A Pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome hipertensiva específica da gravidez, atualmente compreendida como uma doença sistêmica que cursa com inflamação, distúrbios da coagulação, desordens metabólicas, disfunção endotelial e desequilíbrio entre agentes vasoconstrictores e vasodilatadores. Contudo, a fisiopatologia da PE ainda não foi completamente elucidada. Este estudo investigou, em 51 gestantes, o estresse oxidativo, a via L-arginina-óxido nítrico e agregação plaquetária, na gestação normal (n=27) e na PE (n=24). Amostras de soro e plaquetas de gestantes normotensas e com PE, foram utilizadas para a medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a carbonilação de proteínas, a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), assim como a produção de óxido nítrico (NO) pela formação de nitrito. Nas plaquetas foram avaliados, também, o transporte de L-arginina, a atividade da óxido nítrico sintase (NOS) e a agregação plaquetária. Em amostras de plasma foram realizadas medidas da proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e do aminoácido L-arginina. Estes resultados demonstram que não há diferença nas medidas da proteína C reativa e da L-arginina entre gestantes normotensas e com PE. A formação de nitritos e a atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GPx se encontram reduzidas no soro de gestantes com PE, enquanto a medida de TBARS e a carbonilação de proteínas não foi diferente das gestantes normotensas. Em plaquetas, o transporte de L-arginina pelo sistema y+L está diminuído na PE, ao passo que, a atividade da NOS, a formação de nitrito e a agregação plaquetária não modificaram em relação a gestação normal. A carbonilação de proteínas está aumentada em plaquetas na PE e a atividade da CAT está reduzida. Concluiu-se, que a menor formação de nitrito no soro sugere uma menor produção de NO em pacientes com PE. Este dado correlaciona com uma redução da defesa antioxidante observada pela menor atividade das enzimas SOD, CAT, GPx que deve contribuir para uma maior inativação do NO. Apesar dos níveis plasmáticos normais de L-arginina na PE, o sistema de transporte via y+L está reduzido em plaquetas, o que pode estar associado em parte ao estresse oxidativo que contribui para alterações físicas e estruturais da membrana, podendo afetar o influxo do aminoácido. Apesar do transporte de L-arginina reduzido e do aumento do estresse oxidativo em plaquetas na PE, não houve alteração da atividade da NOS, da produção de NO e da agregação plaquetária, indicando que mecanismos compensatórios possam estar contribuindo para a manutenção da produção de NO e de sua função modulatória sobre a agregação / Pre-eclampsia (PE) is a syndrome of pregnancy induced hypertension, currently understood as a systemic disease that leads to inflammation, coagulation, metabolic disorders, endothelial dysfunction and imbalance between vasoconstrictor and vasodilator agents. However, the pathophysiology of PE has not been fully elucidated. This study investigated in 51 women, oxidative stress and its correlation with the L-Arginine-nitric oxide and platelet aggregation in normal pregnancy (n = 27) and PE (n = 24). Serum and platelets of normotensive pregnant women and PE were used to measure thiobarbituric acid reactive species (TBARS), carbonyl proteins, the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) and nitric oxide (NO) production by the formation of nitrite. We also evaluated the transport of L-arginine, the activity of the nitric oxide synthase (NOS) and aggregation in platelets. Plasma samples were used to measure C-reactive protein highly sensitive (hsCRP) and the amino acid L-arginine. Our results demonstrate that there is no difference in the measurements of C-reactive protein and L-arginine at PE compared to normotensive pregnant women. The formation of nitrite and the activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and GPx are reduced in serum from women with PE, while the measure of TBARS and protein carbonyls were not different from normotensive pregnant women. In platelets, the transport of L-arginine by system y+L is reduced in PE, whereas the NOS activity, nitrite formation and platelet aggregation did not change compared to normal pregnancy. Carbonylation of proteins is increased in platelets in PE and CAT activity is reduced. In conclusion, the lower formation of nitrite in serum suggests a lower NO production in patients with PE. This finding correlates with a reduced antioxidant defense observed by the lower activity of SOD, CAT, GPx which might contribute to increased inactivation of NO. Despite normal plasma levels of L-arginine on PE, the transport system via y+L in platelets is reduced, which can be associated in part with oxidative stress that contributes to physical and structural changes of the membrane, which may affect the influx of amino acid. Despite of the reduced L-arginine transport and the increased oxidative stress in platelets from PE, no change occurs in NOS activity, NO production and platelet aggregation, indicating that compensatory mechanisms may be contributing to the maintenance of NO production and its modulatory role on aggregation

