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Expressão de um gene codificador de cisteína proteinase de Leishmania(Leshmania) amazonensis em sistema bacteriano e avaliação das respostas imunes induzidas pela proteína recombinante em modelo murino / Expression in bacteria of a gene encoding a cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania) amazonensis and evaluation of the immune responses induced by the recombinant protein in a murine model

Fedeli, Carlos Eduardo Cardoso [UNIFESP] January 2008 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O enfoque do nosso trabalho foi avaliar a antigenicidade de uma cisteína proteinase recombinante de Leishmania (Leishmania) amazonensis e a capacidade protetora desse antígeno contra a infecção homóloga em camundongos BALB/c. Um fragmento de 500 pb do gene Lacys24, codificador de uma isoforma de cisteína proteinase de L. (L.) amazonensis previamente clonado em nosso laboratório, foi subclonado e expresso no vetor bacteriano pHis, originando uma proteína recombinante de 24 kDa, rLacys24. Por experimentos de “Western blotting” foi demonstrado que anticorpos produzidos contra essa proteína reconhecem uma banda de 30 kDa do extrato de amastigotas de L. (L.) amazonensis, indicando que a rLacys24 corresponde a uma isoforma de cisteína proteinase de 30 kDa abundantemente expressa nesses parasitas. A antigenicidade da rLacys24 foi avaliada pela análise das populações de linfócitos dos camundongos BALB/c previamente imunizados com a proteína recombinante mais Propionibacterium acnes ou adjuvante completo de Freund (ACF) como adjuvantes. A análise por citometria de fluxo dos linfócitos provindos dos linfonodos inguinais e poplíteos dos animais imunizados com a rLacys24 + ACF por via subcutânea mostrou um aumento significante da expressão de linfócitos CD8+ comparada à dos controles que receberam apenas ACF. Quanto à CD4+ , não houve diferença na expressão dessa população de linfócitos entre os controles e os animais imunizados com a rLacys24. Por outro lado, foi baixa a expressão de linfócitos CD4+ e CD8+ no baço dos camundongos imunizados com a rLacys24 + P. acnes pela via intraperitoneal. O ensaio de citotoxicidade dos linfócitos dos camundongos imunizados com a rLacys24 + ACF foi realizado utilizando-se como células-alvo macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis. A lise dos macrófagos infectados na presença dos linfócitos dos animais imunizados com a rLacys24 foi significantemente maior que a observada quando as células-alvo foram incubadas com os linfócitos dos animais controle. A imunização ativa dos camundongos BALB/c com a rLacys24 + ACF resultou em pequeno, porém significante decréscimo das lesões das patas dos animais após o desafio com a L. (L.) amazonensis, enquanto que nos animais imunizados com a rLacys24 + P. acnes as lesões apresentaram aumento gradativo até três meses após o desafio. No outro esquema de imunização avaliado, os animais foram imunizados com a cisteína proteinase de amastigotas de L. (L.) chagasi, rLdccys, além da rLacys24, e P. acnes como adjuvante e desafiados com a L. (L.) amazonensis. A avaliação das respostas imunes dos animais imunizados foi realizada por citometira de fluxo e pela detecção por ELISPOT de IFN-γ, IL-4 e IL-10 nas culturas dos linfócitos dos animais três meses após o desafio. Em todos os animais imunizados houve predomínio da expressão de linfócitos CD4+ , enquanto que a dos linfócitos CD8+ foi baixa (em torno de 8-10%). IFN-γ foi secretado pelos linfócitos isolados de todos os animais estudados, não tendo havido diferenças significantes na secreção dessa linfocina entre os animais imunizados com os antígenos recombinantes e os controles que receberam apenas a P. acnes. Enquanto IL-10 não foi detectada nas culturas de linfócitos de nenhum dos animais imunizados, IL-4 foi secretada pelos linfócitos de todos os animais estudados. Entretanto, a expressão da IL-4 foi significantemente menor nas culturas de linfócitos dos animais imunizados com os