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Investigação sobre uma atividade potenciadora da infecção murina por leishmania braziliensis exercida por moléculas parasitárias hidrossolúveisAraújo, Cintia Figueiredo de January 2013 (has links)
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Cintia Figueiredo de Araújo Investigação sobre uma atividade...2013.pdf: 1673861 bytes, checksum: b9ab47b2dff7a275b8deca0557230323 (MD5)
Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Os protozoários do gênero Leishmania são parasitos intracelulares que causam um conjunto de doenças, as leishmanioses, em milhões de pessoas no mundo. As leishmanias secretam moléculas que modulam o sistema imune do hospedeiro, contribuindo para o estabelecimento da infecção por interferirem na atividade microbicida do macrófago. Os objetivos desse trabalho foram identificar proteínas de Leishmania com atividade imunomoduladora e caracterizar essa imunomodulação. No trabalho foram avaliados os efeitos potenciadores de polipeptídeos da cinesina recombinante de Leishmania infantum, do extrato de Leishmania braziliensis (ELb) e de frações purificadas do extrato de Leishmania amazonensis (ELa), tratados ou não com inibidores de serina ou cisteína proteases, sobre a infecção por L. braziliensis, em camundongos BALB/c. Os animais foram acompanhados semanalmente, durante 6 semanas pós infecção, para a mensuração dos tamanhos das lesões. Após a eutanásia foi realizada a diluição limitante das lesões, a quantificação das concentrações de IL-4 e IL-10 da cultura em leucócitos estimulados com anti-CD3 e a semiquantificação de IgG1 e IgG2a do soro. Frações do ELa foram processadas por técnicas de espectrometria de massas para identificação de proteínas. Foi observado que frações de pesos moleculares aparentes de 28, 36, 45, 68 kDa do ELa foram capazes de potenciar a infecção por L. braziliensis, assim como um polipeptídeo da cinesina recombinante de L. infantum com motivos repetitivos e ELb contendo 5 μg de proteína. Quando as frações de 28 e 68 kDa foram tratadas com os inibidores de serina proteases, elas perderam a capacidade de potenciar a infecção por L. braziliensis, apesar de não terem sido identificadas serina proteases nessas frações por espectrometria de massas. / Leishmania are intracellular parasites that cause a group of diseases, the leishmaniases. Millions of people worldwide are infected with those protozoa. They secrete molecules that modulate the host immune system, allowing the establishment of the infection by interfering in the microbicidal activity of macrophages. The aims of this study were to identify proteins of Leishmania with immunomodulatory activity and characterize this immunomodulation. In this study the infection-enhancing effects of recombinant kinesin polypeptides of Leishmania infantum, Leishmania braziliensis extract (LbE) and purified fractions of the Leishmania amazonensis extract (LaE), treated or not with inhibitors of serine or cysteine proteases, on BALB/c mice infected with L. braziliensis. Animals were monitored weekly for 6 weeks post-infection for measuring the size of the lesion and after euthanasia were carried out at limiting dilution of the lesion, dose of IL-4 and IL-10 from culture supernatant of cells in draining lymph nodes lesion and determination of IgG1 and IgG2a serum. Fractions were processed by techniques of mass spectrometry for protein identification. Iit was seen that fractions of LaE with apparent molecular weights of 28, 36, 45, and 68 kDa were able to excarcebate the cutaneous disease caused by L. braziliensis, as were a recombinant kinesin polypeptide of L. infantum with repetitive motifs and LbE at a dose of 5 μg. However, when the fractions of 28 and 68 kDa were treated with inhibitors of serine proteases, they lost their ability to potentiate the infection by L. braziliensis, despite the fact that peptides of serine proteases were not identified in those fractions by mass spectrometry.
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Modulação da ativação de macrófagos e agravamento da infecção em modelo murino de leishmaniose tegumentar por moléculas de Leishmania (Leishmania) amazonensis / Modulação da ativação de macrófagos e agravamento da infecção em modelo murino de leishmaniose tegumentar por moléculas de Leishmania (Leishmania) amazonensisOliveira, Pablo Rafael Silveira January 2010 (has links)
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Pablo Rafael Silveira Oliveira Modulação da ativação de macrofagos e agravamento da infecção....pdf: 1352782 bytes, checksum: 6124c322249b9e7b7ed3d1afbbb270a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-01T21:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Em humanos, tanto L. amazonensis quanto L. braziliensis causam a leishmaniose
cutânea localizada, mas, no Brasil, o desenvolvimento da leishmaniose cutâneodifusa
(LCD) é exclusivamente atribuído às infecções por L. amazonensis. Por outro
lado, a leishmaniose cutâneo-mucosa (LCM) está usualmente associada à L.
braziliensis. Enquanto a LCD é caracterizada pelo elevado número de parasitos nas
lesões e pela falta de resposta celular anti-Leishmania, a LCM é geralmente
acompanhada por resposta celular intensa e baixo número de parasitos nas lesões.
