Les Benzo[e]pyridoindoles sont identifiés comme inhibiteurs des kinases Aurora. La molécule la plus active, C1, inhibe efficacement à la fois Aurora B et CHK2. Nous avons donc exploité cette potentialité dans des applications de traitements combinés en se basant sur la spécificité restreinte mais multiple de cet inhibiteur. Nous avons mis en place le traitement combiné (Etoposide et C1) sur des lignées cellulaires et des effets additifs pour H358 et synergiques pour U2OS et HL60 sont notés. Ce traitement empêche efficacement la croissance des sphéroides et l'expansion des xénogreffes cellulaires. Un des avantages majeur de cette combinaison est la diminution des doses d'agents de dommages à l'ADN. C1 ouvre une piste pharmacologique basée sur l'altération simultanée de la mitose et de la réparation. La famille des benzo[e]pyridoindoles possède une forme penta-hétérocyclique avec 3 chaines latérales dont les variations peuvent influencer l'activité inhibitrice. Nous avons donc mesuré l'activité antimitotique de différents benzo[e]pyridoindoles. Cette étude structure/fonction permet de définir la contribution des chaînes latérales dans l'activité inhibitrice et d'orienter les futures synthèses. Nous nous sommes également intéressés au composé C4 qui avait un profil atypique d'inhibition de phosphorylation de l'histone H3. Il inhibe cette phosphorylation uniquement en entrée de mitose. Nous avons ainsi pu montrer que la phosphorylation de l'histone H3 n'est pas nécessaire à l'assemblage des chromosomes. Enfin, nous avons caractérisé l'efficacité de la molécule C21, un composé à forte activité anti-proliférative, sur différents modèles cellulaires et animaux. Ce travail révèle les potentialités multiples des benzo[e]pyridoindoles comme nouvelles molécules anti-prolifératives

Les nématodes à galles du genre Meloidogyne sont des parasites obligatoires des plantes. Lors de l’interaction compatible, ils induisent la formation de cellules nourricières hypertrophiées et plurinucléées leur permettant d’assurer croissance et reproduction. L'étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la formation de ces cellules géantes a permis d’identifier une protéine associée aux microtubules, MAP65-3, essentielle à la formation de ces cellules géantes et au développement du nématode. Un des partenaires protéiques de MAP65-3 est un homologue de BUB3, membre du « Mitotic Checkpoint Complex » (MCC). Le MCC est un point de contrôle de la mitose assurant la fidélité de la ségrégation des chromosomes. Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé chez la plante modèle Arabidopsis thaliana les homologues du MCC: BUB3.1, MAD2 et la famille multigénique composée de BUBR1, BRK1 et BUB1.2. J’ai démontré les interactions in planta entre les membres du complexe, certaines interactions ayant lieu au niveau des noyaux, voire au niveau des centromères. J’ai réalisé l’analyse fonctionnelle de ces gènes et montré qu’ils étaient exprimés dans les tissus enrichis en cellules en division comme MAP65-3. L’étude de la localisation subcellulaire des protéines a révélé une localisation cytoplasmique pour BUB3.1, BUB1.2 et MAD2, nucléaire pour BUBR1 et centromérique pour BRK1. Nous avons pu également montrer que lorsque des défauts d’attachement des microtubules du fuseau mitotique sont provoqués, BUB3.1, BUBR1 et MAD2 se relocalisent au niveau des kinétochores. L’étude de la famille BUB1/BUBR1 a révélé que l’inactivation des gènes correspondants induisait une sensibilité accrue à un traitement chimique déstabilisant les réseaux de microtubules. L’étude de la mitose chez ces mutants a révélé que BUBR1 est essentielle à la réalisation d’une mitose sans erreur chez Arabidopsis. Ce travail a ainsi permis de caractériser pour la première fois le MCC chez A. thaliana. / Root-knot nematodes from the genus Meloidogyne are obligate biotrophic plant parasites. During a compatible interaction, they induce the redifferentiation of root cells into multinucleated and hypertrophied feeding cells to ensure their growth and reproduction. The study of molecular and cellular mechanisms underlying giant cell ontogenesis has led to the identification of a Microtubule-Associated Protein, MAP65-3, essential for giant cell ontogenesis and nematode development. One of the MAP65-3 interacting partners is a BUB3 homologue, member of the Mitotic Checkpoint Complex (MCC). The MCC is a surveillance mechanism ensuring that chromosomes undergoing mitosis do not segregate until they are properly attached to the microtubules of the mitotic spindle. During my thesis, I have characterized the Arabidopsis thaliana orthologs of the MCC, BUB3.1, MAD2 and the multigenic family composed of BUBR1, BRK1 et BUB1.2. I have demonstrated that MAP65-3 and all the MCC members interact together in planta, some interactions taking place within the nuclei or at the centromeres. As MAP65-3, all these genes are expressed in dividing cells. The study of the subcellular localization of the protein showed a cytoplasmic localization for BUB3.1, BUB1.2 and MAD2, nuclear for BUBR1 and centromeric for BRK1. Thus, the MCC proteins did not relocalize to the kinetochore during a normal mitosis in planta. BUB3.1, BUBR1 and MAD2 localize to the unattached kinetochores following defects in spindle assembly as observed in cells treated with microtubule poisons. The functional analysis of BUB1/BUBR1 multigenic family showed that the knock-out mutants were more sensitive to microtubule-destabilizing drugs. Furthermore, analysis of mitosis revealed that BUBR1 is essential for an error-free mitosis in Arabidopsis. This work represents the first characterization of the MCC in A. thaliana.

