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Systemic autoimmunity describes a group of detrimental conditions, characterized by loss of immunologic self-tolerance. Pattern recognition receptors (PRR) detect recurrent microbial structures including nucleic acids. Nucleic acid-specific PRRs are not well equipped to discriminate between self and non-self nucleic acids and their aberrant activation leads to autoimmune conditions, driven by chronic activation of the type I interferon (IFN) system. This concept has been established by research on the molecular mechanisms underlying the rare Aicardi-Goutières syndrome (AGS). Loss of function mutations in the gene SAMHD1 cause AGS. SAMHD1 was first described as a deoxyribonucleotide (dNTP) triphosphohydrolase (dNTPase) and its activity is tightly regulated during the cell cycle to ensure the correct cellular supply of dNTPs. Cells decrease SAMHD1 dNTPase activity during S phase where the DNA must be replicated and once the S phase is over, dNTPase activity is restored and the dNTP levels are reduced. Loss of SAMHD1 causes an increase of the cellular dNTP concentration during phases of the cell cycle, a well-known trigger for DNA damage, but its consequences has not been addressed yet thoroughly. Recently, SAMHD1 has been also reported to promote homologous recombination directly at the site of DNA double strand breaks (DSB) upon genotoxic stress. By interacting with the protein CtIP, SAMHD1 helped to coordinate the MRN complex and promotes DSB repair. Loss of SAMHD1 impaired this repair mechanism, causing genome instability. Interestingly, this activity of SAMHD1 has also been recently shown to promote restart of stalled replication forks. Lack of SAMHD1 lead to an increase of stalled replication forks and DSBs. How the different activities of SAMHD1 remain balanced and are activated under specific conditions still remains unknown. Additionally, inactivating mutations in SAMHD1 have recurrently been identified in various types of cancers, raising the question, if the protein might function as a tumour suppressor. However, up to date, no in vivo study has addressed the role of SAMHD1 in preventing DNA damage or cancer development, and its relationship to an uncontrolled type I IFN response. In this work, Samhd1-deficient mice were screened in search for sign of DNA damage and an increase in micronucleated erythrocytes, a hallmark for genome instability, was found in comparison with their littermate controls. This increase was still present upon inactivation of nucleic acid sensing pathways, indicating that it was independent of the status of type I IFN response. HSC competitive transplantation experiments with Samhd1-deficient and control HSCs showed a minor contribution of Samhd1 in maintaining lymphogenesis. Despite these findings, Samhd1-deficient mice do not develop any autoimmune disease nor cancer up to 2 years of observation. Previous reports showed a possible relation between loss of SAMHD1 and p53 activation. We inactivated p53 in Samhd1 ko mice, which resulted in accelerated lethality and an earlier onset of tumour formation when compared with p53 ko mice. However, the underlying molecular mechanisms of both observations remains to be fully elucidated. In contrast to the results with p53, inactivation of DNA mismatch repair (knockout of Pms2) in Samhd1 ko mice, had no effect on the tumour-free survival in comparison with Pms2 ko mice. Inactivation of either p53 or Pms2 in Samhd1 ko mice did not altered the spontaneous type I IFN activation. To understand better the different activities described for Samhd1 – dNTPase and DNA damage-related activities –, the dNTPase-inactivating mutations HD238/239AA were knocked into the endogenous Samhd1 gene using CRISPR/Cas9. Using this mouse model, we found that the mutant Samhd1 protein is rapidly degraded in the proteasome, leading to almost complete absence of Samhd1 in the new mouse strain, as seen in patient with similar mutation in Samhd1. These results demonstrated that in patients with mutations in the dNTPase domain, the phenotype is most likely driven by a complete absence of Samhd1 and only by a selective loss of the dNTPase activity. Our work provides new insights in the understanding of Samhd1 as regulator of DNA damage and establishes new ground for further research on the link between DNA damage and type I IFN response.

Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare, but highly aggressive endocrine malignancy. Tumor-related hypercortisolism is present in 60 % of patients and associated with worse outcome. While cancer immunotherapies have revolutionized the treatment of many cancer entities, the results of initial studies of different immune checkpoint inhibitors in ACC were heterogeneous. Up to now, five small clinical trials with a total of 121 patients have been published and demonstrated an objective response in only 17 patients. However, one of the studies, by Raj et al., reported a clinically meaningful disease control rate of 52 % and a median overall survival of almost 25 months suggesting that a subgroup of ACC patients may benefit from immunotherapeutic approaches. Following the hypothesis that some ACCs are characterized by a glucocorticoid-induced T lymphocytes depletion, several studies were performed as part of the presented thesis. First, the immune cell infiltration in a large cohort of 146 ACC specimens was investigated. It was demonstrated for the first time, and against the common assumption, that ACCs were infiltrated not only by FoxP3+ regulatory T cells (49.3 %), but also that a vast majority of tumor samples was infiltrated by CD4+ TH cells (74 %) and CD8+ cytotoxic T cells (84.3 %), albeit the immune cell number varied heterogeneously and was rather low (median: 7.7 CD3+ T cells / high power field, range: 0.1-376). Moreover, the presence of CD3+-, CD4+- and CD8+ ACC-infiltrating lymphocytes was associated with an improved recurrence-free (HR: 0.31 95 % CI 0.11-0.82) and overall survival (HR: 0.47 96 % CI 0.25-0.87). Particularly, patients with