M, blaSHV e blaKPC were identified with specific primers and genetic typing was performed by PCR with the microsatellite (GTG)5. 254 isolates of enterobacteria were obtained, of which 92,12% (234/254) had some of the genes blaTEM, blaCTX-M, blaSHV or blaKPC, 87,18% (204/234) ESBL (blaTEM, blaCTX-M, blaSHV) and 12,82% (30/234) KPC (blaKPC). Of these 234 isolates, 4,7% (11/234) were community-acquired infections with genes that express ESBL and 95,3% (223/234) of hospital infections, of which 86,55% (193/223) ESBL and 13,45% (30/223) KPC. BlaCTX-M (> 80%) was the most frequent type gene in enterobacteria. Urinary infections were the most frequent cases of infection in the community by Escherichia coli (54,55%) and Klebsiella pneumoniae (39,46%) in the hospital. BlaKPC was identified only in bacteria of hospital infections, especially in K. pneumoniae (30%). At the ICUs (38,57%) were obtained the most number of isolates producing ESBL and KPC. These enterobacteria showed multidrug resistance phenotypes with high levels for aminoglycosides, fluoroquinolones and sulfamethoxazole/trimethoprim. Associations between genotypes and antibiotic resistance were observed. Cases of clonal spread were identified in the hospital of Alagoas by enterobacteria producing ESBL and KPC. There is a predominance of genes blaTEM, blaCTX-M, blaSHV and blaKPC among isolates of enterobacteria resistant to beta-lactam, with the prevalence of the genetic element blaCTX-M. The clonal spread have contributed to the high levels of beta-lactam resistance among isolates of enterobacteria at hospitals in this study. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / A resistência bacteriana representa um dos problemas mundiais de saúde pública. Este trabalho teve como objetivo caracterizar geneticamente espécies da família Enterobacteriaceae produtoras fenotípicas de ESBL e KPC obtidas de pacientes de Alagoas. As bactérias foram identificadas por testes semi-automatizados. Confirmadas como produtoras de ESBL e KPC por testes fenotípicos de triagem. O teste de susceptibilidade in vitro aos antimicrobianos foi realizado pelo método de disco-difusão. O DNA foi extraído pelo método de fervura à 95ºC. Os genes de resistência blaTEM, blaCTX-M, blaSHV e blaKPC foram identificados com oligonucleotídeos específicos e a tipagem genética foi realizada pela PCR com o microssatélite (GTG)5. Foram obtidos 254 isolados de enterobactérias, dos quais 92,12% (234/254) apresentaram alguns dos genes blaTEM, blaCTX-M, blaSHV ou blaKPC, sendo 87,18% (204/234) ESBL (blaTEM, blaCTX-M, blaSHV) e 12,82% (30/234) KPC (blaKPC). Desses 234 isolados, 4,7% (11/234) foram de infecções comunitárias com os genes que expressam ESBL e 95,3% (223/234) de infecções hospitalares, dos quais 86,55% (193/223) ESBL e 13,45% (30/223) KPC. BlaCTX-M (> 80%) foi o tipo gênico mais frequente nas enterobactérias. As infecções urinárias foram os casos mais frequentes de infecção na comunidade por Escherichia coli (54,55%) e Klebsiella pneumoniae (39,46%) no ambiente hospitalar. BlaKPC foi identificado apenas em bactérias causadoras de infecção hospitalar, principalmente em K. pneumoniae (30%). Nas UTIs (38,57%) foram obtidos o maior número de isolados produtores de ESBL e KPC. Estas enterobactérias apresentaram fenótipos de multidroga resistência com elevados níveis para os aminoglicosídeos, fluoroquinolonas e sulfametoxazol/trimetoprim. Associações entre os genótipos e à resistência aos antibióticos foram observadas. Casos de disseminação clonal foram identificados no ambiente hospitalar de Alagoas por enterobactérias produtoras de ESBL e KPC. Há uma predominância dos genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M e blaKPC entre os isolados de enterobactérias resistentes aos beta-lactâmicos, com prevalência do elemento genético blaCTX-M. A disseminação clonal tem contribuído para os elevados níveis de resistência aos beta-lactâmicos entre os isolados de enterobactérias nos hospitais deste estudo.