Portanto, é provável que diferenças espécie-específicas sejam determinantes para o
desenvolvimento dos dois polos de responsividade imune nas leishmanioses
cutâneas. Experimentos realizados em nosso laboratório mostraram que a
imunização de camundongos BALB/c com o extrato de formas amastigotas de L.
amazonensis (ELa) confere suscetibilidade à infecção por L. braziliensis. Os
principais objetivos do presente estudo foram identificar e elucidar os mecanismos
de ação dos fatores do ELa capazes de conferir suscetibilidade à infecção
experimental por L. braziliensis. Para isso, o ELa foi fracionado por cromatografia
líquida em coluna de troca iônica. As atividades das frações obtidas foram avaliadas
quanto às suas capacidades em interferir nas funções normais de macrófagos de
BALB/c, tornando-os suscetíveis à infecção cutânea causada por L. braziliensis.
Foram preparadas quatro misturas de frações adjacentes, eluídas da coluna, que
possuíam proteínas com perfis eletroforéticos na presença de dodecil sulfato de
sódio e atividades proteolíticas semelhantes. Estas misturas de frações foram
denominadas de frações 1, 2, 3 e 4. As frações 2, 3 e 4, e não a 1, foram capazes
de agravar a doença causada por L. braziliensis. Após a ativação dos macrófagos
com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), o ELa suprimiu a produção de óxido nítrico
e das citocinas inflamatórias avaliadas (TNF-α, IL-12p70 e IL-6). De maneira oposta,
o tratamento com o ELa aumentou a produção de IL-10 por macrófagos ativados por
LPS. Nenhuma das frações contendo moléculas eluídas da coluna de troca iônica,
ou a fração efluente da coluna, foi capaz de suprimir globalmente a produção de
citocinas inflamatórias e de NO e aumentar a produção de IL-10 in vitro, como
observado com o extrato total de amastigotas de L. amazonensis, após a ativação
dos macrófagos por LPS. Apenas o tratamento in vitro com a fração 3 suprimiu a
produção de TNF-α por macrófagos. A identificação e a elucidação dos mecanismos
de ação dos fatores capazes de agravar a leishmaniose cutânea podem ser
determinantes para o desenvolvimento de estratégias para o combate de patógenos
intracelulares e também para a imunomodulação terapêutica de doenças
autoimunes e alérgicas. / In humans, infections with Leishmania (Viannia) braziliensis usually induces a
intense cellular response and few lesions restricted to the skin and/or mucous
membrane, while infections with Leishmania (Leishmania) amazonensis can cause
also a very serious form of the disease, known as diffuse cutaneous leishmaniasis, in
which there is a poor cellular response to the parasite and disseminated lesions on
the skin of the host. Most inbred strains of mice, like the BALB/c, are susceptible to L.
amazonensis and resistant to L. braziliensis infections. This parasite-related
difference could result from the activity of a L. amazonensis-specific virulence factor.
In agreement with this hypothesis, we previously demonstrated that the immunization
of BALB/c mice with L. amazonensis amastigote extract (LaE), and not with L.
braziliensis extract, confers susceptibility to L. braziliensis infection. The main
objectives of this study were to identify and elucidate the mechanisms of action of the
LaE factors that contribute to the enhancement of experimental cutaneous
leishmaniasis. The LaE was fractioned by liquid chromatography on ion-exchange
column. The collected fractions were evaluated by their ability to subvert the normal
functions of macrophages, making BALB/c mice susceptible to the infection by L.
braziliensis. The fractions 2, 3 and 4, but not the fraction 1, were able, as well as the
total extract of L. amazonensis, to aggravate the cutaneous infection. The LaE
suppressed the inflammatory cytokine production (IL-12p70, IL-6 and TNF-α) in LPSstimulated
macrophages. On the other hand, LaE increased the IL-10 production in
LPS-stimulated macrophages. None of the fractions obtained by liquid
chromatography on ion-exchange column, neither the effluent fraction were able to
down-modulate the global production of inflammatory cytokines and NO and increase
the IL-10 production in activated macrophages. The in vitro treatment with the
fraction 3 suppressed the TNF-α production in macrophages. The identification and
elucidation of the action mechanisms of the factors that aggravate cutaneous
leishmaniasis may be determinant for the development of novel strategies to combat
intracellular pathogens but also for therapeutic immunomodulation of autoimmune
and allergic diseases.
