SOUSA, B. L. Caracterização parcial de uma pro-lectina funcional de sementes de Dioclea grandiflora Benth expressa em Escherichia coli. 2010. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-20T20:48:10Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_blsousa.pdf: 6849680 bytes, checksum: 105bc7b39cebfb37c4461101abe896ef (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-20T13:08:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_blsousa.pdf: 6849680 bytes, checksum: 105bc7b39cebfb37c4461101abe896ef (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-20T13:08:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_blsousa.pdf: 6849680 bytes, checksum: 105bc7b39cebfb37c4461101abe896ef (MD5) Previous issue date: 2010 / The pro-lectin from Dioclea grandiflora presented active when expressed in recombinant (r-pro-DGL) in the cytoplasm of the model prokaryotic Escherichia coli. Obtained in soluble form from the pET32a vector, the recombinant protein presented apparent mass (25 kDa) and sequence (obtained by mass spectrometry) identical to the natural precursor, being unusually functional compared with other lectins of the pulses expressed heterologously having a specific activity of 134 217 728 (HU / mg). Unlike its counterpart wild r-Pro-DGL not specifically recognize glucose, and only weakly inhibited by mannose. Due to the high sequence homology among the forerunners in the subtribe lectins Diocleinae and galactose-binding lectin belonging to other tribes of legumes, there is the hypothesis that post-translational processing of this peculiar subtribe could influence decisively on the fine specificity of these proteins. However, the pro-r-DGL showed no affinity for galactose or lactose, showing that the topology of the binding site and the conformation of the loops that structure, the main specificity determinants of the monosaccharides. Thus, it can be stated that in the subtribe lectins precursors Diocleinae presents deglicosilados active while being still able to form oligomers and to establish cross-links between cell membranes. / A pro-lectina de sementes de Dioclea grandiflora apresentou-se ativa quando expressa de forma recombinante (r-pro-DGL) no citoplasma do modelo procariótico Escherichia coli. Obtida de forma solúvel a partir do vetor pET32a, a proteína recombinante apresentou massa aparente (25 kDa) e sequência (obtida por espectrometria de massas) idênticas ao precursor natural, mostrando-se atipicamente funcional em comparação a outras lectinas de leguminosas expressas de forma heteróloga, possuindo uma atividade específica de 134.217.728 (U.H./mg). Diferentemente de sua contraparte silvestre a r-pro-DGL não reconheceu especificamente glicose, sendo apenas fracamente inibida por manose. Em decorrência da alta homologia de sequência entre os precursores de lectinas na subtribo Diocleinae e lectinas ligantes de galactose pertencentes a outras tribos de leguminosas, há a hipótese de que o processamento pós-traducional peculiar dessa subtribo poderia influir de forma decisiva sobre a especificidade fina dessas proteínas. Entretanto, a r-pro-DGL não apresentou afinidade por galactose ou lactose, demonstrando ser a topologia do sítio de ligação, bem como a conformação das alças que os estruturam, os principais fatores determinantes da especificidade a monossacarídeos. Assim, pode-se afirmar que precursores de lectinas na subtribo Diocleinae apresentam-se ativos enquanto deglicosilados, sendo ainda capazes de formar oligômeros e estabelecer ligações cruzadas entre membranas celulares.

BRAGA, Marcus Davis Machado. Avaliação dos efeitos renais e vasculares do veneno da Bothrops insularis e de frações isoladas. 2006. 240 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2006. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-06-14T13:50:37Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_mdmbraga.pdf: 4080070 bytes, checksum: 509ef8d3bd5cea21bb7e061583220e8c (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-06-14T16:35:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_mdmbraga.pdf: 4080070 bytes, checksum: 509ef8d3bd5cea21bb7e061583220e8c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-14T16:35:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_mdmbraga.pdf: 4080070 bytes, checksum: 509ef8d3bd5cea21bb7e061583220e8c (MD5) Previous issue date: 2006 / We investigated the biochemical and biological effects of the whole venom from Bothrops insularis (popularly known as “golden lancet”), and four of its fractions, a thrombin-like enzyme, a lectin-like substance, an L-amino acid oxidase and a phospholipase A2, in perfused rat kidneys and vascular sistem. The fractions were purified by a combination of Sephadex gel filtration in HPLC columns, and ion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex in reverse phase, low-pressure affinity columns. We used a modified isolated perfused rat kidney assay, with Krebs-Henseleit solution as the perfusion fluid (Bowman, 1970; Fonteles et al., 1998). Selected parameters of renal function during stable experimental conditions were evaluated before and at 60, 90, and 120 minutes after infusion of venom and its fractions, with the first 30 minutes interval constituting the paired control. In the systemic vascular bed (Ferreira, 1965), the arterial pressure was evaluated by a manometer connected through a canule to carotid common artery and the venom was injected into the jugular vein, with registers made at every 10 minutes after administration in increasing doses, until an infusion of 300mcg was reached at 60 minutes. In the isolated rat mesenteric blood vessels method (McGregor, 1965), the perfusions were done with Krebs-Henseleit solution, at a