FRUTUOSO, Mércia Sindeaux. Avaliação do mecanismo de modulação da resposta imunológica à Leishmaniose visceral chagasi in vitro em indivíduos baixos produtores de INF-Y. 2009. 114 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-12-04T15:50:37Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_msfrutuoso.pdf: 2262232 bytes, checksum: b7189beec1520220c5fd9efcefb3cb5e (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2013-12-04T15:51:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_msfrutuoso.pdf: 2262232 bytes, checksum: b7189beec1520220c5fd9efcefb3cb5e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-04T15:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_msfrutuoso.pdf: 2262232 bytes, checksum: b7189beec1520220c5fd9efcefb3cb5e (MD5) Previous issue date: 2009 / Introduction: Visceral leishmaniasis is a serious public health problem in several parts of the developing world. In leishmaniasis, protection and healing correlate with the development of Th1 immune response, and IFN-γ is considered a key molecule in this response. In contrast, the Th2 response results in disease progression. It is noteworthy that after contact with Leishmania the production of IFN-γ differs between healthy individuals. Some of them are high IFN-γ producer (HIFN-γP), while others respond with low IFN-γ producer (LIFN-γP). This has been observed in the in vitro response to several species of Leishmania, as well as in the early phase of the disease in patients with leishmaniasis. The activation of T lymphocytes can be modulated by immunomodulatory receptors present on the surface of lymphocytes and antigen presenting cells (APCs). Signaling lymphocytic activation molecule (SLAM, CD150) is a transmembrane protein that promotes Th2 differentiation. Evidences support the involvement of this molecule in the immune response against parasites. Objective: To evaluate the role of SLAM signaling pathway in the modulation of immune response of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from individuals low IFN-γ producers (LP) against Leishmania chagasi. Methodology: Healthy individuals’ PBMC were stimulated in vitro with L. chagasi and monoclonal anti-SLAM (α-SLAM), in the presence or not of inflammatory cytokines (rIFN-γ or rIL-12). The supernatants of the cultures were analyzed by ELISA for the determination of IFN-γ and interleukin 10 (IL-10) concentrations. Results: Upon stimulation of PBMC with L. chagasi, the blocking of the SLAM signaling pathway with α-SLAM did not affect the synthesis of IFN-γ and IL-10, regardless of treatment with rIL-12. However, after rIFN-γ treatment of antigen stimulated cells it occurred a download of IL-10 synthesis and upload IFN-γ secretion, regardless of the blockade of SLAM signaling pathway. Conclusions: The blocking of SLAM signaling pathway with α-SLAM at the concentration of 10μg/mL does not interfere significantly in the IFN-γ and IL-10 production of PBMC from individuals LP stimulated with Leishmania chagasi promastigotes. Treatment of PBMC with rIFN-γ is able to induce a reduction of IL-10 and an increment of IFN-γ in the supernates cultures, whereas treatment with rIL-12 enhanced IFN-γ production, but does not interfered with IL-10. It is necessary to make further studies to better understand the role of the SLAM signaling pathway in the immune response of LP against Leishmania chagasi. / Introdução: Nas leishmanioses, proteção e cura se correlacionam com o desenvolvimento de resposta imune tipo Th1, e IFN-γ é considerada uma molécula chave nesta resposta. Ao contrário, a resposta Th2, resulta na progressão da doença. Vale ressaltar que a produção de IFN-γ, após o contato com a Leishmania, difere entre indivíduos sadios, alguns apresentam alta produção de IFN-γ (AP), enquanto outros respondem com baixa produção (BP). Isto tem sido observado com diversas espécies de Leishmania, assim como na infecção natural, na fase inicial da doença. A ativação do linfócito T pode ser modulada por coestimuladores, presentes na superfície de linfócitos e nas APCs, a exemplo da molécula sinalizadora na ativação de linfócitos T (SLAM). Evidências apontam para o envolvimento dessas moléculas na regulação da