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-05-05T19:27:14Z No. of bitstreams: 1 AdrianoPereira.pdf: 4552452 bytes, checksum: c5dc1a24e3fc6e843a7a494ecc39cb39 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-05T19:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AdrianoPereira.pdf: 4552452 bytes, checksum: c5dc1a24e3fc6e843a7a494ecc39cb39 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / Materials consisting of amino acids are of great interest in the application in nonlinear optical (NLO) and are being studied more carefully because they have properties better than the potassium dihydrogen phosphate (KDP), the material most commonly used for Second Generation Harmonic (SHG). In this work, the crystals of L-arginine hydrobromidric monohydrate (LAHBr) and L-arginine hydrochloridric monohydrate (LAHCl) were grown at room temperature (25° C) by the method of slow evaporation of solvent. Were also synthesized hydrochlorobromidric L-arginine monohydrate crystals (LAHClBr) from the mixture of the compounds in equimolar proportions 1:3, 1:1 and 3:1. These five crystals were characterized by the techniques of X-Ray Fluorescence (XRF), Diffraction X-Ray (XRD), Raman Spectroscopy, Thermogravimetry (TG), Differential Thermal Analysis (DTA) and Differential Scanning Calorimetry (DSC). The chemical composition of the single crystal was analyzed by X-ray Fluorescence (XRF) and compositions obtained were: C6H14N4O2•HCL0.14BR0.86•H2O (LAHCl0,14Br0,86), C6H14N4 O2•HCL0.42BR0.58•H2O (LAHCl0,42Br0,58), e C6H14N4O2•HCL0.63BR0.37•H2O (LAHCl0,63Br0,37). The structural parameters of the crystals were characterized by X-ray diffraction (XRD) in association with the Rietveld refinement. The all samples crystallize with the monoclinic structure (space group P21) and the unit cell volume of LAHClxBr1-x series decreases with increasing concentration of chlorine in the composition of the samples. The vibrational modes were observed by Raman Spectroscopy. The Raman spectrum experiments have shown that bands associated with lattice modes undergo blue shifts as the concentration of chorine ion is increased in addition to complement the results obtained by XRD technique. The thermal analysis of TG, DTA and DSC showed that the crystals analyzed show a decrease in temperature of the characteristic exothermic phase transition event, as well as increasing in the melting temperature of the material, with increasing chlorine concentration. The crystals LAHBr, LAHClBr and LAHCl to lose water of hydration suffer phase transformation goes to anhydrous phase without change in structure (monoclinic-monoclinic) and present structural phase transition around 150 oC. / Materiais constituídos por aminoácidos são de grande interesse na aplicação em óptica nãolinear (NLO) e estão sendo estudados com maior atenção por apresentarem propriedades melhores do que o material mais utilizado para Geração de Segundo Harmônico (SHG); dihidrogenofosfato de potássio (KDP). Neste trabalho os monocristais de L-arginina hidrobromídrica monohidratada (LAHBr) e L-arginina hidroclorídrica monohidratada (LAHCl) foram crescidos à temperatura ambiente (25°C), pelo método de evaporação lenta do solvente. Também foram sintetizados cristais de L-arginina hidroclorobromídrica monohidratada (LAHClBr), a partir da mistura dos dois compostos, nas proporções molares 1:3, 1:1 e 3:1. Esses cinco cristais foram caracterizados pelas técnicas de Fluorescência de raios-X (FRX), Difração de raios-X (DRX), Espectroscopia Raman, Termogravimetria (TG), Análise Diferencial Térmica (DTA) e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC). A composição química dos monocristais foi analisada por FRX e as composições são: C6H14N4O2•HCL0.14BR0.86•H2O (LAHCl0,14Br0,86), C6H14N4O2•HCL0.42BR0.58•H2O (LAHCl0,42Br0,58), e H14N4O2•HCL0.63BR0.37•H2O (LAHCl0,63Br0,37), para as amostras de LAHClBr 1:3, LAHClBr 1:1 e LAHClBr 3:1, respectivamente. Os parâmetros estruturais dos cristais foram caracterizados por DRX em associação com o refinamento de Rietveld, onde observamos que todas as amostras se cristalizam com a estrutura monoclínica (grupo espacial P21) e que o volume da célula unitária da série LAHClxBr1-x diminue com o aumento da concentração de Cloro na composição das amostras. Os modos vibracionais foram observados por Espectroscopia Raman. Os espectros Raman mostraram que as bandas associadas aos modos de rede sofreram blue shifts com o aumento da concentração de Cl, além de complementar os resultados obtidos pela técnica de DRX. As análises térmicas de TG, DTA e DSC mostraram que os cristais analisados apresentaram uma diminuição de temperatura do evento exotérmico característico de transição de fase com o aumento da concentração de Cl, bem como, aumento da temperatura em que ocorre a fusão do material. Os cristais de LAHBr, LAHClBr e LAHCl ao perderem água de hidratação sofrem transformação de fase indo para a fase anidra sem mudança na estrutura cristalina monoclínicamonoclínica) e apresentam uma transição de fase estrutural em torno de 150 oC.