constant flow rate of 4mL/minute. The perfusion pressure was measured manometrically. Statistical evaluations were performed by analysis of variance (ANOVA) and Bonferroni test, at the 5% significance level. In perfused kidney studies, the group treated with the whole venom showed a fall in all physiological parameters, except in potassium transport. With the lectin-like fraction, the perfusion pressure rose initially, followed by a fall, along with urinary flow and glomerular filtration rate. Sodium and potassium tubular reabsorption increased, with a fall in the osmotic clearance. The thrombin-like fraction promoted an initial rise followed by a fall in the end, in almost all parameters except in the renal vascular resistance. The sodium and chloride tubular reabsorption fell. There was an initial rise in the potassium transport, and an initial rise followed by a fall in the osmotic clearance. With the L-amino acid oxidase fraction, there was a fall in all the parameters studied. The Phospholipase A2 fraction induced a rise in the physiological and vascular parameters, as also in the potassium transport and osmotic clearance; accompanied by a fall in sodium and chloride reabsorption. With the exception of the thrombin-like fraction, all the substances tested induced acute tubular necrosis in perfused kidneys in the end. Protein extravasation into the Bowman space was evidenced in all perfused kidneys except in those treated with the whole venom; but was more intense with the thrombin-like fraction. In the systemic arterial bed, the whole venom raised arterial pressure in a dose-dependant manner, except at the concentration of 10mcg; in addition to causing intense pulmonary hemorrhage with neutrophils and alveolar lymphocyte proliferation, renal hemorrhage, and generalized vascular dilatation and congestion. In the isolated mesenteric artery, there was a marked fall in perfusion pressure when the whole venom was infused into the vessel pre-contracted with phenillephrine, as also in the isolated vessel without phenillephrine. We conclude that Bothrops insularis venom shows vasodilatation and hemorrhagic potential, like other venoms of the genus; but, different from other Bothrops venoms, it also reveals a significant necrotic activity when perfused into isolated rat kidney, causing acute tubular necrosis. / Foram investigados os efeitos do veneno da serpente Bothrops insularis e de suas frações, lectina, L-aminoácido oxidase, trombina símile e fosfolipase A2, no rim isolado e sistema vascular de rato. As frações foram purificadas a partir de uma combinação de procedimentos cromatográficos, usando colunas de HPLC de exclusão molecular, troca iônica, fase reversa e colunas de baixa pressão de afinidade. Foi utilizada a perfusão de rim isolado de rato e a solução de Krebs-Henseleit modificada (Bowman, 1970; Fonteles et al. 1998). Parâmetros selecionados da função renal foram avaliados durante as condições experimentais, com a infusão do veneno e suas frações, aos 60, 90, e 120 minutos. Os primeiros 30 minutos serviram de controle interno. No leito arterial sistêmico de rato (Ferreira, 1965) a pressão arterial foi avaliada por manômetro conectado por cânula à artéria carótida comum, e o veneno injetado na veia jugular. Os registros foram realizados a cada 10 minutos após a administração de doses crescentes do veneno, até a infusão da dose de 300mcg, aos 60 minutos. Na Perfusão do leito arterial mesentérico isolado de rato (McGregor, 1965), utilizou-se a solução de Krebs-Henseleit em fluxo constante de 4mL/minuto. A pressão de perfusão foi registrada manometricamente. A avaliação estatística foi determinada por análise de variância (ANOVA) e teste de Bonferroni, com nível de significância menor de 5%. No rim, o grupo tratado com o veneno apresentou redução em todos os parâmetros avaliados, com exceção da absorção de potássio. Com a lectina a pressão de perfusão aumentou inicialmente e caiu em seguida, juntamente com o fluxo urinário e o ritmo de filtração glomerular. Houve aumento na reabsorção de sódio e potássio, com redução no clearance osmótico. Com a trombina-símile, ocorreu aumento inicial seguido de queda no final em quase todos os parâmetros, com exceção da resistência vascular renal. A reabsorção tubular do sódio e do cloro caiu; houve elevação inicial do transporte de potássio; com aumento seguido de queda do clearance osmótico. Com a L-aminoacido oxidase houve queda em todos os parâmetros avaliados. Com a fosfolipase A2 houve elevação nos parâmetros fisiológicos e vasculares; no transporte tubular de potássio e no clearance osmótico; com queda na reabsorção de sódio e cloro. Todos os rins mostraram, no final, sinais de necrose tubular aguda, com exceção dos perfundidos com a trombina-símile. Excetuando os tratados com veneno, todos os rins apresentaram, ao final, extravasamento protéico para o espaço de Bowman. No leito arterial sistêmico o veneno produziu redução na pressão arterial sistêmica diretamente proporcional à quantidade de veneno administrada, excetuando a dose de 10mcg, além de intensa hemorragia pulmonar com proliferação de neutrófilos e linfócitos nos alvéolos, hemorragia no rim e congestão generalizada. No leito arterial mesentérico se observou uma redução na presão quando o veneno foi administrado em leito arterial pré-contraído com fenilefrina, como também isoladamente, na ausência de fenilefrina. O veneno da Bothrops insularis mostrou potencial hemorrágico e vasodilatador semelhante aos outros venenos de serpentes do gênero, com atividade necrotizante superior nos rins, onde provocou necrose tubular aguda, ao contrario do observado com outros venenos do mesmo gênero, em experimentos no rim isolado de rato.