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Evolução pós-tratamento de pacientes infectados por duas espécies de Leishmania do subgênero VianniaL. braziliensis e L. naiffiSilva, Giselle Aparecida Fagundes January 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A principal estratégia para controlar a leishmaniose tegumentar Americana (LTA) seria a imunoprofilaxia. Entretanto, até o momento ainda não existe uma vacina, dificultando o controle da doença. Ademais, ainda não se conhece quais são as condições que contribuem para que indivíduos infectados evoluam sem desenvolver sinais clínicos da doença, apresentem insucesso terapêutico, ou que venham a desenvolver a forma mucosa da leishmaniose. O propósito desta tese foi avaliar a evolução pós-tratamento de casos de infecção por Leishmania naiffi (Ln) e L. braziliensis (Lb) sob dois aspectos diferentes: 1) descrever uma série de casos de LTA causados por Ln selecionados dentre trinta pacientes atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus, no período de 2011 a 2013. 2) avaliar se a assinatura imunológica, em termos de subclasses de imunoglobulina e perfil de diferenciação celular e memória, é similar entre pacientes de Lb com até 26 anos de cura após tratamento com dois diferentes esquemas terapêuticos com antimônio. Foram estudados 43 pacientes curados de leishmaniose cutânea (LCC), sendo estes divididos em dois grupos: pacientes de LCC acompanhados desde a fase ativa até três anos (a) após cura da infecção por Lb (n= 23, LCC<3a) e pacientes LCC com até 26 anos de cura da infecção por Lb (n= 12, LCC 12-26a). Além disso, 30 isolados de Leishmania de pacientes de leishmaniose cutânea (LC) proveniente da FMT-HVD foram avaliados
Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram analisadas após estímulo in vitro com antígenos de Lb. A fenotipagem das subpopulações de linfócitos T foi realizada através da citometria de fluxo quanto à ativação, imunosenescência e memória imunológica. A produção de IgG e suas subclasses anti-Leishmania foram avaliadas por ELISA. Os isolados de Leishmania foram caracterizados quanto à espécie pela técnica de isoenzimas. A presença do Leishmania RNA vírus (LRV) na Ln foi avaliada por sequenciamento. Após a cura clínica foi observada uma redução dos níveis de IgG1 e IgG3 anti-Lb (p<0.0001). O tempo de cura clínica neste estudo correlacionou-se negativamente com os valores de Índice de ELISA (IE) obtidos a partir de amostras de LCC<3a, para IgG (r= -0.79; p<0.0001), IgG1 (r=-0.64, p<0.001) e IgG3 (r= -0.4; p<0.05). As CMSP dos compartimentos de memória dos LCC 12-26a apresentaram aumento da ativação das células TME e TMC (p<0.05) frente aos antígenos de Lb, apesar de não ter sido observado expansão destes compartimentos. Foi observada uma frequência de 26,7% da Ln entre os isolados de LC. Ademais, dois pacientes de Ln evoluíram com falha terapêutica após o tratamento com antimonial ou pentamidina. Em um caso clínico foi descrita uma possível associação entre o LRV presente na Ln e o insucesso terapêutico por pentamidina
Os resultados acima indicam que: (1) após longo tempo de cura ocorre uma modulação da reposta imune de memória capaz de manter suas células ativadas, mas não expandir seus compartimentos frente a uma nova estimulação antigênica específica. Além disso, a IgG1 e IgG3 surge como uma importante ferramenta a ser utilizada no acompanhamento clínico dos pacientes. (2) Os casos de LTA por Ln podem não ser tão raros e nem ter um caráter benigno como é descrito na literatura. Estudos posteriores na região Amazônica poderão fornecer mais informação sobre a LTA causada por L. naiffi / The main strategy
to control American tegumentary leishmaniasis (AT
L)
is
immunoprophylaxis. T
o date
,
no vaccine is available to control spread of the disease.
Moreover,
is still unknown what are the conditions that contribute to infected individuals evolve without
developing clinical signs of disease, presenting therapeut
ic failure, or otherwise, will develop
mucosal leishmaniasis. Thus, the purpose of this thesis was to evaluate the evolution of post
-
treatment cases of infection with
Leishmania naiffi
(
Ln
) and
L. braziliensis
(
Lb
) under two
different aspects: 1) describe
a series of cases of ATL caused by
Ln
selected from thirty
cutaneous leishmaniasis (CL) patients attend at the FMT
-
HVD, Manaus, in the period 2011
-
2013. 2)
Evaluating
the immunological signature, in terms of immunoglobulin subclasses and
differentiation pr
ofile and memory is similar between patients
Lb
with 26 years of healing after
treatment with two different treatment regimens with antimony. We studied 43 patients cured
cutaneous leishmaniasis (CCL), which are divided into groups: CCL patients followed f
rom the
active phase to three years (y) after cure of
Lb
infection (n= 23, CCL<3y), CCL patients healed
with up 26 years after infection by
Lb
(n= 12, CCL
12
-
26y
). In addition, 30 isolates of
Leishmania
of patients with cutaneous leishmaniasis (CL) from FM
T
-
HVD were evaluated.
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were analyzed after
in vitro
stimulation with
antigen
Lb
. The phenotyping of T lymphocyte subpopulations was performed by flow cytometry
for the activation, immunological memory and immunosene
scence. The production of IgG and
its subclasses anti
-
Lb
were evaluated by ELISA. Isolates of
Leishmania
were characterized as to
species by isozyme technique. The presence of LRV in
Ln
was evaluated by sequencing. After
clinical cure was observed a reduct
ion in the levels of IgG1 and IgG3 anti
-
Lb
(
p
<0.0001). The
time of cure this clinical study was negatively correlated with the EI values
obtained from
CCL<3y samples for IgG (r=
-
0.79;
p
<0.0001), IgG1 (r =
-
0.64,
p
<0.001) and IgG3 (r=
-
0.4,
p<0.05). PBMC
of CCL
12
-
26y
patients showed increased activation of TEM and TCM cells
(
p
<0.05) when stimulated with
Lb
antigens, despite not having been observed expansion of
these compartments. A frequency 26.7% of
Ln
between CL isolates was observed. In addition,
two
Ln
patients progressed with treatment failure after treatment with antimony or pentamidine.
