A resistência bacteriana a antibióticos é um grave e crescente problema de saúde pública de âmbito mundial. O principal, e mais eficiente, mecanismo de resistência aos &#946-lactâmicos em bacilos Gram-negativos é a produção de &#946-lactamases, que possuem a capacidade de hidrolisar o anel &#946-lactâmicos e consequentemente inativar essa classe de antibióticos. Vale ressaltar, que atualmente os antibióticos &#946-lactâmicos são os mais utilizados clinicamente, particularmente em infecções graves. Dentre as &#946-lactamases existentes destacam-se as carbapenemases, enzimas capazes de inativar a maioria dos antibióticos &#946-lactâmicos. Uma grande preocupação é o fato dessas enzimas, em sua maioria, serem codificadas por plasmídeos, o que propicia a disseminação desses genes de resistência; portanto, é de extrema importância a realização de um rápido e efetivo monitoramento da presença de patógenos portadores desses genes de resistência, para que assim se possa prevenir a disseminação desses determinantes. Foram incluídos neste estudo 230 amostras únicas de Acinetobacter e Pseudomonas aeruginosa resistentes a imipenem detectados em pacientes internados em hospitais privados da cidade de São Paulo durante o período de fevereiro a outubro de 2013. As amostras foram avaliadas quanto à hidrólise de imipenem por espectrofotometria, quanto à presença de genes de carbapenemases por PCR e sequenciamento, e quanto à clonalidade por eletroforese em campos pulsados (PFGE) ou ERIC-PCR. Foram realizados ensaios de conjugação, transformação e sequenciamento completo de plasmídeos. Dentre as amostras de Acinetobacter spp. 80% (88) foram capazes de hidrolisar o imipenem. Dentre esses 76,1% (67) foram positivos para blaOXA-51-like, 19,3% (17) foram positivos para blaOXA-72. blaOXA-23, blaOXA-482 e blaIMP-1 foram detectados isoladamente em isolados distintos. O gene blaIMP-1 foi detectado em A. ursingii inserido em integron de classe 1 e representa a primeira descrição no Brasil. Uma nova carbapenemase OXA-482-like foi detectada em A. baumanii. Utilizando-se ERIC-PCR, observou-se uma grande diversidade de grupos clonais, com o máximo de quatro isolados por grupo. Dentre as amostras de P. aeruginosa, apenas 35,3% foram capazes de hidrolisar o imipenem. Dessas amostras, 14 possuíam o gene blaSPM-1, e isolados únicos possuíam, individualmente, os genes blaIMP, blaVIM, blaKPC-2 ou blaGES-23. O gene blaKPC-2 foi detectado inserido em contexto genético diferente dos descritos anteriormente, em plasmídeo IncU de 32 Kb, mobilizável, mas não conjugativo. Esta é a primeira descrição da sequencia completa de plasmídeo albergando o gene blaKPC-2 em P. aeruginosa no Brasil. Nas demais amostras (20) com atividade hidrolítica, não foram detectados genes de carbapenemase conhecidos, o que sugere a presença de genes de carbapenemase ainda não descritos. Em três amostras foi possível obter transformantes com plasmídeos, resistentes a carbapenêmicos. As amostras com blaSPM-1 apresentaram perfis de PFGE estreitamente relacionados. Em contraste, os perfis de PFGE das amostras com potenciais novas carbapenemases apresentaram índice de similaridade de Dice inferior ix a 80%, evidenciando grande diversidade clonal. Nossos achados evidenciam que a carbapenemase não intrínseca predominante em Acinetobacterem hospitais privados da cidade de São Paulo é OXA-72, e em hospitais privados há uma grande diversidade clonal. Em P. aeruginosa, a carbapenemase predominante é SPM-1, cuja disseminação é mediada por um único clone. Há potencialmente um número significativo de novas carbapenemases em Acinetobacter e P. aeruginosa, algumas delas mediadas por plasmídeos. / Bacterial resistance to antibiotics is a serious and growing public health problem worldwide. The main and most efficient mechanism of resistance to &#946-lactams in Gram-negative bacilli is the production of &#946-lactamases, which have the ability to hydrolyze the &#946-lactam ring and consequently inactivate this class of antibiotics. It is worth mentioning that currently &#946-lactam antibiotics are the most used clinically, particularly in severe infections. Among the existing &#946-lactamases, carbapenemases are capable of inactivating most &#946-lactam antibiotics. A major concern is that these enzymes are mostly encoded by plasmids, which facilitates the spread of these resistance genes; therefore, it is of extreme importance to carry out a rapid and effective monitoring of the presence of pathogens bearing these resistance genes, in order to prevent the dissemination of these determinants. This study included 230 unique samples of imipenem-resistant Acinetobacterand Pseudomonas aeruginosa detected in patients hospitalized in private hospitals in the city of São Paulo during the period from February to October 