resposta imunológica. Objetivo: Avaliar o papel da via de sinalização de SLAM na modulação da resposta imune em células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de indivíduos BP, frente à estimulação in vitro por Leishmania chagasi. Metodologia: CMSP de indivíduos sadios BP foram estimuladas in vitro com L. chagasi na ausência ou na presença do anticorpo monoclonal anti-SLAM (α-SLAM), com ou sem tratamento por citocinas proinflamatórias (rIFN-γ ou rIL-12). Os sobrenadantes das culturas foram analisados por ELISA para IFN-γ e interleucina (IL)-10. Resultados: Sob estimulação de L. chagasi, o bloqueio da via SLAM não modificou a síntese de IFN-γ e IL-10, independente do tratamento com rIL-12. No entanto, o tratamento com rIFN-γ reduziu a síntese de IL-10 e elevou a secreção de IFN-γ endógeno, independente do bloqueio da via SLAM. Conclusões: O bloqueio da via SLAM, com adição de α-SLAM (10µg/mL), não interfere significativamente na produção de IFN-γ e IL-10. O tratamento das CMSP com rIFN-γ é capaz de induzir a redução da produção de IL-10 e o aumento de IFN-γ de forma significativa, enquanto que o tratamento com rIL-12 aumenta a produção de IFN-γ, mas não interfere na produção de IL-10 dos indivíduos baixos produtores. Faz-se necessário ampliar o estudo da ação imunomoduladora da SLAM frente à Leishmania chagasi, para um melhor entendimento do papel desta via de sinalização na resposta imunológica dos BP.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-10-08T20:25:11Z No. of bitstreams: 1 Dissert_MarciaHueb.pdf: 1107770 bytes, checksum: d9ee3e5cfb31d4e7b2bc12002f87fbef (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-10-13T12:44:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_MarciaHueb.pdf: 1107770 bytes, checksum: d9ee3e5cfb31d4e7b2bc12002f87fbef (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-13T12:44:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_MarciaHueb.pdf: 1107770 bytes, checksum: d9ee3e5cfb31d4e7b2bc12002f87fbef (MD5) Previous issue date: 2007 / O antimonial pentavalente, indicado como tratamento de escolha para a leishmaniose tegumentar americana (LTA), é um medicamento eficaz, mas de toxicidade elevada. A resposta imune estabelecida pelo homem diante de uma infecção por Leishmania é fator determinante para a evolução dessa infecção. Assim, pode ser considerada de interesse a avaliação de uma modalidade de tratamento capaz de induzir uma resposta imune associada à regressão de lesões e proteção, o que por hipótese poderia ocorrer com a estimulação antigênica resultante do uso de uma vacina antileishmaniose. Estudos relatados com uma vacina produzida no Brasil, inicialmente avaliada para a profilaxia da LTA e posteriormente para a terapia da doença, mostraram resultados satisfatórios. Nesses trabalhos, o uso do Leishvacin® associou-se a taxas de cura semelhantes às obtidas com os antimoniais, mas sempre se utilizando esquemas prolongados, nos quais as séries eram várias vezes repetidas. Com a proposta de se avaliar a eficácia do uso do Leishvacin® como imunoterapia na leishmaniose cutânea, conduziu-se um ensaio clínico controlado e randomizado, aberto em decorrência da diferença das vias de administração dos medicamentos em comparação. Considerou-se como essencial que o esquema terapêutico a ser utilizado fosse aplicável em situações habituais de assistência aos pacientes com LTA. A amostra inicialmente planejada foi modificada após uma análise intermediária que mostrou resultados conclusivos quanto ao desfecho, não havendo justificativa ética para a continuidade do estudo. Foram tratados 34 pacientes com Leishvacin® e 32 pacientes com Glucantime® em série única de 20 dias, com 133 administração diária supervisionada dos medicamentos. Eram na maioria do sexo masculino (92,4%), com idade variando de 20 a 50 anos (72,7%). Todos tiveram algum exame parasitológico positivo, 92,2% com identificação do parasito por PCR, todos pertencentes ao complexo Viannia. Os pacientes foram avaliados quanto ao desfecho principal cura ou falha terapêutica ao final da série e a cada 30 dias, com tempo máximo de 90 dias de observação após a medicação. Numa análise de intenção de tratar, apresentaram