Universidade do Estado do Rio de Janeiro / Estudos publicados nas duas últimas décadas sugerem um aumento do risco de doença cardiovascular (DCV) em pacientes com periodontite, mas os mecanismos fisiopatológicos dessa associação ainda não estão completamente esclarecidos. Uma vez que foi demonstrado aumento da ativação plaquetária e do estresse oxidativo na periodontite, o objetivo do presente estudo foi investigar a via L-arginina-óxido nítrico (NO)- guanosina monofosfato cíclica (GMPc) e parâmetros de estresse oxidativo em plaquetas de pacientes com periodontite, bem como avaliar o efeito do tratamento periodontal não-cirúrgico nessas variáveis. Um total de 10 pacientes sem periodontite (periodontalmente saudáveis ou com gengivite) e 10 pacientes com periodontite participaram do estudo. A avaliação clínica, laboratorial e experimental foi realizada no início do estudo e 90 dias após realização da terapia periodontal básica (grupo periodontite). A avaliação clínica periodontal incluiu registros de: profundidade de bolsa à sondagem (PBS), nível de inserção (NIC), percentual de placa e percentual de sangramento à sondagem. Os seguintes experimentos foram realizados: influxo de L-arginina; atividade e expressão das enzimas óxido nítrico sintase e da arginase; expressão das enzimas guanilato ciclase solúvel e fosfodiesterase 5; determinação dos níveis intraplaquetários de GMPc; agregação plaquetária; avaliação do estresse oxidativo (atividade oxidante total, atividade das enzimas antioxidantes catalase e da superóxido dismutase - SOD); medição dos níveis de proteína C reativa (CRP) e de fibrinogênio. Os resultados obtidos no início do estudo demonstraram ativação do influxo de L-arginina em plaquetas via sistema y+L nos pacientes com periodontite, bem como concentrações intraplaquetárias de GMPc diminuídas e aumento sistêmico da CRP. Após o tratamento periodontal, observou-se redução do percentual de sítios com PBS ≥ 6 mm, NIC 4-5 mm e NIC ≥ 6 mm, aumento nos níveis de GMPc, para níveis comparáveis aos dos pacientes sem periodontite, acompanhado por uma maior atividade das enzimas antioxidantes SOD e catalase. Os demais parâmetros avaliados não apresentaram alterações significativas tanto pré- quanto pós-tratamento. Esses resultados considerados em conjunto sugerem uma menor biodisponibilidade de NO em plaquetas na periodontite e que o tratamento periodontal não-cirúrgico foi capaz de reverter este quadro por um aumento das defesas antioxidantes. Portanto, alterações na via L-arginina-NO-GMPc e no estresse oxidativo podem levar à disfunção plaquetária, que poderia contribuir para um maior risco de DCV nos pacientes com periodontite. / Studies published over the last two decades have suggested an increase of cardiovascular disease (CVD) risk on periodontitis patients, but the physiopathological mechanisms involved in this association are not yet clear. Since it has been demonstrated an enhancement on both platelet activation and oxidative stress on periodontitis patients, the aim of this study was to investigate the L-arginine-nitric oxide (NO)-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) pathway on platelets from periodontitis patients, and the effect of non-surgical periodontal treatment in these variables. A total of 10 patients without periodontitis (periodontal healthy controls or gingivitis patients) and 10 periodontitis patients were included in this study. The clinical, laboratorial, and experimental evaluations were performed at the beginning of the study and 90 days after the basic periodontal therapy (periodontitis group). The clinical periodontal evaluation included the measurements of probing pocket depth (PPD), clinical attachment level (CAL), plaque percentage, and percentage of bleeding on probing. The following experiments were performed: L-arginine influx; nitric oxide synthase and arginase enzymes activity and expression; expression of guanylate cyclase and phosphodiesterase-5 enzymes; measurement of intraplatelet cGMP levels; platelet aggregation; oxidative stress evaluation (total oxidant activity and activity of both antioxidant enzymes catalase and superoxide dismutase SOD); measurement of C reactive protein (CRP) and fibrinogen. The initial results demonstrated an activation of L-arginine influx in platelets from periodontitis patients via y+L system, reduced intraplatelet cGMP levels and increased CRP. After periodontal treatment, it was observed reduction on percentage of sites with PPD ≥ 6 mm, CAL 4-5 mm and CAL ≥ 6 mm, enhancement on cGMP levels, to levels comparables to patients without periodontitis, accompanied by a higher activity of both antioxidant enzymes SOD and catalase. The other evaluated parameters did not showed significant alterations before and after periodontal treatment. The present results suggested a decreased NO biodisponibility in platelets from periodontitis patients and that the non-surgical periodontal treatment was effective to revert this condition, due to an enhancement on antioxidant defence. Therefore, alterations on L-arginine-NO-cGMP pathway and oxidative stress may lead to platelet dysfunction, which could contribute to a higher risk of CVD in periodontitis patients.