MESQUITA, Jacilane Ximenes. Caracterização estrutural e atividade hipoglicemiante da lectina da alga marinha vermelha Amansia multifida C. lamourox. xix, 67 f. : Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-25T12:27:50Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_jxmesquita.pdf: 1104327 bytes, checksum: 6b0273ab7ad80cb17cdd35f88dbb776b (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T19:53:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_jxmesquita.pdf: 1104327 bytes, checksum: 6b0273ab7ad80cb17cdd35f88dbb776b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T19:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_jxmesquita.pdf: 1104327 bytes, checksum: 6b0273ab7ad80cb17cdd35f88dbb776b (MD5) Previous issue date: 2010 / The function of a protein is determined by its structure. As a result, the structural study of potentially active biomolecules can lead to a better understanding of its mechanism of action, as their biological activities. Thus, this study aimed to purify and structurally characterize the lectin from red seaweed Amansia multifida protein fraction which has a potential hypoglycemic. The protein fraction (F 0/70) was subjected to anion- exchange chromatography on a column of DEAE - Sephacel to elution of the first peak (PI). This peak was selected as the hemagglutination activity was obtained then the lectin from A. multifida, verified by SDS - PAGE. For two - dimensional electrophoresis were detected five isoforms. The N-terminal sequence (20 amino acid) showed no sim ilarity to any sequence deposited in databases, suggesting that it does not belong to any group of algae known lectins. The lectin was structurally characterized by spectroscopic techniques of circular dichroism (CD) and fluorescence. The CD analysis showe d that the lectin was composed of 4% α - helix, 43% beta sheet, 21% turn and 32% unordered structure, according to the deconvolution program Contin. It was also verified by CD, the structural stability of the protein against the extremes of pH and different temperatures. When subjected to temperature of 10 - 85 °C was found that the protein showed 50% of the denaturation in 40.2ºC, being completely denatured at 85°C. Such a distortion was shown to be irreversible, since after being incubated again under native conditions, the lectin was not able to recover its original structure. Extremes of pH (3.0 and 11) did not alter the secondary structure of the protein. For the fluorescence data read out at 280 and 295 nm, showed the presence of aromatic amino acids that fluoresce, such as tryptophan and tyrosine. Fluorescence spectra measured, even in the face of extremes of pH, showed no major changes that could reflect structural changes in order not to shift the peak of the emission measurements. Biological assays of hypoglycemic activity carried out with the F 0/70, containing the lectin from the algae showed that it was able to significantly reduce the blood glucose level of animals with diabetic state induced by alloxan. / A função de uma proteína é determinada pela sua estrutura. Em decorrência, o estudo estrutural de biomoléculas potencialmente ativas pode levar a uma melhor compreensão de seu mecanismo de ação, quanto as suas atividades biológicas. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo purificar e caracterizar estruturalmente a lectina de Amansia multifida, cuja fração protéica, possui um potencial hipoglicemiante. A fração rica em proteínas (F0/70) l foi submetida a uma cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel para eluição do pico I. Este pico protéico foi selecionado quanto à atividade hemaglutinante, coletado e empregado para o isolamento da lectina. Como observado por SDS-PAGE, PI apresentou elevado grau de purificação pela presença de uma única banda protéica (lectina). Por eletroforese bidimensional foram detectadas cinco isoformas. A seqüência N-terminal obtida (20 aminoácidos) não apresentou semelhança com nenhuma outra seqüência depositada em bancos de dados, sugerindo que ela não pertença a nenhum grupo de lectinas de algas conhecidas. Essa proteína foi caracterizada estruturalmente, por técnicas espectrocópicas de dicroísmo circular (CD) e fluorescência. A análise por CD mostrou que a lectina era constituída por 4% de α- hélice, 43% de folha beta, 21% de voltas e 32% de estrutura não ordenada, segundo o programa de desconvolução Contin. Ainda por CD, a proteína foi também avaliada quanto a estabilidade estrutural frente a extremos de temperatura e pH. Quando submetida a variações de temperatura de 10 – 85 ºC foi verificado que a proteína mostrou 50% de desnaturação a aproximadamente 40,2 ºC, mostrando-se completamente desnaturada a 85 ºC. Tal desnaturação mostrou-se irreversível, já que após ser incubada novamente sob condições nativas, a lectina não foi capaz de recuperar sua estrutura original. Extremos de pH (3,0 e 11) não alteraram sua estrutura secundária, demonstrando a estabilidade da mesma nesse aspecto. Quanto aos dados de fluorescência, as leituras realizadas a 280 e 295 nm, mostraram a presença de aminoácidos aromáticos que emitem fluorescência, tais como triptofano e tirosina. Espectros de fluorescência frente a extremos de pH, não mostraram grandes alterações que pudessem refletir em mudanças estruturais, já que não houve deslocamento do pico máximo de emissão em nenhuma situação testada. Ensaios biológicos de atividade hipoglicemiante realizados com a F 0/70 de A. multifida, mostraram que a mesma foi capaz de reduzir significativamente o nível de glicose sanguínea dos animais com estado diabético induzido por aloxano.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-06-25T22:55:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 311468.pdf: 1744978 bytes, checksum: 2c50dfef14dbdb20f41ec7b7942aeb0d (MD5) / A excitotoxicidade induzida pela excessiva ativação da neurotransmissão glutamatérgica está envolvida em várias neuropatologias. Neste sentido, moléculas que impeçam a liberação de glutamato ou a ativação excessiva dos seus receptores, podem ser úteis para prevenir a morte neuronal em algumas doenças. As lectinas são proteínas capazes de ligação reversível a carboidratos e glicoconjugados, e algumas têm sido utilizadas no estudo e purificação de receptores ionotrópicos glutamatérgicos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a potencial atividade neuroprotetora de lectinas extraídas de plantas como a ConBr, BBL, VGL, CGL e FTL frente à excitotoxicidade glutamatérgica. Fatias de hipocampo foram isoladas a partir de camundongos machos adultos e incubadas durante 6 h em solução tampão salina/Krebs/DMEM, na presença de glutamato (10 mM) ou glutamato (10 mM) co-administrado com ConBr, BBL, VGL, CGL ou FTL (10 µg/mL). Além disso, a fosforilação de MAPKs (ERK1/2, p38MAPK e JNK1/2/3) e AKT foi avaliada por western blot na avaliação neuroprotetora de ConBr, VGL e CGL. Os resultados mostram que o glutamato foi capaz de reduzir a viabilidade hipocampal (~25%), diminuiu a fosforilação de AKT e aumentou a fosforilação de ERK1 e p38MAPK. Notavelmente, ConBr e VGL impediram a redução da viabilidade celular e reverteram a diminuição da fosforilação de AKT induzida pelo glutamato. Entretanto, somente VGL reverteu o aumento na fosforilação de p38MAPK e ERK1 induzido por glutamato. Na presença do inibidor de PI3K, LY294002 (10 µM), ConBr não foi capaz de reverter a queda na viabilidade induzida pelo glutamato, sugerindo que o efeito neuroprotetor de ConBr é dependente da via PI3K/AKT. O mecanismo envolvido na modulação das vias de sinalização intracelular não foi elucidado. No entanto, considerando os receptores NMDA como uma proteína glicosilada no domínio N-terminal extracelular, é possível sugerir um bloqueio dos receptores de NMDA por meio da interação das lectinas ConBr e VGL com as cadeias de oligossacarídios. / The excitotoxicity induced by excessive activation of the glutamatergic neurotransmission is involved in several neuropathologies. In this sense, molecules that prevent the release of glutamate or excessive activation of its receptors can be useful to prevent neuronal death in these diseases. Lectins are proteins capable of reversible binding to carbohydrates on glycoconjugates, and some have been used in the study and purification of ionotropic glutamate receptors. The present study aimed to evaluate the potential neuroprotective activity of lectins extracted from plants such as ConBr, BBL, VGL, CGL and FTL to prevent glutamate-induced excitotoxicity. Hippocampal slices were isolated from adult male mice and incubated for 6 h in Krebs/saline/DMEM buffer in the presence of glutamate (10 mM) or glutamate (10 mM) plus ConBr, BBL, VGL, CGL or FTL (10 ìg/mL). Moreover, the phosphorylation of MAPKs (ERK1/2, p38MAPK and JNK1/2/3) and AKT was evaluated by western blotting in the study concerning the neuroprotective mechanism displayed by ConBr, VGL and CGL. The results show that glutamate was able to reduce hippocampal slice viability (-25%), diminish the phosphorylation of AKT and increase the phosphorylation of p38MAPK and ERK1. No changes were observed in the phosphorylation of JNK1/2/3 and ERK2. VGL prevented the increment of p38MAPK and ERK1 phosphorylation. Notably, ConBr and VGL prevented the reduction of cell viability and the decrease of AKT phosphorylation induced by glutamate. Furthermore, in the presence of PI3K inhibitor, LY294002 (10 ìM), ConBr was unable to reverse the loss in cell viability induced by glutamate. It suggests that ConBr exerts its neuroprotective effect in a manner dependent of PI3K/AKT pathway. The mechanism involved in the modulation of signaling pathways was not addressed in our study. However, considering NMDA receptors as glycosylated protein in the extracellular N-terminal domain it is possible to suggest a blockage of NMDA receptors via ConBr or VGL lectin interaction with oligosaccharide chains.