antígenos recombinantes comparada à dos controles. Não foram observadas diferenças do tamanho das lesões das patas dos camundongos imunizados com os antígenos recombinantes em relação aos controles, sendo esses resultados confirmados quando a infecção dos animais foi avaliada pelo crescimento em meio axênico dos parasitas isolados das lesões. Apesar da reduzida proteção conferida pela rLacys24, os dados do presente trabalho sugerem que esse antígeno pode ser útil em novos esquemas de imunização que induzam respostas mediadas por linfócitos CD4+ e CD8+ mais eficazes contra a infecção pela L. (L.) amazonensis. / Our work focused on the antigenicity of a recombinant cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania) amazonensis and on the protective role of this antigen in the infection of BALB/c mice with the parasite. A 500 bp fragment from the Lacys24 gene, encoding an isoform of cysteine proteinase from L. (L.) amazonensis previously cloned in our laboratory, was subcloned and expressed in the pHis vector, resulting in a recombinant protein of 24 kDa, rLacys24. In Western blots of L. (L.) amazonensis extracts, antibodies directed to the rLacys24 antigen recognized a 30 kDa band identified as an isoform of cysteine proteinase abundantly expressed in these parasites. The antigenicity of the rLacys24 was evaluated by analysis of the T lymphocyte profile in BALB/c mice previously immunized with this recombinant protein plus either Propionibacterium acnes or Freund’s complete adjuvant (CFA). Lymphocytes isolated from the popliteal and inguinal lymph nodes of animals immunized with rLacys24 plus CFA by the subcutaneous route were analysed by fluorescence-activated cell sorter (FACS). A significantly higher expression of CD8+ lymphocytes was observed in animals immunized with rLacys24 plus CFA compared to the controls which received CFA alone. In contrast, a low expression of CD4+ lymphocytes was observed in these animals. On the other hand, the expression of CD4+ and CD8+ lymphocytes there was lower in spleens from animals immunized with rLacys24 plus P. acnes by intraperitoneal route. The cytotoxicity of lymphocytes isolated from mice immunized with rLacys24 plus CFA was assyed by use of L. (L.) amazonensis-infected macrophages as the target cells. The cytotoxicity of lymphocytes from rLacys24-immunized mice was significantly higher than that observed when the target cells were incubated with lymphocytes from control animals. Active immunization of BALB/c mice with rLacys24 plus CFA resulted in a low but significant decrease of foot lesions after challenge with L. (L.) amazonensis in comparison with the lesion size in control mice. In contrast, there was a similar increase of foot lesions among mice immunized with rLacys24 plus P. acnes or with P. acnes alone. In another immunization protocol, animals were immunized with a recombinant cysteine proteinase from L. (L.) chagasi, rLdccys1, besides rLacys24, plus P. acnes as the adjuvant. Immune responses were evaluated by FACS and ELISPOT for detection of IFN-γ, IL-4 and IL-10 in lymphocyte cultures from animals three months after challenge with L. (L.) amazonensis. All of the immunized animals showed a predominance of T CD4+ lymphocytes and a low expression of CD8+ (8-10%). IFN-γ was secreted by lymphocytes isolated from all immunized animals and there were no significant differences of IFN-γ secretion among animals immunized with the recombinant antigens or with P. acnes alone. IL-10 was not detected in lymphocyte cultures from the immunized animals. However, IL-4 expression was significantly lower in lymphocyte cultures from animals immunized with the recombinant antigens compared to the controls. There were no significant differences in foot lesion size from BALB/c mice immunized with the recombinant antigens compared to the controls; these results were confirmed by estimates of parasites isolated from the foot lesions. In spite of the low protection conferred by the rLacys24, our data suggest that this recombinant antigen may be useful in new immunization schedules aiming to elicit more efficient CD4+ and CD8+ protective responses against L. (L.) amazonensis infection. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Efeito protetor de CXCL10 em camundongos BALB/C infectados com Leishmania braziliensis / Protective effect of CXCL10 in BALB/c mice infected with Leishmania braziliensis

