Deutsch: Die vorliegende Arbeit beinhaltet die kombinatorische Synthese sowie biomedizinische Aspekte von neuen, lipophilisierten Nucleosiden (Nucleolipiden) als small molecules. Für die Synthesen wurden sowohl Nucleosid-Metabolite als auch -Antimetabolite lipophilisiert. Als Lipidreste wurden natürlich vorkommende Verbindungen, wie azyklische Terpene und (a)symmetrische Ketone verwendet. Diese wurden am O-2‘,3‘-cis-glycosidischen Rest oder an der N(3)-Position von β-D-Pyrimidinen oder an der N(1)-Position von β-D-Purinen eingeführt. Die Einführung der Reste erfolgte durch Ketalisierung der glyconischen Hydroxylgruppen oder durch direkte Alkylierung sowie durch Dimroth-Umlagerung des Aglycons. Zusätzlich wurden in weiteren Reaktionen ausgewählte Nucleolipide in 2-(Cyanoethyl)phosphoramidit für die automatische DNA-Festphasensynthese von Oligo-nucleotiden umgewandelt. Diese wurden für eine Reihe von Penetrationsversuchen hinsichtlich ihres Einlagerungs-und Penetrationsverhaltens in eine künstliche Lipidmembran untersucht und untereinander verglichen. Die synthetisierten Nucleolipide wurden NMR-spektroskopisch im Hinblick auf die strukturellen Parameter (1) Zuckerpucker (3’T2‘⇌3’T2‘) und (2) die Konformation um die exozyklische C(4‘)-C(5‘)-Bindung (γ+(g)⇌γt⇌γ-(g)) charakterisiert. Außerdem wurden die Nucleolipide hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität in in vitro-Tests auf humane, differenzierte THP-1-Makrophagen bezüglich des Immunoeffekts und auf eine Rattengliom- sowie einer humanen Gliom-Zellline bezüglich der Antitumoraktivität getestet. English: The thesis comprises the combinatorial synthesis and biomedicinal aspects of novel lipophilized nucleosides (Nucleolipids) as small molecules. Nucleoside-metabolites, as well as -antimetabolites, were used for the lipophilization. The chemical structure of the lipid residues resembles naturally-occurring compounds, namely acyclic terpenes, and (a)symmetric ketones. They are positioned either at the O-2’,3’-cis-glyconic moiety or at the N(3) of β-D-pyrimidines or N(1) of β-D-purines. The introduction of the lipophilic residues was performed either by ketalization of the glyconic hydroxyls or by direct alkylation as well as by Dimroth rearrangement at the N-alkylated aglycone. Additionally, selected nucleolipids were further converted to 2-(cyanoethyl) phosphoramidites as building blocks for automated solid phase nucleic acid synthesis. The latters were used for the preparation of a series of lipo-oligonucleotides which were studied with respect to their immobilization within artificial lipid bilayers and compared concerning immobilization rate and stability. The resulting nucleolipids were characterized with respect to the structural parameters (1) the sugar pucker (3’T2‘⇌3’T2‘) as well as (2) the conformation around the exocyclic C(4’)-C(5’)-bond (γ+(g)⇌γt⇌γ-(g)) by 1H-NMR-spectroscopy. Moreover, the biological activity of the nucleolipids was tested in-vitro on human, differentiated THP-1-macrophages for the immunoeffect and towards the rat gliom cell line BT4Ca as well as a human gliom (GOS-3) for anticancer activity.

The radiosensitivity of tumour cells depends mainly on their capacity to maintain genomic integrity. This requires efficient repair of radiation-induced DNA double strand breaks, a process governed by the cell cycle. Based on their functions in cell cycle regulation and DNA damage repair, we hypothesised that targeting of CDK2 and CDK9 modifies cancer cell response to radiotherapy. Therefore, we evaluated the significance of CDK2 and CDK9 for the cellular radiation response in a panel of human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines. In order to achieve our goal, we performed a series of experiments to measure several key parameters such as clonogenic radiation survival, cell cycling, DNA damage repair and apoptosis. We found that loss of CDK2 radiosensitises mouse embryonic fibroblasts (MEFs) as well as HNSCC two dimensional (2D) cell cultures. However, under more physiological three dimensional (3D) growth conditions in laminin-rich extracellular matrix, targeting of CDK2 failed to modulate the radiosensitivity of HNSCC cells. Moreover, CDK2 attenuated the repair of radiogenic double strand breaks (DSBs) in MEFs as well as SAS and FaDu HNSCC cells indicating a possible role of CDK2 in DNA damage repair. However, we found that CDK2 is dispensable for cell cycle and checkpoint regulation in response to irradiation in SAS and FaDu cells. Taken together, our results suggest that targeting of CDK2 may not provide a therapeutic benefit to overcome HNSCC cell resistance to radiotherapy. We also showed that depletion of CDK9 clearly enhances the radiosensitivity of HNSCC cultures. In addition, the ectopic expression of CDK9 has a radioprotective effect. These findings suggest a potential role of CDK9 in the radiation response of HNSCC cells. Moreover, our study indicates a possible role of CDK9 in the DNA damage repair response and cell cycling of HNSCC cells. Conclusively, on the basis of these data, targeting of CDK9 in addition to conventional radiotherapy might be a viable strategy to overcome cancer cell resistance.