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Antonio Carlos Paulillo / Banca: Ricardo Luiz Morode Sousa / Resumo: Existem diversos trabalhos publicados sobre métodos de diagnóstico da Doença de Newcastle (DN) em aves comerciais da espécie Gallus gallus. Entretanto, é escassa a literatura sobre o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico laboratorial da infecção pelo vírus da Doença de Newcastle (VDN) em espécies de aves não-galiformes. O presente trabalho foi delineado com o objetivo de desenvolver e aplicar a técnica de bloqueio de fase líquida de ELISA com a concanavalina A (BFL-Con A-ELISA) para a detecção e quantificação de anticorpos contra o VDN em soros de pombos de vida livre e da técnica de Semi-nested-RTPCR para detecção do vírus da DN (VDN) em suabes cloacais das mesmas aves. Na comparação entre o BFL-Con A-ELISA e o HI para a detecção de anticorpos em 107 amostras de soros de pombos, foram obtidos uma correlação significativa com o teste de HI (r = 0,875), bem como valores elevados de sensibilidade (100%), especificidade (95,8%), acurácia (96,3%) e concordância (κ = 0,83). Os resultados obtidos na técnica de semi-nested-RT-PCR mostraram que nove das 101 amostras analisadas foram positivas para o VDN. Na análise comparativa dos resultados da técnica do semi-nested-RT-PCR com os obtidos nas técnicas sorológicas, foram observados índices de especificidade relativa de 93,9% e 96,8% em relação aos métodos de HI e BFL-Con A-ELISA, respectivamente; além de uma máxima sensibilidade relativa (100%), comparativamente a esses testes. Esses dados demonstram que tanto o BFL-Con A-ELISA como o semi-nested-RT-PCR desenvolvidos no presente estudo foram eficientes no diagnóstico da DN, ou detectando anticorpos anti-VDN, ou esse agente viral, respectivamente, e ambas as técnicas apresentaram um grande potencial para serem usadas com vantagens no diagnóstico da infecção pelo VDN em pombos e em outras espécies de aves não-galiformes. / Abstract: A number of studies were done on diagnostic methods of Newcastle disease in commercial poultry (Gallus gallus, species). However the literature is scarce on the development of techniques for the diagnosis of Newcastle disease (ND) infection in non-galiforme and free-living birds. The present study aims to develop and apply a liquid-phase blocking ELISA with Concanavalin A (BFL-Con AELISA) for the detection and quantification of antibodies against ND virus (NDV) in sera of free-living pigeons and a semi-nested-RT-PCR technique for detection of NDV in cloacal swabs collected from these birds. The results of BFL-Con A-ELISA and HI were compared for the detection of antibodies in serum samples from 107 pigeons, and a significant correlation with the HI test was obtained (r = 0.875) as well as high values of relative sensitivity (100 %), specificity (95.8%), accuracy (96.3%) and agreement (k = 0.83). The results of semi-nested-RT-PCR showed that nine of the 101 samples were positive for the presence of NDV. By comparing the seminested- RT-PCR with serological tests, high relative specificity values of 93.9% and 96.8% were obtained with regard to HI and BLF-Con A-ELISA tests, respectively, as well as a maximum relative sensitivity (100%) was observed regarding these serological tests. These data demonstrate that the BFL-Con A-ELISA and seminested- RT-PCR developed in this study were effective in the diagnosis of NDV infection, detecting either specific antibodies, or this virus, respectively, and have a great potential to be used advantageously in the diagnostic of NDV infection in pigeons and other species of non-galliforme birds. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-27Bitstream added on 2014-06-13T21:00:44Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_es_me_jabo.pdf: 649478 bytes, checksum: d2bee0b53ef4e30c3486df035f84bee1 (MD5) / Existem diversos trabalhos publicados sobre métodos de diagnóstico da Doença de Newcastle (DN) em aves comerciais da espécie Gallus gallus. Entretanto, é escassa a literatura sobre o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico laboratorial da infecção pelo vírus da Doença de Newcastle (VDN) em espécies de aves não-galiformes. O presente trabalho foi delineado com o objetivo de desenvolver e aplicar a técnica de bloqueio de fase líquida de ELISA com a concanavalina A (BFL-Con A-ELISA) para a detecção e quantificação de anticorpos contra o VDN em soros de pombos de vida livre e da técnica de Semi-nested-RTPCR para detecção do vírus da DN (VDN) em suabes cloacais das mesmas aves. Na comparação entre o BFL-Con A-ELISA e o HI para a detecção de anticorpos em 107 amostras de soros de pombos, foram obtidos uma correlação significativa com o teste de HI (r = 0,875), bem como valores elevados de sensibilidade (100%), especificidade (95,8%), acurácia (96,3%) e concordância (κ = 0,83). Os resultados obtidos na técnica de semi-nested-RT-PCR mostraram que nove das 101 amostras analisadas foram positivas para o VDN. Na análise comparativa dos resultados da técnica do semi-nested-RT-PCR com os obtidos nas técnicas sorológicas, foram observados índices de especificidade relativa de 93,9% e 96,8% em relação aos métodos de HI e BFL-Con A-ELISA, respectivamente; além de uma máxima sensibilidade relativa (100%), comparativamente a esses testes. Esses dados demonstram que tanto o BFL-Con A-ELISA como o semi-nested-RT-PCR desenvolvidos no presente estudo foram eficientes no diagnóstico da DN, ou detectando anticorpos anti-VDN, ou esse agente viral, respectivamente, e ambas as técnicas apresentaram um grande potencial para serem usadas com vantagens no diagnóstico da infecção pelo