A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome clínica de elevada incidência e com um prognóstico ruim a longo prazo. Ela é a via final comum da maioria das doenças que acometem o coração, sendo um dos mais importantes desafios clínicos na área da saúde. O óxido nítrico (NO) representa, por intermédio de sua influência sobre o endotélio e as plaquetas, um importante papel na regulação da homeostase vascular. Este gás de meia-vida curta é sintetizado a partir do aminoácido L-arginina, pela enzima NO sintase (NOS), levando à produção de guanosina monofosfato cíclica (GMPc). Estudos mostram que anormalidades na biodisponibilidade de NO em plaquetas podem contribuir para eventos trombóticos, não tendo sido ainda avaliada na IC. Na primeira parte do estudo, o objetivo foi investigar o efeito da IC na atividade e na expressão da NOS em plaquetas, no conteúdo intraplaquetário de GMPc, na agregação plaquetária, além dos parâmetros antropométricos e da composição corporal, das variáveis bioquímicas, dos aminoácidos plasmáticos, do estresse oxidativo (plasma e plaquetas) e da concentração sistêmica de marcadores inflamatórios em 15 pacientes com IC e 15 controles saudáveis. Na segunda parte do estudo, objetivou-se avaliar os efeitos do treinamento físico (TF) regular nessas mesmas variáveis (exceto a expressão da NOS) e nas variáveis hemodinâmicas e respiratórias. Para tal, foram avaliados 15 pacientes com IC que se mantiveram sedentários e 15 pacientes com IC que realizaram 30 minutos de atividade física aeróbia e treinamento contraresistência muscular localizada com pesos livres e máquinas, três vezes por semana, durante 24 semanas. Os resultados da primeira etapa do estudo demonstraram hiperagregabilidade plaquetária induzida tanto por colágeno como por ADP, com aumento do estresse oxidativo, da atividade basal da NOS e da concentração de GMPc, estando os níveis plasmáticos de L-arginina em pacientes com IC diminuído. A expressão da iNOS, estava aumentada em plaquetas de pacientes com IC em relação aos controles saudáveis.Também foi observado aumento da resposta inflamatória, com maiores níveis sistêmicos de proteína C reativa, fibrinogênio, interleucina-6 e fator de necrose tumoral α. Após o período de TF, houve aumento do VO2 máximo e a agregação plaquetária induzida tanto por colágeno quanto por ADP estava diminuída. Ocorreu um aumento dos níveis plasmáticos de L-arginina e, uma redução da atividade da NOS após o TF. Em relação ao estresse oxidativo, tanto a produção sistêmica, quanto a intraplaquetária de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs) e a carbonilação diminuíram na presença da atividade aumentada das enzimas superóxido dismutase (SOD) e da catalase após o TF. Houve uma diminuição da resposta inflamatória, uma diminuição do colesterol total, do LDL e dos triglicerídeos e um aumento do HDL, após oTF. Nossos resultados sugerem que o TF tem efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e antiagregantes, que parece ser independente da produção de NO, sendo uma importante ferramenta não farmacológica no tratamento da IC / Heart failure (HF) is a clinical syndrome that have high incidence and negative long-term outcome. Usually, is the final route of most of the diseases that damage the heart, and is one of the most important clinical challenges in the health area. The nitric oxide (NO) represents an important role in the regulation of vascular homeostasis. This short half-life gas is synthesized from the amino acid L-arginine by the NO synthase enzymes (NOS), leading to increased production of GMPc. A lot of studies show that abnormalities in NO bioavailability in platelets can contribute to thrombotic events, which have not yet been evaluated in HF. In the first part of the study, the aim was to investigate the effect of HF on activity and expression of NOS and content of GMPc in platelets, platelet aggregation, and anthropometric and body composition, biochemical variables, plasma amino acid, oxidative stress and the systemic concentration of inflammatory markers in 15 patients with HF and 15 healthy controls. In the second part of the study, aimed to evaluate the effects of physical training (PT) to regulate these same variables, except the expression of NOS isoforms, and including hemodynamic and respiratory. To this end, we evaluated 15 patients with HF who remained sedentary and 15 HF patients that had done 30 minutes of predominantly aerobic physical activity and localized counter-resistance muscular training with free weights and machines three times per week for 24 weeks.The results of the first stage of the study revealed the presence of platelet hyperaggregability induced by collagen as well as ADP associated with oxidative stress, and a increase in intraplatelet NOS activity, GMPc concentration and L-arginine plasma levels in patients with HF compared to healthy controls. The