tumor-infiltrating CD4+ TH cells without glucocorticoid excess had a significantly longer overall survival compared to patients with T cell-depleted ACC and hypercortisolism (121 vs. 27 months, p = 0.004). Hence, the impact of glucocorticoids might to some extent be responsible for the modest immunogenicity in ACC as hypercortisolism was reversely correlated with the number of CD4+ TH cells. Accordingly, CD3+ T cells co-cultured with steroidogenic NCI-H295R ACC cells demonstrated in vitro an enhanced anti-tumoral cytotoxicity by secreting 747.96 ±225.53 pg/ml IFN-γ in a therapeutically hormone-depleted microenvironment (by incubation with metyrapone), versus only 276.02 ±117.46 pg/ml IFN-γ in a standard environment with glucocorticoid excess. Other potential biomarkers to predict response to immunotherapies are the immunomodulatory checkpoint molecules, programmed cell death 1 (PD-1) and its ligand PD-L1, since both are targets of antibodies used therapeutically in different cancer entities. In a subcohort of 129 ACCs, expressions of both molecules were heterogeneous (PD-1 17.4 %, range 1-15; PD-L1 24.4 %, range 1 - 90) and rather low. Interestingly, PD-1 expression significantly influenced ACC patients´ overall (HR: 0.21 95 % CI 0.53-0.84) and progression- free survival (HR: 0.30 95 % CI 0.13-0.72) independently of established factors, like ENSAT tumor stage, resection status, Ki67 proliferation index and glucocorticoid excess, while PD-L1 had no impact. In conclusion, this study provides several potential explanations for the heterogeneous results of the immune checkpoint therapy in advanced ACC. In addition, the establishment of PD-1 as prognostic marker can be easily applied in routine clinical care, because it is nowadays anyway part of a detailed histo-pathological work-up. Furthermore, these results provide the rationale and will pave the way towards a combination therapy using immune checkpoint inhibitors as well as glucocorticoid blockers. This will increase the likelihood of re-activating the immunological anti-tumor potential in ACC. However, this will have to be demonstrated by additional preclinical in vivo experiments and finally in clinical trials with patients. / Das Nebennierenrindenkarzinom (ACC) ist ein seltenes, aber äußerst aggressives endokrines Malignom. Ein tumorbedingter Hyperkortisolismus liegt bei 60 % der Patienten vor und ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Während Krebsimmuntherapien die Behandlung vieler Krebsentitäten revolutioniert haben, waren die Ergebnisse der ersten Studien zu verschiedenen Immun-Checkpoint-Inhibitoren beim ACC heterogen. Die fünf klinischen Studien mit insgesamt 121 Patienten zeigten ein objektives Ansprechen bei nur 17 Patienten. Eine Studie von Raj et al. berichtete über eine klinisch bedeutsame Krankheitskontrollrate von 52 % und ein medianes Gesamtüberleben von fast 25 Monaten. Diese beträchtliche Anti-Tumor-Aktivität legt nahe, dass eine Subgruppe von ACC-Patienten von immuntherapeutischen Ansätzen profitieren könnte. Der Hypothese folgend, dass einige ACCs durch eine Glukokortikoid-induzierte T Lymphozyten-Depletion gekennzeichnet sind, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit mehrere Studien durchgeführt. Zunächst wurde die Immunzellinfiltration in einer großen Kohorte von 146 ACC-Proben untersucht. Entgegen der verbreiteten Annahme konnte erstmals gezeigt werden, dass ACCs nicht nur von FoxP3+ regulatorischen T Zellen (49,3 %), sondern die Mehrheit der ACCs von CD4+ TH (74 %) und CD8+ zytotoxischen T Zellen (84,3 %) infiltriert wurde, wenngleich die Immunzellanzahl heterogen und eher gering war (7,7 CD3+ T Zellen/HPF). Darüber hinaus war die Präsenz von CD3+-, CD4+- und CD8+ ACC-infiltrierenden Lymphozyten mit einem rezidivfreien (HR:0,31;95%CI0,11-0,82) und verbesserten Gesamtüberleben (HR:0,47;95%CI 0,25-0,87) assoziiert. Insbesondere Patienten mit tumorinfiltrierenden CD4+ TH Zellen ohne Glukokortikoid-Überschuss hatten im Vergleich zu Patienten mit T Zell-depletiertem ACC und Hyperkortisolismus ein signifikant län- geres Gesamtüberleben (121 vs. 27 Monate; p = 0.004). Daher könnte die Wirkung von Glukokortikoiden für die moderate Immunogenität verantwortlich sein, da Hyperkortisolismus umgekehrt mit der Zahl der CD4+ TH Zellen korreliert war. Dementsprechend zeigten CD3+ T Zellen, die mit steroid-produzierenden NCI-H295R ACC-Zellen co-kultiviert wurden, in vitro eine erhöhte anti-tumorale Zytotoxizität in einem durch Metyrapon-induzierten Mikromilieu ohne Glukokortikoide im Vergleich zu einem Glukokortikoid- Überschuss (IFN-γ Sekretion: 747,96 pg/ml vs. 276,02 pg/ml). Andere potenzielle Biomarker zur Vorhersage des Ansprechens auf Immuntherapien sind die immunmodulatorischen Checkpoint-Moleküle, Programmed cell death 1 (PD-1) und sein Ligand PD-L1, da beide Ziele von Antikörpern sind, die therapeutisch bei verschiedenen Krebsentitäten eingesetzt werden. In einer Subkohorte von 129 ACCs waren die Expressionen beider Moleküle heterogen (PD-1 17,4 %, PD-L1 24,4 %). Interessanterweise beeinflusste die PD-1-Expression signifikant das Gesamtüberleben (HR: 0,21; 95 % CI 0,53-0,84) und das progressionsfreie Überleben (HR: 0,30; 95 % CI 0,13-0.72) unabhängig von etablierten Faktoren, wie dem ENSAT Tumorstadium, Resektionsstatus, Ki67 Proliferationsindex und Glukokortikoid-Überschuss, während PD-L1 keinen Einfluss hatte. Zusammenfassend liefert diese Studie mehrere mögliche Erklärungen für die heterogenen Ergebnisse der Immun-Checkpoint-Therapie bei fortgeschrittenem ACC. Darüber hinaus ist die Etablierung von PD-1 als prognostischer Marker anwendbar als Teil einer detaillierten histo-pathologischen Untersuchung. Zudem liefern diese Ergebnisse die Rationale und ebnen den Weg für eine Kombinationstherapie von Immun-Check- point-Inhibitoren sowie Anti-Glukokortikoiden, um die Wahrscheinlichkeit einer Reaktivierung des immu- nologischen Anti-Tumor-Potenzials beim ACC zu erhöhen. Dies muss jedoch durch zusätzliche präklinische in vivo Experimente und schließlich in klinischen Studien mit Patienten nachgewiesen werden.

