Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6324_1.pdf: 1187846 bytes, checksum: fab93aac3ac6d96c08d4c73f504e7338 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em eucariotos, a iniciação da tradução é um processo essencial de regulação pós-transcricional da expressão gênica. Neste processo, atuam proteínas designadas eIFs (fatores de iniciação da tradução). Destas destaca-se o complexo eIF4F eIF4E, eIF4A e eIF4G que permite associar o mRNA ao ribossomo. Identificamos no genoma de Leishmania major seqüências que apresentam homologia aos componentes do eIF4F. Este trabalho contempla a caracterização de um homólogo do eIF4A (LmeIF4A2) e três homólogos eIF4G (LmeIF4G1-3). O gene LmeIF4A2 foi clonado, expresso e utilizado na produção de anticorpos. Ensaios de Western-blot sugeriram não haver expressão do LmeIF4A2 na fase promastigota de Leishmania major. Em seguida realizamos construções com os LmeIF4G1-3, fusionando-os a GST, permitindo a realização de ensaios de pull down visando investigar sua associação com as proteínas LmeIF4A1-2. O LmeIF4A2 não interage com nenhum dos LmeIF4G1-3 e o LmeIF4A1 interage especificamente com o LmeIF4G3. Em outra etapa produzimos anticorpos contra as proteínas LmeIF4G1-3 para avaliar sua expressão na forma promastigota do parasita. A expressão do LmeIF4G3 foi confirmada, todavia não detectamos a expressão dos LmeIF4G1-2. A interação eIF4G/eIF4E foi investigada em ensaios onde homólogos LmeIF4G1-3 foram incubados a homólogos LmeIF4E1-3, para tentar reconstituir parcialmente o complexo eIF4F in vitro, e testados quanto a sua afinidade pelo cap sintético. Estes resultados se mostraram inconclusivos. A utilização de novas abordagens e a caracterização dos demais fatores será importante na elucidação da tradução nestes protozoários

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6416_1.pdf: 472787 bytes, checksum: 2ac25948f3153ef1bc2889c6b54b2339 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / A Leishmaniose Visceral (LV) é uma enfermidade potencialmente fatal, sendo no Brasil causada pela Leishmania chagasi com cerca de 3.500 novos casos por ano. Está presente em quase todo o território brasileiro, mas o maior número de casos ocorre em áreas onde os serviços de saúde são pouco desenvolvidos, o que dificulta seu diagnóstico baseado principalmente nos sintomas clínicos, também comuns a outras doenças. Por esse motivo e pela falta de um tratamento não tóxico muitos trabalhos buscam estratégias que permitam um diagnóstico rápido e confiável ou a produção de uma vacina. Em um estudo anterior, foram selecionados genes codificantes para proteínas antigênicas de L. chagasi que se mostraram capazes de reagir com anticorpos de cães infectados por esse parasita e seres humanos portadores de calazar. No presente trabalho, esses genes foram seqüenciados e as seqüências analisadas para a caracterização das respectivas proteínas. Os resultados obtidos mostraram que 6 dos clones codificam 4 proteínas diferentes, compostas por regiões contendo múltiplos domínios repetitivos de tamanhos diferentes e não relacionados entre si. Essas repetições sugerem que, ao menos em L. chagasi, proteínas com regiões repetitivas podem ser melhor indutoras de imunidade humoral, podendo ser então candidatas a componentes de sistemas de diagnóstico contra a leishmaniose visceral.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo769_1.pdf: 2236218 bytes, checksum: c1045cac8144a4b1e0d6bf9c71ea3643 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As proteínas presentes na saliva dos flebotomíneos possuem uma grande importância na proteção contra parasitas do gênero Leishmania. Uma das proteínas identificadas, denominada de SP15, demonstrou ser responsável pela proteção contra a progressão da doença e aumento do tamanho da lesão em modelos animais. A elaboração de vacinas de múltiplos componentes com proteínas salivares pode ser uma forma viável para o desenvolvimento de vacinas anti-Leishmania. Partindo desta estratégia adotada para elaboração de vacinas, é necessário entender a variabilidade dos genes que codificam proteínas salivares e suas implicações nas respostas imunes dos humanos. Neste trabalho, investigamos a variabilidade genética de SP15 de populações naturais de Phlebotomus papatasi do Oriente Médio. Adicionalmente, associamos a variabilidade genética observada com a predição da estrutura secundária da proteína e possíveis epítopos de ligação a MHC classe II. Os resultados obtidos indicaram um baixo nível de variabilidade genética entre as populações oriundas do Oriente Médio, apesar da ocorrência de um grande número de haplótipos, onde alguns deles são compartilhados entre as populações distintas. Em conjunto, estas observações evidenciam a existência de fluxo gênico ou retenção de polimorfismo ancestral entre as populações e a ausência da seleção purificadora atuando sobre este gene. Para os preditos epítopos de MHC classe II, muitos foram identificados como possuindo sítios de mutação, mas pelo menos três epítopos identificados não apresentaram qualquer tipo de mutação, sugerindo que esta molécula apresenta-se moderadamente conservada e deve induzir respostas imunes uniformes nos humanos