cura clínica 20,6% dos pacientes do grupo do Leishvacin® e 81,3% dos pacientes do grupo do Glucantime® (p<0,001). O risco relativo de apresentar falha foi 4,25 vezes maior no grupo do Leishvacin® e a média de tempo para a ocorrência de falha terapêutica foi de 12,3 semanas (11,4; 13.3) e de 14,5 (13,6; 15,1) nos grupos do Leishvacin® e do Glucantime®, respectivamente. O efeito do tratamento manteve-se como significante após ajuste numa análise de regressão logística. O uso do Leishvacin® esteve associado a uma freqüência baixa de eventos adversos sistêmicos. O uso do antimonial associou-se a freqüência elevada de artralgia e mialgia, sintomas digestivos e confirmou a já relatada tendência de elevação da amilase sérica e enzimas hepáticas. Não houve indicação de interrupção dos esquemas terapêuticos para pacientes do estudo. O Leishvacin® não se mostrou como uma alternativa de tratamento da leishmaniose cutânea localizada no esquema e dose utilizados no presente ensaio clínico. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pentavalent antimonial is the first-choice drug for the treatment of American tegumentary leishmaniasis (ATL) but it causes relevant toxicity. The immune response established by the host constitutes a determinant factor for the evolution of this infection. Thus, it is an important goal to evaluate alternative treatments that could induce lesion healing, hypothetically, this situation would be achievable through the use of anti-leishmanial vaccination. Some reports on studies carried out with a vaccine produced in Brazil, used as a prophylactic or therapeutic against leishmaniasis, had shown good results. In those reports, cure rates with Leishvacin® were similar to the cure rates observed with pentavalent antimonial treatment, but the patient exposure to Leishvacin® was longer and repeated compared to the the exposure to antimonial. To evaluate the effectiveness of the use of the Leishvacin® as imunotherapy for cutaneous leishmaniasis, we conducted an open-label controlled randomized clinical trial, considering the difference in the administration route of Leishvacin® and Glucantime®. It was considered essential to evaluate a feasible schedule to be used in common health-care facilities which take care of the patients with ATL. An interim analysis supported the interruption of the study because of a clear inferiority observerd in the immunotherapy arm. Thirty-four and thirty-two patients were submitted to Leishvacin® and Glucantime® treatment, respectively, in only one series of 20 days, with supervised daily administration. The patients were mainly male (92.4%), with age range from 20 to 50 years (72.7%). All had had confirmation of the diagnosis based on parasitological tests, 92.2% with identification of the parasite by the PCR 135 assay. All identified parasites belong to the Viannia complex. Main outcomes were diagnosed by clinical criteria at the end of the treatment series and every 30 days thereafter. The total follow-up after treatment was three months. Intention-to-treat analysis showed cure rate of 20.6% in the Leishvacin® group and of 81.3% in the Glucantime® group (p<0.001). The relative risk of failure was 4.25 times higher in the Leishvacin® group and the mean time-to-failure were 12.3 weeks (11.4; 13.3) and 14.5 (13.6; 15.1) for Leishvacin® and Glucantime®, respectively. The effect of the treatment remained significant after adjusting by relevant co-variates in a logistic regression model. The use of Leishvacin® was associated with a low frequency of systemic adverse events. Glucantime® group showed higher frequency of arthralgia and myalgia, dyspeptic symptoms and abnormal serum amylase and hepatic enzymes levels without clinical symptoms. There was no need of Glucantime® interruption because of adverse events. Concluding, our results with Leishvacin® do not suggest that it could be an alternative against cutaneous leishmaniasis in the treatment schedule and dose used in the present trial.