Diabetic nephropathy is the main cause for initiation of renal replacement therapy and early symptoms in patients include increased glomerular filtration rate (GFR), decreased oxygen tension and albuminuria, followed by a progressive decline in GFR and loss of kidney function. Experimental models of diabetes display increased GFR, decreased tissue oxygenation and nitric oxide bioavailability. These findings are likely to be intertwined in a mechanistic pathway to kidney damage and this thesis investigated their roles in the development of diabetic nephropathy. In vivo, diabetes-induced oxidative stress stimulates renal tubular Na+ transport and in vitro, proximal tubular cells from diabetic rats display increased transport-dependent oxygen consumption, demonstrating mechanisms contributing to decreased kidney oxygenation. In control animals, endogenous adenosine reduces vascular resistance of the efferent arteriole via adenosine A2-receptors resulting in reduced filtration fraction. However, in diabetes, adenosine A2-signalling is dysfunctional resulting in increased GFR via increased filtration fraction. This is caused by reduced adenosine A2a receptor-mediated vasodilation of efferent arterioles. The lack of adenosine-signaling in diabetes is likely due to reduced local adenosine concentration since adenosine A2a receptor activation reduced GFR only in diabetic animals by efferent arteriolar vasodilation. Furthermore, sub-optimal insulin treatment also alleviates increased filtration pressure in diabetes. However, this does not affect GFR due to a simultaneously induction of renal-blood flow dependent regulation of GFR by increasing the filtration coefficient. In diabetes, there is decreased bioavailability of nitric oxide, resulting in alterations that may contribute to diabetes-induced hyperfiltration and decreased oxygenation. Interestingly, increased plasma concentration of l-arginine, the substrate for nitric oxide production, prevents the development of increased GFR and proteinuria, but not increased oxygen consumption leading to sustained intra-renal hypoxia in diabetes. This thesis concludes that antioxidant treatment directed towards the NADPH oxidase as well maneuvers to promote nitric oxide production is beneficial in diabetic kidneys but is targeting different pathways i.e. transport-dependent oxygen consumption in the proximal tubule by NADPH oxidase inhibition and intra-renal hemodynamics after increased plasma l-arginine. Also, the involvement and importance of efferent arteriolar resistance in the development of diabetes-induced hyperfiltration via reduced adenosine A2a signaling is highlighted.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A anorexia nervosa (AN) é um transtorno alimentar com alta morbi-mortalidade, que atinge principalmente adolescentes do sexo feminino. A AN é caracterizada por uma distorção na imagem corporal que leva a restrição alimentar, e, consequentemente, perda de peso e diversas complicações clínicas como um estado de hiperagregabilidade plaquetária. O óxido nítrico (NO) é produzido a partir do aminoácido catiônico L-arginina através de uma família de enzimas denominadas NO-sintases (NOS) e funciona como um protetor cardiovascular modulando várias funções como relaxamento endotelial e função plaquetária. O objetivo dessa dissertação é avaliar a via L-arginina-NO na AN, bem como investigar o ciclo da uréia, a função plaquetária, e o estresse oxidativo em pacientes com AN. O transporte de L-arginina, a produção de guanosina monofosfato cíclica (GMPc), a atividade e a expressão das isoformas da NOS, iNOS e eNOS, o estresse oxidativo (formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS e atividade da superóxido dismutase - SOD), bem como a atividade plaquetária foram avaliados nas plaquetas dos pacientes com AN. Nas hemácias, a atividade e a expressão da NOS, a atividade da arginase e o estresse oxidativo foram investigados. Os níveis plasmáticos de aminoácidos e marcadores de estresse oxidativo no soro foram também analisados. Nossos resultados demonstram que na AN o influxo de L-arginina via sistema y+L, a produção de GMPc e a atividade da NOS estão diminuídos nas plaquetas em relação aos controles. Ainda nas plaquetas dos pacientes com AN, a expressão das isoformas da NOS bem como a atividade plaquetária não se mostrou alterada em relação aos controles. Nas hemácias destes pacientes, observou-se reduzida atividade da NOS e uma elevada função da arginase. A expressão das isoformas da NOS em hemácias não foi afetada pela AN. A concentração plasmática de L-arginina estava reduzida em pacientes com AN. A formação de TBARS nas plaquetas, hemácias e no soro não estava alterada em pacientes com AN enquanto que a atividade da SOD mostrou-se alterada. Assim, apesar da baixa produção de NO, os pacientes anoréticos apresentam um mecanismo cardioprotetor compensatório independente do NO a ser investigado. As descobertas aqui apresentadas contribuem para uma melhor compreensão da fisiopatologia da AN. / The anorexia nervosa (AN) is an eating disorder with high morbi-mortality, that reaches mainly adolescents of the feminine sex. AN is characterized by a distortion of the corporal image that leading to alimentary restriction, and, consequently, loss of weight and diverse clinical complications such as a state of platelet increased aggregation. The nitric oxide (NO) is produced from the cationic amino acid L-arginine through an enzyme family named NO-synthase (NOS) and functions as a cardiovascular protector modulating many functions as endothelial relaxation and platelet activity. The objective of this thesis is to assess the L-arginine-NO pathway in AN, as well as to investigate the cycle of the urea, the platelet function, and the oxidative stress in patients with AN. The L-arginine transport, the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), the activity and the expression of isoforms of NOS, iNOS and eNOS, the oxidative stress (formation of thiobarbituric acid-reactive substances TBARS and superoxide dismutase activity SOD), as well as the platelet function were assessed in platelets from patients with AN. In erythrocytes, the activity and expression of the NOS, the activity of arginase and the oxidative stress were investigated. Plasma amino acid levels and markers of oxidative stress in serum were also assessed. Our results have demonstrated that in AN the L-arginine influx by y+L system, the production of cGMP and activity of NOS are diminished in platelets in relation to controls. Yet in platelets from patients with AN, the expression of NOS isoforms as well as the platelet activity dont show altered. In erythrocytes from these patients, was seen reduced activity of NOS and raised function of arginase. The expression of NOS isoforms in erythrocytes were not affected by AN. The plasmatic concentration of L-arginine was diminished in AN patients. The TBARS formation in platelets, erythrocytes and serum, were not altered in patients with AN, while that the SOD activity was altered. Therefore, although of the low production of NO, the patients with AN presents an NO-independent compensatory cardioprotector mechanisms to be investigated. The discoveries presented in this study contribute for a better understanding of the physiopathology of AN.