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:59:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2826_1.pdf: 2921229 bytes, checksum: acdf158000a6895dc43606daa9342058 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As leishmanioses atigem dois milhoes de pessoas por ano, ocorrendo principalmente em países subdesenvolvidos. Além disso, muitos dos medicamentos usados para tratá-las são tóxicos, difíceis de administrar e pouco efetivos. Nesse sentido, a busca por novas drogas mais eficazes e menos tóxicas ainda é necessária. A atividade leishmanicida dos extratos das folhas de Dioclea grandiflora foi avaliada in vitro utilizando formas promastigotas de Leishmania chagasi e Leishmania amazonensis. O extrato aquoso de D. grandiflora apresentou CI50 de 300 μg/mL frente as duas espécies e induziu a produção de óxido nítrico em macrófagos peritoneais. Alterações na morfologia e motilidade das formas promastigotas de L. amazonensis foram observadas através de microscopia confocal após o tratamento com o extrato aquoso. O extrato aquoso também mostrou atividade frente cepas de Staphylococcus aureus, causador de infecções secundárias nas úlceras leishmanióticas, com CIM de 1.562 μg/mL. Os resultados, em conjunto, mostram que os extratos de Dioclea grandiflora têm potencial para o isolamento de frações e de substâncias com potencial leishmanicida

Trypanosomiases and leishmaniases are amongst the world’s most neglected infectious diseases. Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi and Leishmania major are the primary human pathogens of the trypanosomatidae family and the causative agents of African sleeping sickness, Chagas’ disease and cutaneous leishmaniasis, respectively. The molecular mechanism controlling each parasite’s life cycle and virulence is poorly understood however protein phosphatases are expected to play a critical role. This study presents the biochemical characterisation data of two groups of phosphatases from the trypanosomatids: the LRR-DSP and LM phosphatases. The LRR-DSPs are a group of twelve proteins, characterised by a unique domain architecture: a leucine-rich repeat (LRR) domain together with a dual- specificity phosphatase (DSP) catalytic domain. In this study, the recombinant expression of a representative LRR-DSP orthologue from T. brucei (TbLRR-DSP), proved to be highly problematic in E. coli. Most full-length and catalytic domain constructs were expressed at very low levels or as insoluble proteins. Soluble protein was obtained by denaturation, treatment with detergents, non-denaturing extraction from inclusion bodies and fusion to solubility-enhancing proteins. However, no method yielded protein with catalytic activity or detectable secondary structure. Soluble expression of TbLRR-DSP was achieved using baculovirus-infected insect cells, but the protein co-purified with endogenous chaperones and exhibited no catalytic activity thus implying a lack of correct folding. In the second part of this study, two phosphatases specific to Leishmania major, LM1 and LM2, were characterised and structural studies were initiated. LM2 was shown to readily hydrolyse phospho-tyrosine substrates in vitro, but not phosphoinositides like its homologue, LM1. Both proteins therefore have a differentiated catalytic profile and are likely to have different functions in vivo. Purification protocols for both proteins were established and crystallisation screenings set up. Preliminary hits were obtained for LM2 and a mutagenesis strategy was developed to improve chances of obtaining diffraction quality crystals. Recombinant LM1 samples exhibited heterogeneity and therefore will require additional engineering to improve chances of crystallization. Promising pilot NMR data was also obtained for both phosphatases. In conclusion, this study demonstrates that the recombinant expression of multi- domain trypanosomatid proteins (like the LRR-DSPs) can be highly problematic and may pose a challenge for their biochemical characterisation and functional elucidation. Future work into trypanosomatid phosphatases, however challenging, will improve our understanding of their cell biology and potentially identify therapeutic targets.