Guerra, Priscila Valera January 2013 (has links)
GUERRA, Priscila Valera. Efeito protetor de CXCL10 em infecção experimental por Leishmania braziliensis. 2013. 68 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-09T11:23:12Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_pvguerra.pdf: 1062693 bytes, checksum: cbcefa56a6fe8c511929d08079c527fe (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-10T10:48:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_pvguerra.pdf: 1062693 bytes, checksum: cbcefa56a6fe8c511929d08079c527fe (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-10T10:48:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_pvguerra.pdf: 1062693 bytes, checksum: cbcefa56a6fe8c511929d08079c527fe (MD5) Previous issue date: 2013 / Leishmania braziliensis is the more common etiologic agent of the cutaneous leishmaniasis in Brazil. BALB/c mice are more susceptible to L. braziliensis infection, although develop small and not ulcerated lesions. The lesions in BALB/c mice infected by L. braziliensis are accompanied by expression of a broad chemokines spectrum, including CXCL10, which is able to attract and activate NK and Th1 cells with IFN-γ production. The aim of this study was to evaluate whether the chemokine CXCL10, administered in early stages of infection could influence the course of disease, leading to a faster and more effective time of healing. Groups of BALB/c mice (n=24) were infected by L. braziliensis and divided into two groups: one group (n=12) received CXCL10 (100 ng/5μL) and the other (n=12) received PBS (5μL), at 1, 3, 5 and 7 days postinfection. Some parameters were evaluated: thickness of the lesions every three days; parasite burden in both the footpad and the draining lymph node, NO concentration, cytokines production (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α, IL-4, IL-10 and TGF-β), at 15 and 30 days after infection; and histopathological analysis of lesions. Animals receiving CXCL10 showed reduced disease duration, since the lesions started to regress earlier (12 days), whereas the control animals developed the disease for longer (15 days). CXCL10 induced statistically significant differences in parasite load in the draining lymph nodes compared with control in both times evaluated (15 days: p=0.0353; 30 days: p=0.0292). In the animals receiving CXCL10 was not observed change in the number of parasites in the site of inoculation, even with reduced thickness of the lesion, showing no correlation between lesion size and parasite load. There was no difference in NO concentration between groups with 15 days of infection, and this concentration remained the same in the group receiving CXCL10 at day 30, although it was lower than that observed in the control group. CXCL10 also induced higher levels of IFN-γ and IL-12, and reduced IL-4, IL-10, and TGF-β at 30 days postinfection, when compared to control animals. Histopathology analyses of lesions after 15 days postinfection showed a very mild inflammation in both groups, differing only for the presence of neutrophils, which were practically not observed in lesions of animals receiving CXCL10. Taken together, the data from this study showed CXCL10 chemokine presented a protective effect on L. braziliensis infection in BALB/c mice, with a reduction in the progression of the disease, associated with a higher concentration of IFN-γ and lesser of IL-4 and IL-10. / Leishmania braziliensis é o agente etiológico mais comum da leishmaniose cutânea no Brasil. Camundongos BALB/c são os mais susceptíveis à infecção por L. braziliensis, embora desenvolvam lesões pequenas e não ulceradas. As lesões em BALB/c infectados com L. braziliensis são acompanhadas pela expressão de um amplo espectro de quimiocinas, entre elas CXCL10, que é capaz de atrair a ativar células NK e Th1 com produção de IFN-γ. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a quimiocina CXCL10, administrada nos estágios iniciais da infecção, poderia alterar o curso da doença, dimunindo o tempo de cura. Para isso, camundongos BALB/c (n=24) foram infectados com L. braziliensis e divididos em dois grupos: um grupo (n=12) recebeu CXCL10 (100 ng/5µL) e o outro (n=12) PBS (5µL), nos dias 1, 3, 5 e 7 dias de infecção. Alguns parâmetros foram avaliados: a espessura das lesões a cada três dias; a carga parasitária na pata e no linfonodo de drenagem, a concentração de NO, IFN-γ, IL-12p40, TNF-α, IL-4, IL-10 e TGF-β, 15 e 30 dias após a infecção; e análise histopatológica das lesões. Os animais que receberam CXCL10 apresentaram uma redução no tempo de duração da doença, uma vez que as lesões começaram a regredir mais precocemente (12 dias), enquanto que nos animais controle (PBS) a doença evoluiu por mais tempo (15 dias). CXCL10 induziu diferenças estatisticamente significativas na carga parasitária do linfonodo de drenagem nos dois pontos avaliados, quando comparado com o controle (15 dias: p=0,0353; 30 dias: p=0,0292). Nos animais que receberam CXCL10, não foi observada mudança no número de parasitos no sítio de inoculação, mesmo com redução da espessura da lesão, mostrando que não houve correlação entre o tamanho da lesão e a carga parasitária. Não houve diferença na concentração de NO entre os grupos, no 15º dia de infecção, e esta concentração manteve-se igual no grupo que recebeu CXCL10 no 30º dia, embora tenha sido menor do que a observada no grupo controle. CXCL10 também induziu concentrações mais elevadas de IFN-γ e IL-12 e mais reduzidas de IL-4, IL-10, TGF-β 30 dias pós-infecção, quando comparados aos animais controle. A análise histopatológica das patas mostrou uma inflamação muito leve em ambos os grupos, com diferença apenas quanto à ausência de neutrófilos nas lesões dos animais que receberam CXCL10. Em conjunto, os dados mostraram que CXCL10 apresentou um efeito protetor na infecção por L. braziliensis em camundongos BALB/c, com redução no tempo de evolução da doença, associada a maior concentração de IFN-γ e menor de IL-4 e IL-10.
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Avaliação das alterações celulares induzidas pela naftopterocarpanoquinona LQB-118 em Leishmania amazonensis

Ribeiro, Grazielle Alves January 2011 (has links)
Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T17:13:19Z No. of bitstreams: 1 grazielle_a_ribeiro_ioc_bcm_0041_2011.pdf: 6422583 bytes, checksum: 60938d27c3503eecb3ae677f9a14c36e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-26T17:13:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 grazielle_a_ribeiro_ioc_bcm_0041_2011.pdf: 6422583 bytes, checksum: 60938d27c3503eecb3ae677f9a14c36e (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / As leishmanioses constituem um conjunto de doenças negligenciadas que afetam cerca de 12 milhões de indivíduos em mais de 80 países. Os medicamentos utilizados no controle da infecção estão associados à baixa eficácia, alta toxicidade, dificuldade de administração, altos custos e crescente resistência. Na busca por agentes mais eficazes, uma série de naftopterocarpanoquinonas foram projetadas e sintetizadas, das quais a LQB-118 mostrou-se a mais ativa. Esse trabalho teve como objetivo avaliar os possíveis mecanismos de ação da LQB-118 sobre Leishmania amazonensis, identificando as organelas alvo e o tipo de morte desencadeado no parasito. Alterações morfológicas foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os resultados de MEV mostraram que a LQB-118 induziu retração celular e arredondamento nas promastigotas tratadas, que tornaram-se significativamente menores. Os resultados de MET mostraram que promastigotas tratadas com 2,5μM de LQB-118 apresentaram desestruturação no complexo de Golgi