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2010-10-08T21:52:27Z No. of bitstreams: 1 2008-Raquel Cosmo de Lima.pdf: 2048031 bytes, checksum: 9704da2e512ab1855d9be68000c8a4f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-10-08T23:06:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008-Raquel Cosmo de Lima.pdf: 2048031 bytes, checksum: 9704da2e512ab1855d9be68000c8a4f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-08T23:06:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008-Raquel Cosmo de Lima.pdf: 2048031 bytes, checksum: 9704da2e512ab1855d9be68000c8a4f1 (MD5) / A leishmaniose é uma doença negligenciada endêmica em vários países, considerada um severo problema de saúde pública. O número de casos tem aumentado por diversos fatores, sobretudo, a co-infecção com HIV. As formas de manifestações clínicas são: tegumentar (cutânea, cutânea difusa e mucocutânea), que atinge pele e mucosas, e visceral (calazar), que atinge órgãos internos. O tratamento atualmente disponível inclui antimônio, pentamidina e anfotericina B, sendo que esses causam sérios efeitos adversos, além dos casos de resistência. O interesse em se investigar moléculas eficazes e com menor toxicidade inclui o potencial biológico de compostos extraídos de espécies vegetais. Diante disso, foi realizada uma triagem do Banco de Extratos de Plantas do Bioma Cerrado do Laboratório de Farmacognosia da Universidade de Brasília sobre formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis. O extrato hexânico da madeira da raiz de Guarea kunthiana da família Meliaceae apresentou atividade com IC100 de 125 µg/mL. O fracionamento químico biomonitorado do extrato ativo em coluna cromatográfica aberta de sílica resultou na obtenção de 19 grupos (G). Os mais ativos foram G1 (IC100 = 75 μg/mL), G5 (IC100 = 18,75 μg/mL), G8 (IC100 = 75 μg/mL) e G17 (IC100 = 37,5 μg/mL), dos quais, até o momento, temos resultados promissores para G17. O G17 permitiu o isolamento do triterpeno limonóide 22,24–diepoxitirucall-7-en-3-ona, com potencial leishmanicida, elucidado por meio de técnicas espectrométricas de ressonância magnética nuclear (RMN) de uma dimensão (1D) (1H e 13C) e bidimensional (2D) (COSY, HSQC, HMBC, NOESY), incluindo espectrometria de massa Tandem (EM-EM). Até onde conhecemos, o limonóide 22,24–diepoxitirucall-7-en-3-ona é inédito na espécie Guarea e na família Meliaceae; além de não terem sido reportados dados sobre a atividade anti-Leishmania para limonóides. O triterpenóide isolado neste trabalho é promissor para novos estudos e permitirá prosseguir na busca de opções terapêuticas para o controle da leishmaniose. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis is a neglected disease that affects many countries and is a severe public health problem. The number of cases has been increasing mainly due to Leishmania-HIV co-infection. The clinic forms include tegumentar (cutaneous, diffuse cutaneous and muco-cutaneous leishmaniasis), which affects skin and mucous membrane, and visceral (kala-azar), which affects internal organs. The available therapies include antimony, pentamidine and anphoterin B, which cause serious side effects, as well as resistance cases. Interest in investigating new active molecules with lower toxicity include compounds extracted from vegetal species. Towards this end, we performed a Bank Extract screening against Leishmania (Leishmania) amazonensis. The hexanic extract of Meliaceae family Guarea kunthiana root wood showed IC100 of 125 µg/mL. The active extract bioguided fractionating in the open silica chromatographic column produced 19 groups (G). The most active were G1 (IC100 = 75 μg/mL), G5 (IC100 = 18,75 μg/mL), G8 (IC100 = 75 μg/mL) and G17 (IC100 = 37.5 μg/mL). Until now, we have promising results for G17. G17 fractionating allowed 22,24–diepoxitirucall-7-en-3-one limoid triterpene isolation, with leishmanicidal potential. This compound was elucidated by spectrometric methods of NMR (1H NMR, 13C NMR, COSY, HSQC, HMBC, NOESY), including Tandem mass spectrometry (EM-EM). To the best of our knowledge, 22,24–diepoxitirucall-7-en-3-one limonoid is unpublished in Guarea spp. and Meliaceae family, nor is there information regarding limonoids action against Leishmania. Thus, 22,24–diepoxitirucall-7-en-3-one limonoid is promising for new studies, towards the identification alternative options for leishmaniasis control.