La Division mitotique est une phase essentielle du cycle cellulaire qui assure la répartition correcte du contenu génétique. La mitose implique une réorganisation cellulaire profonde qui est principalement induite par une phosphorylation massive de protéines. Cette phosphorylation a lieu grâce à un équilibre fin entre kinases et phosphatases. À l'entrée mitotique, la phosphorylation protéique est induite par l'activation de la kinase cycline B/CDK1 et par l'inhibition de la phosphatase PP2A-B55. Résultats de notre et d'autres laboratoires ont récemment découvert une nouvelle voie essentielle pour moduler la phosphatase PP2A-B55 pendant la transition G2-M. Cette voie inclut la kinase Greatwall (GW) et ses substrats Arpp19 et ENSA. À l'entrée mitotique GW est activé et phosphoryle Arpp19 et ENSA les convertissant en inhibiteurs puissants de PP2A-B55. Étonnamment, aucun autre substrat de GW n'a été identifié jusqu'ici. Cependant, plusieurs éléments suggèrent fortement de nouveaux rôles de GW indépendamment de Arpp19 et de ENSA. L'objectif principal de ce travail était l'identification de nouveaux substrats de GW. À cette fin, j'ai utilisé plusieurs approches, y compris: (1) fractionnement biochimique des lysats de cellules ou des extraits d'oeufs de Xenopus combiné suivi d’une phosphorylation in vitro avec une kinase GW recombinante, (2) SILAC/phosphoproteomique des lysats de cellules exprimant différents niveau de GW, (3) Co-Immunoprecipitation, (4) BioID, et (5) une approche dirigée candidat. Les résultats de la phosphorylation in vitro ont révélé la présence de deux bandes de phosphorylation intéressantes qui sont actuellement analysées. Les deux approches SILAC/phosphoprotéinique et interactome ont révélé l'enrichissement des protéines impliquées dans la régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique et des processus liés à l'ARN, une fonction physiologique déjà décrite pour cette voie chez la levure. Enfin, nous avons directement étudié la phosphorylation présumée par GW de trois candidats connus pour être impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. Bien que phosphorylées in vitro par GW, nous n’avons pu identifier le site de phosphorylation que dans l'une de ces trois protéines. Cette protéine, qui correspond à un inhibiteur de phosphatase, semble contrôler la sortie mitotique par la modulation de la déphosphorylation protéique. Un mutant non phosphorylable de cet inhibiteur induit une sortie mitotique perturbée avec une déphosphorylation ralentie des substrats mitotiques et une altération de la dégradation de la cycline B. J’ai pu attribuer ce défaut à une association perturbée de l'inhibiteur avec la phosphatase et, par conséquent, à un timing aberrant de l'inhibition de la phosphatase. Enfin, j'ai identifié le site de phosphorylation par GW comme le facteur clé contrôlant cette association. En résumé, j'ai identifié dans cette étude un nouveau substrat de GW contrôlant l'activité de la phosphatase essentielle pour une division mitotique correcte. / Mitotic division is an essential phase of the cell cycle that ensures the correct repartition of the genetic content. Mitosis involves profound cellular reorganization that is mostly induced by massive protein phosphorylation. This phosphorylation is achieved thanks to the fine-tuning of the balance between kinases and phosphatases. At mitotic entry, protein phosphorylation is induced by the activation of the master kinase Cdk1-cyclin B and the inhibition of the phosphatase PP2A B55. Previous results from our and other laboratories recently discovered a new pathway essential to modulate PP2A-B55 during G2-M transition. This pathway includes the kinase Greatwall (GW) and its substrates Arpp19 and Ensa. At mitotic entry GW is activated and promotes the phosphorylation of Arpp19/Ensa converting them into potent inhibitors of PP2A B55. Surprisingly, no other substrates of GW have been identified so far. However, several pieces of data strongly suggest new roles of GW independently of Arpp19 and Ensa. The main aim