In a clinical case was described a possible association between the LRV present in
Ln
and
therapeutic failure by pentamidine. The above results indicate that: (1)
after long time healing
there is a modulation of the immune response of memory able to maintain its activated cells but
not expand its compartments front of new specific antigen stimulation. Moreover, IgG1 and
IgG3 appear as an important tool to be used in
clinical patient monitoring. (2) cases of LTA by
Ln
may not be as rare and even have a benign character as described in the literature. Later
studies in the Amazon region may provide more information about ATL caused by
L. naiffi
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Avaliação das subclasses de IgG em cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral, submetidos ou não a tratamento, e em animais vacinados contra a doençaGarcia, Fabiana Augusta Ikeda [UNESP] 18 February 2009 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2009-02-18Bitstream added on 2014-06-13T21:02:22Z : No. of bitstreams: 1
garcia_fai_dr_jabo.pdf: 798787 bytes, checksum: cc4872fa6b42f7f6ec29fb841ea304bd (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente estudo teve como objetivos comparar a resposta da imunoglobulina G e de suas subclasses nos seguintes grupos de animais; cães hígidos (n=45), animais sintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), animais assintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), cães portadores de leishmaniose visceral submetidos à tratamento (n=27) e animais hígidos submetidos à vacinação contra a doença (n=37). Inicialmente foram avaliadas IgG1 e IgG2 utilizando anticorpos policlonais e posteriormente as quatro subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com anticorpos monoclonais na tentativa de identificar um perfil de resposta para cada grupo de cães. As determinações sorológicas foram realizadas por meio da técnica de ELISA. A avaliação das subclasses de IgG com anticorpos policlonais não permitiu diferenciar os grupos de cães estudados. Por outro lado, com os anticorpos monoclonais observou-se que o grupo sintomático apresentou estimulação de todas as subclasses de IgG enquanto nos animais assintomáticos apenas a fração IgG1 foi estimulada. Nos cães submetidos a tratamento todas as frações encontravam-se elevadas e nos vacinados ocorreu estimulação de IgG1, IgG3 e IgG4. Desta forma, a avaliação das quatro subclasses permitiu a diferenciação entre animais portadores de leishmaniose visceral com e sem quadro clínico; entre cães vacinados e cães assintomáticos acometidos pela doença; e entre cães com leishmaniose visceral submetidos a tratamento e cães infectados assintomáticos. / The present study aimed to compare immunoglobulin G subclasses in the following groups of animals: healthy dogs (n=45); symptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); asymptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); dogs with visceral leishmaniasis submitted to treatment (n=27) and healthy dogs vaccinated for visceral leishmaniasis (n=37). First of all IgG1 and IgG2 were evaluated using polyclonals antibodies, and later the four subclasses of IgG (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) were evaluated with monoclonals antibodies, in order to identify a profile of reply for each group of dogs. Serological tests were carried out using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The evaluation of the subclasses with polyclonals antibodies did not allow to differentiate the groups of studied dogs. On the other hand, with monoclonals antibodies it was possible to verify that symptomatic dogs presented stimulation of all subclasses of IgG, while in asymptomatic animals only IgG1 was stimulated. In dogs submitted to treatment all fractions increased, and in vaccinated ones occurred stimulation of IgG1, IgG3 and IgG4. In such a way, the evaluation of the four subclasses allowed the differentiation between symptomatic and asymptomatic infected dogs; between vaccinated dogs and asymptomatic infected dogs; and between infected dogs submitted to treatment and asymptomatic infected dogs.
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Diagnóstico da leishmaniose visceral canina pelas técnicas de imunoistoquímica e PCR em tecidos cutâneos em associação com a Rifi e Elisa-testeQueiroz, Nina Marí Gual Pimenta de [UNESP] 18 December 2008 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2008-12-18Bitstream added on 2014-06-13T19:14:35Z : No. of bitstreams: 1
queiroz_nmgp_me_araca.pdf: 2616211 bytes, checksum: 581da3d4309fd8ecf96545fb137a9c18 (MD5) / A leishmaniose visceral canina (LVC) é causada pelo protozoário Leishmania (L.) chagasi e a presença deste parasita na pele dos cães reforça a importância destes animais no ciclo de vida da L. (L..) chagasi e na infecção humana. O objetivo deste trabalho foi avaliar o teste imunoistoquímico (IMIQ) e a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) em tecidos cutâneos caninos para o diagnóstico da LVC e compará-los com os exames histoquímico (HE) e sorológicos (ELISA e RIFI). Dos 34 cães naturalmente infectados, classificados em assintomáticos, oligossintomáticos e polissintomáticos, foram colhidas amostras de pele sadia ou com lesão para a realização da IMIQ, HE e PCR. Não somente peles lesionadas (56,5%), mas também peles sadias (31,8%) encontravam-se positivas pela IMIQ, confirmadas posteriormente pela PCR em 97,8% das