Le cycle cellulaire est hautement régulé par la phosphorylation réversible de plusieurs effecteurs. La kinase dépendante des cyclines Cdk1 déclenche la mitose en induisant le bris de l’enveloppe nucléaire, la condensation des chromosomes et la formation du fuseau mitotique. Chez les animaux métazoaires, ces évènements sont contrés par la protéine phosphatase PP2A-B55, qui déphosphoryle plusieurs substrats de Cdk1. La kinase Greatwall (Gwl) est activée par le complexe cycline B-Cdk1 en début de mitose et induit ensuite l’inhibition de PP2A-B55 via Endos/Arpp19. Toutefois, les mécanismes moléculaires qui régulent Gwl sont encore peu connus. Nous avons montré que Gwl a une activité s’opposant à PP2A-B55, qui collabore avec la kinase Polo pour assurer l’attachement du centrosome au noyau et la progression du cycle cellulaire dans le syncytium de l’embryon de la drosophile. Ensuite, nous avons trouvé dans des cellules de drosophile que Gwl est localisée au noyau pendant l’interphase, mais qu’elle se relocalise au cytoplasme dès la prophase, avant le bris de l’enveloppe nucléaire. Nous avons montré que cette translocation de Gwl est cruciale pour sa fonction et qu’elle dépend de la phosphorylation de plusieurs résidus de la région centrale de Gwl par les kinases Polo et Cdk1. Cette région centrale contient également deux séquences de localisation nucléaire (respectivement NLS1 et NLS2). De plus, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de Gwl par la kinase Polo promeut sa liaison avec la protéine 14-3-3ε, ce qui favorise la rétention cytoplasmique de Gwl. Le rôle de Cdk1 dans cette translocation reste quant à lui inconnu. De plus, nous avons montré que le complexe cycline B-Cdk1 entre dans le noyau avant que Gwl ne soit transportée dans le cytoplasme. Cdk1 pourrait donc activer Gwl et phosphoryler ses substrats nucléaires, à l’abri de PP2A-B55 qui est largement cytoplasmique. Gwl est ensuite exclue du noyau et relocalisée dans le cytoplasme afin d’induire l’inhibition de PP2A-B55. Cela permet de synchroniser les événements de phosphorylation se produisant dans le noyau et dans le cytoplasme. Fait intéressant, un mécanisme de régulation de la localisation de Gwl similaire à cela a été découvert chez l’humain et chez la levure, suggérant que ce mécanisme est conservé entre différentes espèces. / Reversible phosphorylation of proteins, triggered by cyclically activated kinases and phosphatases, is a key mechanism to control cell cycle progression. CyclinB-Cdk1 is a crucial kinase phosphorylating a large number of substrates to trigger mitotic entry. However, in metazoans, it is counteracted mainly by a Protein Phosphatase 2A carrying the B55 regulatory subunit (PP2A-B55). On the other hand, the Greatwall (Gwl) kinase is activated by CyclinB-Cdk1 upon mitotic entry and subsequently induces the inhibition of PP2A-B55 by Endos/Arpp19, thus promoting mitotic entry and maintenance. Nonetheless, the regulatory mechanisms of Gwl are less clear. We demonstrated that in Drosophila syncytial embryos, PP2A-B55 is negatively regulated by Gwl, but collaborates with Polo kinase to ensure both nucleus attachment of centrosome and faithful cell cycle progression. Later, we discovered that in Drosophila, the subcellular localization of Gwl changes dramatically throughout the cell cycle. Gwl is nuclear in interphase but suddenly becomes mostly cytoplasmic in prophase before nuclear envelope breakdown. Such translocation is important for Gwl’s function and requires the phosphorylation of Gwl by both Polo kinase and Cdk1 in the region containing two Nuclear Localization Signals (NLSs). Phosphorylation of Gwl by Polo likely promotes its association with14-3-3ε thereby promoting Gwl cytoplasmic retention, whereas Cdk1’s role in this translocation remains elusive. Moreover, I found that most cyclin B is imported into the nucleus before Gwl translocates to the cytoplasm. Therefore, Cdk1 can activate Gwl and phosphorylate its nuclear substrates without the perturbation of PP2A-B55 which is largely cytoplasmic. Subsequently, Gwl translocates into cytoplasm to mediate the inhibition of PP2A-B55 so that the phosphorylation events can be synchronized between the nucleus and the cytoplasm. Interestingly, similar spatial regulation of Gwl was also uncovered in mammal cells and in yeast, implying a conserved regulatory mechanism across species.