Orientador: Carlos Emílio Levy / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T20:01:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_LoredanaNilkenesGomesda_M.pdf: 992653 bytes, checksum: 83629306da3a0966f33f472399264f04 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: INTRODUÇÃO: As leishmanioses são um conjunto de doenças parasitárias causadas por mais de vinte espécies de tripanossomatídeos do gênero Leishmania. Afetam animais (silvestres e domésticos) e o homem. No Brasil é uma doença com diversos agentes, reservatórios e vetores que apresenta diferentes padrões de transmissão e um conhecimento ainda limitado sobre alguns aspectos epidemiológicos, o que a torna de difícil controle. OBJETIVO: Utilizar a técnica de PCR para fins diagnósticos de Leishmaniose, tanto de amostras clínicas humanas (Campinas), como de amostras caninas procedentes das cidades de Campinas/SP e Teresina/PI. MÉTODOS: Foram encaminhadas ao Laboratório de Parasitologia do Hospital de Clínicas da Unicamp, 120 amostras humanas e 195 amostras caninas. A PCR foi realizada utilizando primers específicos para o gênero Leishmania ssp. e para as espécies L. (L.) infantum chagasi e L. (V.) braziliensis. RESULTADOS: Das 120 amostras humanas, 80 eram suspeitas de leishmaniose (43 obtidas de medula óssea e 37 de biópsias e/ou raspado de lesão tegumentar). Destas, 15 foram positivas na pesquisa direta e apenas 9 foram positivas na cultura e 20 apresentaram PCR positivo para gênero. Foram utilizadas 40 amostras como controle, sendo todas negativas para o PCR. As 15 amostras que foram positivas na pesquisa direta apresentaram positividade na PCR, sendo 7 identificadas como L. (L.) infantum chagasi, 7 L. (V.) braziliensis e 1 positiva apenas para o gênero Leishmania, esta sendo procedente de amostra de punção de medula óssea. A PCR realizada nas amostras caninas, quando comparada ao teste de triagem mostrou diferença de sensibilidade do método nas duas cidades de estudo, sendo que em Campinas foi observada maior sensibilidade da PCR (88,24%) [p=0,0455] quando comparada a casuística de Teresina (14,71%) [p<0.0001]. Na comparação da PCR com o teste confirmatório foram encontrados resultados discordantes entre as técnicas de PCR e Elisa (p=0.0027 para Campinas e p<0.0001 para Teresina) para os valores de sensibilidade (Campinas=100%/Teresina=21,74%), especificidade (Campinas=30,77% / Teresina=100%), VPP (Campinas=68,97% / Teresina=100%) e VPN (Campinas=100% / Teresina=37,94%). DISCUSSÃO E CONCLUSÃO: Para o diagnostico de LV e LT em humanos a PCR mostrou excelente concordância com os testes padrão ouro, com elevada sensibilidade e especificidade. Foi possível comprovar a ausência de reações cruzadas dos primers utilizados com outros parasitos filogeneticamente próximos. A PCR apresenta-se como uma ferramenta de considerável valor para a identificação das espécies envolvidas nas infecções em cães e humanos. No diagnóstico da leishmaniose visceral canina em cidades com perfil epidemiológico como Campinas onde o surto parece ser mais recente, o desempenho da PCR mostra-se muito útil na detecção de cães infectados. Nesta população o teste de triagem se mostrou mais sensível e específico que o teste confirmatório, tendo como referência a detecção do DNA do parasito pela PCR. No caso de Teresina, com provável padrão de doença canina endêmica de longa duração a PCR não se mostrou útil para diagnóstico, exceto para detecção de poucos cães com provável parasitemia ativa ou antigenemia / Abstract: BACKGROUND: Leishmaniasis is a group of parasitic diseases caused by over twenty species of trypanosomes of the genus Leishmania. Affect animals (wild and domestic) and man. In Brazil is a disease with many agents, reservoirs and vectors presenting different patterns of transmission and there is still limited knowledge on some epidemiological aspects, which makes it difficult to control. OBJECTIVE: Using PCR for leishmaniasis diagnostic purposes, from human clinical samples (Campinas) and canine samples coming from the cities of Campinas/SP and Teresina/PI . METHODS: In the Laboratory of Parasitology of the Hospital de Clinicas Unicamp, 120 human samples and 195 canine samples were processed. PCR was performed using primers specific for the genus Leishmania ssp. and for L. (L.) infantum chagasi and L. (V.) braziliensis species. RESULTS: Among the 120 human samples, 80 were suspected of leishmaniasis (obtained 43 from bone marrow biopsies and 37 from cutaneous lesion scrapings). Of these 80 samples, only 15 were positive on direct testing, 9 were positive in culture and 20 were positive for PCR