O mecanismo do efeito sedativo da clonidina (CLO), um agonista α2-adrenérgico não é claro. Como a ativação dos receptores α2-adrenérgicos induz a liberação de Óxido Nítrico (NO) das células endoteliais, testamos a hipótese de que o efeito sedativo e antinociceptivo da CLO sistêmica dependeria de mecanismos relacionados a via NOGMPc. O 7-NI reduziu significativamente o tempo de sono induzido pela clonidina. O tempo de sono induzido pelo tiopental (TST) foi aumentado pela CLO, α-metildopa, rilmenidina (RIL) and midazolam. O L-NAME reduziu o prolongamento do TST da CLO, α-metildopa, RIL, sem alterar o efeito do midazolam. O efeito inibitório do L-NAME no prolongamento do TST com a CLO foi revertido pela L-arginine. Os resultados sugerem mecanismos NO-dependentes no efeito sedativo da clonidina. Esses efeitos parecem ser específicos para a ação sedativa dos agonistas α2-adrenérgicos. Avaliamos também a possível ligação envolvendo opóides e a via do NO-GMPc no efeito antinociceptivo da CLO. O efeito antinociceptivo induzido pela administração sistêmica de CLO e RIL foi avaliado utilizando o teste das contorções abdominais em camundongos e o teste tailflick. A CLO (3120 g/kg) and RIL induziram efeito antinociceptivo dose-dependente no teste das contorções abdominais e TFL. O efeito antinociceptivo da CLO foi significativamente reduzido pela inibição da NO-syntase and guanylyl ciclase. O efeito da RIL também foi reduzido pelo 7-NI. O efeito antinociceptivo da morfina foi inibido pela naloxona, que não inibiu o efeito da CLO. Nossos resultados sugerem que o efeito da CLO sistêmica não envolve receptor opióide e é modulado por uma via NO-GMPc. / The mechanism of sedative effect of clonidine (CLO), an α2-adrenoceptor agonist remain unclear. As the activation of α2-adrenoceptors induces release of nitric oxide (NO) from endothelial cells, which has led us to test the hypothesis that sedative and antinociceptive effect from systemic CLO depends on the NO-cGMP pathway mechanisms. The sleeping time in rats induced by CLO was significantly decreased by 7-NI. Thiopental sleeping time (TST) was increased by CLO, α-methyldopa, rilmenidine (RIL) and midazolam. L-NAME reduced the prolongation effect of clonidine, α-methyldopa, RIL, but did not alter the effect of midazolam on the TST. The inhibitory effect of L-NAME on CLO -dependent prolongation of TST was reversed by L-arginine. These results suggest that NO-dependent mechanisms are involved in the sedative effect of CLO. In addition, this effect seems to be specific for the sedative action of α2-adrenoceptors agonists. The possible involvement of an opioid and NO-GMPc pathway link in the antinociceptive effect of CLO was also evaluated. The antinociceptive effect induced by systemic administration of CLO and rilmenidine (RIL) was evaluated using the mice writhing tests and TFL. CLO (3120 g/kg) and RIL induces a dose-dependent antinociceptive effect in the writhing tests and TFL. The antinociceptive effect of CLO was significantly reduced by NO-synthase and guanylyl cyclase inhibition. RIL effect was also reduced by 7-NI.The antinociceptive effect of morphine, but not CLO, was inhibited by naloxone. Our current results suggest that the antinociceptive effect of systemic clonidine does not involve the opioid receptor and is modulated by the NO-cGMP pathway.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A anorexia nervosa (AN) é um transtorno alimentar com alta morbi-mortalidade, que atinge principalmente adolescentes do sexo feminino. A AN é caracterizada por uma distorção na imagem corporal que leva a restrição alimentar, e, consequentemente, perda de peso e diversas complicações clínicas como um estado de hiperagregabilidade plaquetária. O óxido nítrico (NO) é produzido a partir do aminoácido catiônico L-arginina através de uma família de enzimas denominadas NO-sintases (NOS) e funciona como um protetor cardiovascular modulando várias funções como relaxamento endotelial e função plaquetária. O objetivo dessa dissertação é avaliar a via L-arginina-NO na AN, bem como investigar o ciclo da uréia, a função plaquetária, e o estresse oxidativo em pacientes com AN. O transporte de L-arginina, a produção de guanosina monofosfato cíclica (GMPc), a atividade e a expressão das isoformas da NOS, iNOS e eNOS, o estresse oxidativo (formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS e atividade da superóxido dismutase - SOD), bem como a atividade plaquetária foram avaliados nas plaquetas dos pacientes com AN. Nas hemácias, a atividade e a expressão da NOS, a atividade da arginase e o estresse oxidativo foram investigados. Os níveis plasmáticos de aminoácidos e marcadores de estresse oxidativo no soro foram também analisados. Nossos resultados demonstram que na AN o influxo de L-arginina via sistema y+L, a produção de GMPc e a atividade da NOS estão diminuídos nas plaquetas em relação aos controles. Ainda nas plaquetas dos pacientes com AN, a expressão das isoformas da NOS bem como a atividade plaquetária não se mostrou alterada em relação aos controles. Nas hemácias destes pacientes, observou-se reduzida atividade da NOS e uma elevada função da arginase. A expressão das isoformas da NOS em hemácias não foi afetada pela AN. A concentração plasmática de L-arginina estava reduzida em pacientes com AN. A formação de TBARS nas plaquetas, hemácias e no soro não estava alterada em pacientes com AN enquanto que a atividade da SOD