of this work was the identification of new substrates of GW. To this end, I used several approaches including: (1) Biochemical fractionation of cell lysates or Xenopus egg extracts combined with in vitro phosphorylation with recombinant GW kinase, (2) SILAC/phosphoproteomics from cell lysates expressing different GW amounts, (3) Co-Immunoprecipitation, (4) BioID and (5) a candidate directed approach. Results from in vitro phosphorylation revealed the presence of two interesting phosphorylated bands that are currently being analysed. Both SILAC/phosphoproteomic and interactome approaches yielded the enrichment of proteins involved post-transcriptional regulation of gene expression and RNA related processes, a physiological function already described for this pathway in yeast. Finally, we directly investigated the putative phosphorylation by GW of three candidates known to be involved in the control of cell cycle. Although phosphorylated in vitro by GW, we could only identify the phosphorylation site in one of these three proteins. This protein, corresponding to a phosphatase inhibitor, appears to control mitotic exit through the modulation of mitotic protein dephosphorylation. A non-phosporylable mutant of this inhibitor promotes a perturbed mitotic exit with delayed dephosphorylation of mitotic substrates and impaired cyclin B degradation. I could attribute this defect to a perturbed association of the inhibitor with the phosphatase and consequently to an aberrant timing of phosphatase inhibition. Finally, I identified the GW phosphorylation site as a key factor controlling this association. In summary, I identified in this study a new substrate of GW controlling phosphatase activity essential for correct mitotic division.

Plusieurs études ont découvert et renforcé l'implication de la dynamique mitochondriale dans le cancer. J'ai découvert un rôle inattendu des protéines kinases de la famille PKD dans la fission mitochondriale. La perte de l'activité PKD a conduit à un blocage de la fission et a entraîné une élongation significative des mitochondries par fusion continue. D'un point de vue mécanique, nous avons montré que les protéines PKD régulent la dynamique mitochondriale en activant le facteur de fission mitochondrial (MFF) par phosphorylation de plusieurs sites. MFF agit comme un récepteur principal de la GTPase DRP1, qui resserre les mitochondries, et il est essentiel à une bonne division mitochondriale. Les trois membres de la famille PKD peuvent phosphoryler MFF. La phosphorylation de MFF est médiée par PKD et la fragmentation mitochondriale se produit pendant la mitose. Comme démontré dans études sur les phosphoprotéomes, la phosphorylation du MFF est augmentée dans les cancers très mitotiques. Ainsi, l'axe de signalisation PKD-MFF régulant la dynamique mitochondriale en mitose pourrait devenir une voie thérapeutique attrayante pour le traitement du cancer. / Over the last two decades, multiple studies have uncovered and strengthen the implication of mitochondrial dynamics in cancer. During my thesis, I discovered an unanticipated role for the PKD kinase family in mitochondrial fission. Loss of PKD activity led to blockade of mitochondrial fission and resulted in a significant elongation of mitochondria by unopposed fusion. Mechanistically, we showed that PKDs regulated mitochondrial dynamics by activating the mitochondrial fission factor (MFF) through phosphorylation of multiple sites. MFF acts as a main receptor for the large GTPase DRP1, which constricts mitochondria, and it is critical for proper mitochondrial division. All three PKD family members could phosphorylate MFF. PKD-mediated MFF phosphorylation and mitochondrial fragmentation occurred specifically during mitosis. As MFF phosphorylation was found to be significantly upregulated in highly mitotic cancers, which was evidenced in several global phosphoproteome studies, the discovered PKD-MFF signaling axis regulating mitochondrial dynamics in mitosis could become an attractive therapeutic avenue for cancer treatment.