amostras. No grupo assintomático, 87,5% estavam negativos pelos testes sorológicos, mas positivos em 50% dos casos pela IMIQ e 100% pela PCR. Entre os oligossintomáticos, 100%, 85,7% e 28,6% encontravam-se positivos, respectivamente pela PCR, sorologia e IMIQ. 91,7% dos polissintomáticos eram soro positivos e tinham parasitas intactos na pele. A PCR apresentou maior positividade, detectando amastigotas na pele de 100% dos cães independente do quadro clínico, do resultado dos exames sorológicos e do teste HE. A eficiência de cada teste variou de acordo com a evolução da doença, demonstrando a necessidade da associação de técnicas, usando IMIQ para confirmação da sorologia e a PCR apenas nos casos ainda suspeitos após a IMIQ, podendo assim aumentar os níveis de positividade e contribuir para o controle desta zoonose. / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is caused by a protozoa of the specie Leishmania (L.) chagasi and the presence of parasite in the skin reinforces the importance of dogs in the L. (L.). chagasi life cycle and for human infection. The purpose of the present study was to evaluate the immunohistichemistry (IMHC) and PCR (Polymerase Chain Reaction) tests for CVL diagnosis and compared the results with serological tests such as the indirect fluorescence antibody test (IFAT), ELISA and a parasitalogical test (microscopic direct examination of the parasite stained with haematoxylin and eosin - HE). For this study, samples of healthy or lesion skin tissues were obtained from 34 CVL naturally infected dogs classified in three groups: asymptomatic, oligosymptomatic and polisymptomatic. Not only lesion (56.5%) but also healthy skins (31.8%) were positives by IMHC and confirmed by PCR in 97.8% of skin samples. In asymptomatic group, 87.5% dogs were negatives by serological tests, but positives by IMHC in 50% and by PCR in 100%. In oligosymptomatic group, 100%, 85.7% and 28.6% of dogs were positives, respectively by PCR, serological and IMHC tests. In addition, 91.7% of polisymptomatic dogs were serum positives and had intact parasites in the skin. PCR showed higher positivity, detecting amastigotes in skins of 100% dogs regardless their clinical status or the serological or IMHC or HE test results. The efficiency of each test varied in agreement with the evolution of the disease. IMHC may be used to confirm the results of the serology and PCR only in suspicious cases after IMHC. The association of techniques proposed in this study may increase the positivity and contributed to the control of this zoonoses.
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Estudo molecular de Cepas de Leishmania (L.) Infantum Chagasi isoladas de Flebotomíneos Lu. Longipalpis de área endêmica de Leishmaniose visceral da Amazônia BrasileiraLidani, Kárita Cláudia Freitas 30 September 2013 (has links)
Resumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença endêmica em vários estados do Brasil. O agente etiológico é o protozoário Leishmania (L.) infantum chagasi e o principal vetor é o flebotomíneo da espécie Lutzomyia longipalpis. Estudos epidemiológicos têm utilizado a PCR convencional para mensurar a taxa de infecção de flebotomíneos, como estratégia para aumentar a sensibilidade diagnóstica. Entre as principais vantagens deste método destaca-se a sensibilidade e especificidade, independente do número, estágio e localização de Leishmania no trato digestivo do vetor. Nesse sentido, o presente trabalho objetivou comparar genes com diferentes números de cópias para detectar L. chagasi em área endêmica para LV da Amazônia oriental, no município de Barcarena, estado do Pará. Foram realizadas capturas de 280 fêmeas de flebotomíneos Lu. longipalpis utilizando armadilhas de luz tipo CDC, no período de novembro de 2003 a fevereiro de 2004. O DNA foi extraído a partir do inseto inteiro, sem dissecção prévia, utilizando SDS e KOAc e empregado em reações de PCR para os genes de Leishmania: mini-exon, DNA do cinetoplasto (kDNA) e subunidade ribossomal 18S (SSU-rRNA). Foram empregados os seguintes iniciadores: D1 (5'-CCAGTTTCCCGCCCCG-3') e D2 (5'-GGGGTTGGTGTAAAATAG-3') que amplificam 780pb do gene kDNA; R221 (5'-GGTTCCTTTCCTGATTTACG-3') e R332 (5'-GGCCGGTAAAGGCCGAATAG-3') que amplificam 600pb do gene da subunidade menor do ribossomo (SSU-rRNA); S1629 (5'-GGGAATTCAATAWAGTACAGAAACTG-3') e S1630 (5'-GGGAAGCTTCTGTACTWTATTGGTA-3') que amplificam 400pb do gene mini-exon. A amplificação do gene da subunidade 28S rRNA (Lu1- 5'-TGAGCTTGACTCTAGTTTGGCAC3' e Lu2 5'-AGATGTACCGCCCCAGTCAAA-3') de Lu. longipalpis foi utilizado como controle para a extração do DNA do vetor, amplificando um fragmento de aproximadamente 370pb. Do total de 280 amostras de fêmeas Lutzomyia longipalpis, 24 (8,6%) apresentaram resultados positivos para o gene kDNA; 20 (7,1%), para o gene mini-exon; e 15 (5,3%) para o gene SSU-rRNA. Assumindo o resultado da taxa de infecção natural para o kDNA, a sensibilidade dos testes para os genes mini-exon e SSU-rRNA foi de 83,3% e 63%, respectivamente. A taxa de infecção foi considerada elevada e preocupante, visto que 62,5% dos vetores infectados foram coletados no intradomicílio; 37,5%, no peridomicílio. Os dados demonstram a importância da PCR como ferramenta para investigação da epidemiologia molecular da leishmaniose visceral para a estimativa de risco de transmissão da doença em área endêmica, com maior confiabilidade para o uso do DNA do cinetoplasto do parasita como marcador.