expression of the inducible isoform of NOS, but not endothelial isoform, was enhanced in platelets from HF patients. HF seems to induce an inflammatory response with an increase in the systemic levels of C-reactive protein, fibrinogen, inteleukin-6 and the tumour necrosis factor α. After the PT period, the HF patients had an increase in exercise time with a consequent improvement in maximum oxygen consumption (VO2). Moreover, PT leads to a reduction in total cholesterol, LDL-cholesterol and triglycerides and an increase in HDL-cholesterol. Plasma levels of L-arginine also increase after exercise. Platelet aggregation induced by both ADP and collagen were diminished by PT. Paradoxically, there was reduction of intraplatelet NO production compared to the baseline and control group after 24 weeks of exercise. In relation to oxidative stress, systemic and intraplatelet TBARs production and carbonylation were diminished in presence of an improvement of SOD and catalase activities after 24 hours of training in HF patients. Moreover, systemic levels of CRP, fibrinogen and TNF-α were reduced in CHF after training. Our results suggest that chronic exercise has anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-aggregant effects, regardless of NO production, showing that it may be an important non-pharmacological tool in the treatment of HF

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A obesidade é um distúrbio metabólico de etiologia multifatorial e elevada prevalência no Brasil, que pode ser definida por um índice de massa corporal (peso em quilogramas dividido pela altura em metros ao quadrado) maior ou igual a 30 kg/m2, e que está associada de forma independente a um elevado risco de morbidade e mortalidade cardiovascular devido aos eventos aterotrombóticos. O óxido nítrico (NO), uma pequena molécula gasosa, é produzido através da conversão do aminoácido catiônico L-arginina em L-citrulina e NO em uma reação catalisada por uma família de enzimas denominadas NO-sintases (NOS), e funciona como um protetor cardiovascular modulando por exemplo o relaxamento do músculo liso vascular e a função plaquetária. O objetivo desta tese foi avaliar a via L-arginina-NO, bem como investigar a função plaquetária, o estresse oxidativo, e a atividade da arginase em pacientes com obesidade. O transporte de L-arginina, a produção de guanosina monofosfato cíclica (GMPc), a atividade e a expressão das isoformas da NOS (iNOS e eNOS), a atividade da arginase, o estresse oxidativo (produção de espécies reativas de oxigênio EROs; atividade da superóxido dismutase SOD; e atividade da catalase), bem como a função plaquetária foram medidos nas plaquetas dos pacientes com obesidade. Nas hemácias, foram medidos o transporte de L-arginina e a atividade da NOS e da arginase. Os níveis de aminoácidos e de marcadores inflamatórios (fibrinogênio e proteína C reativa) também foram medidos sistemicamente. Os resultados demonstram que o influxo de L-arginina via sistema y+L, a atividade da NOS e a produção de GMPc estão diminuídos nas plaquetas dos pacientes obesos em relação aos controles saudáveis, enquanto que não houve diferença na atividade da arginase. Além disso, a expressão das isoformas da NOS bem como a agregação plaquetária em plaquetas de pacientes com obesidade mostrou-se aumentada em relação aos controles. Nas hemácias destes pacientes, observou-se elevado influxo de L-arginina via sistema y+ e y+L e atividade da NOS, e nenhuma diferença na função da arginase. A concentração plasmática de L-arginina não foi afetada pela obesidade, mas já os marcadores inflamatórios estavam significativamente aumentados. A produção de EROs e a atividade da catalase nas plaquetas não estava alterada em pacientes com obesidade, enquanto que a atividade da SOD mostrou-se diminuida. Assim, apesar do aumento da produção de NO pelas hemácias, é possível que a baixa produção plaquetária de NO, além do estado inflamatório e um possível estresse oxidativo, estejam contribuindo para a elevada atividade plaquetária observada na obesidade. As descobertas aqui apresentadas contribuem para uma melhor compreensão dos eventos cardiovasculares presentes na obesidade. / Obesity is a metabolic disorder of multifactorial etiology and high prevalence in Brazil, which can be defined as a body mass index (weight in kilograms divided by height in square meters) greater than or equal to 30 kg/m2, and that is independently associated with a high risk of cardiovascular morbidity and mortality due to atherothrombotic events. Nitric oxide (NO), a small gaseous molecule, is produced through the conversion of the cationic amino acid L-arginine to L-citrulline and NO in a reaction catalyzed by a family of enzymes called NO synthases (NOS) and it acts as a cardiovascular protector modulating, for example, the relaxation of vascular smooth muscle and the platelet function. The aim of