In dieser Arbeit ist die Synthese von funktionalisiertem Nanodiamant mit bioaktiven Substanzen, welche vor allem als Wirkstofftransporter eingesetzt werden sollen, beschrieben. Dazu werden zum einen bereits bekannte Anbindungsmöglichkeiten an Nanodiamant, wie zum Beispiel die Klick-Reaktion, sowie die Ausbildung von Amidbrücken verwendet. Zum anderen werden neuartige Funktionalisierungsmöglichkeiten wie Protein Ligation und Thioharnstoffbrücken verwendet und somit das Repertoire an bekannten Anbindungsreaktion erweitert. Des weiteren wurde ein multifunktionales Nanodiamantsystem synthetisiert. Dieses ist in der Lage, zwei verschiedene Moleküle auf einem Partikel zu immobilisieren. Die verwendeten Methoden ermöglichen die Anbindung verschiedener Substanzen aus unterschiedlichen Molekülgruppen an Nanodiamanten und sind somit universell einsetzbar. / Because of its unique physical and chemical properties, nanodiamond can be used in a variety of scientific fields, such as in medical and biological research. In this thesis, new ways to covalently bind substances to the nanodiamond surface have been explored, which also can be used in biological systems. ...

Molecular genetic analyses, such as mutation analyses, are becoming increasingly important in the tumor field, especially in the context of therapy stratification. The identification of the underlying tumor entity is crucial, but can sometimes be difficult, for example in the case of metastases or the so-called Cancer of Unknown Primary (CUP) syndrome. In recent years, methylome and transcriptome utilizing machine learning (ML) approaches have been developed to enable fast and reliable tumor and tumor subtype identification. However, so far only methylome analysis have become widely used in routine diagnostics. The present work addresses the utility of publicly available RNA-sequencing data to determine the underlying tumor entity, possible subgroups, and potential therapy options. Identification of these by ML - in particular random forest (RF) models - was the first task. The results with test accuracies of up to 99% provided new, previously unknown insights into the trained models and the corresponding entity prediction. Reducing the input data to the top 100 mRNA transcripts resulted in a minimal loss of prediction quality and could potentially enable application in clinical or real-world settings. By introducing the ratios of these top 100 genes to each other as a new database for RF models, a novel method was developed enabling the use of trained RF models on data from other sources. Further analysis of the transcriptomic differences of metastatic samples by visual clustering showed that there were no differences specific for the site of metastasis. Similarly, no distinct clusters were detectable when investigating primary tumors and metastases of cutaneous skin melanoma (SKCM). Subsequently, more than half of the validation datasets had a prediction accuracy of at least 80%, with many datasets even achieving a prediction accuracy of – or close to – 100%. To investigate the applicability of the used methods for subgroup identification, the TCGA-KIPAN dataset, consisting of the three major kidney cancer subgroups, was used. The results revealed a new, previously unknown subgroup consisting of all histopathological groups with clinically relevant characteristics, such as significantly different survival. Based on significant differences in gene expression, potential therapeutic options of the identified subgroup could be proposed. Concludingly, in exploring the potential applicability of RNA-sequencing data as a basis for therapy prediction, it was shown that this type of data is suitable to predict entities as well as subgroups with high accuracy. Clinical relevance was also demonstrated for a novel subgroup in renal cell carcinoma. The reduction of the number of genes required for entity prediction to 100 genes, enables panel sequencing and thus demonstrates potential applicability in a real-life setting. / Molekulargenetische Analysen, wie z. B. Mutationsanalysen, gewinnen im Tumorbereich zunehmend an Bedeutung, insbesondere im Zusammenhang mit der Therapiestratifizierung. Die Identifizierung der zugrundeliegenden Tumorentität ist von entscheidender Bedeutung, kann sich aber manchmal als schwierig erweisen, beispielsweise im Falle von Metastasen oder dem sogenannten Cancer of Unknown Primary (CUP)-Syndrom. In den letzten Jahren wurden Methylom- und Transkriptom-Ansätze mit Hilfe des maschinellen Lernens (ML) entwickelt, die eine schnelle und zuverlässige Identifizierung von Tumoren und Tumorsubtypen ermöglichen. Bislang werden jedoch nur Methylomanalysen in der Routinediagnostik eingesetzt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Nutzen öffentlich zugänglicher RNA-Sequenzierungsdaten zur Bestimmung der zugrunde liegenden Tumorentität, möglicher Untergruppen und potenzieller Therapieoptionen. Die Identifizierung dieser durch ML - insbesondere Random-Forest (RF)-Modelle - war die erste Aufgabe. Die Ergebnisse mit Testgenauigkeiten von bis zu 99 % lieferten neue, bisher unbekannte Erkenntnisse über die trainierten Modelle und die entsprechende Entitätsvorhersage. Die Reduktion der Eingabedaten auf die 100 wichtigsten mRNA-Transkripte führte zu einem minimalen Verlust an Vorhersagequalität und könnte eine Anwendung in klinischen oder realen Umgebungen ermöglichen. Durch die Einführung des Verhältnisses dieser Top 100 Gene zueinander als neue Datenbasis für RF-Modelle wurde eine neuartige Methode entwickelt, die die Verwendung trainierter RF-Modelle auf Daten aus anderen Quellen ermöglicht. Eine weitere Analyse der transkriptomischen Unterschiede von metastatischen Proben durch visuelles Clustering zeigte, dass es keine für den Ort der Metastasierung spezifischen Unterschiede gab. Auch bei der Untersuchung von Primärtumoren und Metastasen des kutanen Hautmelanoms (SKCM) konnten keine unterschiedlichen Cluster festgestellt werden. Mehr als die Hälfte der Validierungsdatensätze wiesen eine Vorhersagegenauigkeit von mindestens 80% auf, wobei viele Datensätze sogar eine Vorhersagegenauigkeit von 100% oder nahezu 100% erreichten. Um die Anwendbarkeit der verwendeten Methoden zur Identifizierung von Untergruppen zu untersuchen, wurde der TCGA-KIPAN-Datensatz verwendet, welcher die drei wichtigsten Nierenkrebs-Untergruppen umfasst. Die Ergebnisse enthüllten eine neue, bisher unbekannte Untergruppe, die aus allen histopathologischen Gruppen mit klinisch relevanten Merkmalen, wie z. B. einer signifikant unterschiedlichen Überlebenszeit, besteht. Auf der Grundlage signifikanter Unterschiede in der Genexpression konnten potenzielle therapeutische Optionen für die identifizierte Untergruppe vorgeschlagen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei der Untersuchung der potenziellen Anwendbarkeit von RNA-Sequenzierungsdaten als Grundlage für die Therapievorhersage gezeigt werden konnte, dass diese Art von Daten geeignet ist, sowohl Entitäten als auch Untergruppen mit hoher Genauigkeit vorherzusagen. Die klinische Relevanz wurde auch für eine neue Untergruppe beim Nierenzellkarzinom demonstriert. Die Verringerung der für die Entitätsvorhersage erforderlichen Anzahl von Genen auf 100 Gene ermöglicht die Sequenzierung von Panels und zeigt somit die potenzielle Anwendbarkeit in der Praxis.