La mitose est une phase importante du cycle cellulaire. Les mécanismes de surveillance s'assurent de l'ordre et de l'exécution correcte des événements du cycle cellulaire dont les erreurs peuvent conduire à l'aneuploïdie. Pendant la mitose, la séparation des chromatides sœurs est régulée par le point de contrôle du fuseau mitotique qui s'assure que tous les chromosomes sont correctement alignés sur la plaque métaphasique. L'entrée et la sortie de mitose sont régulées par l'activation et l'inactivation du complexe cycline B/Cdk1. Cette fine régulation fait intervenir de nombreuses kinases et phosphatases. Dans ce projet nous nous sommes intéressés plus particulièrement à deux AGC kinases : RSK2 et Greatwall (Gwl).Au cours de cette étude nous nous sommes proposés d'analyser l'implication de RSK2, substrat majeur de la MAPK, dans le point de contrôle du fuseau mitotique. Nos résultats montrent que RSK2 est essentielle pour l'activité du point de contrôle du fuseau mitotique dans les extraits d'œufs de xénope ainsi que pour la localisation des autres protéines de ce mécanisme de surveillance localisées aux kinétochores. Nous montrons également que RSK2 participe au point de contrôle dans les cellules humaines. En effet, RSK2 est nécessaire à la localisation aux kinétochores de Mad1, Mad2 et Cenp-E, protéines essentielles à l'activité de ce checkpoint. L'entrée et la sortie de mitose sont régulées par le complexe cycline B/Cdk1 et des phosphatases. Gwl est une nouvelle kinase essentielle à l'entrée en mitose et au maintien de l'état mitotique dans les extraits d'œufs de xénope. En effet, nos résultats montrent que Gwl maintient l'état mitotique indépendamment du complexe cycline B/Cdk1, en régulant négativement PP2A, une phosphatase responsable de la déphoshorylation des substrats mitotiques. / Mitosis is an important phase of cell cycle. The Spindle Assembly Checkpoint (SAC) verifies the orders and the events correct execution of the cell cycle, as errors may lead to aneuploidy. During the mitosis, the checkpoint delays the anaphase onset until all chromosomes are correctly attached to the spindle‘s microtubules. Entry and Exit of mitosis are regulated by the activation and inactivation of cyclin B/Cdk1. A lot of kinases and phosphatases are involved in this fine regulation. In this project, we are particularly focusing on two AGC kinases: RSK2 and Greatwall (Gwl).In this study, we analyzed RSK2, a major substrates of MAPK, involvement in SAC. Our results show that RSK2 is essential to the activation of SAC in xenopus egg extracts and for the localization at the kinétochores of the others SAC components. We also show that RSK2 participate in the maintenance of the SAC in human cells. Indeed, RSK2 is necessary for Mad1, Mad2 and Cenp-E localization, essential proteins for SAC activation.Entry and exit of mitosis are regulated by cyclin B/Cdk1 complex and phosphatases. Gwl is a new kinase essential to the entry into mitosis and maintenance of the mitotic state in xenopus egg extracts. Indeed, our results showed that Gwl maintains the mitotic state independently of cyclin B/Cdk1 but with the negative regulation of PP2A, which dephosphorylate the mitotic substrates

Quelques évidences suggèrent que Bcl-xL, un membre anti-apoptotique de la famille Bcl-2, possède également des fonctions au niveau du cycle cellulaire et de ses points-contrôle. Pour étudier la régulation et fonction de Bcl-xL au cours du cycle cellulaire, nous avons généré et exprimé dans des cellules humaines une série de mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser49Ala, Ser56Ala, Ser62Ala et Thr115Ala. L'analyse de cette série de mutants révèle que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser62Ala) sont moins stables au point-contrôle G2 du cycle cellulaire comparées aux cellules exprimant le type sauvage ou les autres mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala et Thr115Ala. Les études de cinétiques de phosphorylation et de localisation de phospho-Bcl-xL(Ser62) dans des cellules synchronisées et suite à l'activation du point-contrôle en G2 médié par l'étoposide (VP16), nous indiquent que