2013. The samples were evaluated for the imipenem hydrolysis by spectrophotometry, the presence of carbapenemase genes by PCR and sequencing, and concerning clonality by pulsed field electrophoresis (PFGE) or ERIC-PCR. Conjugation, transformation and complete sequencing of plasmids were performed. Among Acinetobacter spp. samples, 80% (88) were able to hydrolyze imipenem. Among these, 76.1% (67) were positive for blaOXA-51-like genes and 19.3% (17) were positive for blaOXA-72. The blaOXA-23, blaOXA-482 and blaIMP-1 genes were detected alone in distinct isolates. The blaIMP-1 gene was detected in A. ursingii inserted in class 1 integron and represents the first description in Brazil. A novel OXA-482-like carbapenemase was detected in A. baumanii. Using ERIC-PCR, a great diversity of clonal groups was observed, with a maximum of four isolates per group. Among P. aeruginosa samples, only 35.3% were able to hydrolyze imipenem. Of these samples, 14 had the blaSPM-1 gene, and single isolates individually possessed the blaIMP, blaVIM, blaKPC-2 or blaGES-23 genes. The blaKPC-2 gene was found inserted in a genetic context different from those described previously, in a mobilizable, but not conjugative, 32 Kb IncU plasmid. This is the first description of the complete nucleotide sequence of a plasmid harboring the blaKPC-2 gene in P. aeruginosa in Brazil. In the remaining samples (20) with hydrolytic activity, no known carbapenemase genes were detected, suggesting the presence of carbapenemase genes not yet described. In three samples it was possible to obtain transformants with plasmids, resistant to carbapenems. Samples with blaSPM-1 showed closely related PFGE profiles. In contrast, the PFGE profiles of the samples with potential new carbapenemases showed Dice similarity index lower than 80%, evidencing a great clonal diversity. Our findings show that the predominant non-intrinsic carbapenemase in Acinetobacter in the city of São Paulo is OXA-72, and in private hospitals there is great clonal diversity. In P. aeruginosa, the predominant carbapenemase is SPM-1, the spread of this enzyme is mediated by a single clone. There are potentially a significant number of new carbapenemases in Acinetobacter and P. aeruginosa, some of them plasmid mediated.

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Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes destacam-se pelo oportunismo e capacidade de produção destas enzimas e seu envolvimento nas infecções hospitalares. Nosso trabalho teve como objetivo avaliar os aspectos fisiológicos e moleculares relacionados à virulência e resistência aos carbapenêmicos em K. pneumoniae e E. aerogenes, isolados em um serviço de microbiologia clínica em um hospital terciário durante o ano de 2012. De maneira geral, 3437 espécimes clínicos coletados foram processados para isolamento microbiano. Amostras identificadas foram avaliadas quanto à susceptibilidade aos antimicrobianos e 42 enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos foram consideradas. Foram realizados testes para avaliação da produção de carbapenemases, atividade hemolítica, estresse oxidativo, tolerância a biocidas e formação de biofilmes. Os microrganismos foram recuperados de urina, cateter, sangue e trato respiratório. Entre os pacientes, 61,9% eram de UTI. Os isolados apresentaram altos níveis de sensibilidade à amicacina e tigeciclina (>90%). Considerando-se a frequência dos marcadores genéticos, KPC foi a mais frequente (97,6%), seguido por TEM (95,2%), SHV (69,0%) e CTX-M (38,1%). Em todos os isolados avaliados, 2,4% apresentaram 1 marcador genético associado a resistência aos carbapenêmicos, 23,8% apresentaram 2 marcadores, 45,2% apresentaram 3 e 28,6% apresentaram 4. As espécies resistentes aos carbapenêmicos apresentaram características peculiares em relação às características fisiológicas avaliadas, sugerindo que essas bactérias possam apresentar comportamentos diferentes de microrganismos de mesma espécie sensíveis às drogas, com implicações não apenas para antibioticoterapia, mas também para sua virulência e persistência no ambiente nosocomial. Estes resultados confirmam a dificuldade de manejo terapêutico de pacientes com infecções associadas a microrganismos multi-resistentes e oportunistas com impactos diretos na mortalidade e no controle epidemiológico destes microrganismos nos centros de saúde. / The antimicrobial resistance is a growing problem, restricting treatment options and resulting in more frequent clinical failures. Carbapenemases are enzymes produced by Gram-negative bacteria which confer resistance to β-lactams. Klebsiella pneumoniae and Enterobacter aerogenes stand out by opportunism and production capacity of these enzymes and their involvement in nosocomial infections. Our study aimed to