Background Certification programs seek to improve the quality of complex interdisciplinary models of care such as cancer treatment through structuring the process of care in accordance with evidence-based guidelines. In Germany, the German Cancer Society (Deutsche Krebsgesellschaft, DKG) provides a certification programme for cancer care that covers more than one thousand centers. In a recent retrospective cohort study, it has been shown on a large, nationwide data set based on data from a statutory health insurance and selected clinical cancer registries, that there is a benefit in survival for cancer patients who have received initial treatment in hospitals certified by the DKG. Here, we deduce two absolute measures from the relative benefit in survival with the aim to quantify this benefit if all patients had been treated in a certified center. Methods The WiZen study analysed survival of adult patients insured by the AOK with a cancer diagnosis between 2009 and 2017 in certified hospitals vs. non-certified hospitals. Besides Kaplan-Meier-estimators, Cox regression with shared frailty was used for 11 types of cancer in total, adjusting for patient-specific information such as demographic characteristics and comorbidities as well as hospital characteristics and temporal trend. Based on this regression, we predict adjusted survival curves that directly address the certification effect. From the adjusted survivals, we calculated years of life lost (YLL) and number needed to treat (NNT), along with a difference in deaths 5 years after diagnosis. Results Based on our estimate for the 537,396 patients that were treated in a non-certified hospital included in the WiZen study, corresponding to 68,7% of the study population, we find a potential of 33,243 YLL per year in Germany based on the size of the German population as of 2017. The potential to avoid death cases 5 years from diagnosis totals 4,729 per year in Germany. Conclusion While Cox regression is an important tool to evaluate the benefit that arises from variables with a potential impact on survival such as certification, its direct results are not well suited to quantify this benefit for decision makers in health care. The estimated years of life lost and the number of deaths that could have been avoided 5 years from diagnosis avoid mis-interpretation of the hazard ratios commonly used in survival analysis and should help to inform key stakeholders in health care without specialist background knowledge in statistics. Our measures, directly adressing the effect of certification, can furthermore be used as a starting point for health-economic calculations. Steering the care of cancer patients primarily to certified hospitals would have a high potential to improve outcomes. / Hintergrund: Zertifizierungsprogramme zielen darauf ab, die Qualität komplexer interdisziplinärer Versorgungsmodelle wie der Krebsbehandlung zu verbessern, indem der Versorgungsprozess nach evidenzbasierten Leitlinien strukturiert wird. In Deutschland bietet die Deutsche Krebsgesellschaft (DKG) ein Zertifizierungsprogramm für die Krebsversorgung an, das mehr als tausend Zentren umfasst. In einer kürzlich durchgeführten retrospektiven Kohortenstudie wurde anhand eines großen, bundesweiten Datensatzes, der auf Daten einer gesetzlichen Krankenversicherung und ausgewählter klinischer Krebsregister basiert, gezeigt, dass es einen Überlebensvorteil für Krebspatienten gibt, die in von der DKG zertifizierten Krankenhäusern erstbehandelt wurden. Hier leiten wir aus dem relativen Überlebensvorteil zwei absolute Maße ab. Dies geschieht mit dem Ziel, das Potential dieses Vorteils zu quantifizieren für die Annahme, dass alle Patienten in einem zertifizierten Zentrum behandelt worden wären. Methoden: In der WiZen-Studie wurde das Überleben von erwachsenen AOK-Versicherten mit einer Krebsdiagnose zwischen 2009 und 2017 in zertifizierten Krankenhäusern im Vergleich zu nicht zertifizierten Krankenhäusern analysiert. Neben Kaplan-Meier-Schätzern wurde für insgesamt 11 Krebsarten eine Cox-Regression mit sog. „shared frailty“ verwendet, die für patientenspezifische Informationen wie demografische Merkmale und Komorbiditäten sowie Krankenhausmerkmale und den zeitlichen Verlauf adjustiert wurde. Auf der Grundlage dieser Regression berechnen wir adjustierte Überlebenskurven, die den Zertifizierungseffekt direkt berücksichtigen. Anhand dieser adjustierten Überlebenskurven werden die verlorenen Lebensjahre (Life Years lost, YLL) berechnet. Ebenfalls berechnet wird die Number needed to treat (NNT) für Überleben 5 Jahre nach Diagnosestellung und die daraus resultierende Anzahl vermeidbarer Todesfälle. Ergebnisse: Basierend auf unserer Schätzung für die 537.396 Patienten, die in der WiZen-Studie in einem nicht zertifizierten Krankenhaus behandelt wurden, was 68,7 % der Studienpopulation entspricht, finden wir ein Potenzial von 33.243 YLL pro Jahr in Deutschland, berechnet auf Grundlage der deutschen Bevölkerung im Jahr 2017. Das Potenzial zur Vermeidung von Todesfällen 5 Jahre nach der Diagnose beträgt in Deutschland 4.729 Fälle pro Jahr. Schlussfolgerung: Die Cox-Regression ist zwar ein wichtiges Instrument zur Bewertung des Nutzens, der sich aus Adjustierung mit Variablen mit potenziellem Einfluss auf das Überleben ergibt, wie z. B. der Zertifizierung, aber ihre direkten Ergebnisse sind nicht gut geeignet, um diesen Nutzen für Entscheidungsträger im Gesundheitswesen zu quantifizieren. Die geschätzten verlorenen Lebensjahre und die Anzahl der Todesfälle 5 Jahre nach Diagnose, die hätten vermieden werden können, beugen einer Fehlinterpretation der in der Überlebensanalyse üblicherweise verwendeten Hazard Ratios vor und können dazu beitragen, eine Ergebnisdarstellung für wichtige Akteure im Gesundheitswesen ohne spezielles Hintergrundwissen in Statistik zu erreichen. Die hier vorgestellten Maße, die sich direkt auf die Auswirkungen der Zertifizierung beziehen, können darüber hinaus als Ausgangspunkt für gesundheitsökonomische Berechnungen verwendet werden. Die Steuerung von Krebspatient:innen in zertifizierte Krankenhäuser hätte ein hohes Potenzial, das Überleben bei Krebs zu verbessern.