phospho-Bcl-xL(Ser62) migre dans les corps nucléolaires durant l'arrêt en G2 dans les cellules exposées au VP16. Une série d'expériences incluant des essais kinase in vitro, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et d'ARN interférant, nous révèlent que Polo kinase 1 (PLK1) et MAPK9/JNK2 sont les protéines kinase impliquées dans la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62), et pour son accumulation dans les corps nucléolaires pendant le point-contrôle en G2. Nos résultats indiquent que durant le point-contrôle en G2, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie et se co-localise avec CDK1(CDC2), le complexe cycline-kinase qui contrôle l'entrée en mitose. Nos résultats suggèrent que dans les corps nucléolaires, phospho-Bcl-xL(Ser62) stabilise l'arrêt en G2 en séquestrant CDK1(CDC2) pour retarder l'entrée en mitose. Ces résultats soulignent également que les dommages à l'ADN influencent la composition des corps nucléolaires, structure nucléaire qui émerge maintenant comme une composante importante de la réponse aux dommages à l'ADN. Dans une deuxième étude, nous décrivons que les cellules exprimant le mutant de phosphorylation Bcl-xL(Ser62Ala) sont également plus stables au point-contrôle de l'assemblage du fuseau de la chromatine (SAC) suite à une exposition au taxol, comparées aux cellules exprimant le type sauvage ou d'autres mutants de phosphorylation de Bcl-xL, incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala. Cet effet est indépendent de la fonction anti-apoptotique de Bcl-xL. Bcl-xL(Ser62) est fortement phosphorylé par PLK1 et MAPK14/SAPKp38α à la prométaphase, la métaphase et à la frontière de l'anaphase, et déphosphorylé à la télophase et la cytokinèse. Phospho-Bcl-xL(Ser62) se trouve dans les centrosomes avec γ-tubuline, le long du fuseau mitotique avec la protéine moteure dynéine et dans le cytosol mitotique avec des composantes du SAC. Dans des cellules exposées au taxol, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie au complexe inhibiteur CDC20/MAD2/BUBR1/BUB3, alors que le mutant Bcl-xL(Ser62Ala) ne se lie pas à ce complexe. Ces résultats indiquent que durant le SAC, la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62) accélère la résolution du SAC et l'entrée des cellules en anaphase. Des expériences bloquant l'expression de Bcl-xL révèlent ègalement un taux très élevé de cellules tétraploïdes et binuclées après un traitement au nocodazole, consistant avec une fonction de Bcl-xL durant la mitose et dans la stabilité génomique. Dans la troisième étude, l'analyse fonctionnelle de cette série de mutants de phosphorylation indique également que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser49Ala) sont moins stables durant le point-contrôle G2 et entre en cytokinèse plus lentement dans des cellules exposées aux inhibiteurs de la polymérisation/dépolymérisation des tubulines, composantes des microtubules. Ces effets de Bcl-xL(Ser49Ala) sont indépendents de sa fonction anti-apoptotique. La phosphorylation de Bcl-xL(Ser49) est dynamique au cours du cycle cellulaire. Dans des cellules synchronisées, Bcl-xL(Ser49) est phosphorylé en phase S et G2, déphosphorylé à la prométaphase, la métaphase et à la frontière de l'anaphase, et re-phosphorylé durant la télophase et la cytokinèse. Au cours du point-contrôle G2 induit par les dommages à l'ADN, un pool important de phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve aux centrosomes, un site important pour la régulation de l'entrée en mitose. Durant la télophase et la cytokinèse, phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve le long des microtubules avec la protéine moteure dynéine et dans le cytosol mitotique. Finalement, nos résultats suggèrent que PLK3 est responsable de la phosphorylation de Bcl-xL(Ser49), une protéine kinase impliquée pour l'entrée des cellules en mitose et pour la progression de la mitose jusqu'à la division cellulaire. / Accumulating evidence suggest that Bcl-xL, an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family, also functions in cell cycle progression and cell cycle checkpoints. To further understand Bcl-xL regulation