INTRODUÇÃO: O tratamento das infecções relacionadas à assistência à saúde, causadas por enterobactérias, representa um desafio crescente, em função do aumento da prevalência de resistência aos betalactâmicos, em particular às cefalosporinas de terceira e quarta gerações e carbapenêmicos. Os mecanismos de resistência mais relevantes a essas classes de antimicrobianos, em enterobactérias, é a produção de betalactamases de espectro ampliado e carbapenemases. Os objetivos do estudo foram: (1) determinar a frequência e caracterizar betalactamases de espectro ampliado (ESBL); (2) determinar a frequência e caracterizar o gene blaKPC-2; (3) avaliar a relação clonal entre isolados produtores de ESBL ou KPC, uma coleção de isolados do gênero Enterobacter cultivadas de casos de infecções relacionadas aos cuidados com a saúde diagnosticadas em pacientes atendidos em hospitais da cidade de São Paulo. MÉTODOS: Foram estudadas 141 isolados do gênero Enterobacter quanto à produção de ESBL pelo método de Jarlier e colaboradores, concentrações inibitórias mínimas para cefotaxima, cefepima e ceftazidima pelo método da diluição em ágar, halo de inibição para ertapenem pelo método de Kirby-Bauer e presença de genes que codificam ESBL ou KPC, por PCR. RESULTADOS: A frequência de isolados produtores de ESBL, quando utilizado o método de Jarlier e colaboradores foi de 22,7%. Os genes que codificam cefotaximases foram detectados em 34,4% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, e houve predomínio do grupo da CTX-M-8, enquanto os genes que codificam variantes SHV foram detectados em 18,7% dos produtores de ESBL. Os genes blaTEM-1 e blaOXA-1 foram detectados em 62,5%; 12,5% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, mas não são ESBLs. Não houve detecção do gene que codifica a enzima BES-1 na amostragem. O gene blaKPC-2 foi detectado em três dos 15 isolados produtores de ESBL e resistentes ao ertapenem. Os perfis obtidos por ERIC-PCR sugerem a disseminação de um clone de E. aerogenes entre instituições hospitalares. CONCLUSÕES: Os determinantes genéticos de ESBLs predominantes na amostragem analisada são derivados de blaCTX-M. A presença de grupos clonais em instituições hospitalares distintas, evidencia disseminação entre hospitais. A presença de KPC em Enterobacter é reportada pela primeira vez em São Paulo / INTRODUCTION: The treatment of healthcare associated infections caused by enterobacteria represents a growing challenge due to the increasing prevalence of beta-lactam resistance, particularly to third and fourth generations cephalosporins and carbapenems. The main mechanisms of resistance to these antimicrobial classes are the production of extended spectrum beta-lactamases and carbapenemases. The objectives of this study were: (1) determine the frequency and characterize extended spectrum beta-lactamases; (2) determine the frequency and characterize blaKPC; (3) evaluate the clonal relation among ESBL or KPC producers, in a collection of Enterobacter isolates cultivated from cases of healthcare associated infections in patients from hospitals located in the city of São Paulo. METHODS: A total of 141 Enterobacter isolates were studied concerning ESBL production using the method from Jarlier and colleagues, minimum inhibitory concentrations for cefotaxime, ceftazidime and cefepime by agar dilution method, inhibition zone for ertapenem by by Kirby-Bauer method and the presence of genes coding for ESBLs or KPCs, by PCR. RESULTS: The frequency of ESBL producers using Jarlier´s method was 22.7%. Genes coding for cefotaximases were detected in 34.4% of isolates with a positive test for ESBl and CTX-M-8 group was predominant, but blaSHV variants were also detected in 18.7% of the ESBL producres. blaTEM-1, and blaOXA-1 genes were detected in 62.5%; 12.5% of all isolates with a positive phenotypic test for ESBL, but there are not ESBLs. The blaKPC-2 gene was detected in three among 15 ESBL producers that were also resistant to ertapenem. ERIC-PCR profiles suggest the dissemination of an E. aerogenes clone among hospitals. CONCLUSIONS: The predominant ESBL determinants in the sample analyzed derive from blaCTX-M. The presence of the same clonal groups in different hospitals indicates inter-hospital dissemination. The presence of KPC producing Enterobacter is reported for the first time in São Paulo