this thesis was to assess the L-arginine-NO pathway, as well as to investigate platelet function, oxidative stress, and the arginase activity in patients with obesity. The L-arginine transport, the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), the activity and expression of NOS isoforms (eNOS and iNOS), the arginase activity, oxidative stress (production of reactive oxygen species - ROS; superoxide dismutase activity - SOD, and catalase activity), and platelet function were evaluated in platelets from patients with obesity. In erythrocytes, the L-arginine transport and the activity of NOS and arginase were investigated. Systemic levels of amino acids and inflammatory markers (fibrinogen and C-reactive protein) were also investigated. The results demonstrated that L-arginine influx via y+L system, NOS activity, and cGMP levels were decreased in platelets from obese subjects compared to healthy controls, whereas no difference was observed in arginase activity. In addition, the expression of NOS isoforms and platelet aggregation in platelets from patients with obesity was increased in relation to controls. In erythrocytes from these patients, there were a higher influx of L-arginine via y+ and y+L system, and NOS activity, and no difference in arginase function. The plasma concentration of L-arginine was not affected by obesity, whereas the concentration of inflammatory markers was significantly increased. The production of ROS and catalase activity in platelets were not altered in patients with obesity, whereas SOD activity was reduced. Thus, despite the increased NO production by erythrocytes, it is possible that the low platelet production of NO, in addition to a possible inflammatory state and oxidative stress, are contributing to the elevated platelet activity observed in obesity. These findings may contribute to a better understanding of the cardiovascular events seen in obesity

Investigamos os efeitos dos exercícios físicos (EF) aeróbios e/ou suplementação de L-Arginina (L-ARG) sobre as possíveis alterações da composição corporal (CC) de ratas hipertensas (SHR) ovariectomizadas. As ratas (com aproximadamente 13 semanas de idade) foram submetidas a remoção cirúrgica dos ovários para podermos estudar o efeito da depleção de hormônios ovarianos, que ocorre na menopausa. Após 30 dias de ovariectomia, as ratas realizaram um protocolo de EF em esteira ergométrica de moderada intensidade ou mantidos sedentários por oito semanas e suplementadas com L-ARG. Enquanto o ganho de massa corporal (MC) relativa não foi afetada pelos EF ou L-ARG, o consumo alimentar (CA) aumentou significativamente nos grupos EXER (hipertenso treinado) e EXER-ARG (hipertenso treinado associado com suplementação de L-ARG), quando comparado ao grupo CONT (hipertenso sedentário - controle) Como esperado, os EF e a L-ARG, foram eficientes em elevar a capacidade física dos grupos EXER e EXER-ARG, com aumento extremamente significativo (p<0.001) da distância máxima alcançada na 8ª semana de EF, porém não causou alterações na massa úmida dos músculos estriados esqueléticos (MEE). Em associação, verificamos um aumento da massa úmida do coração nos grupos EXER e EXER-ARG, porém no grupo EXER-ARG observou-se uma discreta queda na PA (pressão arterial) final, ainda que não significante. Paralelamente, os dados mostraram que a L-ARG e/ou os EF não foram efetivos para a diminuição da reabsorção do osso ou a formação óssea crescente. / We investigated the effects of physical exercise (PE) aerobic and/or supplementation of L-arginine (L-ARG) on the possible changes in body composition (CC) of hypertensive rats (SHR) ovariectomized. The rats (approximately 13 weeks old) underwent surgical removal of the ovaries in order to study the effect of depletion of ovarian hormones at menopause occurring. After 30 days of ovariectomy, the rats underwent a protocol of PE treadmill of moderate intensity or kept sedentary for eight weeks and supplemented with L-ARG. While the gain in body mass (BM) was not affected by the relative PE or L-ARG, food consumption (CA) increased significantly in groups EXER (hypertensive trained) and EXER-ARG (hypertensive trained associated with supplementation of L-ARG) when compared to the CONT group (untrained - control) As expected, PE and L-ARG, were effective in increasing the physical capacity of groups EXER and EXER-ARG, with highly significant increase (p <0.001) the maximum distance reached the 8th week of PE, but caused no change in wet mass of striated skeletal muscle (ESM). In combination, we see an increase in wet weight of the heart in groups EXER and EXER-ARG, but in the group EXERARG showed a slight drop in BP (blood pressure) end, though not significant. Simultaneously, the data show that L-Arg and/or PE were not effective to decrease bone resorption or increasing bone formation.