e número aumentado de vacúolos no citoplasma. Promastigotas incubadas com 10μM de LQB-118 apresentaram-se com citoplasma rarefeito, compactação da cromatina, mitocôndria com matriz elétron-densa e cristas dilatadas, e protuberâncias na membrana plasmática (blebs). Ensaios realizados por citometria de fluxo mostraram que o tratamento com 5μM de LQB-118 induziu exposição de fosfatidilserina indicativa de apoptose em 30% dos parasitos. A LQB-118 induziu a perda do potencial de membrana mitocondrial (m) em 70% dos parasitos avaliados por marcação com rodamina em citometria. Essa perda do m foi confirmada por fluorimetria e mostrou ser concentração-dependente quando as promastigotas foram tratadas com 2,5, 5 e 10μM de LQB-118. O tratamento das promastigotas com 2,5, 5 e 10M de LQB-118 por 48 horas induziu fragmentação no DNA de 37%, 67% e 81% da células, respectivamente, conforme avaliado pela técnica de TUNEL. Macrófagos tratados com LQB-118 não apresentaram exposição de fosfatidilserina, perda do m, e fragmentação de DNA, mostrando que o composto age de maneira setiva sobre os parasitos. Análises realizadas por microscopia de fluorescência indicaram que esse agente também induziu fragmentação do DNA de amastigotas intracelulares de L. amazonensis, sem provocar fragmentação do DNA da célula hospedeira. Dessa forma, a LQB-118 parece provocar de maneira seletiva em L. amazonensis muitas das alterações associadas ao processo de apoptose clássico. O colapso do potencial mitocondrial do parasita pode ser um mecanismo plausível para a atividade leishmanicida da LQB-118, a partir do qual o processo de morte celular programada seria disparado. / Leishmaniasis is a complex of neglected diseases that affect approximately 12 million people in over 80 countries. The drugs used in the treatment of the infection are associated with low efficacy, high toxicity, difficult administration, high costs and increasing resistance. In the search for more effective agents, a series of naphthopterocarpanquinones were designed and synthesized, of which LQB-118 was the most active. This study aimed to evaluate the possible mechanisms of action of LQB-118 on Leishmania amazonensis, identifying the target organelles and the type of death triggered on the parasite. Morphological changes were evaluated by both scanning (SEM) and transmission (TEM) electron microscopy. SEM showed a clear parasite retraction and rounding, with a significant reduction in size. TEM revealed Golgi complex disruption and increased number of vacuoles in the cytoplasm of promastigotes treated with 2.5μM LQB118. Promastigotes incubated with 10μM LQB-118 had scarce cytoplasm, chromatin condensation, mitochondria with electron dense matrix and disrupted cristae, and blebs on the plasm membrane. Assays by flow cytometry showed that the treatment with 5μM LQB-118 induced phosphatidylserine exposure indicative of apoptosis in about 30% of parasites. The LQB-118 induced loss of m in 70% of the parasites stained with rhodamine as evaluated using cytometry. This loss of m was confirmed by fluorimetry and showed to be dose dependent when the promastigotes were treated with 2,5, 5 and 10 M LQB-118. Treatment of promastigotes with 2,5, 5 and 10M LQB-118 for 48 hours induced DNA fragmentation in 37%, 67% and 81% of cells, respectively, as evaluated by TUNEL assay. Macrophages treated with LQB-118 did not present phosphatidilserine exposure, loss in the m and DNA fragmentation, indicating that this compound acts selectively on the parasite. Analyses performed by fluorescence microscopy indicated that this compound also induced DNA fragmentation in intracellular amastigotes of L. amazonensis, but failed to induce DNA fragmentation in the host cells. Thus, LQB-118 is able to trigger in L. amazonensis promastigotes several changes associated with classical apoptosis. The collapse of mitochondrial potential of the parasite may be a plausible mechanism for the leishmanicidal activity of LQB-118, triggering the process of programmed cell death.