We present an atypical case of disseminated cutaneous leishmaniasis in the Sihuas district, located in the Andean valleys of Ancash-Peru. A 62-year-old man with no particular medical history presented multiple lesions located on the inferior abdomen, lumbar region and the right anterior thigh. Histological analysis found leishmanial amastigotes in the lesion sample, the Montenegro reaction was positive for Leishmania spp, and the polymerase chain reaction was positive for Leishmania peruviana. In conclusion, the atypical presentation of this disease may be related to the presence of an uncommon parasite strain or host immune deficiencies. The molecular identification of the etiology for disseminated leishmaniasis, will allow a better understanding of the presentation and proper treatment, as well as associated risk factors.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fatty acids, especially those from phospholipids (PLFA), are essential membrane components, present in a relatively constant proportion in the biological membranes under natural conditions. However, under harmful growth conditions such as diseases, environmental changes and chemical exposure, the proportion of lipids may vary. Once these changes could be identified and revel to be specific for such adverse situation, it could be used as a biomarker. Thus, the biomarkers can help, for example, to identify a virulence and resistance mechanism to a particular chemotherapeutic agent. Therefore, to make treatment more effective, a specific biomarker could lead to a better therapeutic decision, regarding candidate drugs and their indications. The objective of this study was to compare the fatty acid profiles of L. chagasi and L. amazonesis isolates resistant and sensitive to antimony (Glucantime ®) and to nitric oxide (NO). We studied 2 isolates of L. amazonensis and 8 of L. chagasi. Total lipids were extracted from lyophilized promastigotes forms in late logarithmic growth phase (50 mL; 5x108/mL cells). Fatty acid methyl esters (FAMEs) were obtained from total lipids, ester-linked lipids and ester-linked phospholipids by MIDI, ELFA and PLFA techniques respectively. FAMEs were analyzed by chromatography and mass spectrometry. Differences in FAME profiles associated with species or resistance were assessed by non-metric multidimensional scaling, multiresponse permutation procedures and indicator species analyses using PC-ORD 6.0. Previously to these analyses, molar masses of individual FAMEs were relativized by FAMEs totals within each sample. Isolates resistant and sensitive to NO and antimony had different MIDI-FAME profiles, regardless the species. However, neither ELFA nor PLFA profiles differed between sensitive and resistant isolates. The fatty acid 18:1 δ9c was increased in sensitive isolates (p<0,001), whereas an yet unidentified peak showed the opposite trend (p<0,01). We can conclude that these two fatty acids are potential biomarkers for NO and antimony resistance in L. chagasi and L. amazonesis and they can be helpful for therapeutical diagnosis. / Acidos graxos, especialmente aqueles de fosfolipideos (PLFA), sao componentes essenciais das membranas biologicas que estao em proporcao relativamente constante em condicoes naturais. No entanto, sob condicoes adversas de crescimento, como doencas, mudancas ambientais e exposicao a substancias quimicas, pode ocorrer uma variacao na proporcao dos lipideos. A identificacao destas modificacoes especificas pode revelar um biomarcador. Assim, os biomarcadores podem ajudar, por exemplo, na identificacao de um mecanismo de virulencia e de resistencia a um agente quimioterapico particular. Portanto, um biomarcador especifico pode levar a uma melhor decisao terapeutica, a respeito da indicacao e escolha de drogas, tornando o tratamento mais eficaz. O objetivo deste estudo foi comparar os perfis de acidos graxos de L. chagasi e L. amazonesis em isolados resistentes e sensiveis a antimonio (Glucantime R) e oxido nitrico (NO). Os lipidios totais foram extraidos a partir de formas promastigotas liofilizadas em fase tardia de crescimento logaritmico (50 mL celulas 5x108/mL). Foram estudados 2 isolados de L. amazonensis e 8 de L. chagasi. Os esteres metilicos de acidos graxos (FAMEs) foram obtidos a partir de lipideos totais, lipideos e fosfolipideos ester ligados, respectivamente, pelas tecnicas MIDI, ELFA e PLFA. Os FAMEs foram analisados por espectrometria de massa e cromatografia gasosa. Diferencas nos perfis de acidos graxos associadas a especies ou resistencia foram avaliadas por escalonamento multidimensional nao metrico, procedimentos de permutacao de respostas multiplas e analises indicadoras de especies, usando o PC-ORD 6.0. Anteriormente a essas analises, as massas molares individuais dos FAMEs foram relativizadas por FAMEs totais dentro de cada amostra. Os isolados resistentes e sensiveis ao NO e ao antimonio apresentaram diferentes perfis FAME-MIDI, independentemente da especie. No entanto, os perfis de ELFA e PLFA nao diferiram entre os isolados sensiveis e resistentes. O acido graxo 18:1 Â9c foi aumentado em isolados sensiveis (p <0,001), ao passo que um pico ainda nao identificado mostrou a tendencia oposta (p <0,01). Assim, podemos concluir que esses dois acidos graxos sao potenciais biomarcadores para sensibilidade e resistencia ao NO e ao antimonio em L. chagasi e L. amazonesis e podem ajudar no diagnostico terapeutico.