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diabetes mellitus (DM) can be defined as a heterogeneous group of metabolic disorders characterized by hyperglycemia, resulting in dysfunction, ultimately, failure of various organs, especially the eyes, kidneys, nerves and vascular system. This study aimed to evaluate the effects of L-arginine (L-Arg), resistance exercise (RE) and the association between them on changes of endothelium-derived relaxing factor (EDRF) in isolated rings of superior mesenteric artery of diabetic rats induced by alloxan. Wistar rats (250-300g) were divided into 7 groups: Control (CON, n = 4), Electrically Stimulated (ES, n = 4), Trained Control (TC, n = 4), Sedentary Diabetic (SD, n = 5), L-arginine Diabetic (L-Arg + D, n = 5), Trained Diabetic (TD, n = 5) and L-arginine + Trained Diabetic (L-Arg + TD, n = 5). The animals diabetic groups received alloxan 2 weeks before the start of treatment protocols. The RE protocol consisted of 3 sets of 10 squats (Tamaki apparatus) with an intensity of 50% of one repetition maximum (1RM). Animals treated with L-Arg received 1.25 mg/ml daily in drinking water. At the end of 8 weeks, vessel relaxation endothelium-dependent was obtained in rings pre-contracted with L-phenylephrine (Phe, 10 mM) by addition of increasing concentrations and cumulative acetylcholine (ACh, 10-9 10-4 M). After this, concentration-response curves were constructed in control conditions or in the presence of inhibitors of nitric oxide sintetase (L-NAME), cyclo-oxygenase (INDO) and potassium channels blockers (TEA). The vessel relaxation induced by 10 ACh showed a significant reduction (p < 0.05) in the maximum response (Rmax) of SD compared with CON. Furthermore, we observed a significant reduction (p < 0.001) in sensitivity (pD2) (6.8 ± 0.12 to 6.2 ± 0.11) of L-Arg + D compared with the SD. In the presence of L-NAME the L-Arg + D showed a reduction (p < 0.001) of vessel relaxation compared to the SD. After addition of L-NAME + INDO, the LArg + TD showed a significant reduction (p < 0.001) in vessel relaxation compared with the SD. The presence of L-NAME + INDO + TEA, the TD and L-Arg + TD showed a significant reduction (p <0.001) of vessel relaxation compared with the SD. The results show that although there was no improvement in vessel relaxation induced by ACh, we observed a change in the participation of EDRF in all groups. / O diabetes mellitus (DM) pode ser definido como um grupo heterogêneo de distúrbios metabólicos caracterizados pela hiperglicemia, resultando em disfunção, e última instância, insuficiência de vários órgãos, especialmente dos olhos, rins, nervos e sistema vascular. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da Larginina (L-Arg), do exercício resistido (ER) e da associação entre L-Arg e o ER sobre as alterações dos fatores relaxantes derivados do endotélio (EDRFs) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de ratos diabéticos induzidos por aloxano. Ratos Wistar (250-300g) foram divididos em 7 grupos: Controle (CON, n = 4), Estimulado Eletricamente (EE, n = 4), Controle Treinado (CT, n = 4), Diabético Sedentário (DS, n = 5), Diabético L-arginina (DL-Arg, n = 5), Diabético Treinado (DT, n = 5) e grupo Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg, n = 5). Os animais dos grupos diabéticos receberam aloxano 2 semanas antes do início dos protocolos de tratamento. O protocolo de ER consistiu em 3 séries de 10 agachamentos (no aparelho de Tamaki) com uma intensidade de 50% de uma repetição máxima (1RM). Os animais tratados com L-Arg receberam 1,25 mg/ml diariamente na água de beber. No final de 8 semanas, o vasorrelaxamento dependente de endotélio foi obtido em anéis pré-contraídos com L-fenilefrina (FEN, 10 μM) pela adição à cuba de concentrações crescentes e cumulativas de acetilcolina (ACh, 10-9 10-4 M). Após isto, curvas concentração-respostas foram construídas na condição controle ou na presença dos inibidores da síntese do óxido nítrico (LNAME), da ciclo-oxigenase (INDO) e dos canais para potássio (TEA). Os vasorrelaxamentos induzidos por ACh apresentaram uma redução significativa (p < 0,05) na resposta máxima (Rmax) do DS comparado com o CON. Além disso, foi observado uma redução significativa (p < 0,001) da sensibilidade (pD2) (de 6,8 ± 0,12 para 6,2 ± 0,11) do DL-Arg quando comparado com o DS. Na presença do LNAME o DL-Arg apresentou uma redução (p < 0,001) dos vasorrelaxamentos 8 quando comparado com o DS. Após adição de L-NAME + INDO, o DT + L-Arg apresentou uma redução significativa (p < 0,001) nos vasorrelaxamentos quando comparado com o DS. Já na presença de L-NAME + INDO + TEA, o DT e DT + LArg apresentaram uma redução significativa (p < 0,001) dos vasorrelaxamentos quando comparados com o DS. Os resultados demonstram que apesar de não haver melhora nos vasorrelaxamentos induzidos por ACh, foi observado uma modificação na participação dos EDRFs em todos os grupos.