VDN em pombos e em outras espécies de aves não-galiformes. / A number of studies were done on diagnostic methods of Newcastle disease in commercial poultry (Gallus gallus, species). However the literature is scarce on the development of techniques for the diagnosis of Newcastle disease (ND) infection in non-galiforme and free-living birds. The present study aims to develop and apply a liquid-phase blocking ELISA with Concanavalin A (BFL-Con AELISA) for the detection and quantification of antibodies against ND virus (NDV) in sera of free-living pigeons and a semi-nested-RT-PCR technique for detection of NDV in cloacal swabs collected from these birds. The results of BFL-Con A-ELISA and HI were compared for the detection of antibodies in serum samples from 107 pigeons, and a significant correlation with the HI test was obtained (r = 0.875) as well as high values of relative sensitivity (100 %), specificity (95.8%), accuracy (96.3%) and agreement (k = 0.83). The results of semi-nested-RT-PCR showed that nine of the 101 samples were positive for the presence of NDV. By comparing the seminested- RT-PCR with serological tests, high relative specificity values of 93.9% and 96.8% were obtained with regard to HI and BLF-Con A-ELISA tests, respectively, as well as a maximum relative sensitivity (100%) was observed regarding these serological tests. These data demonstrate that the BFL-Con A-ELISA and seminested- RT-PCR developed in this study were effective in the diagnosis of NDV infection, detecting either specific antibodies, or this virus, respectively, and have a great potential to be used advantageously in the diagnostic of NDV infection in pigeons and other species of non-galliforme birds.

Lectinas estão situadas dentro de um grupo estruturalmente diverso de proteínas que se ligam a carboidratos e glicoconjugados com grande especificidade. Encontradas em diversos organismos, elas são moléculas extremamente úteis na caracterização de sacarídeos, como agentes mediadores de endereçamento de fármacos ou até mesmo como marcadores de superfície celular. A pulchellina é uma glicoproteína heterodimérica ligante de D-Galactose oriunda de sementes de Abrus pulchellus e classificada como proteína inativadora de ribossomo do tipo 2 (“type 2 ribosome-inactivating protein” - type 2 RIP). A cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC) foi previamente produzida em E. coli BL21(DE3). Neste presente trabalho, a rPBC é analisada quanto a sua atividade, interação com células de mamíferos “in vitro” e estabilidade estrutural. Os resultados indicam que a rPBC possui seletividade quanto a tipos celulares alvo e é endocitada ativamente, provavelmente compartilhando a via de endocitose descrita para outras RIPs. Além disto, a rPBC foi unida à cadeia catalítica e o heterodímero resultante demonstrou toxicidade similar à da holotoxina nativa, confirmando a atividade da rPBC e atribuindo-lhe papel essencial no mecanismo de intoxicação. Uma segunda parte deste trabalho tratou de outra lectina, extraída de sementes de Camptosema ellipticum. Recentemente, experimentos com extratos aquosos obtidos a partir de sementes de Camptosema ellipticum demonstraram possuir atividade hemaglutinante frente a hemácias humanas. Tal atividade foi atribuída a um dado componente protéico que foi então purificado através de cromatografias de troca iônica e exclusão molecular. A proteína, então chamada camptosemina, demonstrou ocorrer na forma de um tetrâmero e cujo estado de oligomerização pode ser controlado pelo pH do meio. Informações sobre a seqüência primária na porção amino-terminal, obtidas por seqüenciamento de aminoácidos, permitiram o desenho de oligonucleotídeos degenerados para a amplificação e clonagem de seu cDNA. As seqüências dos clones obtidos foram submetidas a diversas rotinas de procura de dados do NCBI. Entre os resultados retornados encontraram-se a concanavalina e a aglutinina de amendoim, dois representantes da chamada família de lectinas de leguminosas. Representantes deste grupo compartilham com a camptosemina o tamanho de seus monômeros e a forma de controle de seus graus de oligomerização. O presente trabalho traz a caracterização preliminar da camptosemina quanto a sua seqüência primária e oligomerização através de técnicas de clonagem e de espectroscopia. Foi possível a clonagem de duas variantes para o cDNA da camptosemina cujas seqüências prevêem um peptídeo sinal N-terminal ausente na proteína madura. As seqüências primárias deduzidas são muito semelhantes entre si e em comparação com outros membros da família de lectinas de leguminosas. A camptosemina se demonstrou extremamente resistente a mudanças de temperatura, exibindo sua dissociação em monômeros somente sob pHs extremamente ácidos ou alcalinos. / Lectins have been placed in a structurally diverse group of proteins that bind carbohydrates and glycoconjugates with high specificity. Found in several organisms, they are extremely useful molecules in the characterization of saccharides, as drug delivery mediators, and even as cellular surface markers. Pulchellin is a D-Galactose-binding heterodimeric glycoprotein from Abrus pulchellus seeds and classified as a type-2 ribosome-inactivating protein (type-2 RIP). The recombinant pulchellin B (rPBC) was previously produced in E. coli BL21 (DE3). In the present work, rPBC is analyzed with respect to its interaction with mammal cells “in vitro” and structural stability. Results show that rPBC has selectivity for targeted cell types and that it is actively endocytosed, probably by the same route described for other RIPs. Furthermore, rPBC was bond to the catalytic chain and the resulting