Conflicts should be analyzed in terms of a full spectrum conflict including discourse. There are more means to achieve an end goal than through the kinetic force such as military means. The invasion of Ukraine 24th of February 2022 was the culmination of many years of soft and hard power practiced by the Russian state.  With a thematic content analysis on the Russian President Putin’s address to the Nation 18th of March 2014 and 21st of February 2022 the rethoric was separated into themes and analyzed with two theories. The first was soft and hard power where the themes of attraction- and coercion-based rhetoric was applied to the analysis. The second was legitimacy theory, which entailed that rethoric is a mean to gain support towards a grand strategic policy by establishing the national interest, defining threats, course of action and mobilizing the necessary resources within the state. The results showed that in the first speech soft and hard power was more prominent since there was no official involvement from the Russian state in the conflict in Donetsk and Luhansk region of Ukraine that needed to be legitimized. There was an attempt to influence the Ukrainian government and population to change their policies in a more favorable direction with the use of soft and hard power. The second speech was more in line of legitimacy where the Russian state was about to engage military and thus needed to garner the approval of the Russian state and population to be able to mobilize the resources necessary to accomplish such grand strategic agenda.

Es wurden Goldnanopartikel (AuNP) hergestellt, die eine einheitliche Größenverteilung von 3–5 nm aufweisen. Damit kann eine Mehrfachfunktionalisierung erreicht werden, d.h. gleich mehrere tumorspezifischen Moleküle an einen AuNP gekoppelt werden können und somit eine stark erhöhte Avidität zur Tumorzelle erzielt werden kann. Diese so hergestellten AuNP wurden mit diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Radionukliden beladen bzw. radiomarkiert. Diese so funktionalisierten und radiomarkierten AuNP reicherten sich in Tumorgewebe an mit nur geringfügiger Akkumulation in gesundem Gewebe.:1. Einleitung 1 1.1 Radioaktive Arzneimittel zur Diagnostik und Therapie in der Nuklearmedizin 1 1.2 Radioaktives Gold gegen Krebs 2 1.3 Aktueller Stand der Forschung zu Goldnanopartikeln 3 1.4 Chemische Charakterisierung von oberflächen-modifizierten AuNP 5 1.5 Zielstellung 7 2. Ergebnisse 8 2.1 Gastrin-Releasing Peptide Receptor- and Prostate-Specific Membrane Antigen-Specific Ultrasmall Gold Nanoparticles for Characterization and Diagnosis of Prostate Carcinoma via Fluorescence Imaging 8 2.2 Targeted 64Cu-labeled gold nanoparticles for dual imaging with positron emission tomography and optical imaging 20 2.3 αvβ3-Specific gold nanoparticles for fluorescence imaging of tumor angiogenesis 34 2.4 68Ga-NeoB: Preclinical results on imaging of gastrointestinal stromal tumors and determination of target receptor density in the gastrointestinal tract 65 2.5 GMP-compliant production of [68Ga]Ga-NeoB for positron emission tomography imaging of patients with gastrointestinal stromal tumor 80 2.6 Ac-EAZY! Towards GMP-Compliant Module Syntheses of 225Ac-Labeled Peptides for Clinical Application 93 3. Diskussion 105 3.1 Entwicklung von klinisch anwendbaren radiomarkierten Goldnanopartikeln gegen Krebs 105 3.2 Klinische Translation von neuen diagnostischen und therapeutischen Radiopharmaka 106 4. Zusammenfassung und Ausblick 108 5. Literaturverzeichnis 110 Abkürzungsverzeichnis 115 Erklärungen und Versicherung 117 / Gold nanoparticles (AuNPs) with a uniform size distribution of 3-5 nm were produced. This allows multiple functionalization to be achieved, i.e. several tumour-specific molecules can be coupled to one AuNP at the same time and thus a greatly increased avidity to the tumour cell can be achieved. These AuNPs produced in this way were loaded or radiolabeled with diagnostically or therapeutically effective radionuclides. These functionalized and radiolabeled AuNPs accumulated in tumour tissue with only slight accumulation in healthy tissue.:1. Einleitung 1 1.1 Radioaktive Arzneimittel zur Diagnostik und Therapie in der Nuklearmedizin 1 1.2 Radioaktives Gold gegen Krebs 2 1.3 Aktueller Stand der Forschung zu Goldnanopartikeln 3 1.4 Chemische Charakterisierung von oberflächen-modifizierten AuNP 5 1.5 Zielstellung 7 2. Ergebnisse 8 2.1 Gastrin-Releasing Peptide Receptor- and Prostate-Specific Membrane Antigen-Specific Ultrasmall Gold Nanoparticles for Characterization and Diagnosis of Prostate Carcinoma via Fluorescence Imaging 8 2.2 Targeted 64Cu-labeled gold nanoparticles for dual imaging with positron emission tomography and optical imaging 20 2.3 αvβ3-Specific gold nanoparticles for fluorescence imaging of tumor angiogenesis 34 2.4 68Ga-NeoB: Preclinical results on imaging of gastrointestinal stromal tumors and determination of target receptor density in the gastrointestinal tract 65 2.5 GMP-compliant production of [68Ga]Ga-NeoB for positron emission tomography imaging of patients with gastrointestinal stromal tumor 80 2.6 Ac-EAZY! Towards GMP-Compliant Module Syntheses of 225Ac-Labeled Peptides for Clinical Application 93 3. Diskussion 105 3.1 Entwicklung von klinisch anwendbaren radiomarkierten Goldnanopartikeln gegen Krebs 105 3.2 Klinische Translation von neuen diagnostischen und therapeutischen Radiopharmaka 106 4. Zusammenfassung und Ausblick 108 5. Literaturverzeichnis 110 Abkürzungsverzeichnis 115 Erklärungen und Versicherung 117

BACKGROUND: Sarcomas are rare cancers of high heterogeneity. Health-Related Quality of Life (HRQoL) has been shown to be a prognostic factor for survival in other cancer entities but it is unclear whether this applies to sarcoma patients. PATIENTS AND METHODS: HRQoL was prospectively assessed in adult sarcoma patients from 2017 to 2020 in 39 German recruiting sites using the European Organisation for Research and Treatment of Cancer Quality of Life Questionnaire (EORTC QLQC30). Vital status was ascertained over the course of 1 year. HRQoL domains were analysed by multivariable cox-regressions including clinical and socio-economic risk factors. RESULTS: Of 1102 patients, 126 (11.4%) died during follow-up. The hazard ratio (HR) for global health was 0.73 per 10-point increase (95% confidence interval (CI) 0.64–0.85). HR for the HRQoL-summary score was 0.74 (CI 0.64–0.85) and for physical functioning 0.82 (CI 0.74–0.89). There was also evidence that fatigue (HR 1.17, CI 1.10–1.25), appetite loss (HR 1.15, CI 1.09–1.21) and pain (HR 1.14, CI 1.08–1.20) are prognostic factors for survival. CONCLUSION: Our study adds sarcoma-specific evidence to the existing data about cancer survival in general. Clinicians and caregivers should be aware of the relations between HRQoL and survival probability and include HRQoL in routine assessment.