and function in cell cycle progression, we first expressed a series of single-point Bcl-xL cDNA phospho-mutants, including Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser49Ala, Ser56Ala, Ser62Ala and Thr115Ala in human cancer cell lines and investigated their impact on cell cycle progression. Analysis of this series of phosphorylation mutants reveals that cells expressing Bcl-xL(Ser62Ala) mutant are less stable at the G2 checkpoint and enter mitosis more rapidly than cells expressing wild type Bcl-xL or Bcl-xL phosphorylation mutants, including Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala and Thr115Ala. Dynamic phosphorylation and location studies on phospho-Bcl-xL(Ser62) in unperturbed, synchronized cells and during DNA damage-induced G2 arrest revealed that phospho-Bcl-xL(Ser62) translocates into nucleolar structures in VP16-exposed cells during G2 arrest. Using in vitro kinase assays, pharmacological inhibitors and specific siRNAs experiments, we found that Polo kinase 1 and MAPK9/JNK2 are major protein kinases involved in Bcl-xL(Ser62) phosphorylation and accumulation into nucleolar structures during the G2 checkpoint. In nucleoli, phospho-Bcl-xL(Ser62) binds to and co-localizes with CDK1(CDC2), the key cyclin-dependent kinase required for entry into mitosis. These data indicate that, during G2 checkpoint, phospho-Bcl-xL(Ser62) stabilizes G2 arrest by timely trapping CDK1(CDC2) in nucleolar structures to slow mitotic entry. It also highlights that DNA damage affects the dynamic composition of the nucleolus, which now emerges as a key event in the DNA damage response. In a second study, we describe that cells expressing Bcl-xL(Ser62Ala) are also more stable at a sustained spindle-assembly checkpoint (SAC) after exposure to taxol than cells expressing wild-type Bcl-xL or other mutants, an effect that appears to be independent of its anti-apoptotic activity. Bcl-xL(Ser62) is strongly phosphorylated by PLK1 and MAPK14/SAPKp38α at prometaphase, metaphase and the anaphase boundary, while it is dephosphorylated at telophase and cytokinesis. Phospho-Bcl-xL(Ser62) localizes in centrosomes with γ-tubulin, along the mitotic spindle with dynein motor protein and in cytosol with SAC signaling components. In taxol-exposed cells, phospho-Bcl-xL(Ser62) binds to the CDC20/MAD2/BUBR1/BUB3 complex, while Bcl-xL(Ser62Ala) does not. The data indicate that during SAC, Bcl-xL(Ser62) phosphorylation accelerates SAC resolution and cell entry into anaphase, even in the presence of unattached or misaligned chromosomes. Silencing Bcl-xL expression also leads nocodazole-exposed cells to tetraploidy and binucleation, consistent with a Bcl-xL function in SAC and genomic stability. In the third study, the functional analysis of a Bcl-xL phosphorylation mutant series has revealed that cells expressing Bcl-xL(Ser49Ala) mutant are less stable at G2 checkpoint after DNA damage and enter cytokinesis much more slowly after microtubule poisoning than cells expressing wild-type Bcl-xL. These effects of Bcl-xL(Ser49Ala) mutant seem to be distinct from Bcl-xL function in apoptosis. Bcl-xL(Ser49) phosphorylation is cell cycle-dependent. In synchronized cells, phospho-Bcl-xL(Ser49) appears during the S phase and G2, whereas it disappears rapidly in early mitosis during prometaphase, metaphase and early anaphase, and re-appears during telophase and cytokinesis. During DNA damage-induced G2 arrest, an important pool of phospho-Bcl-xL(Ser49) accumulates in centrosomes which act as essential decision centers for progression from G2 to mitosis. During telophase/cytokinesis, phospho-Bcl-xL(Ser49) is found along microtubules and at midbody with dynein motor protein. In a series of in vitro kinase assays, specific small interfering RNA and pharmacological inhibition experiments, polo kinase 3 (PLK3) was implicated in Bcl-xL(Ser49) phosphorylation. These data indicate that during G2 checkpoint phospho-Bcl-xL(Ser49) is another downstream target of PLK3, acting to stabilize G2 arrest. Bcl-xL phosphorylation at Ser49 also correlates with essential PLK3 activity and function, enabling cytokinesis and mitotic exit.