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A produção de β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) tem sido descrita como um importante mecanismo de resistência aos β-lactâmicos. De maneira geral, Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae são as espécies bacterianas mais comumente encontradas produzindo ESBL, embora a detecção dessas enzimas já tenha sido observada em diversos gêneros dentro da família Enterobacteriaceae. O objetivo deste estudo foi avaliar os perfis de susceptibilidade a antimicrobianos e correlacionar os testes fenotípicos com a detecção de marcadores genéticos para produção de β-lactamases dos tipos ESBL, AmpC e KPC em enterobactérias associadas à etiologia de ITUs em pacientes atendidos em um Laboratório de Análises Clínicas da cidade de Juiz de Fora, MG. Para o estudo restrospectivo (20012008), 66.660 isolados de urina com suspeita de ITU foram analisadas, e após a identificação bioquímica, as linhagens de enterobactérias foram submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos, pelo método de disco-difusão, de acordo com as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute/CLSI. A detecção fenotípica da produção de ESBL foi feita através do teste de aproximação dos discos. Para o estudo prospectivo (2009), 12.304 amostras com suspeita de ITU foram avaliadas, e após a identificação bioquímica das linhagens, foram feitos os testes de susceptibilidade aos antimicrobianos e o teste de aproximação dos discos, para a detecção fenotípica da produção de ESBL. A identificação dos marcadores de β-lactamase (SHV, TEM, CTX-M, AMPc e KPC) foi feita por reação em cadeia da polimerase (PCR). De 416 linhagens produtoras de ESBL entre 2001- 2008, E. coli foi a mais freqüente (74,4%). Altos níveis de resistência foram obtidos para sulfazotrim, gentamicina e ciprofloxacina neste período. Todas as linhagens foram sensíveis ao imipenem. No estudo prospectivo, 105 linhagens produtoras de ESBL foram isoladas, sendo E. coli a mais freqüente (63%). Foi observado um alto índice de resistência a amoxacilina-clavulanato (80,8%), e aproximadamente 70% das amostras foram resistentes à associação trimetoprim/sulfametoxazol e as fluoroquionolonas (ciprofloxacina e ácido nalidíxico). Dentre as drogas utilizadas como substrato para detecção de ESBL, a cefotaxima foi o substrato com maior índice de resistência (86,6%), seguido de aztreonam (60,9%) e ceftazidima (55,2%). Entre as 105 linhagens recuperadas, todos os marcadores genéticos pesquisados para ESBL foram detectados. Considerando-se a freqüência de detecção dos marcadores genéticos, TEM foi o mais frequente (86,6%), seguido por SHV (59%), CTX-M (31,4%) e AMPc (27,6%). Em todas as linhagens bacterianas avaliadas, foi detectado pelo menos 1 dos marcadores genéticos associados à produção de β-lactamases (22,8%), 52,4% apresentaram 2 marcadores, 20% apresentaram 3 marcadores e 4,8% apresentaram 4 dos marcadores pesquisados. β-lactamases do tipo KPC não foram detectadas. O conhecimento da epidemiologia, dinâmica de disseminação e circulação destes marcadores genéticos de resistência a drogas constitui um dado clínico relevante, pois possibilita a instauração de uma terapia antimicrobiana mais adequada, bem como a construção de um banco de informações epidemiológicas, como ferramenta para contenção da expansão da disseminação dos genes de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos. / The urinary tract infections (UTI) are highly frequent within the population and usually caused by Gram-negative rods. The bacterial β-lactamases are enzymes which confer resistance against β-lactam antibiotics (penicillins, cephalosporins, aztreonam and carbapenems) amongst which Extended Spectrum β-Lactamases (ESBL) has been described as an important resistance mechanism to the β-lactam in Gram-negative bacteria. Generally, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae are the most frequent ESBL producing bacterial species, but its production by representatives of other bacterial genus within the Enterobacteriaceae family has already been documented. The aim of this study were to evaluate the antimicrobial susceptibility patterns and to correlate phenotypic tests with the detection of genetic markers for β-lactamases production such as ESBL, AmpC and KPC in enterobacteria associated to the UTI etiology in patients assisted at a Clinical Analyses Laboratory in Juiz de Fora, MG. From a retrospective study (2001-2008), 66.660 urine samples were analyzed, and the biochemically identified bacteria were submitted to antibiotic susceptibility testing by the disk-diffusion method, according to the Clinical Laboratory Standards Institute/CLSI