Während der Tumorprogression unterliegen Zellen und Gewebe mechanischen Veränderungen. Mittels Magnetresonanz-Elastographie (MRE) kann die Mechanik von Geweben in vivo untersucht werden. In der Klinik wird diese Technik jedoch bisher hauptsächlich als zusätzlicher Bildkontrast verwendet, wobei eine Verknüpfung mit der zugrunde liegenden Physik des Krebses bisher weitgehend fehlt. In meiner Arbeit skizziere ich einen in vivo Tumor-Marker, der auf biophysikalische Parametern beruht. Dazu liefere ich eine breite experimentelle Basis, die von der mechanischen Charakterisierung von Kollagen als Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix bis zum Tracking lebender Zellen und ex vivo MRE in vitalen menschlichen Tumorexplantaten reicht. Eine anschließende Analyse der mechanischen Fingerabdrücke von Tumoren in vivo zeigt robuste Trends. Diese werden durch ein Gedankenexperiment zu den grundlegenden mechanischen Voraussetzungen für das Tumorwachstum weiter erläutert. Darauf aufbauend leite ich ein auf biophysikalischen Parametern basierendes Tumor-Klassifikationsschema ab. Abschließend fasse ich zusammen, wie tumorassoziierte Mechanismen die Mechanik von Gewebe beeinflussen, wobei ich auch emergente Effekte berücksichtige.:Contents iv List of Figures viii 1 Introduction 1 2 Background 5 2.1 Tissue architecture 5 2.1.1 The extracellular matrix 5 2.1.2 ECM in tumors 6 2.1.3 Focus: collagen 7 2.1.4 The neural ECM in the brain 9 2.1.5 Breast tissue 10 2.1.6 Cervix and uterus tissue 11 2.2 Cancer 13 2.2.1 Development and spreading 13 2.2.2 Clinical grading and staging 15 2.3 Cell mechanics 17 2.3.1 Contractility17 2.3.2 Unjamming and tissue Fluidization in cancer 19 2.4 Applied Magnetic Resonance Imaging 20 2.4.1 The necessary basics 20 2.4.2 Diffusion weighted imaging 24 2.4.3 MR Elastogprahy 25 2.5 Viscoelasticity and rheological models 28 2.5.1 Deformation and material response 28 2.5.2 Basic viscoelastic model components 30 2.5.3 Fractional element model 32 2.5.4 Kelvin-Voigt model 33 2.6 Stiffness and Fluidity 34 2.6.1 Stiffness and Fluidity in clinical in vivo MRE 35 3 Materials and Methods 36 3.1 Collagen Gels 36 3.1.1 Collagen preparation 36 3.1.2 Collagen crosslinking 37 3.2 Cell and tissue culture 37 3.2.1 Cell lines 37 3.2.2 Multicellular Spheroids 39 3.2.3 Primary tissues 40 3.2.4 Contractility and invasion assay 41 3.3 Optical imaging and analysis 43 3.3.1 Confocal microscopy for collagen pore size analysis 43 3.3.2 Optical clearing and imaging of fixated primary tissues 44 3.3.3 Live imaging scenarios for cell tracking and collagen displacement analysis 44 3.4 Oscillatory shear rheology 46 3.5 MR techniques 47 3.5.1 0.5 T Tabletop MRE device 48 3.5.2 NMR based diffusion measurements 49 3.5.3 MR Elastography with the tabletop device 52 3.5.4 Clinical in vivo MRE 55 3.6 Optical cell stretcher after in vivo MRE 58 3.6.1 Study design and sample handling 58 3.6.2 In vivo MRE on human brain tumors 59 3.6.3 OCS on cells from dissociated human brain tumors 61 3.6.4 Correlation analysis between OCS and in vivo MRE 61 3.7 Atomic force microscopy (AFM) 62 4 Results and Discussion 63 4.1 Elastic vs. viscoelastic behavior 63 4.2 The scalability of rheological methods 65 4.2.1 Quantitative comparison 65 4.2.2 Qualitative coherence in aortic tissues across all scales 66 4.2.3 Section-Discussion: Multiscale tissue analysis 71 4.3 Collagen as a tuneable ECM surrogate 73 4.3.1 Shear rheology on collagen gels 73 4.3.2 Crosslinking solidies collagen gels 74 4.3.3 Simplifying data interpretation with stiffness and Fluidity 79 4.3.4 Inuence of matrix architecture on stiffness and Fluidity 81 4.3.5 Section-Discussion: tabletop MRE and DWI on collagen gels 84 4.4 Single cell vs. bulk tissue mechanics 86 4.4.1 Surface and bulk mechanics of spheroids in context of their single cell properties 86 4.4.2 Soft cancer cells in rigid tumors (ex vivo) 88 4.4.3 Correlation of in vivo bulk tissue mechanics with single cell properties in human brain tumors 89 4.4.4 Section-Discussion: Single cell vs. bulk tissue mechanics 94 4.5 Cells in interaction with the ECM 97 4.5.1 Single cells on collagen 97 4.5.2 Cell aggregates and spheroids on collagen 102 4.5.3 Primary tumor tissue on collagen 106 4.5.4 Partial tissue fluidization in cancer cell clusters in primary human tumor explants 111 4.5.5 Section-Discussion: Cell-ECM interactions 114 4.6 Tabletop MRE on tumor tissues 116 4.6.1 General remarks 116 4.6.2 Results 119 4.6.3 Correlations with patient data 125 4.6.4 Section-Discussion: Tabletop vs. clinical in vivo NMR 126 4.7 Stiffness and Fluidity as prognostic tumor markers 134 4.7.1 Rheological Fingerprints of tumors in vivo 134 4.7.2 Gedankenexperiment on tumor growth 139 4.7.3 Roadmap to a novel prognostic tumor marker 143 4.7.4 Section-Discussion: Stiffness and Fluidity in tumor progression 147 4.7.5 The limitations of in vivo MRE 155 5 Conclusions and Outlook 156 5.1 Conclusions 156 5.2 Outlook on a novel biophysical in vivo tumor marker 163 A Extended data 165 A.1 Extended tabletop results for aortic tissue 165 A.2 Supplementary Figures 168 A.3 Protocols 171 A.3.1 Data acquisition with the tabletop MRE 171 A.3.2 Data evaluation routines for the