Le variant d’histone CENP-A marque épigénétiquement le centromère. La présence de CENP-A au centromère permet le recrutement de protéines centromériques qui constituent la plateforme pour l’assemblage de kinétochores fonctionnels.Dans les cellules humaines, l'extrémité amino-terminale de CENP-A ainsi que la phosphorylation de la sérine 7, ont été signalées comme étant cruciales pour la progression de la mitose. Cependant, aucune phosphorylation de CENP-A dans d'autres espèces de métazoaires n'a été décrite. Ici, nous montrons que le domaine NH2-terminal CENP-A, mais pas sa séquence primaire, est nécessaire pour la mitose dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs). Nos données montrent que les défauts mitotiques résultant de la déplétion de CENP-A endogène peuvent être restaurés lorsque les MEFs expriment un mutant GFP-CENP-A dont l'extrémité NH2-terminal de CENP-A a été échangée par la queue phosphorylable de l'histone canonique H3. Inversement, dans ce même mutant, lorsque l’on remplace les deux serines phosphorylables par des résidus alanines, les défauts mitotiques persistent. En outre, le mutant de fusion non- phosphorylable de CENP-A, où les sept serines du domaine NH2-terminal ont été remplacées par des résidus alanines, a été également incapable de restaurer le phénotype mitotique des cellules déplétées en CENP-A endogène.Nous avons également identifié les trois premières sérines de la queue de CENP-A comme sites potentiels de phosphorylation. De plus, nos résultats montrent que l’absence de phosphorylation du domaine amino-terminal conduit à la délocalisation de la protéine centromérique CENP-C. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation mitotique de CENP-A est un événement potentiellement fréquent chez les métazoaires et essentiel à la progression mitotique.Dans la seconde partie de ce travail, nous avons voulu lier sans ambiguïté la fonction du domaine NH2-terminal du CENP-A à la mitose. Nous avons conçu une nouvelle méthode, appelée approche Hara-kiri, pour pouvoir éliminer le domaine NH2- terminal seulement pendant la mitose. Ceci afin de répondre à la question ci-dessus dans les cellules humaines. L'élimination du domaine NH2-terminal du CENP-A en utilisant l'approche Hara-kiri en début de mitose a conduit à une augmentation des défauts mitotiques dans les cellules. Prises collectivement, ces données montrent que le domaine NH2-terminal CENP-A est nécessaire pendant la mitose afin d’assurer le bon déroulement de la division cellulaire. / The histone variant CENP-A epigenetically marks the centromere. The presence of CENP-A at the centromeres allows the recruitment of centromeric proteins that constitute the platform for functional kinetochores.In human cells, the NH2-terminus of CENP-A and its phosphorylation at serine 7 in mitosis has been reported to be crucial for the progression of mitosis. However, no phosphorylation of CENP-A in other metazoan species has been described. Here, we show that the NH2-terminus of CENP-A, but not its primary sequence, is required for mitosis in mouse embryonic cells (MEFs). Our data show that the mitotic defects resulting from the depletion of the endogenous CENP-A can be rescued when MEFs expressing a GFP- CENP-A mutant where the NH2-terminus of CENP-A was swapped with the phosphorylatable tail of conventional histone H3. Conversely, no rescue was observed when the two phosphorylatable serines in the H3 tail mutant were replaced with alanines. Furthermore, a non-phosphorylatable fusion mutant of CENP-A where all seven serines in the amino-tail were replaced with alanines, was also unable to rescue the mitotic phenotype of CENP-A depleted cells.We also identified that the first three serines of the tail of CENP-A as potential sites for phosphorylation. Additionally, we were able to link the phosphorylation of CENP-A amino-tail to the proper localization of the key centromeric protein CENP-C. These results suggest that mitotic CENP-A phosphorylation is a potentially common event in metazoans essential for mitotic progression.In the second par of this work we wanted to unambiguously tie the NH2-terminus function of CENP-A to mitosis. To achieve this, we wanted to remove the CENP-A amino-tail only during mitosis and we devised a new method called the Hara-kiri approach in order to answer the above question in human cells. The removal of the NH2-terminal domain of CENP-A using the Hara-kiri approach at the onset of mitosis led to increased mitotic defects in cells. Taken collectively these data show that the CENP-A NH2- terminus is required during mitosis to assure proper cell division.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissOCS.pdf: 1218083 bytes, checksum: 3aedc0986d07d9054bf628336cec9436 (MD5) Previous issue date: 2002-12-05 / Não consta.