Big data and the revolution in sequencing technologies have transformed the way biomedical research is conducted. To unravel the underlying biological mechanisms of tumor development, treatment efficiency and to find new treatments for diseases such as cancer, it is necessary to use bioinformatic tools addressing the challenges posed by big data. This dissertation demonstrated how vast amounts of publicly available high-throughput sequencing data can be used to address open questions that relate to data-driven research. These include how genetic information can be used to assess therapeutic efficacy and drug repurposing, and how the analysis of tissue-specific transcriptional patterns can improve our understanding of the transcriptional repertoire of human genes. First study: This study investigates the prognostic and predictive value of TERT promoter mutations (TERTpm) and TERT expression in melanoma patients, particularly those undergoing immune checkpoint inhibition (ICI) therapy (anti-CTLA4 and anti-PD1/L1). Leveraging data from highly annotated melanoma cohorts, the study aims to evaluate how TERTpm and TERT expression influence tumor survival and immune response. Additionally, it seeks to address gaps in understanding the non-canonical roles of TERT in malignant melanoma by analyzing clinicopathological and demographic factors, as well as co-regulated gene expression, to provide deeper insights into its broader biological impact. Main findings first study: As comprehensive multivariate survival analyses were not available, the prognostic value of TERTpm and expression was tested in several melanoma ICI and non-ICI cohorts, including important clinical variables such as tumor mutational burden (TMB). However, the prognostic value for melanoma was not supported, as neither TERTpm nor TERT expression were associated with longer survival. As the proposed predictive value of TERTpm for anti-CTLA4 therapy was not statistically supported, we emphasize the inclusion of discussed biomarkers such as TMB in multivariate survival analysis. Incorporating immune signatures, TERT expression as a potential proxy for immune response was assessed. Although TERT expression was associated with elevated CD4+ T cells, its association with exhaustion markers suggests a dysfunctional T-cell response in TERT-high tumors. Defining phenotypic exhaustion in the CD4+ T-cells could be crucial to understanding missing immune responses in TERT-high tumors. TERT expression was increased in metastases arising from thinner primaries compared to metastases arising from thicker primaries. This raises the question of whether upregulation of TERT expression promotes early efficient metastasis, a function that may exist in addition to canonical telomerase activity. This was further supported by the enrichment of genes with upregulated TERT expression that are involved in extracellular matrix remodeling and thus would promote invasion of primary melanoma cells. Extending the non-canonical functions of TERT expression, its co-expression with DNA repair-genes, even across tumor types, hints toward a function of TERT in establishing genomic stability under stress in line with many previous studies. This could be useful in the context of chemotherapy and radiotherapy resistance of melanoma and also in other cancers such as glioblastoma, where in addition to TERTpm, TERT expression could also be measured to test for sensitivity to DNA damaging agents. This highlights the relevance of assessing TERT expression, besides the promoter mutation status. In summary, this study highlights the importance of across-cohort replication to re-evaluate potential biomarkers. While the extent of which TERT promoter mutations govern survival under anti-CTLA4 therapy was inconclusive, this study emphasizes the importance of a comprehensive multivariate analysis that accounts for confounding factors to identify robust biomarkers. Moreover, this data-driven analysis highlights the non-canonical functions of TERT expression, which are currently of great interest as it appears to contribute to early metastasis and the establishment of genomic stability. As our analysis revealed a potentially dysfunctional immune response in patients with high levels of TERT, it would be highly interesting to see whether the combination of currently tested TERT-based vaccines and immune checkpoint inhibition could achieve better results than ICI alone. Second study: This study aimed to identify potential drug candidates for tumors with DLST overexpression, which is linked to poor outcomes in triple-negative breast cancer and neuroblastoma and associated with the oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathway. By integrating drug sensitivity data from over 250 drugs (GDSC project) and genomic data from over 800 cell lines (CCLE database), the research tested whether DLST amplification or elevated DLST mRNA levels make tumors more or less sensitive to OXPHOS inhibitors or other approved drugs, providing a foundation for targeted therapeutic strategies. Main results second study: Vulnerabilities of DLST-high tumors were identified for seven different drugs. Those drug candidates proposed could be subject to further rigorous tests using knock-out and knock-in experiments of cell lines, xenografts in animal models to evaluate their therapeutic potential for DLST-high tumors. DLST-activated cell lines were more sensitive to the BCL-2 inhibitor (obatoclax mesylate), a drug which has previously been shown to reduce OXPHOS in human leukemia stem cells. This was consistent with the hypothesis that some tumor cells may activate OXPHOS via DLST upregulation to ensure increased energy production. Several protein kinase inhibitors were identified, which hints toward a link between DLST and the extracellular signal-regulated kinases/mitogen-activated protein kinase (ERK/MAPK) signaling pathways. This was further supported by increased DLST expression in cell lines with driver mutations in KRAS and therefore serves as a starting point for understanding the role of ERK/MAPK inhibitors in DLST-activated cancer. I showed that using genomic information in conjunction with drug sensitivity data can provide drug candidates for