tabletop MRE 173 A.4 Additional information on breast tumor sample MCA200 175 A.5 Case-wise tumor classification scheme 176 B Video Attachments 178 B.1 Collagen synthesis 178 B.2 Single cells on collagen 178 B.3 Cell aggregates and spheroids on collagen 178 B.4 Primary tumor tissues on collagen 179 B.5 Live cell tracking in breast tumor MCA200 179 Bibliography 180 Acknowledgments 207 Zusammenfassung nach §11 209 / During cancer progression, cells and tissues undergo mechanical changes. Magnetic Resonance Elastography (MRE) can probe tissue mechanics in vivo, but currently, it is predominantly used as an additional contrast mode in clinical settings and the connection to the underlying physics of cancer is mostly lacking. In my thesis, I outline a roadmap towards an in vivo tumor marker that focuses on biophysical properties. I provide a diverse experimental background, which spans from the mechanical characterization of extracellular matrix surrogates to live cell tracking and ex vivo MRE in vital human tumor explants. A subsequent analysis of the mechanical Fingerprints of tumors in vivo reveals robust trends. These trends are elucidated further through a gedankenexperiment on the fundamental mechanical prerequisites for tumor growth. I propose a biophysics-based tumor classification scheme rooted in mechanical parameters. In conclusion, I consolidate how tumorassociated mechanisms impact bulk tissue mechanics, emphasizing emergent effects.:Contents iv List of Figures viii 1 Introduction 1 2 Background 5 2.1 Tissue architecture 5 2.1.1 The extracellular matrix 5 2.1.2 ECM in tumors 6 2.1.3 Focus: collagen 7 2.1.4 The neural ECM in the brain 9 2.1.5 Breast tissue 10 2.1.6 Cervix and uterus tissue 11 2.2 Cancer 13 2.2.1 Development and spreading 13 2.2.2 Clinical grading and staging 15 2.3 Cell mechanics 17 2.3.1 Contractility17 2.3.2 Unjamming and tissue Fluidization in cancer 19 2.4 Applied Magnetic Resonance Imaging 20 2.4.1 The necessary basics 20 2.4.2 Diffusion weighted imaging 24 2.4.3 MR Elastogprahy 25 2.5 Viscoelasticity and rheological models 28 2.5.1 Deformation and material response 28 2.5.2 Basic viscoelastic model components 30 2.5.3 Fractional element model 32 2.5.4 Kelvin-Voigt model 33 2.6 Stiffness and Fluidity 34 2.6.1 Stiffness and Fluidity in clinical in vivo MRE 35 3 Materials and Methods 36 3.1 Collagen Gels 36 3.1.1 Collagen preparation 36 3.1.2 Collagen crosslinking 37 3.2 Cell and tissue culture 37 3.2.1 Cell lines 37 3.2.2 Multicellular Spheroids 39 3.2.3 Primary tissues 40 3.2.4 Contractility and invasion assay 41 3.3 Optical imaging and analysis 43 3.3.1 Confocal microscopy for collagen pore size analysis 43 3.3.2 Optical clearing and imaging of fixated primary tissues 44 3.3.3 Live imaging scenarios for cell tracking and collagen displacement analysis 44 3.4 Oscillatory shear rheology 46 3.5 MR techniques 47 3.5.1 0.5 T Tabletop MRE device 48 3.5.2 NMR based diffusion measurements 49 3.5.3 MR Elastography with the tabletop device 52 3.5.4 Clinical in vivo MRE 55 3.6 Optical cell stretcher after in vivo MRE 58 3.6.1 Study design and sample handling 58 3.6.2 In vivo MRE on human brain tumors 59 3.6.3 OCS on cells from dissociated human brain tumors 61 3.6.4 Correlation analysis between OCS and in vivo MRE 61 3.7 Atomic force microscopy (AFM) 62 4 Results and Discussion 63 4.1 Elastic vs. viscoelastic behavior 63 4.2 The scalability of rheological methods 65 4.2.1 Quantitative comparison 65 4.2.2 Qualitative coherence in aortic tissues across all scales 66 4.2.3 Section-Discussion: Multiscale tissue analysis 71 4.3 Collagen as a tuneable ECM surrogate 73 4.3.1 Shear rheology on collagen gels 73 4.3.2 Crosslinking solidies collagen gels 74 4.3.3 Simplifying data interpretation with stiffness and Fluidity 79 4.3.4 Inuence of matrix architecture on stiffness and Fluidity 81 4.3.5 Section-Discussion: tabletop MRE and DWI on collagen gels 84 4.4 Single cell vs. bulk tissue mechanics 86 4.4.1 Surface and bulk mechanics of spheroids in context of their single cell properties 86 4.4.2 Soft cancer cells in rigid tumors (ex vivo) 88 4.4.3 Correlation of in vivo bulk tissue mechanics with single cell properties in human brain tumors 89 4.4.4 Section-Discussion: Single cell vs. bulk tissue mechanics 94 4.5 Cells in interaction with the ECM 97 4.5.1 Single cells on collagen 97 4.5.2 Cell aggregates and spheroids on collagen 102 4.5.3 Primary tumor tissue on collagen 106 4.5.4 Partial tissue fluidization in cancer cell clusters in primary human tumor explants 111 4.5.5 Section-Discussion: Cell-ECM interactions 114 4.6 Tabletop MRE on tumor tissues 116 4.6.1 General remarks 116 4.6.2 Results 119 4.6.3 Correlations with patient data 125 4.6.4 Section-Discussion: Tabletop vs. clinical in vivo NMR 126 4.7 Stiffness and Fluidity as prognostic tumor markers 134 4.7.1 Rheological Fingerprints of tumors in vivo 134 4.7.2 Gedankenexperiment on tumor growth 139 4.7.3 Roadmap to a novel prognostic tumor marker 143 4.7.4 Section-Discussion: Stiffness and Fluidity in tumor progression 147 4.7.5 The limitations of in vivo MRE 155 5 Conclusions and Outlook 156 5.1 Conclusions 156 5.2 Outlook on a novel biophysical in vivo tumor marker 163 A Extended data 165 A.1 Extended tabletop results for aortic tissue 165 A.2 Supplementary Figures 168 A.3 Protocols 171 A.3.1 Data acquisition with the tabletop MRE 171 A.3.2 Data evaluation routines for the tabletop MRE 173 A.4 Additional information on breast tumor sample MCA200 175 A.5 Case-wise tumor classification scheme 176 B Video Attachments 178 B.1 Collagen synthesis 178 B.2 Single cells on collagen 178 B.3 Cell aggregates and spheroids on collagen 178 B.4 Primary tumor tissues on collagen 179 B.5 Live cell tracking in breast tumor MCA200 179 Bibliography 180 Acknowledgments 207 Zusammenfassung nach §11 209