for Leishmania genus. As control were used 40 samples, all negative for PCR. The 15 samples that were positive in the direct examination were also positive in PCR , 7 identified as L. (L.) infantum chagasi, 7 L. (V.) braziliensis and only 1 positive for genus Leishmania and negative for L. (L.) i. chagasi or L. (V.) braziliensis coming from a sample of bone marrow aspiration. The PCR performed in canine samples compared to the screening test showed difference in sensitivity in both cities. In Campinas was obtained higher sensitivity of PCR (88.24 %) [p = 0.0455] when compared with the series in Teresina (14.71 %) [p<0.0001]. When compared PCR with the confirmatory testing, discordant results were found between PCR and ELISA (p=0.0027 for Campinas and p<0.0001 for Teresina) for values of sensitivity (100 %=Campinas/Teresina = 21.74 % ), specificity (Campinas = 30.77 %/Teresina = 100 %), PPV (Campinas = 68.97 %/Teresina = 100 %) and VPN (Campinas = 100 %/ Teresina = 37.94 %). DISCUSSION AND CONCLUSION: PCR showed excellent agreement with the gold standard test for the diagnosis of human VL and TL with high sensitivity and specificity. It was possible to prove the absence of cross-reactivity of the primers with other phylogenetically close parasites. PCR is presented as a tool of considerable value to identify the species involved in infections in dogs and humans. In the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in cities with epidemiological profile like Campinas, where the outbreak appears to be more recent, the performance of PCR proved to be very useful for the detection of infected dogs. In this population the screening test was more sensitive and specific than the confirmatory test, with the detection of the parasite DNA by PCR as reference. In the case of Teresina, with the probable pattern of endemic canine long-term illness, PCR was not useful for diagnosis, except for detection of few dogs with probable active parasitemia and antigenemia / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestra em Ciências

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Le parasite protozoaire Leishmania est transmis à l'homme par la piqûre de la mouche des sables. Suite à son injection, Leishmania est ingéré par une cellule du système immunitaire, le macrophage, dans laquelle il se différencie de la forme promastigote à la forme amastigote. Cette différenciation est essentielle à la survie du parasite dans l'environnement hostile que constitue la cellule du macrophage. Bien que certaines stratégies de survie du parasite aient été décrites, les protéines qui en sont responsables n'ont pas encore été identifiées. L'identification des protéines exprimées spécifiquement au stade amastigote (intracellulaire), ainsi que la compréhension des mécanismes contrôlant leur expression, pourraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou vaccinales contre ce parasite. Les objectifs de cette thèse étaient de (i) identifier un grand nombre de protéines exprimées spécifiquement au stade intracellulaire chez Leishmania (ii) obtenir une meilleure vue d'ensemble de la régulation génique chez ce parasite (iii) caractériser le mécanisme de contrôle de la traduction stade-spécifique d'une grande famille de protéines, les amastines, qui sont potentiellement impliquées dans la survie intracellulaire du parasite. Une approche protéomique a d'abord permis d'identifier un grand nombre de protéines exprimées spécifiquement dans l'un ou l'autre des deux stades du parasite. Par la suite, une étude transcriptomique a été appliquée aux gènes codant pour les protéines identifiées afin de déterminer à quel(s) niveau(x) est exercé le contrôle de leur expression. Les résultats obtenus suggèrent que la régulation aux niveaux traductionnel et post-traductionnel joue un rôle important dans l'expression génique stade-spécifique chez ce parasite. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont aussi permis de mieux caractériser le mécanisme de contrôle de la traduction stade-spécifique des protéines amastines. Nous avons démontré que des éléments distincts en 3' de la région codante étaient responsables de la stabilité et de la traduction des transcrits de l'amastine. Nous avons aussi démontré que ces deux mécanismes de régulation étaient activés par des stimuli différents au cours du stade intracellulaire. De plus, nous avons démontré que la région 3' responsable de la traduction stade-spécifique se compose de deux éléments cis indépendants. Une protéine d'environ 22 kDa se liant spécifiquement à l'un de ces éléments a été détecté. / Leishmania parasites alternate