drug repurposing. In a wider scope, these analyses could be transferred to analyses of other genes in association with drugs and hence, this study could serve as a prime example of how to approach questions of drug resistance in the presence of genetic changes. Third study: a browser-based application was developed to investigate tissue-specific transcript variability using deep-sequenced data from 927 human samples across 48 tissues. As the full picture of the human transcriptome is still incomplete, new non-canonical transcript variants and tissue-specificity may help to explain cellular mechanisms and may change the interpretation of disease-relevant mutations. We applied the webtool to the class of adhesion G protein-coupled receptors (aGPCRs), a class of receptors with a complex exon-intron structure. Main results third study: A vast transcript variety was identified by using deliberately relaxed parameters, with an average of 24 different transcript variants per all 33 aGPCR genes, where several of the priorly expressed variants had not yet been annotated. Therefore, future experimental planning should consider that the annotated aGPCR transcript variants may not be the dominant transcript variants. Adhesion GPCR transcript variants showed variable transcription starts and their complex exon-intron structures encoded for a flexible protein domain architecture of the N and C termini and the seven-helix transmembrane domain (7TMD). Of particular interest, we found that ADGRG7 has a transcript variant with an extra helix in the transmembrane domain. This was further supported by functional experiments using immunofluorescence studies and indirect cellular enzyme-linked immunosorbent assays, making it the first aGPCR with an eight-helix TMD. Tissue-specific expression patterns of transcript variants were observed, which may explain the phenotypic variation between tissues. This could also affect the assessment of disease-causing mutations as shown in the case of ADGRC1/CELSR1 where some transcript variants might not be affected by a specific mutation. Therefore querying other sets of genes in the application, where disease-causing mutations are described, may explain tissue-specific phenotypes. The development of the user-friendly browser-based application Splice-O-Mat, has demonstrated the feasibility of the analysis of tissue-specific transcriptomes. All accumulated data are presented in a browser-based application at: https://tools.hornlab.org/Splice-O-Mat/. Hence, this application serves as a starting point for in-depth analysis of genes, their splicing patterns and (alternative) promoter usage across human tissues. This dissertation highlights the importance of sequence analysis and bioinformatics in addressing clinically relevant questions in cancer, such as therapy efficacy and drug resistance. By leveraging publicly available data and large-scale analyses, it reduces biases from small datasets and uncovers key mechanistic insights. The development of a browser-based tool for tissue-specific splicing further advances understanding of protein diversity and genomic changes, emphasizing the critical role of big data in medical research.:Chapter I - Introduction 1 Big data in biomedicine 1 Challenges and potentials in data-driven biomedical research 4 Data-driven aspects of basic and translational cancer research 6 Clinical relevance of RNA and transcriptomics 8 Chapter II - Objectives 11 Chapter III - Publications 14 Publication 1: TERT expression is associated with metastasis from thin primaries, exhausted CD4+ T cells in melanoma and with DNA repair across cancer entities 14 Publication 2: Candidate drugs associated with sensitivity of cancer cell lines with DLST amplification or high mRNA levels 33 Publication 3: The repertoire and structure of adhesion GPCR transcript variants assembled from publicly available deep-sequenced human samples 42 Chapter IV - Summary 69 References 75 Supplementary Material 82 Supplementary material for “TERT expression is associated with metastasis from thin primaries, exhausted CD4+ T cells in melanoma and with DNA repair across cancer entities” 82 Supplementary material for “Candidate drugs associated with sensitivity of cancer cell lines with DLST amplification or high mRNA levels” 96 Supplementary material for “The repertoire and structure of adhesion GPCR transcript variants assembled from publicly available deep-sequenced human samples” 98 Spezifizierung des wissenschaftlichen Beitrags 108 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 111 Curriculum vitae 112 Publikationen und Präsentationen 114 Artikel 114 Präsentationen 115 Poster 115 Danksagungen 116

Lung cancer is the main cause of cancer-related deaths worldwide. Despite the availability of several targeted therapies and immunotherapies in the clinics, the prognosis for lung cancer remains poor. A major problem for the low benefit of these therapies is intrinsic and acquired resistance, asking for pre-clinical models for closer investigation of predictive biomarkers for refined personalized medicine and testing of possible combination therapies as well as novel therapeutic approaches to break resistances. One third of all lung adenocarcinoma harbor mutations in the KRAS gene, of which 39 % are transitions from glycine to cysteine in codon 12 (KRASG12C). Being considered “undruggable” in previous decades, KRASG12C-inhibitors now paved the way into the standard-of-care for lung adenocarcinoma treatment in the clinics. Still, the overall response rates as well as overall survival of patients treated with KRASG12C-inhibitors are sobering. Therefore, 3D KRASG12C-biomarker in vitro models were developed based on a decellularized porcine jejunum (SISmuc) using commercial and PDX-derived cell lines and characterized in regards of epithelial-mesenchymal-transition (EMT), stemness, proliferation, invasion and c-MYC expression as well as the sensitivity towards KRASG12C-inhibiton. The phenotype of lung tumors harboring KRAS mutations together with a c-MYC overexpression described in the literature regarding invasion and proliferation for in vivo models was well represented in the SISmuc models. A higher resistance towards targeted therapies was