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Avaliação dos mecanismos de ação da lectina de Cratyliamollis(Cramoll 1,4) sobre LeishmaniasppSILVA, Carina Helena da 25 February 2014 (has links)
Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:41:00Z
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Previous issue date: 2014-02-25 / CAPES / As leishmanioses são doenças endêmicas que constituem sérios problemas de saúde pública podendo levar a uma extensa mortalidade e morbidade. São classificadas em leishmanioses tegumentar (LT), e visceral (LV),provocadas por protozoários do gênero Leishmania e no Brasil as principais espécies envolvidas em sua propagação são a Leishmania amazonensis e a Leishmania chagasi para LT e LV respectivamente. Antimoniais pentavalentes são as drogas de primeira escolha, no entanto a recidiva devido à resistência dos parasitas, e os efeitos colaterais, ocasionadospela elevada toxicidade destes medicamentos tem revelado a necessidade da busca pelo tratamento adequado das leishmanioses. Cramoll 1,4, uma lectina extraída das sementes de Cratylia mollis, uma planta forrageira da família das Leguminoseae encontrada no sertão do Nordeste brasileiro, em estudos anteriores tem demonstrado o seu perfil biotecnológico, como propriedades antimicrobiana, antitumoral e antiparasitária. Diante das importantes aplicações biológicas de Cramoll 1,4 a presente pesquisa teve por objetivo analisar os mecanismos de ação desta lectina sobre L. amazonensis e L.chagasi. Os seguintes testes foram realizados: Atividade leishmanicida, análise da citotoxidade, produção de Óxido Nítrico e análise em microscopia eletrônica de transmissão. A atividade leishmanicidada de Cramoll 1,4 foi determinada através da IC50, que revelou a grande efetividade da lectina para as formas promastigotas das duas espécies de Leishmania. Cramoll 1,4 não apresentou citotoxidade frente às células de mamíferos, possuindo alto grau de seletividade para os promastigotas. A lectina induziu a síntese de Óxido Nítrico (molécula importantíssima para a resposta imunológica às infecções causadas por Leishmanias) por macrófagos, mostrando seu perfil imunomodulatório. A análise por microscopia eletrônica de transmissão revelou alterações severas causadas nos parasitas após tratamentos com Cramoll 1,4, como mudanças na morfologia, surgimento de vacúolos e desintegração das membranas celular e nuclear. Estas alterações são compatíveis com a perda de viabilidade e morte celular. Nossos resultados sugerem a Lectina Cramoll 1,4 como agente promissor no desenvolvimento de novo fármaco para o tratamento das leishmanioses visceral e tegumentar.
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Estudos de alterações funcionais de macrofagos submetidos a hipoxia no modelo in vitro da leishmaniose / Studies of funcional alterations of macrophages submetted to hypoxia in ana in vitro model of leishmaniasisDegrossoli, Adriana 08 July 2009 (has links)
Orientador: Selma Giorgio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T05:53:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2009 / Resumo: Diversas patologias provocam mudanças na pressão parcial de oxigênio, tornando o microambiente tecidual hipóxico. O interesse em analisar as alterações fenotípicas de células em hipóxia deve-se a necessidade de entender os mecanismos patológicos e a resistência aos tratamentos e ao desenvolvimento de terapias celulares. Células como os macrófagos adaptam-se a hipóxia modificando o metabolismo e a produção de citocinas. As lesões causadas pelo parasita intracelular Leishmania amazonensis são hipóxicas e o cultivo de macrófagos (células hospedeiras da Leishmania) em hipóxia induz redução da infecção com o parasita e modula a expressão de proteínas do choque térmico, indicando alterações funcionais e estruturais em ambiente hipóxico. Neste trabalho avaliamos os mecanismos responsáveis pela resistência destas células ao parasita em hipóxia e as modificações dos macrófagos causadas por este microambiente. Macrófagos cultivados em hipóxia não apresentam alterações na produção de óxido nítrico (NO) e na expressão da sua enzima produtora, óxido nítrico sintase (iNOS). Além disso, macrófagos knockout para enzima iNOS, que não produzem NO, são capazes de reduzir a infecção por L. amazonensis semelhante a macrófagos selvagens, o que sugere que o efeito leishmanicida da hipóxia não se deve ao NO. A liberação das citocinas TNF-a, IL-6, IL-12 e IL- 10 pelos macrófagos é alterada quando estes são cultivados em microambiente hipóxico. A produção destas moléculas pelos macrófagos infectados com L. amazonensis é semelhante em hipóxia e normóxia, indicando que estas citocinas não participam do efeito leishmanicida. O metabolismo energético dos macrófagos infectados, avaliado pela produção de ATP, não é modificado pela hipóxia, indicando que este fator não está envolvido na morte do parasita em macrófagos cultivados em hipóxia. Embora macrófagos fagocitem menos partículas inertes em hipóxia do que macrófagos em normóxia, a fagocitose do parasita vivo não é alterada pela hipóxia, sugerindo que o processo fagocítico também não está relacionado à diminuição da infecção pela hipóxia. Macrófagos cultivados em hipóxia aumentam a produção de ROS em relação a normóxia, mas a produção de ROS por macrófagos infectados com L. amazonensis em hipóxia não é alterada. Mas a inibição do efeito leishmanicida pelos antioxidantes N-acetilcisteína e Ebselen sugere que ROS tem papel na resistência dos macrófagos a L. amazonensis em hipóxia. A expressão de duas isoformas