evaluate the virulence and related carbapenem resistance in K. pneumoniae and E. aerogenes physiological and molecular aspects, isolated from the Clinical Laboratory, in a tertiary hospital in the city of Juiz de Fora - Minas Gerais, during 2012. During the study period, 3437 clinical specimens were processed for microbial isolation. Identified samples were evaluated for antimicrobial susceptibility and 42 resistant Enterobacteriaceae to carbapenems were considered. Underwent tests for evaluation of carbapenemase production, hemolytic activity, biofilm formation, oxidative stress and biocides tolerance. The results showed that K. pneumoniae and E. aerogenes were recovered in urine, catheter, blood and respiratory tract. Among the patients, 61.9% were ICU. The isolates showed high levels of sensitivity to amikacin and tigecycline (>90%). Considering the frequency of genetic markers, KPC was the most common (97.6%), followed by TEM (95.2%), SHV (69.0%) and CTX-M (38.1%). In all isolates, 2.4% had one genetic marker associated with resistance to carbapenems, 23.8% had two markers, 45.2% had three and 28.6% had four. Carbapenemase producers showed particular characteristics regarding the assessed physiological characteristics, suggesting that these bacteria may exhibit different behaviors of microorganisms of the same species susceptible to carbapenem with implications not only for antibiotic therapy, but also for their virulence and persistence in the nosocomial environment. These results confirm the difficulty of therapeutic management of patients with infections associated with multi- resistant and opportunistic microorganisms with direct impacts on mortality and epidemiological control of these microorganisms in health centers.

Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.

During the last decades, K. pneumoniae has emerged as one of the most clinically significant pathogens, especially due to the high prevalence of strains producing extended spectrum β-lactamases (ESBL) and carbapenemases. The therapeutic options to treat these infections are constrained not only by this enzyme production, but also by the regular ability to form biofilms. The development of K. pneumoniae biofilms on the host tissue eventually protect the microorganisms from the action of antimicrobial agents and from the immune response, apart from driving the expression of virulence factors. Thus, the aim of this study was to detect mechanisms of resistance, adhesive properties and ability of multi-resistant K. pneumoniae clinical isolates to form biofilms. In the first stage of the study, 33 strains of K. pneumoniae with reduced susceptibility to carbapenems were isolated. By using phenotypic tests, 10 samples positive for the modified Hodge test were detected, suggesting the production of carbapenemases, and 2 strains manifested positivity for the synergic test with boronic acid, suggesting the production of KPC. When employing molecular techniques, such as polymerase chain reaction, the gene blaKPC was not detected, characterizing failure on the phenotypic detection of KPC. In the second stage of the study, 14 strains of multi-resistant K. pneumoniae were analyzed in order to verify the ability of biofilm formation, as well as adhesive/aggregative properties. Most of the strains analyzed presented low affinity to p-xylene, suggesting hydrophilic character, aside from strong affinity to the basic solvent ethyl acetate indicating acidic surface characteristics. It was also verified that the strains studied manifested high ability of biofilm formation and important adhesion in epithelial cells. The combination of all the characteristics studied may contribute to the survival of K. pneumoniae in the host and in the environment, as the organization of microorganisms in biofilms complicates the pharmacological treatment and favors its spread and multi-resistance. / Durante as últimas décadas, a Klebsiella pneumoniae tem emergido como um dos patógenos mais importantes clinicamente, especialmente em função da alta prevalência de amostras produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) e carbapenemases. As opções terapêuticas para o tratamento destas infecções são limitadas não somente por esta produção enzimática, mas também pela frequente capacidade de formação de biofilmes. O estabelecimento de biofilmes de K. pneumoniae sobre tecidos do hospedeiro acaba por proteger os microrganismos da ação de agentes antimicrobianos e da resposta imunológica, além de conduzir a expressão de determinantes de virulência. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi detectar mecanismos de resistência, propriedades adesivas e capacidade de formação de biofilmes de isolados clínicos de K. pneumoniae multirresistentes. Na primeira fase deste estudo, foram isoladas 33 isolados clínicos de K. pneumoniae com perfil de sensibilidade reduzida aos carbapenêmicos. Através de testes fenotípicos foram detectadas 10 amostras que apresentaram positividade para o teste modificado de Hodge (MHT) sugerindo produção de carbapenemases e duas amostras que apresentaram positividade para o teste sinérgico com ácido borônico (AB), indicando produção de KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase). Quando utilizado ferramentas moleculares, como a reação em cadeia da polymerase, não foi detectado o gene blaKPC, caracterizando desta forma uma falha na detecção fenotípica de KPC. Na segunda fase deste estudo, foram analisadas 14 amostras de K. pneumoniae multirresistentes a fim de verificar a capacidade de formação de biofilmes, bem como propriedades adesivas/agregativas. A maioria das isolados clínicos analisadas apresentaram baixa afinidade ao xileno, sugerindo um caráter hidrofílico, além de alta afinidade ao solvente básico acetato de etila indicando características superficiais ácidas. Foi verificado ainda que os isolados clínicos estudados apresentaram alta capacidade de formação de biofilme e importante adesão em células epiteliais. As combinações de todas estas características estudadas podem contribuir para a sobrevivência de K. pneumoniae no hospedeiro e no ambiente, pois a organização dos microrganismos em biofilme dificulta o tratamento farmacológico e favorece a sua disseminação e multirresistência.

Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.

Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.

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Die Mehrzahl der jährlich 400.000 bis 600.000 Krankenhausinfektionen in Deutschland wird von Erregern der sog. ESCAPE-Gruppe (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und verschiedene Enterobacteriaceae, u.a. Klebsiella pneumoniae) verursacht. Besondere Sorge bereitet dabei die Ausbreitung von K. pneumoniae-Stämmen mit enzymvermittelter Resistenz gegenüber Carbapenem-Antibiotika (K. pneumoniae-Carbapenemase, KPC) und die Zunahme von C. difficile-Infektionen (CDI) durch hypervirulente Epidemiestämme (z.B. Ribotyp 027). Die spezifischen Erfahrungen eines prolongierten Ausbruchsgeschehens durch einen KPC-bildenden K. pneumoniae-Stamm (KPC-KP) am Leipziger Universitätsklinikum machen deutlich, dass bei diesem Erregertyp ein hohes Transmissionspotential bei enormer Tenazität (Umweltresistenz) zu berücksichtigen ist, ein Versagen von Standardhygienemaßnahmen in Betracht zu ziehen ist, und Infektionsketten oftmals unklar bleiben. Die Anwendung von Antibiotika ist bei KPC-KP-Infektionen auf einzelne Substanzen (Colistin, Tigecyclin, Gentamicin) beschränkt und vor allem bei immunsupprimierten Patienten (z.B. Lebertransplantierte) mit einem relevanten Risiko des Therapieversagens behaftet. Die Therapie von CDI wird gerade bei Immunsupprimierten durch eine steigende Zahl an Rezidiven erschwert, die teilweise antibiotisch (Vancomycin, Fidaxomicin) nicht beherrschbar sind, so dass alternative Therapieverfahren wie die fäkale Bakterientherapie („Stuhltransplantation“) zur Anwendung kommen. CDI-Rezidive, aber auch eine dauerhafte intestinale Besiedelung mit multiresistenten Enterobakterien wie KPC-KP, scheinen neben wirtsspezifischen Faktoren der Immunantwort durch eine Dysregulation der physiologischen intestinalen Standortflora mit Störung der Kolonisationsresistenz bedingt zu sein. Der Versuch einer Eradikationsbehandlung von Patienten mit persistierender intestinaler Besiedelung durch KPC-KP mittels oraler Applikation der nicht resorbierbaren Antibiotika Colistin und Gentamicin ist mit einem relevanten Risiko der Entstehung von Sekundärresistenzen behaftet. Die Zulassung neuer, besser wirksamer Antibiotika ist für die nächsten Jahre nicht in Sicht, so dass der Infektionsprävention überragende Bedeutung zukommt. Die Erfahrungen der KPC-Ausbruchsbewältigung am Leipziger Universitätsklinikum zeigen, dass nahezu lückenlose Compliance bei der Händedesinfektion, rigoros praktizierte und kontrollierte Barriere- und Isolationsmaßnahmen, Optimierung des Gebrauchs von Breitspektrum-Antibiotika (sog. „Antibiotic Stewardship“) und systematisches mikrobiologisches Erregerscreening dabei unabdingbar sind. Nachhaltige Verbesserungen hinsichtlich der globalen Ausbreitung von multiresistenten Krankenhausbakterien werden sich nur durch grundlegende Umgestaltungen in Umwelt, Landwirtschaft, Tierzucht und Gesundheitswesen mit sparsamer und möglichst gezielter Anwendung von Antibiotika erzielen lassen. Um Risikopopulationen hospitalisierter Patienten vor potentiell lebensbedrohlichen Erregertransmissionen effektiv schützen zu können, sind erweiterte Surveillance und konsequent umgesetzte krankenhaushygienische Maßnahmen erforderlich.