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Caracterização de Leishmania spp em amostras isoladas de pacientes portadores de leishmaniose tegumentar americana em área endêmica da região Norte, Brasil / Characterization of Leishmania spp in samples isolated from patients with cutaneous leishmaniasis in endemic area in Northern Brazil

Coelho, Leíla Inês de Aguiar Raposo da Câmara January 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2015-05-27T13:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 580.pdf: 1742532 bytes, checksum: 684716d3a71fb503e627b0931f084829 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) na Amazônia Ocidental, Brasil, comporta-se, dentro do padrão de transmissão modificado do ponto de vista epidemiológico, pelos diversos fatores que influenciam no ciclo da doença. A ocorrência de casos vem aumentando nos últimos anos em Manaus, com freqüência maior em áreas de assentamentos populacionais, notificados em média 600 casos/ano. Esse estudo tem como objetivo caracterizar as espécies de Leishmania spp. em amostras isoladas de pacientes com leishmaniose tegumentar americana em área endêmica da região norte, Brasil. Pacientes com leishmaniose tegumentar, procedentes de Manaus (61 por cento), região metropolitana, do interior do estado do Amazonas, Pará, Roraima e Rondônia (39 por cento) procuraram os serviços de ambulatório da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. Um total de 209 pacientes submeteu-se aos exames clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. Os exames parasitológicos foram realizados nos 209 pacientes através da técnica de escarificação de borda da lesão para a pesquisa direta; em 188 foi realizada punção aspirativa e em 21 biópsias para o isolamento do parasito em meios de cultura NNN/Schnneiders. Foi realizada a identificação e caracterização das espécies de Leishmania spp utilizando painel de anticorpos monoclonais e perfil de isoenzimas (MLEE). Dos 209 isolados 85 por cento (178/209) foram positivas na pesquisa direta e se conseguiu isolamento por cultura de todas as amostras. Na caracterização os serodemas apresentaram maior freqüência para L. (V.) guyanensis (73 por cento) 153/209, zimodemas 83 por cento(173/209). Em 13 por cento (26/209) dos isolados apresentaram mais de uma espécie de parasitos, denominado de infecção mista. Nessas infecções a L. (V.) guyanensis estava presente na maioria dos isolados. O expressivo índice de infecções mistas evidenciado demonstra a grande diversidade de espécies de Leishmania associadas à doença nesta área endêmica da região norte. Esses achados podem contribuir no seguimento de tratamento, com a perspectiva de intervenção terapêutica mais eficaz para o paciente
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Estudo morfológico e morfométrico comparativo de espécies de flebotomíneos (diptera:psychodidae:phlebotominae) dos gêneros nyssomyia barretto, 1962, bichromomyia artemiev, 1991 e migonemyia galati, 1995, vetores de leishmânias dermotrópicas, no Brasil

Godoy, Rodrigo Espíndola January 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2015-10-21T12:19:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rodrigo_godoy_ioc_mest_2012.pdf: 4319793 bytes, checksum: 12512310f752b37e87a767cc8d0a9bae (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Phlebotominae representa um dos grupos de insetos de grande importância médica, especialmente para o Brasil, estando associado à transmissão de agentes das leishmanioses tegumentar e visceral. A geração de conhecimentos sobre a morfologia e morfometria de ambos, machos e fêmeas de flebotomíneos vetores de leishmaniose tegumentar americana (LTA), poderão indicar estruturas diagnósticas importantes como subsídios para estudos filogenéticos que permitam avaliar a relação vetor -patógeno no processo de coevolução. Com isso o trabalho teve como objetivo analisar comparativamente as seguintes espécies de flebotomíneos: Nyssomyia intermedia, Ny. neivai, Ny. whitmani, Migonemyia migonei e Bichromomyia flaviscutellata, importantes vetores de Leishmania spp., causadores da LTA no Brasil. As análises morfométricas foram capazes de separar os gêneros. A análise comparativa dos flebotomíneos por morfometria geométrica e clássica, permitiu aprofundar a discussão sobre a posição taxonômica de Ny. intermedia e Ny. neivai, consideradas por alguns autores como espécies crípticas, onde houve diferença significativa em várias das