heterodimer has shown toxicity degree very similar to the native holotoxin, confirming rPBC activity and attributing it a essential role in the intoxication mechanism. A second part of this work has dealed with another lectin extracted from the seeds of Camptosema ellipticum. Recently, experiments with water-soluble extracts obtained from the seed of Camptosema ellipticum have shown to have hemagglutinative properties when assayed with human erythrocytes. Such biological activity was attributed to a certain proteic component that was purified by ion-exchange and size-exclusion chromatographies. The protein, so called camptosemin, has shown to occur as a tetramer and which oligomerization’s state could be driven by the environmental pH. Primary sequence information from the amino-terminal portion, obtained by aminoacid sequencing, allowed the design of degenerated oligonucleotides for the amplification and cloning of its cDNA. The obtained clones’ sequences were submitted to several NCBI data bank search scripts. Among the retrieved results were found concanavalin and peanut agglutinin, two representatives of the called legume lectins family. Members of this group share with camptosemin their monomer sizes and the way their oligomerization state can be driven. This present work characterizes camptosemin with respect to its sequence and oligomerization using cloning and spectroscopy techniques. It was possible the cloning of two cDNA variants for camptosemin which sequences deduce an N-terminal signal peptide absent in the mature protein. Deduced primary sequences are very similar to each other and to other legume lectin members. Camptosemin has shown being extremely temperature resistant, only dissociating in monomeric subunits under extremely acid or alkaline pHs.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / PolissacarÃdeos ocorrem em grandes quantidades nas sementes como componentes da parede celular ou como reserva. Dentre estes Ãltimos, incluem-se as xiloglucanas cotiledonÃrias e as galactomananas endospÃrmicas. As xiloglucanas apresentam uma cadeia principal de β-D-(1→4)-glucana ramificada com ligaÃÃes α-(1→6) por resÃduos D-xilopiranosÃdeos ou β-D-galactopiranosÃdeo-(1→2)-D-xilopiranosÃdeos, enquanto as galactomananas endospÃrmicas consistem em cadeias polimÃricas de resÃduos β-D-manopiranosil (1→4) ligados, substituÃdos em O-6 por unidades de α-D-galactopiranosil. O objetivo deste trabalho foi analisar a interaÃÃo de xiloglucanas e galactomananas com lectinas galactose-ligantes e, assim, sugerir o uso de tais polissacarÃdeos como alternativa barata e eficaz na preparaÃÃo de matrizes cromatogrÃficas para o isolamento e determinaÃÃo da especificidade anomÃrica de novas lectinas. Dessa forma, as interaÃÃes das lectinas das sementes de Artocarpus integrifolia (frutalina), Artocarpus incisa (jacalina), Ricinus communis (ricina) e Arachis hypogaea (PNA) com matrizes de xiloglucanas de sementes de Copaifera langsdorffii, Mucuna sloanei e Hymenaea courbaril (MC, MMu, MJ, respectivamente) e de galactomananas de Mimosa scabrella, Stryphnodendron barbatiman, Adenanthera pavonina e Dimorphandra mollis (MM, MS, MA; MD, respectivamente) foram analisadas. As galactomananas apresentaram melhor capacidade de retenÃÃo da jacalina (MA â 0,92 mg ; MM â 1,48 mg ; MD â0,88 mg ; MS â 0,83 mg) e da frutalina (MA â 0,99 mg ; MM â 1,09 mg ; MD â 0,94 mg ; MS â 0,85 mg), lectinas que possuem especificidade por α-D-galactose. Vale destacar que a galactomanana de M. scabrella apresentou melhor capacidade de retenÃÃo da lectinas testadas. Por outro lado a ricina, capaz de ligar-se aos dois anÃmeros, mas que se liga preferencialmente ao anÃmero β, teve maior massa retida nas colunas de xiloglucana (MMu â 2,17 mg ;MJ â 1,30 mg; MC â 2,83 mg). Houve diferenÃa nos perfis de retenÃÃo da PNA, que tambÃm se liga aos anÃmeros α e β da galactose, sendo que a melhor retenÃÃo foi na coluna contendo matriz de M. sloanei (0,12 mg). As colunas foram todas saturadas com extrato bruto a partir das farinhas das sementes, para que se utilizasse a capacidade mÃxima de retenÃÃo de cada matriz. Atividade hemaglutinante foi detectada em ambos os picos PI e PII. Para a ricina, atividade tÃxica foi realizada e detectada para todos os PII obtidos. Por meio de SDS-PAGE, a pureza de cada uma das lectinas foi confirmada. Diante dos resultados expostos, pode-se sugerir o uso de xiloglucanas e galactomananas para o isolamento, purificaÃÃo e determinaÃÃo da especificidade anomÃrica de lectinas galactose-ligantes. / Polysaccharides are found in large quantity in seeds and they represent the main compounds of cell wall or reservoir. Among reservoir compounds, it included cotyledonary xyloglucans and endospermic galactomannans. The xyloglucans are made of a main chain of β-D-(1→4)-glucan with α-(1→6) ramifications of D-xylopyranoside or β-D-galactopyranoside-(1→2)-D-xylopyranoside residues. Endospermic galactomannans are polimeric chains of β-D-mannopyranosil (1→4) and replaceabled in O-6 for units of α-D-galactopyranosil. The aim of this work is investigate the interaction of xyloglucans and galactomannans with galactose bounding lectins and show the possibility of the usage of these polysaccharides as cheap and useful chromatographic matrices for isolation and determination of anomeric specificity of galactose bounding lectins. The interactions of lectins from seeds of Artocarpus integrifolia (frutalin), Artocarpus incisa (jacalin), Ricinus communis (ricin) e Arachis hypogaea (PNA) were performed with coluns of xyloglucans of seeds from Copaifera langsdorffii, Mucuna sloanei and Hymenaea courbaril (MC, MMu, MJ, respectively) and