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In der vorliegenden Dissertation wird die Entwicklung eines phylogenetischen DNA Microarrays, die Analyse von mehreren Microarray-Genexpressionsdatensätzen und neue Ansätze für die Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse vorgestellt. Die Entwicklung und Analyse der Daten eines phylogenetischen DNA Microarrays wird in der ersten Publikation dargestellt. Ich konnte zeigen, dass die Spezies-Detektion mit phylogenetischen Microarrays durch die Datenanalyse mit einem linearen Regressionsansatz signifikant verbessert werden kann. Standard-Methoden haben bislang nur Signalintensitäten betrachtet und eine Spezies als an- oder abwesend bezeichnet, wenn die Signalintensität ihres Messpunktes oberhalb eines willkürlich gesetzten Schwellenwertes lag. Dieses Verfahren ist allerdings aufgrund von Kreuz-Hybridisierungen nicht auf sehr nah verwandte Spezies mit hoher Sequenzidentität anwendbar. Durch die Modellierung des Hybridisierungs und Kreuz-Hybridisierungsverhaltens mit einem linearen Regressionsmodell konnte ich zeigen, dass Spezies mit einer Sequenzähnlichkeit von 97% im Markergen immer noch unterschieden werden können. Ein weiterer Vorteil der Modellierung ist, dass auch Mischungen verschiedener Spezies zuverlässig vorhergesagt werden können. Theoretisch sind auch quantitative Vorhersagen mit diesem Modell möglich. Um die großen Datenmengen, die in öffentlichen Microarray-Datenbanken abgelegt sind besser nutzen zu können, bieten sich Meta-Analysen an. In der zweiten Publikation wird eine explorative Meta-Analyse auf Arabidopsis thaliana-Datensätzen vorgestellt. Mit der Analyse verschiedener Datensätze, die den Einfluss von Pflanzenhormonen, Pathogenen oder verschiedenen Mutationen auf die Genexpression untersucht haben, konnten die Datensätze anhand ihrer Genexpressionsprofile in drei große Gruppen eingeordnet werden: Experimente mit Indol-3-Essigsäure (IAA), mit Pathogenen und andere Experimente. Gene, die charakteristisch für die Gruppe der IAA-Datensätze beziehungsweise für die Gruppe der Pathogen-Datensätze sind, wurden näher betrachtet. Diese Gene hatten Funktionen, die bereits mit Pathogenbefall bzw. dem Einfluss von IAA in Verbindung gebracht wurden. Außerdem wurden Hypothesen über die Funktionen von bislang nicht annotierten Genen aufgestellt. In dieser Arbeit werden auch Primäranalysen von einzelnen Arabidopsis thaliana Genexpressions-Datensätzen vorgestellt. In der dritten Publikation wird ein Experiment beschrieben, das durchgeführt wurde um herauszufinden ob Mikrowellen-Strahlung einen Einfluss auf die Genexpression einer Zellkultur hat. Dazu wurden explorative Analysemethoden angewendet. Es wurden geringe aber signifikante Veränderungen in einer sehr kleinen Anzahl von Genen beobachtet, die experimentell bestätigt werden konnten. Die Funktionen der regulierten Gene und eine Meta-Analyse mit öffentlich zugänglichen Datensätzen einer Datenbank deuten darauf hin, dass die pflanzliche Zellkultur die Strahlung als eine Art Energiequelle ähnlich dem Licht wahrnimmt. Des weiteren wird in der vierten Publikation die funktionelle Analyse eines Arabidopsis thaliana Genexpressionsdatensatzes beschrieben. Die Analyse der Genexpressions eines pflanzlichen Tumores zeigte, dass er seinen Stoffwechsel von aerob und auxotroph auf anaerob und heterotroph umstellt. Gene der Photosynthese werden im Tumorgewebe reprimiert, Gene des Aminosäure- und Fettstoffwechsels, der Zellwand und Transportkanäle werden so reguliert, dass Wachstum und Entwicklung des Tumors gefördert werden. In der fünften Publikation in dieser Arbeit wird GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool) beschrieben. Es besteht aus einer Internet- Anwendung und einer Datenbank, die das einfache Hochladen von Datensätzen in die Datenbank und viele Möglichkeiten der Datenanalyse und die Integration anderer Datentypen erlaubt. In den folgenden zwei Publikationen (Publikation 6 und Publikation 7) wird GEPAT auf humane Microarray-Datensätze angewendet um Genexpressionsdaten mit weiteren Datentypen zu verknüpfen. Genexpressionsdaten und Daten aus vergleichender Genom-Hybridisierung (CGH) von primären Tumoren von 71 Mantel-Zell-Lymphom (MCL) Patienten ermöglichte die Ermittlung eines Prädiktors, der die Vorhersage der Überlebensdauer von Patienten gegenüber herkömmlichen Methoden verbessert. Die Analyse der CGH Daten zeigte, dass auch diese für die Vorhersage der Überlebensdauer geeignet sind. Für den Datensatz von Patienten mit großzellig diffusem B-Zell-Lymphom DLBCL konnte