guidelines. Further, phenotypic detection of the ESBL production was carried out through the disk approximation test. From a prospective study (2009), 12.304 samples were evaluated, and after the microbial identification, antibiotic susceptibility tests and disk approximation assays were performed, for ESBL phenotypic detection. Identification of β-lactamase genetic markers (SHV, TEM, CTX-M, AMPc and KPC) were performed through polymerase chain reaction (PCR). Out of 416 ESBL producing bacteria identified between 2001 and 2008, E. coli was the most frequent (74.4%). High resistance levels were obtained for trimethopim-sulfamethoxazole, gentamicin and ciprofloxacin in this period. All of the strains were sensitive to imipenem. Regarding the prospective study, 105 ESBL producing bacteria were isolated, being E. coli the most frequent (63%). A high resistance rate was observed against amoxacilin/clavulanic-acid (80.8%), and almost 70% of the samples were resistant to the association trimethopim-sulfamethoxazole and the fluoroquionolones (ciprofloxacin and nalidixic acid). Among the drugs for ESBL detection, the cefotaxime was the substrate with the highest resistance rate (86.6%), followed by aztreonam (60.9%) and ceftazidime (55.2%). Among these strains, all of the researched genetic markers for ESBL were detected. In regard to the frequency of detection of the genetic markers, TEM was the most frequent (86.6%), following by SHV (59%), CTX-M (31.4%) and AmpC (27.6%). In all of the bacterial strains it was detected at least 1 of the genetic markers associated to the production of β –lactamases. Two markers were detected in 52.4% and in 20% and 48%, at least 3 or 4 markers were detected, respectively. The KPC type β -lactamase was not detected. The knowledge about the epidemiology, spread dynamics and circulation of these resistance genetic markers to drugs among the different bacterial populations constitutes a relevant issue and makes possible the establishment of a more appropriated chemotherapy. Besides, the generation of basic epidemiological information may sustain for contention of the antimicrobial resistance and the spread of resistant genetic markers related to inactivation of β-lactam drugs.

INTRODUÇÃO: O aumento da incidência de infecções causadas por bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos limita cada vez mais as opções terapêuticas, dificultando o tratamento e aumentando os índices de morbidade e mortalidade, além dos gastos em saúde. Ao longo dos últimos cinco anos, essa limitação tem levado ao reestabelecimento do uso de antimicrobianos consideradas ultrapassados, como as polimixinas. Este grupo passou a ser utilizado com cada vez mais frequência no tratamento de infecções causadas por microrganismos gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos. As enterobactérias, em particular a espécie Klebsiella pneumoniae, tem apresentado frequentemente esse perfil, porém, a resistência à polimixinas têm sido relatada, eliminando essa importante alternativa terapêutica. Apesar da importância do tema, são escassas as publicações sobre frequência de resistência às polimixinas em K. pneumoniae e a relação clonal entre isolados resistentes à polimixina B no Brasil. OBJETIVOS: Avaliar a relação genética, perfil de sensibilidade antimicrobiana e mecanismos de resistência às polimixinas em K. pneumoniae. MATERIAIS E MÉTODOS: A execução deste trabalho dividiu-se em duas partes principais: (i) levantamento de dados de culturas positivas para K. pneumoniae da rotina de pacientes hospitalizados em instituições atendidas pelo serviço de análises clínicas do Fleury Medicina e Saúde; (ii) confirmação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) para polimixina B, avaliação da relação clonal por eletroforese em campos pulsados (PFGE),e sequenciamento de múltiplos loci (MLST), avaliação da integridade do gene mgrB e da presença do gene mcr-1 por PCR entre isolados resistentes à polimixina B e aos carbapenêmicos (CPRKp). RESULTADOS e CONCLUSÕES: Na análise de 3.085 isolados de K. pneumoniae obtidos de pacientes internados em 11 hospitais da Grande São Paulo entre os anos de 2011 e 2015, foi evidenciado um aumento estatisticamente significativo na resistência aos carbapenêmicos de 6,8% em 2011 para 35,5% em 2015. Em 2015, KPC foi detectada em 96,2% dos isolados resistentes aos carbapenêmicos. A distribuição das concentrações inibitórias mínimas de polimixina B entre todos os isolados de K. pneumoniae evidenciou uma distribuição