galactomannans from Mimosa scabrella, Stryphnodendron barbatiman, Adenanthera pavonina and Dimorphandra mollis (MM, MS, MA; MD, respectively). The galactomannans showed the best colun interaction capacity for the jacalin (MA â 0,92 mg ; MM â 1,48 mg ; MD â0,88 mg ; MS â 0,83 mg) and frutalin (MA â 0,99 mg ; MM â 1,09 mg ; MD - 0,94 mg ; MS - 0,85 mg) lectins. Remarkably the M. scabrella galactomannan showed the best colun interaction among all lectins analysed. On the other hand, ricin was better hold in coluns made of xyloglucan (MMu â 2,17 mg ;MJ â 1,30 mg; MC â 2,83 mg). For PNA lectin, differences were detected in colun interaction capacity. The best colun interaction was with the M. sloanei matrix (0,12 mg) for PNA lectin. All coluns were fill with sample extract of flour from seeds and hemagglutination assays was performed with PI and PII. In these assays, hemagglutination activity was detected in both PI and PII from the coluns. For ricin, toxic activity was made and it was detected for all obtained chromatographic samples. With SDS-PAGE it was possible confirmed the purification of the studied lectins. The bands in polyacrilamid gel were the same for the lectins purified. In conclusion, it can be suggested the usage of xyloglucans and galactomannans for isolation, purification and determination of anomeric specificity of galactose-bounding lectins.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O cÃncer de mama representa o tipo de cÃncer mais comum entre as mulheres no mundo e no Brasil, depois do cÃncer de pele nÃo melanoma. Caracterizando-se como uma doenÃa clÃnica e biologicamente heterogÃnea, a detecÃÃo precoce do cÃncer de mama, uma caracterizaÃÃo fidedigna da doenÃa e um diagnÃstico preciso sÃo de fundamental importÃncia para reduÃÃo da mortalidade. Assim, o objetivo do presente trabalho foi realizar anÃlises qualitativas e quantitativas de proteÃnas plasmÃticas de mulheres saudÃveis e mulheres com cÃncer de mama tipo ductal, em diferentes estÃgios. Para isso, inicialmente, as amostras de plasma foram depletadas de albumina e IgG e depois reunidas em pools representativos para cada grupo em estudo. Os pools foram entÃo fracionados por meio de cromatografias de afinidade em matrizes de Sepharose 4B imobilizadas com as lectinas vegetais α-galactose-ligante de Artocarpus incisa - Frutalina e glucose/manose-ligante de Dioclea altÃssima â DAL. Posteriormente, tantos os pools como as fraÃÃes cromatogrÃficas obtidas foram digeridas e submetidas à anÃlise independente de dados (MSE) e quantificadas (label-free) por espectrometria de massas. A utilizaÃÃo das cromatografias de afinidade com lectinas vegetais a priori da anÃlise por espectrometria de massas foi fundamental para reduzir a complexidade das amostras e estender o intervalo dinÃmico de proteÃnas, e frutalina apresentou os melhores resultados de fracionamento. Um somatÃrio de todas as anÃlises realizadas revelou a identificaÃÃo de cerca de 445.000 peptÃdeos e mais de 30.000 proteÃnas, com redundÃncia entre isoformas do mesmo grupo e entre grupos. Ademais, alÃm de fracionar, as cromatografias de afinidade com lectinas vegetais foram eficientes em isolar glicoformas especÃficas que refletem um padrÃo de glicosilaÃÃo alterado associado à doenÃa. Diversas proteÃnas diferencialmente expressas, algumas delas com mudanÃas na glicosilaÃÃo, foram identificadas, tais como apolipoproteÃna A2, apolipoproteÃna C3, fatores do sistema complemento (C3, C4b e C4A), clusterina, α-1-2-Ãcido glicoproteÃna, haptoglobina, hemopexina, paraoxonase arilesterase sÃrica, proteÃna plasmÃtica de ligaÃÃo ao retinol, plasminogÃnio e vitronectina. Dentre as proteÃnas identificadas, algumas estÃo relacionadas com a decomposiÃÃo da matriz extracelular, metabolismo lipÃdico, estresse oxidativo e outras caracterizam-se como proteÃnas de fase aguda. Finalmente, os dados de expressÃo diferencial e possÃveis alteraÃÃes de glicosilaÃÃo das proteÃnas contribuem para o desenvolvimento de um perfil protÃico, alvo para posterior validaÃÃo, que apresenta uma associaÃÃo com o desenvolvimento e a caracterizaÃÃo do cÃncer de mama em seus diferentes estÃgios. / The breast cancer presents one of the most commonly diagnosed types of cancer among women worldwide and in Brazil, after nonmelanoma skin cancer. Itâs a clinically and biologically heterogeneous disease. Therefore, early detection of breast cancer, a reliable characterization of the disease and an accurate diagnosis are crucial to reducing mortality. The aim of this work was perform a qualitative and quantitative analyzes of plasma proteins from healthy women and from women with ductal breast cancer in different stages. For this, initially, plasma samples were depleted of IgG and albumin and then pooled into samples representative for each study group. The pools were then fractionated by immobilized plant lectins (frutalin and DAL)-affinity chromatography. Subsequently, the pools and chromatographic fractions were digested and submited to and data-independent label-free mass spectrometric analysis. The use of affinity chromatography with plant lectins prior to analysis by mass spectrometry was essential to reduce sample complexity and extend the dynamic range of proteins, and frutalin showed the best results from fractionation. A sum of all analyzes performed revealed the identification of about 445,000 peptides and more than 30,000 proteins, with redundancy between isoforms of the same group and between groups. Furthermore, in addition to fractionation, the chromatography of affinity with plant lectins were effective in isolating specific glycoforms that reflect an altered