validated in the 3D models compared to 2D cultures, while reduced viability after treatment with combination therapies were exclusively observed in the 3D models. In the test system neither EMT, stemness nor the c-MYC expression were directly predictive for drug sensitivity. Testing of a panel of combination therapies, a sensitizing effect of the aurora kinase A (AURKA) inhibitor alisertib for the KRASG12C-inhibitor ARS-1620 directly correlating with the level of c-MYC expression in the corresponding 3D models was observed. Thereby, the capability of SISmuc tumor models as an in vitro test system for patient stratification was demonstrated, holding the possibility to reduce animal experiments. Besides targeted therapies the treatment of NSCLC with oncolytic viruses (OVs) is a promising approach. However, a lack of in vitro models to test novel OVs limits the transfer from bench to bedside. In this study, 3D NSCLC models based on the SISmuc were evaluated for their capability to perform efficacy and risk assessment of oncolytic viruses (OVs) in a pre-clinical setting. Hereby, the infection of cocultures of tumor cells and fibroblasts on the SISmuc with provided viruses demonstrated that in contrast to a wildtype herpes simplex virus 1 (HSV-1) based OV, the attenuated version of the OV exhibited specificity for NSCLC cells with a more advanced and highly proliferative phenotype, while fibroblasts were no longer permissive for infection. This approach introduced SISmuc tumor models as novel test system for in vitro validation of OVs. Finally, a workflow for validating the efficacy of anti-cancer therapies in 3D tumor spheroids was established for the transfer to an automated platform based on a two-arm-robot system. In a proof-of-concept process, H358 spheroids were characterized and treated with the KRASG12C-inhibitor ARS-1620. A time- and dose-dependent reduction of the spheroid area after treatment was defined together with a live/dead-staining as easy-to-perform and cost-effective assays for automated drug testing that can be readily performed in situ in an automated system. / Lungentumoren sind die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit. Trotz der Verfügbarkeit diverser zielgerichteter Therapien und Immuntherapien im klinischen Alltag ist die Prognose für Lungenkrebs nach wie vor schlecht. Eine Hauptursache hierfür sind intrinsische und erworbene Resistenzen. Hieraus ergibt sich ein Bedarf für präklinische Modelle zur genaueren Untersuchung prädiktiver Biomarker für eine verbesserte personalisierte Medizin und zur Testung von Kombinationstherapien sowie neuartiger therapeutischer Ansätze, um bestehende Resistenzen zu brechen. Ein Drittel aller Lungen-Adenokarzinome weisen Mutationen im KRAS-Gen auf, von denen 39 % Transitionen von Glycin zu Cystein in Codon 12 (KRASG12C) darstellen. Obwohl KRAS in den vergangenen Jahrzehnten als "unbehandelbar" galt, haben sich KRASG12C-Inhibitoren nun den Weg in die klinische Standardbehandlung von Lungen-Adenokarzinomen gebahnt. Jedoch sind die Ansprech- und Überlebensraten von Patienten, die mit KRASG12C-Inhibitoren behandelt werden, ernüchternd. Daher wurden in dieser Arbeit 3D KRASG12C-Biomarker in vitro Modelle basierend auf dezellularisierten Schweinedünndarm (SISmuc) unter Verwendung kommerzieller und PDX-abgeleiteter Zelllinien aufgebaut und hinsichtlich der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), Stammzell-Eigenschaften, Proliferation, Invasion und c MYC-Expression sowie der Sensitivität gegenüber KRASG12C-Inhibitoren charakterisiert. Der in der Literatur für in vivo Modelle beschriebene Phänotyp von Lungentumoren mit KRAS-Mutationen und c-MYC-Überexpression in Bezug auf Invasion und Proliferation war in den SISmuc-Modellen reproduzierbar. Während in den 3D Modellen erhöhte Resistenz gegenüber zielgerichteten Therapien im Vergleich zu 2D beobachtet wurde, konnte eine verringerte Viabilität nach der Behandlung mit Kombinationstherapien ausschließlich in den 3D Modellen beobachtet werden. Im Test-System zeigten sich weder EMT noch die c-MYC-Expression als direkt prädiktiv für die Sensitivität gegenüber KRASG12C-Inhibitoren. Bei der Prüfung von verschiedenen Kombinationstherapien, wurde eine sensibilisierende Wirkung des Aurora-Kinase A (AURKA)-Inhibitors Alisertib für den KRASG12C-Inhibitor ARS-1620 beobachtet, welche direkt mit dem Grad der c-MYC-Expression in den entsprechenden 3D-Modellen korrelierte. Hierdurch konnte die Eignung von SISmuc Tumor Modellen als in vitro Test-System zur Patienten-Stratifizierung gezeigt werden, welches die Möglichkeit einer Reduktion von Tierversuchen birgt. Neben zielgerichteten Therapien ist die Behandlung von NSCLC mit onkolytischen Viren (OVs) ein vielversprechender Ansatz. Es mangelt jedoch an in vitro Modellen, um neue OVs in einer präklinischen Umgebung zu testen. Hierfür wurden 3D-NSCLC-Modelle auf der Grundlage der SISmuc bezüglich ihrer Eignung zur Durchführung von Wirksamkeits- und Risikobewertungen von OVs untersucht. Dabei zeigte die Infektion von Kokulturen aus Tumorzellen und Fibroblasten auf der SISmuc mit bereitgestellten Viren, dass die abgeschwächte Version des OV im Gegensatz zu einem auf dem Wildtyp des Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) basierenden OV eine Spezifität für NSCLC-Zellen mit einem fortgeschritteneren und stark proliferativen Phänotyp aufwies, während Fibroblasten sich für eine Infektion nicht länger permissiv zeigten. Dieser Ansatz stellt unter Beweis, dass SISmuc-Tumormodelle sich als neues Test-System zur in vitro Prüfung von OVs eignen. Schließlich wurde ein Arbeitsablauf zur Validierung der Wirksamkeit von Krebstherapien in 3D-Tumor-Sphäroiden für die Übertragung auf eine automatisierte Plattform auf der Grundlage eines zweiarmigen Robotersystems entwickelt. In einem Proof-of-Concept-Prozess wurden H358-Sphäroide charakterisiert und mit dem KRASG12C-Inhibitor ARS-1620 behandelt. Eine zeit- und dosisabhängige Reduktion der Sphäroid-Fläche nach der Behandlung wurde zusammen mit einer Lebend/Tot-Färbung als einfach durchzuführender und kostengünstiger Assay für automatisierte Medikamententests definiert, welche in situ in einer automatisierten Umgebung durchgeführt werden können.