bimodal com a CIM de 2 mg/L como o valor de ponto de corte para a susceptibilidade à polimixina B; assim, 3,6% do número total de isolados sensíveis aos carbapenêmicos foram interpretados como resistentes enquanto essa proporção foi de 22,5% entre as resistentes aos carbapenêmicos (CRKp). Entre esses últimos isolados também houve um aumento estatisticamente significativo na tendência anual de resistência à polimixina B, de 0% em 2011 para 27,1% em 2015. Estas taxas variaram de 0,7% em 2011 para 3,9% até junho de 2014 entre os sensíveis aos carbapenêmicos. Entre os antimicrobianos alternativos, a amicacina e a tigeciclina foram os compostos mais ativos. A análise por PFGE de 60 isolados de CPRKp obtidos de pacientes distintos nos anos de 2014 e 2015 evidenciou dois grandes grupos clonais: CPRKp1 e CPRKp2, os quais segundo a análise por MLST pertencem, respectivamente, aos grupos ST11 e ST437, ambos do complexo clonal 258. Foi observado o mesmo grupo ST entre isolados obtidos dentro de um mesmo hospital e também entre diferentes hospitais, públicos e privados. O mecanismo de resistência mais comum entre os isolados de CPRKp foi a presença de sequências de inserção interrompendo o gene mgrB. O gene mcr-1 não foi detectado em nenhum dos isolados. / INTRODUCTION: The increasing incidence of infections caused by bacteria resistant to multiple antimicrobials increasingly limits therapeutic options, making treatment difficult and increasing the morbidity and mortality and health spending. Over the past five years, this limitation has led to the reestablishment of the use of antimicrobials deemed outdated, such as polymyxins. This group is now used with increasing frequency to treat infections caused by carbapenem-resistant gram-negative microorganisms. Enterobacteria, especially Klebsiella pneumoniae, have often presented this profile, however, resistance to polymyxins have been also reported, eliminating this important therapeutic alternative. Despite the importance of this issue, the publications are scarce on the polymyxins resistance frequency in K. pneumoniae and clonal relationship among isolates resistant to polymyxin B in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the genetic relationship, antimicrobial susceptibility profile and polymyxin B resistance mechanisms in K. pneumoniae. MATERIALS AND METHODS: The execution of this work was divided into two main parts: (i) survey data on routine cultures positive for K. pneumoniae from patients hospitalized in institutions attended by the clinical analysis service of Fleury Health and Medicine; (ii) confirmation of to polymyxin B minimum inhibitory concentrations (MIC), evaluation of clonal relationship by electrophoresis pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), evaluation of the integrity of the mgrB gene and the presence of mcr-1 gene by PCR among isolates resistant to polymyxin B and carbapenems (CPRKp). RESULTS AND CONCLUSIONS: The analysis of 3,085 K. pneumoniae isolates obtained from inpatients from 11 hospitals in the São Paulo urban area between 2011 and 2015, has shown a statistically significant increase in carbapenem resistance from 6.8% in 2011 to 35.5% in 2015. In 2015, KPC was detected in 96.2% of isolates resistant to carbapenems. The polymyxin B MIC distribution of all Klebsiella pneumoniae showed a bimodal distribution with the MIC of 2 mg/L as the cutoff value for polymyxin B susceptibility; thus, 3.6% of the total number of isolates susceptible to carbapenems were interpreted as resistant while this proportion was 22.5% among carbapenem-resistant isolates (CRKp). Among these isolates there was also a statistically significant increase in the annual trend of polymyxin B resistance, from 0% in 2011 to 27.1% in 2015. These rates ranged from 0.7% in 2011 to 3.9% by June 2014 between carbapenem-susceptible isolates. Among alternative antimicrobials, amikacin and tigecycline were the most active compounds. The analysis by PFGE of 60 CPRKp isolates obtained from different patients in the years 2014 and 2015 showed two major clonal groups: CPRKp1 and CPRKp2, which according to the analysis by MLST belong respectively to ST11 and ST437 groups, both from clonal complex 258. We observed the same ST group of isolates obtained within a hospital and between different public and private hospitals. The most common mechanism of polymyxin B resistance among CPRKp isolates was the presence of insertion sequences interrupting the mgrB gene. The mcr-1 gene was not detected in any of the isolates.