do fator transcricional hypoxia-inducible factor (HIF) (HIF-1alfa e 2alfa) é induzida em macrófagos cultivados em ambiente hipóxico e, interessantemente, em macrófagos infectados com L. amazonensis, mesmo quando estes são cultivados em normóxia. A inibição do HIF-1alfa pelo cloreto de cobalto impediu a sobrevivência do parasita dentro do macrófago, indicando que este fator é importante na manutenção do macrófago como célula hospedeira da L. amazonensis. Nossos resultados também demonstraram que a hipóxia alterou a capacidade proliferativa dos linfócitos T e o processamento e apresentação de antígeno de L. amazonensis pelos macrófagos. Assim, concluímos que a hipóxia induz alterações funcionais e estruturais nos macrófagos e que ROS são importantes para o efeito leishmanicida da hipóxia. Palavras-chave: Leishmania, macrófagos, hipóxia / Abstract: Regions of low oxygen tension (hypoxia) are common features of inflamed/infected tissues. The analyses of cell phenotypic alterations by hypoxia are helpful for understanding of the pathological mechanisms and treatment resistance and for the development of cellular therapies. Macrophages, cells involved in the clearance of microorganisms from infected tissues, are influenced by oxygen tension changing metabolism and cytokines production. Lesions caused by intracellular protozoan Leishmania amazonensis are hypoxic and macrophages (host cells for Leishmania) cultured in hypoxia are resistant to the infection and change heat shock proteins expression, suggesting functional and structural alterations of these cells in hypoxic microenvironment. In the present work we evaluated mechanisms involved in the macrophage resistance to the parasite as well as macrophages phenotypic alterations in hypoxia. Macrophages cultured in hypoxia did not show alterations in nitric oxide (NO) production and oxide nitric synthase (iNOS) enzyme expression. Furthermore, iNOS knockout macrophages lacking NO production are also able to reduce L. amazonensis infection as wild type macrophages, what suggests the leishmanicidal effect of hypoxia is not related to NO. The cytokines TNF-a, IL-6, IL-12 e IL-10 release is altered when macrophages are cultured in hypoxia. However, the production of these cytokines by L. amazonensis-infected macrophages in hypoxia is similar to normoxia, indicating these cytokines do not participate of the leishmanicidal effect of hypoxia. The energetic metabolism of infected macrophages, evaluated through ATP production, is not modified by hypoxia, suggesting this factor is not responsible for parasite death by macrophages cultured in hypoxia. Although the uptake of inert particles by macrophages in hypoxia is lower than in normoxia, living L. amazonensis phagocytosis by macrophages is not altered by hypoxia. This result suggests that phagocytic process is also not related to low infection in hypoxia. Cultured macrophages in hypoxia have shown higher ROS production than in normoxia, but the ROS production by L. amazonensis-infected macrophages is not altered by hypoxia. Indeed, the inhibition of leishmanicidal effect of hypoxia by antioxidants N-acetylcystein and Ebselen suggests ROS play a role in the macrophage resistance to L. amazonensis in hypoxia. The expression of two isoforms of the transcriptional factor hypoxia-inducible factor (HIF) (HIF- 1alpha e 2alpha) is induced in macrophages cultured in hypoxia and, interestingly, in L. amazonensis-infected macrophages in normoxia and hypoxia. The inhibition of HIF-1alpha by cadmium chloride impaired survival of intracellular parasite, suggesting this factor is important for macrophages as host cell for L. amazonensis. Our results also demonstrated hypoxia altered the proliferative capacity of T lymphocytes and the L. amazonensis antigen presentation by macrophages. We conclude hypoxia induces macrophages functional and structural alterations and ROS are important for the leishmanicidal effect of hypoxia. Keywords: Leishmania, macrophages, hypoxia / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular
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Utilização de inibidores enzimáticos em Leishmania amazonensis / Use of enzyme inhinibitors in Leishmania amazonensisBarbosa, Ademar Mesquita, 1973- 23 August 2018 (has links)
Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:16:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2013 / Resumo: A leishmaniose tegumentar americana é uma doença causada pelos parasitas do gênero Leishmania e atualmente, está em franca expansão em todos os estados da federação. O tratamento é problemático, tendo em vista que os fármacos preconizados são de difícil administração e com sérios efeitos colaterais. Este trabalho foi realizado com o objetivo de testar compostos sintéticos, desenvolvidos pelo grupo de Química da USP/São Carlos. A avaliação de compostos com ação sobre enzimas do metabolismo foi realizada em formas promastigotas de Leishmania amazonensis e em cultura de macrófagos peritoneais murinos. Os resultados mostraram que dos 17 compostos testados, 3 (IDs 71S, 130S e 195 que são inibidores da enzima diidroorotato desidrogenase - DHODH) foram tóxicos para promastigotas de L. amazonensis-GFP, em ensaios de contagem em microscópio óptico e medição de fluorescência em espectro-fluorimêtro, apesar de que somente o ID 71S o ID 130S foram considerados significativos pela analise estatística. Esses inibidores reduziram a infecção com amastigotas em cultura de macrófagos peritoneais murinos, mas foram tóxicos para essas culturas de macrófagos. O composto