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires qui composent une grande partie du phytoplancton et qui jouent un rôle important au niveau de la photosynthèse, de la production primaire et de la conservation des écosystèmes marins. Les dinoflagellés se distinguent des autres eucaryotes par leur biologie et leur organisation nucléaire unique. Lors de la mitose, leur membrane nucléaire demeure intacte et la ségrégation des chromosomes se fait à partir de fuseaux mitotiques formés dans le cytoplasme et qui traversent le noyau au travers de canaux spécialisés Aussi, leurs chromosomes sont condensés en permanence et le processus utilisé pour y arriver est encore très mal compris puisque les dinoflagellés ne possèdent aucunes histones détectables. Lingulodinium polyedrum est un dinoflagellé photosynthétique marin utilisé comme organisme modèle en ce qui concerne l’étude des rythmes circadiens (bioluminescence, migration verticale, mitose et photosynthèse). La découverte et l’étude des éléments régulateurs du cycle cellulaire peuvent nous amener à comprendre le mécanisme, l’influence et la portée du contrôle circadien sur le cycle cellulaire. De plus, l’étude du cycle cellulaire pourrait permettre de révéler des indices quant aux caractéristiques singulières des dinoflagellés qui sont pour le moment énigmatiques. Par le passé, une étude chez Lingulodinium polyedrum a permis d’identifier la cycline impliquée dans la mitose, LpCyc1, le premier régulateur du cycle cellulaire a être découvert chez les dinoflagellés. La présente étude s’attarde sur la caractérisation de la LpCyc1, soit son expression, sa localisation, sa phosphorylation. Ces trois éléments concordent de façon à synchroniser l’activité de la LpCyc1 (et ainsi la mitose) de façon circadienne. Cette étude présente aussi la création et le développement d’un outil majeur pour l’étude future de Lingulodinium polyedrum, le transcriptome des ARNm à partir d’un iv séquençage Illumina. C’est d’ailleurs avec cet outil que nous avons découvert la CDK responsable du contrôle de la phase M, LpCdk1. Cette CDK possède tous les domaines d’une CDK classique, un site de liaison des substrats, un site de liaison à l’ATP, une boucle activatrice, et une interface de liaison avec la cycline. Le transcriptome de Lingulodinium polyedrum a aussi permis de recenser toutes les protéines conservées normalement retrouvées dans le contrôle du cycle cellulaire, qui nous a permis de faire une ébauche préliminaire du cycle cellulaire de L. polyedrum. Cette analyse est une première chez Lingulodinium polyedrum et peut s’étendre pour l’étude d’une multitude d’autres processus métaboliques. / Dinoflagellates are unicellular eukaryotes that constitute a large part of the phytoplankton. They are major contributors to the global photosynthesis and primary production and they possess an important role in conservation of marine ecosystems. Dinoflagellates are distincted from other eukaryotes by their unique biology and nuclear organization. During mitosis, their nuclear envelope stays intact and chromosome segregation is done by a mitotic spindle that passed through the nucleus inside several specialized cytoplasmic channels. In addition, the chromosomes are permanently condensed and are not thought to have histones. Lingulodinium polyedrum is a marine photosynthetic dinoflagellate widely used to study the control mechanisms of circadian rhythms, because many aspects of its physiology (bioluminescence, mitosis, photosynthesis and vertical migration) are circadian. The discovery of cell cycle regulators is essential for understanding the mechanism and the circadian control over the cell cycle. A previously study identified the M-phase cyclin, LpCyc1, the first dinoflagellate cell cycle regulator to be discovered. The present study presents the characterization of the LpCyc1, with respect to expression levels and phosphorylation patterns. These elements act together to ensure the synchronization of the LpCyc1 activity (and the mitosis) within the day. This study also presents the creation and the development of the transcriptome, a major tool for the upcoming studies of Lingulodinium polyedrum. With this tool, we identified the Lingulodinium polyedrum M-CDK, LpCdk1. The LpCdk1 has all the domains of a classic M-CDK, a substrate binding site, an ATP binding site, an activation loop and a cyclin binding interface. vi With the Lingulodinium polyedrum transcriptome, we also made a census of all the conserved proteins normally found in the cell cycle control of yeast. The identification of these proteins had provided a rough shape of L. polyedrum cell cycle. This kind of analysis is the first to be made with Lingulodinium polyedrum and could be expanded to other metabolic processes.