As repetições ricas em leucina (LRR) são domínios presentes em diversas famílias de proteínas com diferentes funções, sendo responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. Em decorrência do projeto de caracterização de um segmento do cromossomo 17 de L. amazonensis, identificamos um gene que codifica uma proteína de 72 kDa, contendo em sua região central, seis motivos LRR. Genes ortólogos estão presentes nos genomas de L. major e L. braziliensis. Observamos que o gene LRR17 é regulado de forma distinta ao longo dos ciclos biológicos de L. braziliensis e L. amazonensis. A proteína LRR17 de L. braziliensis e secretada tanto nos estágios promastigota como amastigota. Identificamos também a secreção da proteína LRR17 em promastigotas de L. amazonensis. Obtivemos mutantes hiperexpressores da proteína LRR17 em L. braziliensis e L. amazonensis. As linhagens mutantes foram mais infectivas em infecções de macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. A proteína LRR17 parece estar envolvida no processo de invasão do parasita em infecções in vitro e no estabelecimento da infecção da forma amastigota de Leishmania. / Leucine-rich repeats (LRRs) are versatile binding motifs found in a variety of proteins involved in protein-protein interactions. The LaLRR17 gene, identified initially in the L. amazonensis genome, encodes a protein with 6 LRR in its central region, that is secreted to the cytoplasm of L. amazonensis-infected macrophages. An orthologue to LaLRR17 was identified in L. braziliensis chromosome 17. LRR17 gene expression is regulated differentially during the life cycle of L. braziliensis and L. amazonensis. The LbLRR17 protein is secreted in L. braziliensis promastigotes and amastigotes. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained transgenic parasite lines of L. amazonensis overexpressing the LaLRR17 gene and of L. braziliensis overexpressing the LbLRR17 gene. The mutants were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strains, indicating that the LRR17 protein may interact with macrophage molecules, modulating the cellular response to increase parasite survival.

Objetivo: Seleccionar e identificar aptámeros de ADN capaces de reconocer con alta afinidad y de forma específica péptidos de proteínas de membrana de Leishmania braziliensis. Diseño: El presente estudio es un estudio experimental in vitro que involucra las áreas de biomedicina y biotecnología debido a que se usará péptidos sintéticos para evaluar la afinidad de unión a los aptámeros seleccionados usando la plataforma ELONA.

Phlebotomine sand flies are proven vectors of many pathogens including parasites of genus Leishmania. Leishmania develop in sand fly midgut which is colonized also by many others microorganisms, creating rich community known as gut microbiota. The presence and composition of gut microbiota affect sand fly mortality, but also development of transmitted pathogens. In contrast to mosquitoes, sand fly gut microbiota is not well studied. This thesis focuses on bacteria of the genera Asaia and Wolbachia and their potential impact on Leishmania in sand fly midgut. Thesis reports the first finding of Asaia sp. and Wolbachia sp. in sand flies from Balkan penninsula - hotspot for visceral leishmaniasis and phleboviruses. In 273 individuals from subgenera Larroussius were Asaia sp. and Wolbachia sp. detected with infection prevalence 2,5 % and 8,4 %, respectively. In addition, laboratory-reared sand flies were tested for presence of these bacteria: from twelve studied colonies, only Phlebotomus perniciosus was infected by Wolbachia sp. Then, we focussed on elimination of Wolbachia sp. from this laboratory colony with the aim to use Wolbachia-negative sand flies in future experiments with Leishmania. The final part of the thesis was dedicated to bacteria of the genus Asaia (specifically A. krungthepensis),...