Dans le noyau de nos cellules l’ADN est enroulé autour de petites protéines que l’on appelle les histones et forme ainsi ce que l’on nomme la chromatine. L’activation des gènes permet la production de protéines qui sont nécessaires au bon fonctionnement des différentes cellules de notre organisme. Notre corps est composé de différentes cellules dont l’identité est définie par un patron de gènes actifs et inactifs bien spécifique. Au cours de la mitose (division des cellules) il est crucial que les cellules conservent leur identité, faute de quoi des structures non adaptées peuvent apparaître et dans certains cas conduire à l’apparition de cancers. Les protéines du groupe Polycomb (PcG) constituent un important système de mémoire cellulaire qui permet de maintenir un gène inactif au cours du développement d’un organisme. Ces protéines sont ciblées sur des gènes spécifiques où elles modifient la nature chimique des histones, rendant la chromatine compacte, difficile d’accès et donc empêchant l’activation de ces gènes. Lors de la mitose, la chromatine va se compacter drastiquement pour faciliter la ségrégation des chromosomes. Les mécanismes par lesquels les protéines du PcG s’adaptent à cette restructuration massive du génome ne sont pas connus. Mon projet est d’étudier le comportement des protéines du PcG au niveau de la chromatine à travers la mitose et ainsi de comprendre comment est préservée l’identité des cellules. Historiquement, les protéines du PcG ont été découvertes chez la drosophile et leurs mutations entrainent des anomalies au niveau du plan corporel. Ces protéines existent également chez l’homme et jouent un rôle essentiel dans le contrôle du développement. Ainsi mes travaux effectués chez la drosophile pourront être repris pour l’étude de ces protéines chez l’homme. Par l’utilisation de techniques de microscopie à fluorescence, il est possible de détecter la fixation des protéines du PcG au niveau de la chromatine au cours de la mitose. Il a été observé que durant la mitose l’une des protéines du PcG est dissociée de la chromatine alors que deux autres protéines de ce groupe sont quant à elles maintenues. L’ancrage des protéines du PcG à la chromatine se fait par le dépôt d’une modification chimique spécifique sur une histone, la triméthylation de la lysine 27 de l’histone 3 (H3K27me3). Pendant la mitose le résidu adjacent, la serine 28, va être phosphorylé (H3S28ph), et cette seconde modification perturbe la fixation des protéines du PcG. Pour mieux comprendre comment ces deux modifications (H3K27me3 et H3S28ph) définissent la fixation des protéines du PcG le long du chromosome lors de la mitose, j’analyserai la distribution de ces protéines le long du génome dans des cellules en mitose. D’autre part, j’étudierai les défauts développementaux provoques par l’absence de ces deux modifications chimiques à partir de drosophiles mutantes. La dérégulation des protéines du PcG entraine des défauts développementaux et est à l’origine de nombreux cancers chez l’homme. Des avancées dans le domaine pharmacologique ont permis d’élaborer des inhibiteurs de certaines des protéines du PcG qui pourraient constituer de nouvelles thérapies anti-cancer. Il est donc important de comprendre parfaitement les mécanismes d’actions de ces protéines, tout particulièrement au cours de processus biologiques cruciaux tel que la mitose. / Polycomb group (PcG) proteins maintain repression on key developmental genes to preserve cell fates. It is unknown on how PcG-mediated repressive chromatin is inherited across cell cycles. This project aims to study the chromatin-binding profile of PcG proteins and their cognate histone mark (H3K27me3) in mitosis. We observed that Polycomb (Pc) were dissociated from chromosomes during mitosis and reassociation begins from late anaphase onwards. In contrary, Ph, PSC and high level of H3K27me3 were detected on mitotic chromosomes. Importantly, drug-inhibition of Aurora B and hence depletion of H3S28ph retained Pc on mitotic chromosomes. To further understand how mitotic H3S28ph affects PcG proteins binding profile, a FACS-sorting protocol was optimized to isolate mitotic cells for ChIP-seq analyses. In parallel, Drosophila model of histone mutants (H3K27R and H3S28A) were established to assess the importance of these modifications on PcG-mediated epigenetics inheritance across mitoses.