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Title: Nitric oxide and its neurophysiologic role Objectives: The main aim of my diploma work is to evaluate the role of nitric oxide and its effects during epileptic seizure in rats. I summarize the present knowledge about nitric oxide and its effects on human organism in the theoretical section of this paper and I will suppose the positive effect of nitric oxide inhibitor in epileptic seizures in rats by the realization of my experiment. Methods: The experiment will be performed in the laboratory of Academy of Science of Czech Republic. Implementation will come through examining a set of ten rats. The first six will be given v (L-NPA) in an amount of 0,5mg to one side, which will take place by applying bilaterally to coele. Then after ten minutes 0,5µl of 4-aminopyridine (4-AP) will be applied bilaterally to coele. The control group, consisting of four rats will be given saline instead of L-NPA. The experiment will run for two days. Results: The course of epileptic seizure with application of L-NPA to examined group was compared with the control group. The experiment confirmed the positive effect of L-NPA in terms of delay and reduction of seizure. Keywords: nitric oxide, Nω -propyl-l-arginine, neurovascular coupling, 4-anopyridine, epilepsy

Hintergrund. L-Arginin spielt eine komplexe Rolle in der renalen Matrixexpansion, eingeschlossen der endogene Stoffwechsel der Aminosäure in Stickoxid (NO), Polyamine, L-Prolin und Agmatin. Bei Ratten mit einer induzierten Anti-Thy1-Glomerulonephritis (GN) ist gezeigt worden, dass die diätetische Gabe von L-Arginin die Überproduktion von transforming growth factor (TGF)-beta sowie die Matrixakkumulation limitieren konnte. Die vorliegende Studie testet die Hypothese, dass die günstigen Effekte auf die Überexpression von TGF-beta in vivo durch die Generierung von NO vermittelt wird. Methoden. Einen Tag nach Induktion einer Anti-Thy-1-Glomerulonephritis wurden männliche Wistar Ratten, die mit normal proteinhaltigen Futter ernährt worden sind, in die folgenden Gruppen zugeordnet worden: (1) normale Kontrollen; (2) GN; (3) GN-Arg [plus 500 mg L-Arginin/die]; (4) GN-Arg-NAME [plus 500 mg L-Arginin/die und 75 mg/die des NO-Synthase-Inhibitors Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester (L-NAME) im Trinkwasser] und (5) GN-Molsi [plus 10 mg/die des NO-Donors Molsidomin]. In Versuchsprotokoll 1 wurde die Behandlung bis Tag 7, in Protokoll 2 bis Tag 12 nach Induktion der Glomerulonephritis durchgeführt. Analysiert wurden die Daten des systolischen Blutdrucks, die histologische glomeruläre Matrixexpansion, die Proteinurie sowie die glomeruläre mRNA- und Protein-Expression des Schlüsselfibrogens TGF-beta, des Matrixproteins Fibronektin und des Protease-Inhibitors Plasminogen-Aktivator-Inhibitor Typ 1(PAI-1). Ergebnisse. Die Blutdruckwerte zeigten sich normal in unbehandelten Anti-Thy-1-Tieren und nicht signifikant beeinflusst durch eine der Behandlungen. Verglichen mit unbehandelten, nephritischen Ratten, reduzierten die Gabe von L-Arginin sowie von Molsidomin signifikant die glomeruläre TGF-beta Überexpression und auch in ähnlichem Mass in beiden Studienprotokollen. Die günstigen Effekte von L-Arginin wurden durch gleichzeitige Blockade der NOS-Synthese mit L-NAME aufgehoben. Die glomeruläre Matrixakkumulation, Fibronektin und PAI-1 mRNA- und Protein-Expression folgten eng der TGF-beta-Expression. Die Proteinurie wurde durch keine der Behandlungen signifikant beeinflusst.Schlussfolgerung. Die vorliegende Studie zeigt, dass die antifibrotischen Effekte der Aminosäure L-Arginin in der normotensiven Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte hauptsächlich über die endogene Produktion von NO vermittelt werden. Diese Daten lassen vermuten, dass NO in vivo die TGF-beta-Überexpression auf einem blutdruck-unabhängigen Weg limitiert und dass NO-Donoren sich günstig in der Behandlung von menschlichen fibrotischen Nierenerkrankungen auswirken könnten. / Background. L-arginine olays a complex role in renal matrix expansion, involving endogenous metabolism into nitric oxide (NO), polyamines, L-prolin and agmatine. Supplementing dietary L-arginine intake has been shown to limit transforming growth factor (TGF)-beta1 overproduction and matrix accumulation in rats with induced anti-thy1 glomerulonephritis (GN). The present study tests the hypothesis that this beneficial effect on in vivo TGF-beta overproduction is mediated via the generation of NO. Methods. One day after inducion of anti-thy1 GN, male wistar rats fed a normal protein diet were assigned to the following groups: (1) normal controls; (2) GN; (3) GN-Arg [plus 500 mg L-arginine/day]; (4) GN-Arg-NAME [plus 500 mg L-arginine/day and 75 mg/day of the NO synthase inhibitor nitro-L-arginine-methyl ester (L-NAME) in the drinking water] and (5) GN-Molsi [plus 10 mg/day of the NO donor molsidomine]. In protocol 1, treatment lasted until day 7 and in protocol 2 until day 12 after disease induction, respectively. Analysis included systolic blood pressure, proteinuria, a glomerular histologic matrix score and the glomerular mRNA and protein expression of the key fibrogen TGF-beta1, the matrix protein fibronectin and the protease inhibitor plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1). Results. Blood pressure was normal in untreated anti-thy1 animals and not significantly affected by any of the treatments. Compared to nephritic rats, administration of both L-arginine and molsidomine reduced glomerular TGF-beta1 overexpression significantly and to a similar degree in both protocols, while the beneficial effect of L-arginine was abolished by concomitant NO synthesis inhibition. Glomerular matrix accumulation, fibronectin and PAI-1 mRNA and protein expression cloxely followed the expression of TGF-beta1. Proteinuria was not significantly affected by any treatment. Conclusion. The present study shows that L-arginine´s antifibrotic action in normothensive anti-thy1 GN is mainly mediated by endogenous production of NO. The data suggest that NO limits in vivo TGF-beta overexpression in a pressur-independent manner and that NO donors may be of benefit in the treatment of human fibrotic renal disease.