mostrou-se alterada. Assim, apesar da baixa produção de NO, os pacientes anoréticos apresentam um mecanismo cardioprotetor compensatório independente do NO a ser investigado. As descobertas aqui apresentadas contribuem para uma melhor compreensão da fisiopatologia da AN. / The anorexia nervosa (AN) is an eating disorder with high morbi-mortality, that reaches mainly adolescents of the feminine sex. AN is characterized by a distortion of the corporal image that leading to alimentary restriction, and, consequently, loss of weight and diverse clinical complications such as a state of platelet increased aggregation. The nitric oxide (NO) is produced from the cationic amino acid L-arginine through an enzyme family named NO-synthase (NOS) and functions as a cardiovascular protector modulating many functions as endothelial relaxation and platelet activity. The objective of this thesis is to assess the L-arginine-NO pathway in AN, as well as to investigate the cycle of the urea, the platelet function, and the oxidative stress in patients with AN. The L-arginine transport, the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), the activity and the expression of isoforms of NOS, iNOS and eNOS, the oxidative stress (formation of thiobarbituric acid-reactive substances TBARS and superoxide dismutase activity SOD), as well as the platelet function were assessed in platelets from patients with AN. In erythrocytes, the activity and expression of the NOS, the activity of arginase and the oxidative stress were investigated. Plasma amino acid levels and markers of oxidative stress in serum were also assessed. Our results have demonstrated that in AN the L-arginine influx by y+L system, the production of cGMP and activity of NOS are diminished in platelets in relation to controls. Yet in platelets from patients with AN, the expression of NOS isoforms as well as the platelet activity dont show altered. In erythrocytes from these patients, was seen reduced activity of NOS and raised function of arginase. The expression of NOS isoforms in erythrocytes were not affected by AN. The plasmatic concentration of L-arginine was diminished in AN patients. The TBARS formation in platelets, erythrocytes and serum, were not altered in patients with AN, while that the SOD activity was altered. Therefore, although of the low production of NO, the patients with AN presents an NO-independent compensatory cardioprotector mechanisms to be investigated. The discoveries presented in this study contribute for a better understanding of the physiopathology of AN.

A prevalência da obesidade e da síndrome metabólica (SM) vem aumentando dramaticamente em jovens e está se tornando um problema de saúde pública na maioria dos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Tanto a obesidade quanto a SM aumentam o número de pacientes expostos ao risco de doença cardiovascular. Estudos recentes mostram que uma redução na biodisponipilidade de óxido nítrico (NO) é um dos principais fatores que contribui para a ação deletéria da insulina nos vasos de pacientes adultos com obesidade e SM. O NO, potente vasodilatador e anti-agregante plaquetário, tem como precursor o aminoácido catiônico L-arginina que é transportado para o interior das plaquetas através do carreador y+L. Uma família de enzimas denominadas NO sintases (NOS) catalisa a oxidação da L-arginina em NO e L-citrulina e é composta de três isoformas: neuronal (nNOS), induzível (iNOS) e endotelial (eNOS). Os objetivos principais do presente estudo são de investigar diferentes etapas da via L-arginina-NO em plaquetas associando agregação plaquetária, concentração plasmática de L-arginina, estresse oxidativo, marcadores metabólicos, hormonais, clínicos e inflamatórios em pacientes adolescentes com obesidade e SM. Foram incluídos no estudo trinta adolescentes, sendo dez com obesidade, dez com SM, e dez controles saudáveis pareados por idade, sexo e classificação de Tanner (controles: n= 10, 15.6 0.7 anos; obesos: n= 10, 15 0.9 anos; SM: n= 10, 14.9 0.8 anos). O transporte de L-arginina (pmol/109céls/min) através do sistema y+L estava diminuído nos pacientes com SM (18.4 3.8) e obesidade (20.8 4.7), comparados aos controles (52.3 14.8). Houve uma correlação positiva do influxo de L-arginina via sistema y+L com os níveis de HDL-Colesterol. Por outro lado, foi encontrada uma correlação negativa do influxo de L-arginina com os níveis de insulina, os índices Homa IR, relacionado a RI, Homa Beta, relacionado a função da célula beta e também com os índices de Leptina. Em relação a produção de NO, a obesidade e a SM não afetaram a atividade e expressão das enzimas NOS. A atividade da superóxido dismutase (SOD), através da mensuração da inibição da auto-oxidação da adrenalina, mostrou diferença significativa nas plaquetas de pacientes com obesidade (4235 613,2 nMol/mg de proteína), quando comparada aos controles (1011 123,6 nmol/mg de proteína) e SM (1713 267,7 nmol/mg de proteína). A nível sistêmico, foi também evidenciada uma ativação desta enzima anti-oxidante no soro de pacientes obesos, em relação aos controles. A peroxidação lipídica avaliada pelas substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) estava inalterada no soro dos pacientes e controles. Estes resultados sugerem que o transporte de L-arginina diminuído nas plaquetas de adolescentes obesos e com SM pode ser um marcador precoce de disfunção plaquetária. A alteração desta via