between two major developmental stages: extracellular flagellated promastigotes in the alimentary tract of the sandfly vector and intracellular amastigotes residing in macrophage phagolysosomes of the mammalian host. The cytodifferentiation of the promastigote into the amastigote form is characterized by multiple morphological and biochemical changes, which are essential for parasite survival and proliferation within the hostile environment of the phagolysosome. Although several survival strategies of the parasite have been described, few proteins responsible for its intracellular survival have been identified. Identification of proteins expressed specifically in the amastigote (intracellular) stage, as well as comprehension of the mechanisms controlling their expression, could allow development of new strategies of prevention and/or therapies against this parasite. The objectives of this thesis are (i) to identify a large number of proteins expressed specifically in the intracellular stage of Leishmania (ii) to obtain a better global view of gene regulation in this parasite (iii) to characterize the mechanism of stage-specific translational control of a large protein family, the amastins, which are potentially involved in the intracellular survival of the parasite. A proteomic approach first allowed the identification of a large number of differentially expressed proteins in Leishmania. A transcriptomic study was then applied to the genes encoding the proteins identified in order to détermine which level(s) of gene expression is (are) controlled. Our results suggest that translational and post-translational regulatory mechanisms play an important role in stage-specific gene expression in this parasite. The work presented in this thesis also allowed to better characterize the mechanism of stagespecific translational control of the amastin proteins. Our results demonstrated that distinct elements regulate stability and translation of the amastin transcript in response to distinct stimuli encountered during the parasite intracellular stage. We also better characterized the regulatory region responsible for stage-specific translational control and showed that it was composed of two independent m-acting elements. A protein of 22 kDa specifically bound to one of these elements was detected

Le parasite protozoaire Leishmania possède un cycle de vie dimorphique; le stade promastigote présent chez l'insecte vecteur et le stade amastigote présent dans les phagolysosomes des macrophages de l'hôte vertébré. L'étude des gènes exprimés préférentiellement ou spécifiquement au stade intracellulaire pourrait nous en apprendre d'avantage sur les mécanismes de survie du parasite à l'intérieur des macrophages. Parmi les gènes exprimés préférentiellement au stade amastigote nous avons identifié la famille des amastines qui codent pour des protéines de surface. Cette famille est présente chez plusieurs espèces de Leishmania où on retrouve en moyenne 50 membres. Toutes les amastines possèdent une séquence signature de 11 acides aminés qui leur est unique. La majorité des amastines sont plus abondantes au stade amastigote et cette régulation implique des séquences situées en 3'UTR. La comparaison des génomes de deux espèces de Leishmania causant des pathologies distinctes, soit L. major et L. infantum a révélé une grande conservation au niveau de la synténie du génome. Cela suggère que ce qui est responsable de chaque pathologie se situe au niveau des quelques gènes uniques à chaque espèce ou encore au niveau de l'expression différentielle des gènes communs. Pour identifier de nouveaux gènes exprimés au stade intracellulaire et également identifier des gènes impliqués dans le tropisme, une analyse du transcriptome entier a été effectuée à l'aide de la technologie de puces à ADN. Lors de cette étude, où des parasites intracellulaires ont été utilisés, les résultats ont montré que chez L. infantum, 7.1 % des gènes étaient différemment exprimés entre les deux stades tandis que 9.3% l'étaient chez L. major. Parmi ces gènes modulés très peu (=10%) sont communs aux deux espèces. Une expérience indépendante avec les puces a été réalisée avec des parasites axéniques de L. infantum, pour comparer les deux stades de développement mais aussi pour évaluer la pertinence du système de culture axénique pour les amastigotes par rapport aux amastigotes obtenus de macrophages ou d'animaux infectés. Cette expérience a révélé que 12.8% des gènes étaient modulés entre les deux stades et que parmi ces gènes très peu étaient en commun avec ceux identifiés chez les amastigotes intracellulaires.