This thesis integrates biomedical research and data science, focusing on an in vitro model for studying myeloma cell dissemination and a Python-based tool, plotastic, for semi-automated analysis of multidimensional datasets. Two major challenges are approached: (1) understanding the steps of myeloma dissemination and (2) improving data analysis efficiency to address the complexity- and reproducibility bottlenecks currently present in biomedical research. In the experimental component, primary human mesenchymal stromal cells (hMSCs) are co-cultured with INA-6 myeloma cells to study their cell proliferation, attachment, and detachment. Time-lapse microscopy reveal that predominantly myeloma daughter cells detach from hMSCs after cell division. Novel separation techniques were developed to isolate myeloma subpopulations for further characterization by RNAseq, cell viability, and apoptosis assays. Adhesion and retention genes are upregulated by MSC adhering INA-6 cells, which correlates with patient survival. Overall, this work provides insights into myeloma dissemination mechanisms and identifies genes that potentially counteract dissemination through adhesion, which could be relevant for the design of new therapeutics. To manage the complex data resulting from the in vitro model, a Python-based software named plotastic was developed that streamlines analysis and visualization of multidimensional datasets. plotastic is built on the idea that statistical analyses are performed based on how the data is visualized. This approach simplifies data analysis and semi-automates it in a standardized statistical protocol. The thesis becomes a case study as it reflects on the application of plotastic to the in vitro model, demonstrating how the software facilitates rapid adjustments and refinements in data analysis and presentation. Such efficiency could be crucial for handling semi- big datasets transparently, which —despite being managable— are complex enough to complicate analysis and reproducibility. Together, this thesis illustrates the synergy between experimental methodolo- gies and new data analysis tools. The in vitro model provides a robust platform for studying myeloma dissemination, while plotastic addresses the need for efficient data analysis. Combined, they provide an approach for handling complex cell biological experiments and could advance both cancer biology and other research practices by supporting the exploratory investigation of challenging phenomena while communicating results transparently. / Diese Doktorarbeit kombiniert biomedizinische Forschung und Datenwissenschaften und fokussiert sich auf ein in vitro-Modell zur Untersuchung der Dissemination von Myelomzellen sowie auf die Python-Software plotastic zur semi-automatisierten Analyse multidimensionaler Datensätze. Zwei Hauptfragen werden behandelt: (1) das Verständnis der Schritte der Myelomdissemination und (2) die Steigerung der Effizienz der Datenanalyse, um die in der biomedizinischen Forschung bestehenden Herausforderungen hinsichtlich Komplexität und Reproduzierbarkeit zu bewältigen. Im experimentellen Teil werden primäre humane mesenchymale Stromazellen (hMSCs) mit INA-6-Myelomzellen kokultiviert, um ihre Proliferation, Anhaftung und Ablösung zu untersuchen. Zeitraffer-Mikroskopie zeigt, dass sich überwiegend Myelom-Tochterzellen nach Zellteilung von hMSCs ablösen. Neue Trennmethoden wurden entwickelt, um Myelom-Subpopulationen für weitere Charakterisierungen durch RNAseq, Zellviabilitäts- und Apoptose-Assays zu isolieren. Adhäsions- und Retentionsgene werden von MSC-adhärierenden INA-6 hochreguliert, was mit Patientenüberleben korreliert. Insgesamt bietet diese Arbeit Einblicke in die Mechanismen der Myelomdissemination und identifiziert Gene, die potenziell die Dissemination durch Adhäsion behindern könnten, was für die Entwicklung neuer Therapien von Bedeutung sein könnte. Zur Handhabung der komplexen Daten, die bei dem in vitro-Modell entstanden sind, wurde eine Python-basierte Software namens plotastic entwickelt, welche die Analyse und Visualisierung der multidimensionaler Datensätze optimiert. plotastic basiert auf dem Prinzip, dass statistische Analysen abhängig davon durchgeführt werden, wie die Daten visualisiert werden. Dieser Ansatz vereinfacht die Datenanalyse nicht nur, sondern semi-automatisiert sie auch als standardisiertes statistisches Protokoll. Diese Arbeit fungiert als Fallstudie, da sie die Anwendung von plotastic auf das in vitro-Modell beleuchtet und zeigt, wie die Software schnelle Anpassungen und Verfeinerungen in der Datenanalyse und -präsentation ermöglicht. Eine solche Effizienz könnte entscheidend für den transparenten Umgang mit semi-großen Datenmengen sein, die trotz ihrer Handhabbarkeit komplex genug sind, um die Analyse und Reproduzierbarkeit zu erschweren. Zusammenfassend zeigt diese Dissertation die Synergie zwischen experimentellen Methoden und neuen Werkzeugen der Datenanalyse. Das in vitro-Modell bietet eine robuste Plattform für die Untersuchung der Myelomdissemination, während plotastic den Bedarf an effizienter Datenanalyse unterstützt. Zusammen stellen sie einen Ansatz für die Bewältigung komplexer zellbiologischer Experimente dar, und könnten sowohl die Krebsbiologie als auch andere Forschungspraktiken förden, indem sie die explorative Untersuchung anspruchsvoller Phänomene unterstützen und dabei Ergebnisse transparent kommunizieren.

In many European countries, migrants utilize cancer screening less often than non-migrants. In Germany, in contrast, higher rates of utilization among migrants as compared with non-migrants have been reported. The role of demographic and socioeconomic factors potentially confounding the association between migration status and participation in screening, however, could not be studied. The present study aims to investigate the utilization of cancer screening among migrant and nonmigrant women residing in Germany, adjusting for potential confounders. We used self-reported information from women surveyed on whether they have ever participated in screening for cancer (n = 11,709). The data was collected as part of a cross-sectional representative telephone survey conducted by the Robert Koch-Institute in 2010. We distinguished between three groups of women: (1) respondents of non-German nationality, those who had immigrated to Germany after their birth or those who have two foreign-born parents (“migrants with two-sided migration background”), (2) respondents who only have one foreign-born parent (“migrant with one-sided migration background”), and (3) all others (“non-migrants”). To account for confounders, logistic regression analysis was performed. Only individuals proficient in German were included in the survey, allowing to control for a bias arising from poor language proficiency. 84.9% of nonmigrant women, 82.1% of women with a one-sided, and 70.5% of women with a two-sided migration background had utilized screening for cancer at least once in their lifetime before the survey. The adjusted odds ratios (OR) as compared with nonmigrant women were 0.99 (95% confidence interval [95% CI]: 0.77–1.27) and 0.55 (95% CI: 0.47–0.64), respectively. The study shows that migrant women with a two-sided migration background residing in Germany utilize screening for cancer less often than nonmigrant women—independently of demographic and socioeconomic factors. This is in line with findings from other countries. Likely, barriers that migrant women encounter limit them from taking informed choices. These barriers need to be identified and appropriate measures aiming to enhance informed decision making must be implemented.