correlaciona-se com a resistência à insulina e hiperinsulinemia. A contribuição deste estudo e de fatores que possam ser precocemente identificados pode diminuir o risco cardiovascular na vida adulta desta população de pacientes. / The prevalence of obesity and metabolic syndrome (MS) is dramatically increasing in young people and becoming a public health problem in the majority of developed and developing countries. Both obesity and MS increase the number of patients exposed to the risk of cardiovascular disease. Recent studies have shown that a reduction in nitric oxide (NO) bioavailability is one of the major factors contributing to the deleterious action of insulin in the blood vessels of adult patients with obesity and MS. NO, a powerful vasodilator and platelet anti-aggregating agent, has the cationic amino acid L-arginine as a precursor, which is transported into platelets via transport system y+L. A family of enzymes known as NO sinthases (NOS) catalyses the oxidation of L-arginine in NO and L-citrulline and is composed of three isoforms: neuronal (nNOS), inducible (iNOS) and endothelial (eNOS). The major objectives of this study are to investigate different steps of the L-arginine-NO pathway in platelets and their association with platelet aggregation, L-arginine plasma concentration, oxidative stress, and metabolic, hormonal, clinical and inflammatory markers in adolescent patients with obesity and MS. Thirty adolescents were included in this study: ten with obesity, ten with MS and ten healthy controls paired by age, sex and Tanner classification (controls: n= 10, 15.6 0.7 years; obese: n= 10, 15 0.9 years; MS: n= 10, 14.9 0.8 years). Larginine transport (pmol/109cells/min) via system y+L was reduced in patients with MS (18.4 3.8) and obesity (20.8 4.7) compared to controls (52.3 14.8). There was a positive correlation between L-arginine influx via system y+L and HDL-cholesterol. On the other hand, a negative correlation was found between L-arginine influx via system y+L and insulin levels, Homa-IR related to insulin resistance, Homa-Beta, related to betacell function and the leptin index. In relation to nitric oxide production, obesity and MS do not affect the activity and expression of NOS enzymes. The activity of superoxide dismutase (SOD), by measuring the inhibition of adrenaline autoxidation, showed a significant difference in platelets from patients with obesity (4235 613,2nMol/mg protein) compared to controls (1011 123,6 nmol/mg de protein) and MS (1713 267,7 nmol/mg protein). At the systemic level, an activation of this anti-oxidant enzyme was also observed in the serum of patients with obesity and MS in relation to controls in the presence of similar levels of substances that are reactive to tiobarbituric acid (TBARS), a marker of lipid peroxidation. These results suggest that diminished L-arginine transport in platelets from adolescents with obesity and MS may be an early marker of platelet dysfunction. The alteration of this pathway correlates to insulin resistance and hyperinsulinemia. The contribution of this study and of factors that can be identified early may reduce cardiovascular risk during adult life in this population of patients.

A Pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome hipertensiva específica da gravidez, atualmente compreendida como uma doença sistêmica que cursa com inflamação, distúrbios da coagulação, desordens metabólicas, disfunção endotelial e desequilíbrio entre agentes vasoconstrictores e vasodilatadores. Contudo, a fisiopatologia da PE ainda não foi completamente elucidada. Este estudo investigou, em 51 gestantes, o estresse oxidativo, a via L-arginina-óxido nítrico e agregação plaquetária, na gestação normal (n=27) e na PE (n=24). Amostras de soro e plaquetas de gestantes normotensas e com PE, foram utilizadas para a medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a carbonilação de proteínas, a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), assim como a produção de óxido nítrico (NO) pela formação de nitrito. Nas plaquetas foram avaliados, também, o transporte de L-arginina, a atividade da óxido nítrico sintase (NOS) e a agregação plaquetária. Em amostras de plasma foram realizadas medidas da proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e do aminoácido L-arginina. Estes resultados demonstram que não há diferença nas medidas da proteína C reativa e da L-arginina entre gestantes normotensas e com PE. A formação de nitritos e a atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GPx se encontram reduzidas no soro de gestantes com PE, enquanto a medida de TBARS e a carbonilação de proteínas não foi diferente das gestantes normotensas. Em plaquetas, o transporte de L-arginina pelo sistema y+L está diminuído na PE, ao passo que, a atividade da NOS, a formação de nitrito e a agregação plaquetária não modificaram em relação a gestação normal. A carbonilação de proteínas está aumentada em plaquetas na PE e a atividade da CAT está reduzida. Concluiu-se, que a menor formação de nitrito no soro sugere uma menor produção de NO em pacientes com PE. Este dado correlaciona com uma redução da defesa antioxidante observada pela menor atividade das enzimas SOD, CAT, GPx que deve contribuir para uma maior inativação do NO. Apesar dos níveis plasmáticos normais de L-arginina na PE, o sistema de transporte via y+L está reduzido em plaquetas, o que pode estar associado em parte ao estresse