Die fortschreitende Vermehrung extrazellulärer Matrixproteine ist zentrales Kennzeichen von chronisch-progressiver Niereninsuffizienz. L-Arginin ist eine semi-essentielle Aminosäure und über seinen endogenen Metaboliten Stickoxid (NO) in komplexer Weise mit renaler Matrixvermehrung verbunden. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie sich die Gabe von L-Arginin auf die Matrixexpansion bei experimenteller, immun-vermittelter Nierenerkrankung auswirkt. Im Modell der akuten Anti-Thy1-Glomerulonephritis der Ratte und der chronischen Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus wurde gezeigt, daß die Aktivierung des L-Arginin-NO-Stoffwechsels sowohl mit günstigen als auch mit ungünstigen Wirkungen auf die renale Matrixakkumulation verbunden ist. Diese "duale" Wirkung von L-Arginin ist im wesentlichen als Ausdruck der "ambivalenten" Wirkung von NO zu deuten. Antifibrotische Wirkungen von L-Arginin stehen in enger Verbindung mit einer gesteigerten endothelialen NO-Synthese. Neben renaler Blutdrucksenkung vermittelt die endotheliale NO-Synthase auch parakrin wichtige antifibrotische Effekte. Profibrotische Wirkungen von L-Arginin stehen in engem Zusammenhang mit einer gesteigerten NO-Synthese durch induzierbare, destruktive NO-Synthasen. Folgen sind verstärkte Organschädigung und beschleunigte Progression von renaler Funktionseinschränkung. / Ongoing expansion of extracellular matrix proteins is a hallmark of progressive chronic renal insufficiency. L-Arginine is a semi-essential amino acid and alters renal matrix accumulation via its endogenous metabolite nitric oxide (NO) in a complex manner. The present study analyzed how administration of L-arginine affects renal matrix accumulation in experimental immune-mediated disease. In acute anti-Thy1 glomerulonephritis of the rat and chronic lupus nephritis of MRL/lpr-mice, activation of the L-arginine-NO-pathway was related to both beneficial and detrimental actions on renal matrix accumulation. This "dual" effect of L-arginine administration essentially reflects the "ambivalent" nature of NO. Antifibrotic actions of L-arginine are associated with increased endothelial NO synthesis. In addition to lowering glomerular blood pressure, endothelial NO production mediates important paracrine antifibrotic actions. Profibrotic effects of L-arginine are related to increased NO production by inducible, destructive NO synthases, resulting in increased organ damage and accelerated progression of chronic kidney insufficiency.