aus den Genexpressionsdaten ebenfalls ein neuer Prädiktor vorgeschlagen werden. Mit den zwischen lang und kurz überlebenden Patienten differentiell exprimierten Genen der MCL Patienten und mit den Genen, die zwischen den beiden Untergruppen von DLBCL reguliert sind, wurden Interaktionsnetzwerke gebildet. Diese zeigen, dass bei beiden Krebstypen Gene des Zellzyklus und der Proliferation zwischen Patienten mit kurzer und langer Überlebensdauer unterschiedlich reguliert sind. / In this thesis, the development of a phylogenetic DNA microarray, the analysis of several gene expression microarray datasets and new approaches for improved data analysis and interpretation are described. In the first publication, the development and analysis of a phylogenetic microarray is presented. I could show that species detection with phylogenetic DNA microarrays can be significantly improved when the microarray data is analyzed with a linear regression modeling approach. Standard methods have so far relied on pure signal intensities of the array spots and a simple cutoff criterion was applied to call a species present or absent. This procedure is not applicable to very closely related species with high sequence similarity because cross-hybridization of non-target DNA renders species detection impossible based on signal intensities alone. By modeling hybridization and cross-hybridization with linear regression, as I have presented in this thesis, even species with a sequence similarity of 97% in the marker gene can be detected and distinguished from related species. Another advantage of the modeling approach over existing methods is that the model also performs well on mixtures of different species. In principle, also quantitative predictions can be made. To make better use of the large amounts of microarray data stored in public databases, meta-analysis approaches need to be developed. In the second publication, an explorative meta-analysis exemplified on Arabidopsis thaliana gene expression datasets is presented. Integrating datasets studying effects such as the influence of plant hormones, pathogens and different mutations on gene expression levels, clusters of similarly treated datasets could be found. From the clusters of pathogen-treated and indole-3-acetic acid (IAA) treated datasets, representative genes were selected which pointed to functions which had been associated with pathogen attack or IAA effects previously. Additionally, hypotheses about the functions of so far uncharacterized genes could be set up. Thus, this kind of meta-analysis could be used to propose gene functions and their regulation under different conditions. In this work, also primary data analysis of Arabidopsis thaliana datasets is presented. In the third publication, an experiment which was conducted to find out if microwave irradiation has an effect on the gene expression of a plant cell culture is described. During the first steps, the data analysis was carried out blinded and exploratory analysis methods were applied to find out if the irradiation had an effect on gene expression of plant cells. Small but statistically significant changes in a few genes were found and could be experimentally confirmed. From the functions of the regulated genes and a meta-analysis with publicly available microarray data, it could be suspected that the plant cell culture somehow perceived the irradiation as energy, similar to perceiving light rays. The fourth publication describes the functional analysis of another Arabidopsis thaliana gene expression dataset. The gene expression data of the plant tumor dataset pointed to a switch from a mainly aerobic, auxotrophic to an anaerobic and heterotrophic metabolism in the plant tumor. Genes involved in photosynthesis were found to be repressed in tumors; genes of amino acid and lipid metabolism, cell wall and solute transporters were regulated in a way that sustains tumor growth and development. Furthermore, in the fifth publication, GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool), a tool for the analysis and integration of microarray data with other data types, is described. It consists of a web application and database which allows comfortable data upload and data analysis. In later chapters of this thesis (publication 6 and publication 7), GEPAT is used to analyze human microarray datasets and to integrate results from gene expression analysis with other datatypes. Gene expression and comparative genomic hybridization data from 71 Mantle Cell Lymphoma (MCL) patients was analyzed and allowed proposing a seven gene predictor which facilitates survival predictions for patients compared to existing predictors. In this study, it was shown that CGH data can be used for survival predictions. For the dataset of Diffuse Large B-cell lymphoma (DLBCL) patients, an improved survival predictor could be found based on the gene expression data. From the genes differentially expressed between long and short surviving MCL patients as well as for regulated genes of DLBCL patients, interaction networks could be set up. They point to differences in regulation for cell cycle and proliferation genes between patients with good and bad prognosis.

Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes. Bei den zu Tode führenden Tumoren wird es im Jahre 2003 nach dem Bronchialkarzinom an 2. Stelle stehen. Diese Inzidenz zeigt, dass dringend neue diagnostische Marker und therapeutische Zielgene zur Behandlung von Prostatakrebs benötigt werden. Ziel dieser Dissertation war es, mit Hilfe der DNA-Chiptechnologie neue tumorrelevante Gene für eine Small-Molecule- und Antikörper-Basierte Therapie des Prostatakarzinoms zu identifizieren. Auf einen proprietären Tumor-Chip der Firma metaGen Pharmaceuticals GmbH wurde mikrodissektiertes Normal- und korrespondierendes Tumorgewebe von 52 Prostatatumorpatienten hybridisiert. Mit Hilfe bioinformatischer Analysen der Chipergebnisse konnte das Gen TRPM8 identifiziert werden, das in Prostatatumoren in mehr als 56% der Patienten überexprimiert ist. Northern-Blot, Dot-Blot und Chipexperimente zeigten, dass TRPM8 ungewöhnlich gewebespezifisch exprimiert wird. In mehr als 400 getesteten Tumorpatienten und in 23 Normalgeweben wurde TRPM8 ausschließlich in der Prostata und neuroendokrinen Tumoren nachgewiesen. TRPM8 gehört zur Familie der Transient Receptor Potential Channel Proteins. Es konnte hier erstmals in Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Experimenten (FRET) gezeigt werden, dass TRPM8 Multi-Homomere bildet. Dies wurde bisher nur für Kanäle anderer TRP-Subfamilien (TRPV und TRPC) gezeigt. Weiterhin konnten erstmals mehrere Spleißvarianten von TRPM8 identifiziert werden. Quantitative RT-PCR Experimente zeigten, dass diese noch stärker in Prostatatumoren überexprimiert sind als TRPM8 selbst. Des Weiteren wurde ein neues Gen auf dem DNA-Gegenstrang von TRPM8 entdeckt, das mit Exon 11 von TRPM8 100% komplementär ist und an der Regulation von TRPM8 beteiligt sein könnte. Der Promotor von TRPM8 wurde durch eine in silico Analyse identifiziert und in vitro bestätigt. Obwohl eine starke androgenabhängige Expression von TRPM8 in LNCaP Zellen gezeigt werden konnte, wurden keine Bindungsstellen für androgenabhänginge Elemente gefunden. Allerdings ließen sich drei Bindungsstellen des androgenregulierten Homeoboxgens NKX3.1 identifizieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass TRPM8 und seine Isoformen aufgrund ihrer Gewebspezifität ausgezeichnete Angriffspunkte für eine zielgerichtete Prostatakrebstherapie sind. / Prostate cancer is the most commonly diagnosed malignancy in men in the Western World. In 2003 malignancies of the prostate will be the second most common fatal cancer in men after lung cancer as estimated by the American Cancer Society. Despite the tremendous efforts made in the past to improve the treatment of prostate cancer patients, there is still an urgent need for new markers and therapeutic targets for medication. The aim of this thesis was the identification of new genes relevant in prostate cancer, which could be used in a small-molecule or antibody based therapy of prostate cancers. Microdissected matched prostate cancer and normal tissues of 52 prostate cancer patients were hybridized to a proprietary high density Cancer-Chip based on Affymetrix GeneChip technology. Using a bioinformatic analysis, it was possible to identify TRPM8, which was highly overexpressed in 56% of prostate cancer patients. Northern blot, dot blot and gene chip experiments revealed that TRPM8 expression is extremely tissue specific. Of 400 patients and 23 tissues tested, TRPM8 expression could only be detected in the prostate and neuroendocrine tumors. Functionally, the protein belongs to the transient receptor potential channel family of non-voltage gated proteins. It could be shown for the fist time that TRPM8 subunits form homomers using FRET technology. Molecular characterization of TRPM8 transcription revealed multiple splice forms of TRPM8. Further, it was possible to identify a new mRNA present on the opposite strand of TRPM8, which was 100% complementary to exon 11 of TRPM8, thus it could possibly function as a regulatory RNA of TRP channel. All of these isoforms were found to be even higher overexpressed in prostate tumors than TRPM8 itself. The promoter region of TRPM8 was identified using in silico methods and confirmed in promoter reporter assays. Although a high androgen dependent transcriptional activation of TRPM8 could be found by RT-PCR in LNCaP cells, no androgen responsive elements was identifiable within the promoter region. On the other hand three binding sites for the androgen dependent homeobox gene NKX3.1 and several other homeobox genes were discovered. The results of the thesis show that TRPM8 and its isoforms are, due to their tissue specificity, ideal targets for the development of new therapeutic drugs for the treatment of prostate cancer.