oxidativo que contribui para alterações físicas e estruturais da membrana, podendo afetar o influxo do aminoácido. Apesar do transporte de L-arginina reduzido e do aumento do estresse oxidativo em plaquetas na PE, não houve alteração da atividade da NOS, da produção de NO e da agregação plaquetária, indicando que mecanismos compensatórios possam estar contribuindo para a manutenção da produção de NO e de sua função modulatória sobre a agregação / Pre-eclampsia (PE) is a syndrome of pregnancy induced hypertension, currently understood as a systemic disease that leads to inflammation, coagulation, metabolic disorders, endothelial dysfunction and imbalance between vasoconstrictor and vasodilator agents. However, the pathophysiology of PE has not been fully elucidated. This study investigated in 51 women, oxidative stress and its correlation with the L-Arginine-nitric oxide and platelet aggregation in normal pregnancy (n = 27) and PE (n = 24). Serum and platelets of normotensive pregnant women and PE were used to measure thiobarbituric acid reactive species (TBARS), carbonyl proteins, the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) and nitric oxide (NO) production by the formation of nitrite. We also evaluated the transport of L-arginine, the activity of the nitric oxide synthase (NOS) and aggregation in platelets. Plasma samples were used to measure C-reactive protein highly sensitive (hsCRP) and the amino acid L-arginine. Our results demonstrate that there is no difference in the measurements of C-reactive protein and L-arginine at PE compared to normotensive pregnant women. The formation of nitrite and the activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and GPx are reduced in serum from women with PE, while the measure of TBARS and protein carbonyls were not different from normotensive pregnant women. In platelets, the transport of L-arginine by system y+L is reduced in PE, whereas the NOS activity, nitrite formation and platelet aggregation did not change compared to normal pregnancy. Carbonylation of proteins is increased in platelets in PE and CAT activity is reduced. In conclusion, the lower formation of nitrite in serum suggests a lower NO production in patients with PE. This finding correlates with a reduced antioxidant defense observed by the lower activity of SOD, CAT, GPx which might contribute to increased inactivation of NO. Despite normal plasma levels of L-arginine on PE, the transport system via y+L in platelets is reduced, which can be associated in part with oxidative stress that contributes to physical and structural changes of the membrane, which may affect the influx of amino acid. Despite of the reduced L-arginine transport and the increased oxidative stress in platelets from PE, no change occurs in NOS activity, NO production and platelet aggregation, indicating that compensatory mechanisms may be contributing to the maintenance of NO production and its modulatory role on aggregation

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T14:47:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_LuisGustavoRomani_D.pdf: 7008087 bytes, checksum: 909b9df6a6e3bfa7deab2ef94bb01541 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As células dendríticas (DCs) desempenham um papel central na iniciação de respostas de células T. Neste trabalho, investigamos os efeitos de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) sobre a resposta imune de camundongos BALB/c e DO11. 10. Observou-se que a modulação de BMDCs com LPS+TNF-? elevou a expressão de CD80, CD86 e CD40 e com IL-10+TGF-? aumentou a expressão de CD86 e CD40. BMDCs moduladas com LPS+TNF-? induziram a produção de citocinas TH1 e TH2 em TCD4+ de linfonodos mesentéricos (LNM) de todos os grupos de BALB/c e DO11. 10, bem como de células T reguladoras CD25+Foxp3+ (Tregs) em DO11. 10 e BALB/c imunizados por via i.p. A transferência adotiva de BMDCs moduladas com LPS+TNF-? aumentou a produção de anticorpos em camundongos BALB/c, bem como a proliferação e produção de IFN-? por células TCD4+ de DO11. 10. BMDCs moduladas com IL-10+TGF-? elevaram a proliferação, bem como a expansão de Tregs, em células TCD4+ de DO11. 10 e BALB/c imunizados, mas reduziu significativamente a produção de citocinas TH1 e TH2. A transferência adotiva de BMDCs moduladas com IL-10+TGF-? para camundongos BALB/c elevou a níveis de anti-OVA, mas não teve efeito sobre a proliferação de células TCD4+ de camundongos tolerizados ou imunizados. Em DO11. 10, a transferência de BMDCs moduladas com IL-10+TGF-? não alterou os níveis de anticorpos, mas reduziu a proliferação de células T esplênicas dos transgênicos imunizados, bem como a produção de IL-2 e INF-? nessas culturas. O tratamento de BMDCs com L-NAME elevou a expressão de CD80 e reduziu a de CD40, enquanto a NOHA elevou a expressão CD80 e CD86, mas reduziu CD40. BMDCs tratadas com L-NAME não alteraram a proliferação de células TCD4+ de BALB/c e DO11. 10, mas as BMDCs tratadas com NOHA reduziram a proliferação e produção de citocinas por células TCD4+ de ambas as linhagens. A expressão CD28 e CTLA-4 não se modificou em células TCD4+ de BALB/c e DO11. 10 co-cultivados com BMDCs moduladas com os inibidores. A freqüência de Tregs aumentou pelo cultivo de células TCD4+ de BALB/c imunizados com BMDCs moduladas ou não. A freqüência de Tregs foi mais elevada quando as células TCD4+ de camundongos DO11. 