estruturas analisadas, como no tamanho do centroide das asas e a razão entre os filamentos genitais e a ponta dos filamentos genitais. Através das análises de morfometria clássica e do tamanho dos centróides e as formas médias das asas, as espécies de Nyssomyia se apresentam mais próximas feneticamente de Mg. migonei, vetores de Leishmania (Viannia) braziliensis, do que de Bi. flaviscutellata, vetora de Leishmania (Leishmania) amazonensis, o que também corrobora com a separação dos gêneros Nyssomyia e Bichromomyia / Phlebotominae represents one group of insects of medical importance, especially in Brazil being associated with the transmission of agents of cutaneous and visceral leishmanias e s . The generation of knowledge about the morphology and morphometry of both male and female sandfly vectors of American c utaneous l eishmaniasis (ACL) may indicate structures as important diagnostic information for phylogenetic studies to assess the relationship of vector - pathogen coevolution . In this aspect the work was to analyze comparatively the following species of sandflies : Nyss omyia intermedia, Ny. neivai, Ny. whitmani, Migonemyia migonei and Bichromomyia flaviscutellata , important vectors of Leishmania spp ., causing leishmaniasis in Brazil. The morphometric analyzes were able to separate the genders. The comparative analysis of sandflies by classical and geometric morphometr y allowed us to discuss about the taxonomic position of Ny. intermedia and Ny. neivai , considered by some authors as cr yptic species , where significant differences were observed in several structures analyzed as the centroid size of the wings and the ratio between the genital filaments and the tip of the genital filaments . The classical morphometric analysis, size of the centroids of the wings as well as the mean forms of the wings showed Nyssomyia close st phe netically to Mg. migonei , vectors of Leishmania (Viannia) braziliensis , than Bi. flaviscutellata , vector of Leishmania (Leishmania) amazonensis , these results also corroborate with the separation of the genders Nyssomyia and Bichromomyia
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Papel do colesterol exógeno nos mecanismos de adaptação de Leishmania spp a condições de estresse metabólico e farmacológico

Andrade Neto, Valter Viana de January 2013 (has links)
Made available in DSpace on 2016-03-15T14:19:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 valter_neto_ioc_dout_2013.pdf: 5032159 bytes, checksum: 09d4b19d84fdc8d6bc1295312fe03ccd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os tripanossomatídeos não sintetizam o colesterol e sim esteróis com o esqueleto ergostano, porém um percentual significativo de colesterol exógeno é encontrado em todas as espécies de Leishmania, sugerindo um papel biológico para esta molécula. Esta tese tem como objetivo estudar a importância do uso de colesterol para Leishmania spp. em várias situações, avaliando o potencial deste sistema como um possível alvo farmacológico. A atividade dos inibidores de biossíntese de ergosterol associado com inibidores de transporte de colesterol derivado de LDL, foi avaliada em promastigotas e amastigotas intracelulares. A associação entre LBqT01 e cetoconazol, miconazol ou terbinafina mostrou sinergia. A associação entre a imipramina ou progesterona e cetoconazol ou terbinafina indicaram um efeito aditivo. O cetoconazol e miconazol demonstraram uma diminuição de até duas vezes o valor de IC50 nas formas amastigotas, quando combinado com os inibidores de transporte de colesterol. Foi observado também alteração da biossíntese de ergosterol após tratamento dos parasitos com os inibidores de transporte de colesterol, demonstrado por CG/MS. A combinação de LBqT01 e cetoconazol mostrou ser mais ativa in vivo do que cada fármaco individualmente. Estudamos também o mecanismo de resistência desses inibidores, avaliando a modulação de enzimas da via de biossíntese de esteróis e a utilização de colesterol exógeno pelos parasitos. Promastigotas de Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis e Leishmania guyanensis foram cultivadas com concentrações crescentes de sinvastatina, terbinafina e miconazol Estes inibidores mostraram um índice de resistência de 2,5 - 8 vezes. A resistência cruzada também foi avaliada, com estes inibidores e fármacos de referência (miltefosina, anfotericina B e antimônio trivalente). A expressão de genes da biossíntese de esterol