Krebs und Infektionskrankheiten, wie z.B. Influenza, stellen zwei der großen Bedrohungen für die Menschheit dar. Gerade durch den demographischen Wandel sind immer mehr Menschen gefährdet. Mathematische Modelle von Krankheiten decken verschiedene Detailebenen ab -- von epidemologischen Modellen der Virusinfektion bis zu intrazellulären Modellen der Signaltransduktion in einzelnen Krebszellen. Diese Modelle, sofern sie anhand von biologische Daten kalibriert wurden, können sich als sehr nützlich erweisen um Hypothesen zu bisher unbekannten Wechselwirkungen zu generieren, Wirkstoffkandidaten vorherzusagen, und die Funktionsweise von existierenden Wirkstoffen besser zu verstehen. Im Rahmen dieser Arbeit möchte ich mehrere Projekte vorstellen, in denen prädiktive mathematische Modelle dazu benutzt wurden, tiefere Einblicke in die biologischen Prozesse zu gewinnen und die Therapieansätze bei Krebserkrankungen und den damit verbundenen Gesundheitsproblemen zu verbessern. Im ersten Teil geht es um die Bedeutung von gemeinschaftlich entwickelter Software für die Systembiologie. Eine offene und erweiterbare Modellierungssoftware ermöglicht es ständig verbessert zu werden und an die Bedürfnisse der Nutzer angepasst zu werden. Im zweiten Projekt wurden die intrazellulären Prozesse während der frühen Influenza A Infektion untersucht. Durch eine Kombination von biologischen Messungen und mathematischer Modellierung konnte der Abbau von viraler RNA wähernd des Transportes durch das Wirtszellzytoplasma als limitierender Faktor für die erfolgreiche Infektion identifiziert werden. Mit Hilfe eines experimentell modifizierten viralen Hämagglutintin-Proteins mit veränderter pH-Abhängigkeit konnte gezeigt werden, dass sich der Abstand zum Zellkern, in dem das virale Genom freigesetzt wird, vergrößert. Die Modellvorhersage, dass die Infektion dadurch weniger effektiv wird, konnte experimentell bestätigt werden. Im dritten Projekt beschäftigte ich mich mit gesundheitlichen Problemen, die im Zusammenhang mit einer Krebserkrankung und deren Behandlung auftreten können. Chemotherapie oder die Krebserkrankung selbst führt bei vielen Patienten zu einer Blutarmut (Anämie). Diese wird aktuell entweder durch regelmäßige Bluttransfusionen oder durch Verabreichung von sogenannten Erythropoiesis-Stimulating Agents (kurz: ESA, zu Deutsch: Erythropoese-stimulierende Substanzen) behandelt. Mithilfe eines publizierten mathematischen Modells zur ESA-EpoR Interaktion konnten die Bindungseigenschaften verschiedener ESAs charakterisiert und zudem die Anzahl der Bindungsstellen auf unterschiedlichen Zelllinien bestimmt werden. Durch eine Erweiterung des Modells mit einem pharmakokinetischen und -dynamischen Teil konnte die Dosierung für Anämiepatienten retrospektiv verbessert werden. Das letzte Projekt stellt eine computerbasierte Methode zur Analyse und Entschlüsselung der zellulären Zusammensetzung von Tumorproben dar. In den vergangenen Jahren wurde vermehrt eine neue Klasse von Krebsmedikamenten entwickelt, die sich das körpereigene Immunsystem zunutze macht, um den Krebs zu bekämpfen. Das Funktionieren dieser Medikamente hängt jedoch davon ab, ob bestimmte Immunzellen in der Umgebung des Tumors vorhanden sind. Auf Grundlage von Einzelzell RNA-Sequenzierungsdaten konnte eine existierende Methode so erweitert werden, dass nunmehr auch Proben von soliden Tumoren entschlüsselt werden können. Zudem wurden die Einflüsse von verschiedenen Faktoren, wie etwa der Gewebeherkunft oder dem verwendeten Algorithmus, systematisch ausgewertet. Zusammengefasst habe ich in dieser Arbeit dargestellt, wie prädiktive Computermodelle dazu verwendet werden können bestehende Behandlungsansätze zu verbessern und neue Wirkstoffkandidaten zu identifizieren. / Cancer and infectious diseases, such as influenza infection, represent major threats to the human population, especially since demographic change makes more and more people vulnerable. Mathematical modeling of disease covers several layers of detail ranging from epidemiological models for infection spread to cancer-associated signaling within individual cells. These models, when being calibrated to biological data, can provide useful means for generating hypothesis of priorly unknown interactions, predicting drug targets for novel therapeutic substances and for improving the understanding and efficient functioning of existing treatment strategies. In this thesis, I present several projects in which predictive computational models are utilized to gain deeper insights into the biological processes and to improve therapy of cancer and associated health problems. The first part highlights the importance of community-driven software development for systems biology applications. Efficient, yet expandable and open software continuously improves, driven by an active community of users and developers. In the second project, the intracellular processes during the early influenza A infection are investigated. Using a combination of experimental measurements and mathematical modeling, degradation of the viral genome during its diffusion through the cytoplasm could be identified as a limiting factor for a successful infection. By experimentally increasing the pH sensitivity of the viral hemagglutinin protein, the distance of diffusion was increased and the computationally predicted decrease in infectivity could be validated in experiment. The third project deals with cancer-associated health issues and their treatment. Patients suffering from anemia, caused by the cancer itself or as a side-effect of chemotherapy, are treated either with blood transfusions or with an erythropoiesis stimulating agent (ESA). By adapting a published model of ESA-EpoR interaction, not only the biochemical properties of different ESAs could be characterized in silico but also the number of binding sites (i.e. Epo receptors on the cell surface) in different cell lines was accurately determined. The model was extended by a pharmaco-kinetic and -dynamic part. The combined ESA-EpoR-PK/PD model could be utilized to retrospectively optimize the dosing regimen of patients suffering from anemia. In the last project, a computational method for analyzing and deciphering the cellular composition of bulk tumor samples is presented. Only recently, a new class of anti-cancer drugs was introduced recruiting the body’s own immune system to combat malignant tissue. However, the efficient functioning of these immunotherapeutical drugs heavily depends on the presence of specific immune cells in the tumor micro-environment. Based on single-cell RNA sequencing data, an existing method for computational deconvolution could be adapted for data from solid tumor tissue and its performance was benchmarked. Taken together, in this thesis I present approaches how predictive computational models can be utilized to render more efficient existing treatment strategies.