Une caractéristique intéressante de la protéine Bcl-xL est la présence d'un domaine en boucle non-structurée entre les hélices α1 and α2 de la protéine. Ce domaine protéique n'est pas essentiel pour sa fonction anti-apoptotique et absent chez CED-9, la protéine orthologue chez Caenorhabditis elegans. A l'intérieur de ce domaine, Bcl-xL subit une phosphorylation et déphosphorylation dynamique sur les résidus Ser49 et Ser62 en phase G2 du cycle cellulaire et lors de la mitose. Lorsque ces résidus sont mutés et les protéines exprimées dans des cellules cancéreuses, les cellules démontrent plusieurs défauts mitotiques liés à l'instabilité chromosomique. Pour analyser les effets de Bcl-xL Ser49 et Ser62 dans les cellules normales, les présentes études ont été réalisées dans des cellules diploïdes humaines normales, et in vivo chez Caenorhabditis elegans. Dans une première étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cellules fibroblastiques diploïdes humaines normales BJ, exprimant Bcl-xL (type sauvage), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) et les double (S49/62A) et (S49/62D) mutants. Les cellules exprimant les mutants de phosphorylation ont montré des cinétiques de doublement de la population cellulaire réduites. Ces effets sur la cinétique de doublement de la population cellulaire corrèle avec l'apparition de la sénescence cellulaire, sans impact sur les taux de mort cellulaire. Ces cellules sénescentes affichent des phénotypes typiques de sénescence associés notamment à haut niveau de l'activité β-galactosidase associée à la sénescence, la sécrétion d' interleukine-6, l'activation de p53 et de p21WAF1/ Cip1, un inhibiteur des complexes kinase cycline-dépendant, ainsi que la formation de foyers de chromatine nucléaire associés à γH2A.X. Les analyses de fluorescence par hybridation in situ et des caryotypes par coloration au Giemsa ont révélé que l'expression des mutants de phosphorylation de Bcl-xL provoquent de l'instabilité chromosomique et l'aneuploïdie. Ces résultats suggèrent que les cycles de phosphorylation et déphosphorylation dynamiques de Bcl-xL Ser49 et Ser62 sont importants dans le maintien de l'intégrité des chromosomes lors de la mitose dans les cellules normales. Dans une deuxième étude, nous avons entrepris des expériences chez Caenorhabditis elegans pour comprendre l'importance des résidus Ser49 et Ser62 de Bcl-xL in vivo. Les vers transgéniques portant les mutations de Bcl-xL (S49A, S62A, S49D, S62D et S49/62A) ont été générés et leurs effets ont été analysés sur les cellules germinales des jeunes vers adultes. Les vers portant les mutations de Bcl-xL ont montré une diminution de ponte et d'éclosion des oeufs, des variations de la longueur de leurs régions mitotiques et des zones de transition, des anomalies chromosomiques à leur stade de diplotène, et une augmentation de l'apoptose des cellules germinales. Certaines de ces souches transgéniques, en particulier les variants Ser/Ala, ont également montré des variations de durée de vie par rapport aux vers témoins. Ces observations in vivo ont confirmé l'importance de Ser49 et Ser62 à l'intérieur du domaine à boucle de Bcl-xL pour le maintien de la stabilité chromosomique. Ces études auront une incidence sur les futures stratégies visant à développer et à identifier des composés qui pourraient cibler non seulement le domaine anti-apoptotique de la protéine Bcl-xL, mais aussi son domaine mitotique pour la thérapie du cancer. / An interesting feature of Bcl-xL protein is the presence of an unstructured loop domain between its α1 and α2 helices, a domain not essential for its anti-apoptotic function and absent in CED-9, ortholog protein in Caenorhabditis elegans. Within this domain, Bcl-xL undergoes dynamic phosphorylation and dephosphorylation at Ser49 and Ser62 during G2 and mitosis in human cancer cells. When these residues are mutated and proteins expressed in cancer cells, cells harbor mitotic defects, including chromosome mis-attachment, lagging, bridging and mis-segregation, events associated with chromosome instability and aneuploidy. To further analyze the effects of Bcl-xL Ser49 and Ser62 in normal cells, the present studies were performed in normal human diploid cells, and in vivo in Caenorhabditis elegans. First, we studied normal human diploid BJ foreskin fibroblast cells expressing Bcl-xL(wild type), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) and the dual (S49/62A) and (S49/62D) mutants. Cells expressing S49 and/or S62 phosphorylation mutants showed reduced kinetics of cell population doubling. These effects on cell population doubling kinetics correlated with early outbreak of senescence with no impact on the cell death rate. Senescent cells displayed typical senescence-associated phenotypes including high-level of senescence-associated β-galactosidase activity, interleukin-6 secretion, tumor suppressor p53 and cyclin-dependent kinase inhibitor p21Waf1/Cip1 activation as well as γH2A.X-associated nuclear chromatin foci. Fluorescence in situ hybridization analysis and Giemsa-banded karyotypes revealed that the expression of Bcl-xL phosphorylation mutants in normal diploid BJ cells provoked chromosome instability and aneuploidy. These findings suggest that dynamic Bcl-xL Ser49 and Ser62 phosphorylation/ dephosphorylation cycles are important in the maintenance of