A prevalência da obesidade e da síndrome metabólica (SM) vem aumentando dramaticamente em jovens e está se tornando um problema de saúde pública na maioria dos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Tanto a obesidade quanto a SM aumentam o número de pacientes expostos ao risco de doença cardiovascular. Estudos recentes mostram que uma redução na biodisponipilidade de óxido nítrico (NO) é um dos principais fatores que contribui para a ação deletéria da insulina nos vasos de pacientes adultos com obesidade e SM. O NO, potente vasodilatador e anti-agregante plaquetário, tem como precursor o aminoácido catiônico L-arginina que é transportado para o interior das plaquetas através do carreador y+L. Uma família de enzimas denominadas NO sintases (NOS) catalisa a oxidação da L-arginina em NO e L-citrulina e é composta de três isoformas: neuronal (nNOS), induzível (iNOS) e endotelial (eNOS). Os objetivos principais do presente estudo são de investigar diferentes etapas da via L-arginina-NO em plaquetas associando agregação plaquetária, concentração plasmática de L-arginina, estresse oxidativo, marcadores metabólicos, hormonais, clínicos e inflamatórios em pacientes adolescentes com obesidade e SM. Foram incluídos no estudo trinta adolescentes, sendo dez com obesidade, dez com SM, e dez controles saudáveis pareados por idade, sexo e classificação de Tanner (controles: n= 10, 15.6 0.7 anos; obesos: n= 10, 15 0.9 anos; SM: n= 10, 14.9 0.8 anos). O transporte de L-arginina (pmol/109céls/min) através do sistema y+L estava diminuído nos pacientes com SM (18.4 3.8) e obesidade (20.8 4.7), comparados aos controles (52.3 14.8). Houve uma correlação positiva do influxo de L-arginina via sistema y+L com os níveis de HDL-Colesterol. Por outro lado, foi encontrada uma correlação negativa do influxo de L-arginina com os níveis de insulina, os índices Homa IR, relacionado a RI, Homa Beta, relacionado a função da célula beta e também com os índices de Leptina. Em relação a produção de NO, a obesidade e a SM não afetaram a atividade e expressão das enzimas NOS. A atividade da superóxido dismutase (SOD), através da mensuração da inibição da auto-oxidação da adrenalina, mostrou diferença significativa nas plaquetas de pacientes com obesidade (4235 613,2 nMol/mg de proteína), quando comparada aos controles (1011 123,6 nmol/mg de proteína) e SM (1713 267,7 nmol/mg de proteína). A nível sistêmico, foi também evidenciada uma ativação desta enzima anti-oxidante no soro de pacientes obesos, em relação aos controles. A peroxidação lipídica avaliada pelas substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) estava inalterada no soro dos pacientes e controles. Estes resultados sugerem que o transporte de L-arginina diminuído nas plaquetas de adolescentes obesos e com SM pode ser um marcador precoce de disfunção plaquetária. A alteração desta via correlaciona-se com a resistência à insulina e hiperinsulinemia. A contribuição deste estudo e de fatores que possam ser precocemente identificados pode diminuir o risco cardiovascular na vida adulta desta população de pacientes. / The prevalence of obesity and metabolic syndrome (MS) is dramatically increasing in young people and becoming a public health problem in the majority of developed and developing countries. Both obesity and MS increase the number of patients exposed to the risk of cardiovascular disease. Recent studies have shown that a reduction in nitric oxide (NO) bioavailability is one of the major factors contributing to the deleterious action of insulin in the blood vessels of adult patients with obesity and MS. NO, a powerful vasodilator and platelet anti-aggregating agent, has the cationic amino acid L-arginine as a precursor, which is transported into platelets via transport system y+L. A family of enzymes known as NO sinthases (NOS) catalyses the oxidation of L-arginine in NO and L-citrulline and is composed of three isoforms: neuronal (nNOS), inducible (iNOS) and endothelial (eNOS). The major objectives of this study are to investigate different steps of the L-arginine-NO pathway in platelets and their association with platelet aggregation, L-arginine plasma concentration, oxidative stress, and metabolic, hormonal, clinical and inflammatory markers in adolescent patients with obesity and MS. Thirty adolescents were included in this study: ten with obesity, ten with MS and ten healthy controls paired by age, sex and Tanner classification (controls: n= 10, 15.6 0.7 years; obese: n= 10, 15 0.9 years; MS: n= 10, 14.9 0.8 years). Larginine transport (pmol/109cells/min) via system y+L was reduced in patients with MS (18.4 3.8) and obesity (20.8 4.7) compared to controls (52.3 14.8). There was a positive correlation between L-arginine influx via system y+L and HDL-cholesterol. On the other hand, a negative correlation was found between L-arginine influx via system y+L and insulin levels, Homa-IR related to insulin resistance, Homa-Beta, related to betacell function and the leptin index. In relation to nitric oxide production, obesity and MS do not affect the activity and expression of NOS enzymes. The activity of superoxide dismutase (SOD), by measuring the inhibition of adrenaline autoxidation, showed a significant difference in platelets from patients with obesity (4235 613,2nMol/mg protein) compared to controls (1011 123,6 nmol/mg de protein) and MS (1713 267,7 nmol/mg protein). At the systemic level, an activation of this anti-oxidant enzyme was also observed in the serum of patients with obesity and MS in relation to controls in the presence of similar levels of substances that are reactive to tiobarbituric acid (TBARS), a marker of lipid peroxidation. These results suggest that diminished L-arginine transport in platelets from adolescents with obesity and MS may be an early marker of platelet dysfunction. The alteration of this pathway correlates to insulin resistance and hyperinsulinemia. The contribution of this study and of factors that can be identified early may reduce cardiovascular risk during adult life in this population of patients.