Une surprolifération cellulaire associée à de l’aneuploïdie est un marqueur couramment retrouvé dans les cancers et une faible instabilité génétique peut-être un élément aggravant (sinon déclencheur) de la tumorigénèse. Récemment, il a été montré sur un modèle de cellules cancéreuses en culture qu’une forte aneuploïdie compromet la prolifération cellulaire en entraînant la mort de ces dernières. Au cours de ma thèse, nous avons souhaité tester si cette hypothèse se vérifiait in vivo en utilisant comme modèle, les tumeurs du système nerveux central de la larve de D. melanogaster. Nous avons fait le choix d’utiliser des mutants pour des gènes impliqués dans la formation du fuseau mitotique et la ségrégation des chromosomes (Sas-4 ou AurA) afin d’induire ces tumeurs. Pour générer l’aneuploïdie, nous avons choisi d’associer les mutations sas-4 ou aurA avec des mutations pour des gènes essentiels du SAC, Mad2 ou BubR1ken. Nous avons ensuite analysé par immunofluorescence et microscopie l’effet de la perte du SAC sur la prolifération des Nb. Pour sas-4, la perte du SAC cause l’apparition d’une forte aneuploïdie et une baisse du nombre de Nb associée à une forte réduction de taille des cerveaux. Cela compromet totalement la capacité des cerveaux mutants à induire des tumeurs lorsqu’on les injecte dans l’abdomen de mouches adultes saines. Dans le cas d’aurA, ni hausse de l’aneuploïdie dans le tissu ni baisse de la prolifération des Nbs n’ont été observés. Par ailleurs, la même forte proportion de mouches injectées avec des cerveaux aurA ou aurA mad2 développant une tumeur a été constaté. Afin de mieux comprendre pourquoi le mutant aurA ne réagit pas comme le mutant sas-4 à la déplétion du SAC, nous avons entrepris une analyse détaillée des mutants aurA et aurA mad2. Nous avons d’abord observé que, malgré la perte du SAC, 1) il existe toujours un délai en mitose dans aurA mad2 et 2) il existe un délai entre la satisfaction du SAC et l’entrée en anaphase dans aurA. Comme l’entrée en anaphase est dépendante de la dégradation de la CycB et de la Sécurine via l’APC/C, nous avons analysé le comportement de la CycB (couplé à une étiquette GFP) par vidéo-microscopie en temps réel et observé un défaut de la régulation de la dégradation de cette dernière dans le mutant aurA ainsi que dans le double mutant aurA mad2. Ces observations nous ont permis de proposer un nouveau rôle pour la kinase AurA dans la régulation de la dégradation de la CycB en fin de mitose. / Cellular overproliferation associated with aneuploidy is a common hallmark of cancers. Low genetic instability may be a contributing factor of tumorigenesis. Recently, it was shown on a cellular cancer model in culture that strong aneuploidy compromises cell proliferation by causing cell death. During my thesis, we have test if this hypothesis was verified in vivo by using as a model, the tumours of the larval central nervous system of D. melanogaster. We decided to use mutants involved in mitotic spindle formation and chromosome segregation (Sas-4 or AurA) to induce these tumours. To generate aneuploidy, we chose to associate these mutations with mutations in genes essential for the SAC, Mad2 or BubR1ken. We then analysed the effect of the SAC depletion on the Nb proliferation. For sas-4, loss of the SAC leads to high aneuploidy and a decrease in Nb number associated with brain size reduction. It completely undermines the ability of mutant brain to induce tumors when injected into the abdomen of healthy adult flies. In the case of aurA, nor increase of aneuploidy in tissue or decrease in nb proliferation have been observed. Moreover, the same proportion of flies injected with aurA or aurA mad2 brains developed tumours. To better understand why the aurA mutant not react as the sas-4 mutant to the SAC depletion, we undertook a detailed analysis of aurA and aurA mad2 mutants. We first observed that despite the SAC depletion, 1) there is always a delay in mitosis in aurA mad2 and 2) there is a delay between SAC satisfaction and anaphase onset in aurA. Since anaphase onset is dependent of the CycB and Securine degradation via the APC / C, we analysed the behaviour of the CycB (coupled with a GFP tag) by real-time videomicroscopy and observed a defect in the regulation of CycB degradation in aurA and in the double aurA mad2 mutant. These observations lead us to propose a new role for AurA kinase in regulating the degradation of CycB at the end of mitosis.