chromosome integrity during mitosis in normal cells. Second, we undertook experiments in Caenorhabditis elegans to understand the importance of Bcl-xL Ser49 and Ser62 in vivo. Transgenic worms carrying single-site S49A, S62A, S49D, S62D and dual-site S49/62A mutants were generated and their effects were analyzed in germlines of young adult worms. Worms expressing Bcl-xL variants showed decreased egg-laying and hatching, variations in the length of their mitotic regions and transition zones, chromosomal abnormalities at their diplotene stages, and increased germline apoptosis. Some of these transgenic strains, particularly the Ser to Ala variants, also showed slight modulations of lifespan compared to their controls. The in vivo observations confirmed the importance of Ser49 and Ser62 within the loop domain of Bcl-xL in maintaining chromosome stability. These studies could impact future strategies aiming to develop and identify compounds that could target not only the anti-apoptotic domain of Bcl-xL protein, but also its mitotic domain for cancer therapy.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative héréditaire autosomique dominante. Elle résulte d’une expansion anormale de glutamines (polyQ) dans la partie N-terminale de la protéine huntingtine (HTT ; codé par HTT). La MH est caractérisée par la dysfonction et la mort de cellules neuronales dans le cerveau, entraînant l’apparition de symptômes cognitifs, psychiatriques et moteurs, dévastateurs chez les patients. De nombreuses études sur des modèles animaux et cellulaires montrent que l’expansion polyQ dans la protéine mutante conduit à un gain de nouvelles fonctions toxiques, ainsi qu’à la perte de fonctions neuroprotectives de la protéine sauvage. Pendant ma thèse, je me suis intéressée à la description et à la validation fonctionnelle d’un nouvel outil pour étudier la HTT : pARIS-htt. pARIS-htt est un gène synthétique construit pour faciliter le clonage et le marquage de la protéine HTT totale. En utilisant différentes approches cellulaires, nous avons montré que pARIS-htt peut remplacer le rôle de la HTT endogène dans le transport de vésicules du Golgi ainsi que du brain derived neurotrophic factor (BDNF). La version mutante de pARIS-htt ne peut pas restaurer cette fonction. Parallèlement, nous avons généré deux variants de pARIS-htt avec soit une délétion dans la région d’interaction de la HTT avec la dynéine, moteur moléculaire se dirigeant vers l'extrémité négative des microtubules, soit avec la huntingtin associated protein 1 (HAP1), l’un de ses interacteurs. Dans les expériences de remplacement du gène, aucun des deux mutants n’a restauré le transport vésiculaire.Un autre aspect de ma thèse a été d’étudier le rôle de la HTT au cours de la mitose. Nous avons mis en évidence l’importance de la HTT dans le contrôle de l’orientation du fuseau. Cette fonction est perdue lorque la HTT est mutée, mais restaurée lorsque celle-ci est phosphorylée par Akt à la sérine 421. Le contrôle de l’orientation du fuseau est particulièrement important durant la neurogénèse puisque cette orientation ainsi que le mode de division sont impliqués dans la détermination des devenirs cellulaires. Cette fonction de la HTT est conservée chez la D. melanogaster.Cette étude a donc permis de mieux comprendre les fonctions de la HTT, et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la MH. / Huntington disease (HD) is an autosomal-dominant neurodegenerative disorder caused by the pathogenic expansion of the poly-glutamine (polyQ) N-terminal stretch in the huntingtin protein (HTT; encoded by HTT). HD is characterized by the dysfunction and death of neurons in the brain, leading to devastating cognitive, psychiatric, and motor symptoms in patients. Studies in multiple cell and animal model systems support the notion that polyQ expansion in mutant HTT leads to the gain of new toxic functions and loss of the neuroprotective functions of the wild-type HTT. During my thesis, I focused on the description and functional validation of a new tool to study HTT: pARIS-htt. pARIS-htt is a synthetic gene built to facilitate cloning and tagging of full-length HTT. Using different cellular approaches, we showed that pARIS-htt can replace endogenous HTT in the transport of Golgi and brain derived neurotrophic factor (BDNF) containing vesicles. pARIS-htt mutant version could not restore vesicular transport when endogenous HTT was knocked-down. Moreover, we generated pARIS-htt deletion mutants for HTT interaction domain with dynein, a minus-end directed motor protein, and huntingtin associated protein 1 (HAP1), a HTT interactor. Both deletion mutants failed to restore vesicular transport in gene replacement assays. Another aspect of my thesis was the study of HTT during mitosis. We showed that HTT monitors spindle orientation though its interaction with diverse proteins involved in cell division. This function is lost when HTT is mutated and can be reverted by Akt phosphorylation at serine 421. The control of spindle orientation is particularly important during neurogenesis since spindle orientation and the mode of division of apical progenitors are implicated in the determination of cell fate. This function of HTT is conserved in D. melanogaster. This study contributes to the understanding of HTT functions and suggests new therapeutical approaches to treat HD.