10 foram co-cultivadas com BMDCs não moduladas. A transferência adotiva de BMDCs moduladas com L-NAME para camundongos BALB/c elevou os níveis de anticorpos séricos, enquanto a de BMDCs moduladas com NOHA diminuiu a resposta proliferativa das células T esplênicas, mas não afetou a proliferação de células TCD4+ de LNM e nem a produção de citocinas TH1 e TH2. Em DO11. 10, a transferência adotiva de BMDCs modulada com os inibidores não teve efeito sobre os níveis de anticorpos, bem como sobre a proliferação e produção de citocinas in vitro por células T esplênicas e de LNM. Embora a administração de L-NAME e NOHA não tenha resultado em nenhuma alteração na expressão de CD80, CD86 e CD40 nas DCs esplênicas de ambos BALB/c e DO11. 10, notamos uma redução significativa da produção de anticorpos nesses animais, mas teve menos efeitos in vitro sobre a resposta proliferativa e produção de citocinas por células T esplênicas. / Abstract: Dendritic cells (DCs) play a central role in the initiation of T cell responses. In this study, we investigated the effects of dendritic cells derived from bone marrow (BMDC) on the immune response of BALB/c and DO11. 10. It was observed that the modulation of BMDCs with LPS+TNF-? increased the expression of CD80, CD86 and CD40 and IL-10 +TGF-? increased the expression of CD86 and CD40. BMDCs modulated with LPS+ TNF-? induced the production of TH1 and TH2 cytokines in CD4+ T cells of mesenteric lymph nodes (LNM) of all groups of BALB/c and DO11. 10, as well as regulatory T cells CD25+Foxp3+ (Tregs) in DO11.10 and BALB/c mice immunized by i.p. route. The adoptive transfer of BMDCs modulated with LPS+TNF-? increased the production of antibodies in BALB/c, as well as the proliferation and IFN-? production by T CD4+ cells from DO11. 10. BMDCs modulated with IL-10+TGF-? increased the proliferation and expansion of Tregs in TCD4+ cells from DO11.10 and BALB/c mice immunized, but significantly reduced the production of TH1 and TH2 cytokines. The adoptive transfer of BMDCs modulated IL-10+TGF-? to BALB/c mice increased the levels of anti-OVA, but had no effect on the proliferation of TCD4+ cells from mice tolerized or immunized. In DO11.10, the adoptive transfer of BMDCs modulated IL-10+TGF-? did not alter the levels of antibodies, but reduced the proliferation of splenic T cells of immunized transgenic mice, as well as the production of IL-2 and INF-? in these cultures. Treatment of BMDCs with L-NAME increased the expression of CD80 and reduced CD40, while treatment with NOHA increased the expression of CD80 and CD86, but reduced CD40. BMDCs treated with L-NAME did not alter the proliferation of TCD4+ cells from BALB/c and DO11.10, but BMDCs treated with NOHA reduced proliferation and cytokine production by TCD4+ cells from both strains. The expression CD28 and CTLA-4 did not change in TCD4+ cells from BALB/c and DO11.10 co-cultured with BMDCs modulated with inhibitors. The frequency of Tregs increased by the cultivation of TCD4+ cells from immunized BALB/c mice with BMDCs modulated or not. The frequency of Tregs was higher when the TCD4+ cells from DO11. 10 mice were co-cultured with BMDCs non modulated. The adoptive transfer of BMDCs modulated with L-NAME to BALB/c mice increased the serum antibody levels, whereas the BMDCs modulated with NOHA decreased the proliferative response of splenic T cells but did not affect the proliferation of TCD4+ cells of LNM and neither production of TH1 and TH2 cytokines. In DO11. 10, the adoptive transfer of BMDCs modulated with the inhibitors had no effect on antibody levels, as well as on the proliferation and cytokine production in vitro by T cells from spleen and LNM. Although the administration of L-NAME and NOHA has not resulted in change in the expression of CD80, CD86 and CD40 on splenic DCs from both BALB/c DO11. 10 led to a significant reduction in the production of antibodies in these animals, but had less effects in vitro on the proliferative response and cytokine production by splenic T cells. / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

No / Cortical spreading depression (CSD) is a transient disruption of local ionic homeostasis that may promote migraine attacks and the progression of stroke lesions. We reported previously that the local inhibition of nitric oxide (NO) synthesis with N¿-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) delayed markedly the initiation of the recovery of ionic homeostasis from CSD. Here we describe a novel method for selective, controlled generation of exogenous NO in a functioning brain region. It is based on microdialysis perfusion of the NO donor, 2-(N,N-diethylamino)-diazenolate-2-oxide (DEA/NO). As DEA/NO does not generate NO at alkaline pH, and as the brain has a strong acid-base buffering capacity, DEA/NO was perfused in a medium adjusted at alkaline (but unbuffered) pH. Without DEA/NO, such a microdialysis perfusion medium did not alter CSD. DEA/NO (1, 10 and 100 ¿M) had little effect on CSD by itself, but it reversed in a concentration-dependent manner the effects of NOS inhibition by 1 mM L-NAME. These data demonstrate that increased formation of endogenous NO associated with CSD is critical for subsequent, rapid recovery of cellular ionic homeostasis. In this case, the molecular targets for NO may be located either on brain cells to suppress mechanisms directly involved in CSD genesis, or on local blood vessels to couple flow to the increased energy demand associated with CSD