ID 195 foi tóxico para os macrófagos nas concentrações mais altas. Em outro experimento demonstrou-se que em concentrações menores o ID 195 não foi tóxico para macrófagos, mas também não reduziu o numero de amastigotas no interior dos macrófagos / Abstract: Leishmaniasis is a disease caused by parasites of the genus Leishmania and currently is expanding in all states. Treatment is problematic, given that the recommended drugs are difficult to administer and serious side effects. The present study aims to test synthetic compounds, developed by the group of Chemistry, USP / São Carlos. The evaluation of compounds that act on enzymes of metabolism was performed in promastigotes of Leishmania amazonensis in cultured murine peritoneal macrophages. The results showed that the 17 compounds tested, three IDs (71S, 130S and 195 are dehydrogenase inhibitors enzima diidroorotato - DHODH) were toxic to promastigotes of L. amazonensis-GFP, in assays counting under a light microscope and measuring fluorescence spectra-fluorometer, though only the ID of the ID 71S 130S were considered significant by statistical analysis. These inhibitors are reduced infection with amastigotes in cultured murine macrophages peritoneias but these were toxic to macrophage cultures. The compound ID 195 was toxic to macrophages at the higher concentrations. In another experiment it was shown that at concentrations below 195 the ID was not toxic to macrophages, but did not reduce the number of amastigotes inside macrophages / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia
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Sintese de neolignanas 8.O.4', derivados e analogos ativos em Leishmania / Synthesis of 8.O.4' neolignans, derivatives and active analogues in LeishmaniaAveniente, Mario 07 March 2009 (has links)
Orientador: Lauro Euclides Soares Barata / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T13:59:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2009 / Resumo: Neolignanas e lignanas são substâncias importantes, devido suas atividades biológicas e farmacológicas. Quimicamente, lignanas são dímeros resultantes do acoplamento oxidativo do ácido cinâmico e/ou álcool cinamílico, e neolignanas derivadas de alil e/ou propenil fenóis. Nesta dissertação, as sínteses de neolignanas e análogos resultaram das reações de condensação de intermediários a-bromocetonas com fenóis e tiofenóis. Reações de oxidação no enxofre de alguns análogos de neolignanas foram feitas para a obtenção dos derivados sulfóxido e sulfonas, usando ácido m-cloroperbenzóico e ácido peracético. Neolignanas-alcoóis foram obtidas via reações de redução com NaBH4, e o respectivo derivado acetato através da reação de acetilação com anidrido acético e piridina. Os análogos quirais foram obtidos da reação de cetonas aquirais com (d) e (l)-dimetil tartarato, proporcionando cetonas quirais que reagiram em seguida com bromo resultando em a-bromocetonas quirais e estas com derivados de tiofenóis, levando à quatro análogos quirais. Em pesquisas anteriores nosso grupo realizou ensaios biológicos de neolignanas e análogos em Leishmania donovani, tendo sido verificado que os análogos sulfurados apresentavam maior atividade anti-leishmania. Então, vinte e oito análogos de neolignanas sintéticos contendo S e O na ponte C-8 foram obtidos neste projeto de mestrado, sendo vinte e quatro compostos racêmicos e quatro compostos quirais. Em cooperação com o Instituto Carlos Chagas- UFRJ os vinte e oito análogos de neolignanas sintéticos foram testados in vitro em Leishmania donovani e L. amazonensis. Os resultados mostraram que quatro substâncias, dois racêmicos e seus respectivos análogos quirais, produziram significativas atividades anti-leishmania. / Abstract: Neolignans and lignans present significant biological and pharmacological activities. Chemically lignans are dimers derived from the oxidative coupling of cinnamic and/or cinnamyl alcohol, while neolignans derive from allyl and/or propenyl phenols. In this work, the synthesis of neolignans and correlated substances resulted from the condensation reactions between intermediate alpha-bromoketones with phenols and thiophenols. Sulphur oxidation reactions of certain neolignans analogues leading to neolignans-sulfoxide and sulfones respectively were also carried out, with the use of m-chloroperbenzoic and peracetic acids. Neolignans-alcohols were obtained using NaBH4 reductions while its acetate derivative was obtained from the acetylation reaction, with acetic anhydride and pyridine. The chiral reactions started with non-chiral ketones, which reacted with d/l-dimethyl-tartrate, providing chiral ketones that reacted with bromine, resulting in chiral a-bromoketone, these in their turn reacted with thiophenols leading to four chiral analogues. In previous studies conducted by our group, neolignans carrying oxygen and sulphur on the C-8 were essayed in Leishmania donovani showing that sulphur-neolignans had significant anti-leishmania activity. From the twenty-eight synthetic neolignans analogues containing O and S on the C-8 bridge obtained in this Master in Science project, twenty-four were racemic and four were chiral compounds. In cooperation with the UFRJ Carlos Chagas Institute, all substances were tested in vitro in Leishmania donovani and L. amazonensis. The results showed that four substances, two racemic and their respective chiral analogues, had significant anti-leishmania activity. / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química
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