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No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ana Flávia Chagas.pdf: 2651636 bytes, checksum: 31f422b87baf13b0e63decdbaeb0d66e (MD5) Previous issue date: 2015-09-10 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The American Cutaneous Leishmaniasis is characterized as an infectious parasitic disease, not contagious, caused by parasites of the genus Leishmania, which has a heteroxenic life cycle, alternating between hosts invertebrates and vertebrates. Leishmaniasis is a neglected disease, affecting 98 countries, estimated 1.3 million new cases each year. Patients with American cutaneous leishmaniasis may present different clinical picture, namely: the cutaneous and mucocutaneous. The cutaneous form is the most frequent and widely distributed characterized by localized skin lesions, and can display a spontaneous healing above, depending on the host immune response and Leishmania species. The mucocutaneous form manifests as lesions in the mucosa, usually ulcerative and can produce disfiguring lesions. In Brazil leishmaniasis has become endemic, with notifications of cases of leishmaniasis in all states. The first-line drug used in Brazil is the pentavalent antimoniate N- methylglucamine ( Glucantime® ) and its management is done through daily injections. As second choice drugs are sodium stibogluconate (Pentostan®), pentamidine isethionate, amphotericin B, liposomal amphotericin B, miltefosine, among others. Although efficacy of these drugs usually present, some problems may be cited as the high toxicity which induces an array of side effects which often preclude treatment continuity and resistance of some species of Leishmania. In this context it is necessary to search for new compositions which have anti- Leishmania activity and low toxicity to the patient. Based on studies on the activity of metal complexes, especially with antitumor activity, we have seen the possibility of using such complexes for the treatment of cutaneous leishmaniasis. Studies have demonstrated the potential to cover the treatment of disorders showing promising activity antimicrobial, antitumor and anti- inflammatory. This study aimed to evaluate the leishmanicidal activity six copper complexes against promastigote forms and amastigote Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania ( Viannia) guyanensis , and the complexes [Cu(thp)4]PF6 and [Cu(PCN)(HBPz3] showed higher leishmanicidal activity, respectively. / A Leishmaniose Tegumentar Americana caracteriza-se como uma doença infecto-parasitária, não contagiosa, causada por parasitos do gênero Leishmania, que possui um ciclo de vida heteroxênico, alternando entre hospedeiros invertebrados e vertebrados. A leishmaniose é uma doença negligenciada e acomete 98 países, estimando 1,3 milhões de novos casos a cada ano. Os pacientes com Leishmaniose Tegumentar Americana podem apresentar quadro clínico diferenciado, sendo eles: a forma cutânea e mucocutânea. A forma cutânea é a mais frequente e mais amplamente distribuída, caracterizando-se por lesões localizadas na pele, podendo apresentar um quadro de cura espontânea, dependendo da resposta imune do hospedeiro e da espécie de Leishmania. A forma mucocutânea manifesta-se como lesões na mucosa, normalmente ulcerativas, podendo produzir lesões desfigurantes. No Brasil a leishmaniose apresenta-se endêmica, apresentando notificações de casos de leishmaniose em todos os estados. O medicamento de primeira escolha utilizado no Brasil é o antimoniato pentavalente de N-metilglucamina (Glucantime®) e sua administração é feita por meio de injeções diárias. Como drogas de segunda escolha estão estibogluconato de sódio (Pentostan®), isetionato de pentamidina, anfotericina B, anfotericina B lipossomal, miltefosina, entre outras. Apesar desses fármacos normalmente apresentarem eficácia, alguns problemas podem ser citados como a alta toxicidade que induz a uma gama de efeitos colaterais que muitas vezes impossibilitam a continuidade do tratamento e a resistência de algumas espécies de Leishmania. Nesse contexto faz-se necessário a busca por novas composições que apresentem atividade anti-Leishmania e com baixa toxicidade ao paciente. Com base em estudos sobre a atividade de complexos metálicos, principalmente com atividade antitumoral, tem-se visto a possibilidade de utilizar esses complexos para o tratamento de leishmaniose cutânea. Estudos tem demonstrado o potencial do cobre para o tratamento de patologias apresentando atividade promissora com ação antimicrobiana, antitumoral e anti-inflamatória. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade leishmanicida de seis complexos de cobre contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) guyanensis, tendo os complexos [Cu(thp)4]PF6 e [Cu(PCN)(HBPz3] apresentado maior atividade leishmanicida, respectivamente.

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Leishmania parasites are reliant on salvage mechanisms to acquire purines from the extracellular environment. GMP reductase (GMPR) catalyzes the conversion of GMP to IMP, an integral reaction for maintaining purine nucleotide balance. Enzymatically active L. major GMPR (LmGMPR) has been cloned, expressed and purified. The LmGMPR gene complements GMPR deficiency in E. coli strains. Quaternary structure analysis indicates that LmGMPR forms tetramers and higher order complexes under reducing conditions. Kinetic assays reveal that the enzyme deviates from hyperbolic behaviour with regard to GMP but conforms to typical Michaelis-Menten kinetics for NADPH. Sequence analysis indicates that LmGMPR contains CBS domains and an MPA binding site. MPA competes for the NADPH binding site with a K i of 20 muM. ATP and GTP regulate enzymatic activity through inhibition and activation, respectively. This data indicates that LmGMPR is a novel enzyme that performs a highly regulated step in Leishmania purine metabolism.