La présence de cassures double-brin de l'ADN en mitose est problématique pour les cellules, car cette situation produit des fragments de chromosome ne possédant pas de centromères. En l'absence d'un mécanisme permettant leur prise en charge, ces fragments acentriques n'étant pas attachés au fuseau mitotique, pourraient être ségrégés aléatoirement dans les cellules filles, causant de l'instabilité génomique. Nous avons découvert un mécanisme permettant la transmission correcte des fragments acentriques dans les cellules filles via une structure faisant le lien entre les deux fragments cassés. Plusieurs protéines sont recrutées sur les cassures, comme les kinases mitotiques BubR1 et Polo, et favorisent la ségrégation correcte de ces chromosomes cassés. Cependant, les mécanismes permettant le recrutement de BubR1 et Polo sur les cassures d'ADN en mitose sont inconnus. De plus, les mécanismes moléculaires par lesquels BubR1 et Polo favorisent la ségrégation correcte des fragments acentriques restent à être identifiés. La première partie de mon projet a été d'étudier le rôle et la régulation de BubR1 sur les cassures d'ADN pendant la mitose. Nous avons montré que BubR1 requiert Bub3 pour se localiser sur les chromosomes cassés afin de favoriser leur ségrégation correcte. Nous avons également détecté l'accumulation de FizzyCDC20, un cofacteur de l'E3 ubiquitine ligase APC/C (Anaphase-Promoting- Complex/Cyclosome), sur les cassures d'ADN, et son recrutement dépend de son interaction avec la KEN Box de BubR1. De plus, l'utilisation d'un substrat synthétique de l'APC/C nous a permis de démontrer que la dégradation par l'APC/C est inhibée localement autour du chromosome cassé, de manière dépendante de BubR1. Ces résultats suggèrent fortement que le complexe BubR1/Bub3 recrut é sur les cassures d'ADN inhibe localement l'APC/C en séquestrant FizzyCDC20 et empêche ainsi la dégradation de substrats clefs impliqués dans la ségrégation correcte des chromosomes cassés. La seconde partie de mon projet a été d'étudier les relations d'interdépendance entre Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. Nous avons utilisé un laser UV pulsé pour induire des cassures dans un chromosome à un instant précis pendant la mitose, puis nous avons suivi le recrutement de protéines tagguées GFP sur les cassures de chromosome. Cette étude révèle que Polo est rapidement recrutée sur les cassures d'ADN et précède BubR1, Bub3 et Fizzy. De plus, la disparition de BubR1, Bub3 et Fizzy des cassures d'ADN coïncide avec la télophase alors que Polo disparait des cassures pendant l'interphase. Nous avons également montré que le recrutement de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN est retardé dans les mutants polo, indiquant que Polo est requis pour un recrutement efficace de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN. Pour finir, nous avons montré que l'accumulation de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN dépend de deux composants de la réponse aux dommages à l'ADN, le complexe MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) et ATM (ataxia-telangiectasia mutated). Ce travail a permis d'avoir une meilleure compréhension sur la dynamique de recrutement de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. De plus, le mécanisme moléculaire par lequel le complexe BubR1/Bub3 agit pour faciliter la ségrégation des chromosomes cassés a pu être en partie élucidé. / The presence of DNA double strand breaks (DSB) during mitosis is challenging for the cell, as it produces fragments of chromosome lacking a centromere. If not processed, this situation can cause genomic instability resulting in improper segregation of the broken fragments into daughter cells. We uncovered a mechanism by which broken chromosomes are faithfully transmitted to daughter cells via the tethering of the two broken chromosome ends. Several proteins including the mitotic kinase BubR1 and Polo are recruited to the breaks and mediate the proper segregation of the broken fragments. However, the mechanism underlying Polo and BubR1 recruitment to DNA breaks is unknown. Moreover, the molecular mechanisms by which Polo and BubR1 mediate the proper segregation of the broken fragments remain to be elucidated. We first investigated the role and regulation of BubR1 on DNA breaks during mitosis. We show that BubR1 requires Bub3 to localize on the broken chromosome fragment and to mediate its proper segregation. We also find that FizzyCdc20, a co--‐factor of the E3 ubiquitin ligase Anaphase--‐Promoting--‐Complex/Cyclosome (APC/C), accumulates on DNA breaks in a BubR1 KEN box--‐dependent manner. A biosensor for APC/C activity demonstrates a BubR1--‐dependent local inhibition of APC/C around the segregating broken chromosome. These results are consistent with a model where Bub3/BubR1 complex on DNA breaks functions to inhibit the APC/C locally via the sequestration of FizzyCdc20, thus preserving key substrates from degradation, which promotes proper transmission of broken chromosomes. In a second study, we investigated the dependency relationship between Polo and BubR1/Bub3/Fizzy on DNA breaks in mitosis. We used a pulsed UV laser to break one chromosome at a define time during mitosis. We immediately follow the recruitment of GFP--‐tagged proteins to laser--‐induced DNA breaks. My study reveals that Polo is promptly recruited to DNA breaks and precedes BubR1, Bub3 and Fizzy. In addition, while BubR1, Bub3 and Fizzy dissociation from the breaks coincide with telophase and the nuclear envelope reformation, Polo remains on the breaks well into interphase. We further show that the appearance of BubR1, Bub3 and Fizzy on DNA breaks is delayed in polo mutant, indicating that Polo is required for the robust and efficient recruitment of BubR1, Bub3 and Fizzy to DNA breaks. Finally, the timely accumulation of Polo, BubR1 and Bub3 to DNA breaks depends on two components of the DNA Damage Response, the MRN complex (Mre11--‐Rad50--‐Nbs1) and ATM (ataxia--‐telangiectasia mutated). This work gives us a better understanding on how Polo and BubR1, Bub3 and FizzyCdc20 are recruited to DNA breaks in mitosis and how they promote broken chromosomes segregation.