Die Mehrzahl der jährlich 400.000 bis 600.000 Krankenhausinfektionen in Deutschland wird von Erregern der sog. ESCAPE-Gruppe (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und verschiedene Enterobacteriaceae, u.a. Klebsiella pneumoniae) verursacht. Besondere Sorge bereitet dabei die Ausbreitung von K. pneumoniae-Stämmen mit enzymvermittelter Resistenz gegenüber Carbapenem-Antibiotika (K. pneumoniae-Carbapenemase, KPC) und die Zunahme von C. difficile-Infektionen (CDI) durch hypervirulente Epidemiestämme (z.B. Ribotyp 027). Die spezifischen Erfahrungen eines prolongierten Ausbruchsgeschehens durch einen KPC-bildenden K. pneumoniae-Stamm (KPC-KP) am Leipziger Universitätsklinikum machen deutlich, dass bei diesem Erregertyp ein hohes Transmissionspotential bei enormer Tenazität (Umweltresistenz) zu berücksichtigen ist, ein Versagen von Standardhygienemaßnahmen in Betracht zu ziehen ist, und Infektionsketten oftmals unklar bleiben. Die Anwendung von Antibiotika ist bei KPC-KP-Infektionen auf einzelne Substanzen (Colistin, Tigecyclin, Gentamicin) beschränkt und vor allem bei immunsupprimierten Patienten (z.B. Lebertransplantierte) mit einem relevanten Risiko des Therapieversagens behaftet. Die Therapie von CDI wird gerade bei Immunsupprimierten durch eine steigende Zahl an Rezidiven erschwert, die teilweise antibiotisch (Vancomycin, Fidaxomicin) nicht beherrschbar sind, so dass alternative Therapieverfahren wie die fäkale Bakterientherapie („Stuhltransplantation“) zur Anwendung kommen. CDI-Rezidive, aber auch eine dauerhafte intestinale Besiedelung mit multiresistenten Enterobakterien wie KPC-KP, scheinen neben wirtsspezifischen Faktoren der Immunantwort durch eine Dysregulation der physiologischen intestinalen Standortflora mit Störung der Kolonisationsresistenz bedingt zu sein. Der Versuch einer Eradikationsbehandlung von Patienten mit persistierender intestinaler Besiedelung durch KPC-KP mittels oraler Applikation der nicht resorbierbaren Antibiotika Colistin und Gentamicin ist mit einem relevanten Risiko der Entstehung von Sekundärresistenzen behaftet. Die Zulassung neuer, besser wirksamer Antibiotika ist für die nächsten Jahre nicht in Sicht, so dass der Infektionsprävention überragende Bedeutung zukommt. Die Erfahrungen der KPC-Ausbruchsbewältigung am Leipziger Universitätsklinikum zeigen, dass nahezu lückenlose Compliance bei der Händedesinfektion, rigoros praktizierte und kontrollierte Barriere- und Isolationsmaßnahmen, Optimierung des Gebrauchs von Breitspektrum-Antibiotika (sog. „Antibiotic Stewardship“) und systematisches mikrobiologisches Erregerscreening dabei unabdingbar sind. Nachhaltige Verbesserungen hinsichtlich der globalen Ausbreitung von multiresistenten Krankenhausbakterien werden sich nur durch grundlegende Umgestaltungen in Umwelt, Landwirtschaft, Tierzucht und Gesundheitswesen mit sparsamer und möglichst gezielter Anwendung von Antibiotika erzielen lassen. Um Risikopopulationen hospitalisierter Patienten vor potentiell lebensbedrohlichen Erregertransmissionen effektiv schützen zu können, sind erweiterte Surveillance und konsequent umgesetzte krankenhaushygienische Maßnahmen erforderlich.