glycosylation pattern associated with the disease. Several differentially expressed proteins, some of which changes in glycosylation were identified, such as apolipoprotein A2, apolipoprotein C3, complement factors (C3, C4b and C4A), clusterin, 1-2-α-acid glycoprotein, haptoglobin, hemopexin, serum paraoxonase arylesterase, plasma retinol binding protein, plasminogen and vitronectin. Among the proteins identified, some are related to the breakdown of the extracellular matrix, lipid metabolism, oxidative stress and other characterized as acute phase proteins. Finally, the data of differential expression and possible changes in the glycosylation patterns of proteins contributes to the development of a protein profile, subject to later validation, presenting an association with the development and characterization of breast cancer in its different stages.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Muitos compostos isolados de plantas apresentam diversos tipos de atividades biolÃgicas, como tem sido o caso de proteÃnas conhecidas como lectinas. Essas proteÃnas fazem parte de um grupo de molÃculas que reconhecem e se ligam a carboidratos contidos na superfÃcie das cÃlulas de forma especÃfica e reversÃvel. Nas Ãltimas dÃcadas as lectinas vÃm se tornando ferramentas promissoras com aÃÃo antitumoral e antiviral. Esse trabalho objetivou investigar a possÃvel aÃÃo anticancerÃgena e antiviral das lectinas isoladas das sementes de Canavalia brasiliensis (ConBr), Canavalia marÃtima (ConM), Dioclea lasiocarpa (DLasiL) e Dioclea sclerocarpa (DSclerL), o possÃvel mecanismo inicial de aÃÃo anticancerÃgena da lectina DLasiL, alÃm de estudar a estrutura da DLasiL atravÃs das tÃcnicas de fluorescÃncia e dicroÃsmo circular e seu mecanismo para atividade anticÃncer. A lectina DLasiL foi particularmente caracterizada, apresentando 237 resÃduos de aminoÃcidos com alta similaridade com as lectinas da subtribo Diocleinae. RessonÃncia paramagnÃtica de elÃtrons mostrou sinal caracterÃstico da presenÃa do Ãon manganÃs (Mn2+), enquanto medidas de ICP-MS confirmaram a quantidade deste Ãon, alÃm de cÃlcio (Ca2+), cuja quantidade foi inferior ao medido nas outras lectinas. Estudos de fluorescÃncia intrÃnseca indicaram melhor acessibilidade aos triptofanos por molÃculas neutras, provando que a vizinhanÃa possuui carÃter nÃo carregado, enquanto que fluorescÃncia extrÃnseca usando Bis-ANS ilustrou a alteraÃÃo conformacional provocada pela interaÃÃo a aÃÃcares, concluindo que à possÃvel utilizar esse tipo de medida para a constataÃÃo desse fenÃmeno. Medidas de DicroÃsmo Circular confirmam a significativa estabilidade tÃrmica da DLasiL no qual perdeu 50% de sua atividade a 72 oC. Para investigar a aÃÃo antitumoral das lectinas em estudo, cÃlulas de carcinoma de ovÃrio humano (A2780), carcinoma caucasiano de pulmÃo humano (A549), carcinoma de mama humano (MCF7), carcinoma de prÃstata humano (PC3) foram cultivadas com DLasiL. AlÃm disso, foi determinada a viabilidade celular. Os resultados mostraram que as lectinas foram efetivas em inibir o crescimento celular das linhangens testadas utilizando concentraÃÃo nanomolar. Dentre as lectinas testadas, a mais efetiva em inibir o crescimento celular foi a DLasiL, demonstrando um maior Ãndice de citotoxicidade contra cÃlulas da linhagem A2780 com IC50 de 52 nM. O mecanismo de aÃÃo da DLasiL foi investigado atravÃs de ensaios especÃficos de apoptose. Dados de ciclo celular mostraram que a DLasiL apresenta mudanÃas significativas nos nÃveis S e G2/M. Adicionalmente, ensaios com uma sÃrie de conjuntos de vÃrus apresentaram resultados bastante promissores. / Several compounds isolated from plants, including proteins called lectins, have exhibited many types of biological activities. These proteins are specific recognizing and binding to carbohydrates found onto the cell surface. During the last decades, lectins have become promising sources for antitumor and antiviral studies. This study aimed to investigate legumineous lectins, ConBr (Canavalia brasiliensis), ConM (Canavalia maritima), DLasiL (Dioclea lasiocarpa) and DSclerL (Dioclea sclerocarpa) as potential anti-cancer and anti-viral agents, as well as studying structurally DLasiL using fluorescence, circular dichroism and its initial mechanism of anticancer activity. DLasiL lectin was characterized showing 237 amino acid residues with high similarity to lectin from the Diocleinae subtribe. Electron paramagnetic resonance of DLasiL showed a typical signal for manganese (Mn+2), while ICP-MS provided its actual amount along with calcium (Ca2+), whose values were below those found for the other lectins. Intrinsic fluorescence studies using three quenchers showed a better accessibility of neutral species to tryptophans of DLasiL, while extrinsic fluorescence using bis-ANS exhibited a dose-dependent conformational changes promoted by sugars. Circular dichroism showed very expressive thermal stability of DLasiL with mid-point for thermal denaturation at 72 ÂC. These lectins were used to treat human ovarian carcinoma (A2780), Human Lung Carcinoma (A549), Human Breast Carcinoma (MCF7), Human Prostate Carcinoma (PC3) and cell viability was determined. These proteins showed potent activity on inhibiting cell growth at nanomolar concentrations. Among these lectins, DLasiL was the most effective showing potent cytotoxicity against A2780 cell line with IC50 of 52 nM. The mechanism of cytotoxicity action of DLasiL was investigated by specific apoptosis assay. Cell cycle studies showed DLasiL causes significant changes in the levels of S and G2/M. A virus screening investigation was carried out showing promissing antiviral activity.