Images are teaching resources widely used in education. Especially in biology, they are very useful to register form and structure of organisms and to represent the cellular processes. The overall aim of this dissertation was to investigate how the records and representations through images, also can be a source of misconceptions. The specific objectives of the study were to evaluate the recognition and interpretation of images of mitosis and propose educational activities that would help in the development of interpretation skills. The sample of this research was 50 students in the first year of high school. The activities were developed in two schools, one private school and one public school). The research was divided into three stages; the first one was the application of diagnostic activities using: i) a sequence of images of cell division, to investigate the recognition of phases of mitosis; ii) modeling clay to know how the students represent a chromosome. Difficulties in recognition of images and concepts about the structure of chromosomes were analyzed. After the diagnostic activities was applied a set of educational activities about the mitosis. Two ludic activities (card game and puzzle) and two practical classes (observation of mitosis in onion roots and tridimensional model of metaphase) were associated for presentation and discussion of the phases of the mitosis. At the end of the activities the students carried out the assessment of the set of educational proposals and answered questions about interpretation of images related to mitosis and chromosomes. At diagnostic activity was detected that students still have difficulty in recognizing the images produced by microscopy. The construction of chromosomes with modeling clay revealed that most students believe that the chromosomes have the shape of X. This concept was resistant and remained even after the presentation of the set of educational activities. The students were highly motivated and rated as very positive all the activities presented. The application of these activities had positive results for the understanding of the spatial distribution of chromosomes in mitosis and permited more effective association between microscopy and simplified representations of images. These results reinforce the ideas about the need to diversify the forms and methods of presentation of abstract content related to cellular processes and the importance of working with the images generated from microscopy to assist the development of interpretation skills. / As imagens são recursos didáticos muito utilizados no Ensino, especialmente na Biologia, onde podem registrar de modo direto organismos e estruturas macroscópicas ou representar processos e componentes microscópicos. O objetivo geral dessa dissertação foi investigar, como os registros e representações através imagens que são facilitadores do entendimento de conceitos, aproximando o aluno da teoria que está em estudo, também pode ser fonte de concepções inadequadas. O presente trabalho teve por objetivos específicos avaliar o reconhecimento e interpretação de imagens da mitose e propor atividades didáticas que auxiliassem no desenvolvimento de habilidades de interpretação. Participaram deste trabalho 50 alunos do primeiro ano do Ensino Médio, sendo 27 de escola da rede particular de ensino da cidade de Rosário do Sul e 23 de escola rede pública de ensino da cidade de Santa Maria. A pesquisa foi dividida em três etapas; no primeiro momento houve a aplicação de atividades diagnósticas, utilizando: i) uma sequência de imagens de divisão celular, para investigar o reconhecimento das fases da mitose; ii) massa de modelar para que os alunos modelassem um cromossomo de maneira livre, de acordo com suas concepções. As dificuldades de reconhecimento de imagens e o conceito dos alunos sobre a estrutura de cromossomos foram analisadas. Finalizada a atividade diagnóstica utilizou-se uma intervenção constituída por um conjunto de atividades didáticas tendo como tema imagens de mitose. Os alunos participaram de atividades lúdicas compostas por jogos de baralho e quebra- cabeça, e também de atividades com caráter mais formal, como aula prática de observação de lâminas de células de Allium cepa em divisão celular e montagem de um modelo didático tridimensional representando uma célula na fase de metáfase da mitose. Ao final das atividades os alunos realizaram a avaliação do conjunto de propostas didáticas e responderam questões relacionadas a interpretação de imagens sobre mitose e cromossomos. A atividade diagnóstica demonstrou que os alunos ainda possuem dificuldade no reconhecimento de imagens principalmente as de microscopia. A concepção de que o cromossomo é sempre correspondente a letra X foi observada na maioria dos alunos, conceito este que permaneceu após a intervenção. Os alunos se mostraram bastante motivados e participaram dede modo atento e ativo em todas as atividades, o que se refletiu nas avaliações. Em relação a compreensão de imagens da mitose foi possível detectar mudanças que revelam melhor interpretação. Os resultados positivos da aplicação das atividades foram melhor compreensão da distribuição espacial dos cromossomos na mitose e associação mais efetiva entre imagens de microscopia e representações simplificadas. Esses resultados reforçam as ideias sobre a necessidade de diversificar as formas e métodos de apresentação de conteúdos abstratos relacionados a processos celulares e a importância de trabalhar com as imagens geradas a partir da microscopia para auxiliar o desenvolvimento de habilidades de interpretação.