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Les agents permettant de créer des dommages sur l'ADN sont principalement utilisés dans les traitements contre le cancer. L'activation de points de contrôle du cycle cellulaire après lésion de l'ADN entraîne un arrêt du cycle des cellules. De la connaissance des mécanismes moléculaires de l'arrêt du cycle cellulaire par ces points de contrôle dépend l'efficacité du traitement. Dans les cellules humaines, ces points de contrôle sont primordiaux puisque leur inactivation entraîne la carcinogenèse (génération de cancers). Après traitement par des agents chimiothérapiques et des rayons X, les cellules s'arrêtent en phase G-1 et G-2/Mitose (M) du cycle cellulaire. Si de nombreuses études ont permis de clarifier les mécanismes de l'arrêt en phase G-1 pour des cellules dont l'ADN est endommagé, peu de données sont disponibles concernant l'arrêt en phase G-2/M. Parmi ces points de contrôle, le point de contrôle G-2/M est particulièrement important car il prévient l'entrée en mitose (phase M) des cellules dont l'ADN est endommagé. <br /> Nous avons analysé le rôle du complex appelé APC (Anaphase-Promoting Complex) dans les points de contrôle G-2/M après lésion de l'ADN. Les lésions de l'ADN sont induites dans les cellules synchronisées en phase S. Suite à ces dommages, les cellules montrent un retard et s'arrêtent en phase G-2 avec 4N chromosomes. Afin d'identifier les bases biochimiques de l'arrêt en G-2/M après traitement avec des agents endommageant l'ADN, nous allons concentrer notre recherche sur un complexe composé de multiples protéines possédant une activité de ligation de l'ubiquitine de type E3 (ubiquitin-ligase E3). Ce complexe APC est necessaire pour la dégradation des inhibiteurs d'entrée en anaphase, cyclins mitotiques, et plusieurs kinases mitotiques pour la complétion de la sortie de la mitose. Nous avons analysé et déterminé que l'absence d'activité du complexe APC inhibe l'activation du point de contrôle G-2/M lors de dommages de l'ADN.

Les eucaryotes se divisent selon une série d'étapes régulées finement appelée le cycle cellulaire. Ce cycle cellulaire permet la réplication exacte du génome et sa distribution entre deux cellules filles identiques. Le cycle cellulaire est contrôlé par de nombreux mécanismes qui garantissent l'intégrité du génome. La mitose est la période du cycle cellulaire pendant laquelle le contenu en ADN des cellules est réparti entre les deux cellules filles. Le bon déroulement de la mitose chez les eucaryotes supérieurs est soumis à un point de contrôle dit point de contrôle du fuseau mitotique. L'activité du point de contrôle permet de retarder l'anaphase jusqu'à ce que toutes les conditions requises pour la ségrégation des chromosomes soient présentes. Malgré cela, les cellules peuvent présenter des anomalies de la ségrégation des chromosomes et devenir aneuploïdes. Ceci est fréquemment le cas dans les cellules cancéreuses.<br />Dans cette étude, nous avons mis en évidence l'existence d'une réponse cellulaire survenant dans la phase G1 qui suit une mitose anormale. Nous avons étudié des cellules primaires de mammifères traitées avec de faibles concentrations d'inhibiteurs des microtubules, la vinblastine et le nocodazole. Les cellules ainsi traitées présentent des défauts de ségrégation pendant la mitose et deviennent aneuploïdes. Les cellules résultant de ces mitoses anormales s'arrêtent dans la phase G1 qui suit la division et deviennent sénescentes. Nous avons trouvé que les cellules de mammifères transformées par l'antigène grand T de SV40 n'observent pas d'arrêt après une mitose anormale.

Nous avons utilisé une technique récente de mesure d'élasticité de chromosomes mitotiques assemblés in vitro de Xénope et mis au point une technique de fonctionnalisation par anticorps de micropipettes. Nous avons confirmé que le chromosome mitotique n'était pas un objet homogène. Il est constitué de deux parties bien distinctes : une gaine molle de chromatine et une structure rigide. Nous avons identifié les protéines SMC comme actrices de ces structures rigides. Nous avons aussi montré que l'ADN et les protéines sont nécessaires au maintien de l'organisation des chromosomes alors que l'ARN ne l'est pas. Nous avons aussi étudié le paysage énergétique du chromosome, ce qui n'avait jamais été réalisé sur un objet aussi complexe. Nous proposons un modèle dynamique de formation des chromosomes dans lequel les protéines SMC agissent comme médiatrices de la forme en bâtonnet des chromosomes mitotiques et dans lequel les ions Mg++ et Ca++ jouent le rôle d'agents de