e utilização do colesterol exógeno entre as cepas selvagens e resistentes, foram avaliadas por PCR em tempo real e CG/MS, respectivamente. As enzimas HMGCoA e C -14 desmetilase foram as mais moduladas, independente do fármaco utilizado, variando sua expressão nas cepas resistentes. Promastigotas de L. braziliensis resistentes à terbinafina apresentaram alteração no perfil de esteróis, L. amazonensis resistente aos três inibidores e L. guyanensis resistente ao miconazol mostraram alteração da biossíntese de esteróis e aumento na absorção do colesterol exógeno. Os resultados mostram que alguns genes foram amplificados na cepa resistente em relação à cepa selvagem. Juntos estes resultados sugerem que o colesterol desempenha um papel importante na atividade e resistência aos inibidores da biossíntese de esteróis e que o bloqueio da sua utilização pela Leishmania spp. pode ser um alvo para a síntese de novos fármacos para o tratamento da leishmaniose / The trypanosomes do not synthesize cholesterol sterols but with ergostane skeleton, but a significant percentage of exogenous cholesterol is fou nd in all species of Leishmania , suggesting a biologica l rol e for this molecule. This work aims to study the importance of use cholesterol to Leishmania spp . in several cases , evaluating the potential of the s ystem as a possible drug target . The activity of the inhibitors of ergosterol biosynthesis inhibitors associated with transport of LDL cholesterol derivative was evaluated in intracellula r amastigotes and promastigotes . The association between LBqT01 and ketoconazole , miconazol e or terbinafine showed synergy . The association bet ween imipramine or progester one, and ketoconazole , or terbinafine indica ted an additive effect . The ketoconazole and miconazole showed a reduction of up to twice the IC50 value in amastigotes when combined with the inhi bitors of cholesterol transport . Change of ergosterol biosynthesi s of parasites after treatment with inhibitors of cholesterol transport as demonstrat ed by GC/MS was also observed . The combination of LBqT01 and ketoconazole was more active in vivo than either drug individually. We also studied the mechanism of resistanc e of these inhibitors by evaluating the modulation of enzymes of the sterol biosynthesis pathway and use of exo genous cholesterol by parasites . Promastigotes of Leishmania amazonensis , Leishmania braziliensis and Leishmania guyanensis were cultured with in creasing concentrations of simvastati n, terbinafine and miconazole . These inhibitors showed resis tance index from 2.5 to 8 times . Cross - resistance was evaluated with these inhibitors an d reference drugs (miltefosine , amphot ericin B and trivalent antimony) . The expression of sterol biosynthesis genes and use of exogenous cholesterol in the wild and resistant strains were analyz ed by real - time PCR and GC / MS , respectively. The HMGCoA C and - 14 demethyl ase enzymes were more modulated, regardless of the drug u sed , varying its expression in resistant strains . Promastigotes of L. braziliensis resistant to terbinafine pres ented changes in sterol profile, L. amazonensis resistant to all three inhibitors amazonensis and L. guyanensis miconazole resistant showed alte rations in the biosynthesis of sterols and increase in the absorption of exogenous cholesterol. The results show that some genes were amplified in the resistant strain c ompared to the wild type strain . Together these results suggest that cholesterol plays an important role in the activity and resistance to inhibitors of sterol biosynthesis and blocking their use Leishmania spp . may be a target for the synthesis of new drugs for the treatment of leishmaniasis.
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Leishmaniose cutânea no estado do Ceará : aspectos históricos, clínicos e evolução terapêutica / Cutaneous leishmaniais in the state of Ceará : historical and clinical aspects and therapeutic evolution

Sousa, Anastácio de Queiroz January 2009 (has links)
SOUSA, Anastácio de Queiroz. Leishmaniose cutânea no Ceará : aspectos históricos, clínicos e evolução terapêutica. 2009. 287 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-24T13:02:10Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_aqsousa.pdf: 3937295 bytes, checksum: 23a7913c532b6643de8b65587ed11508 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-30T14:17:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_aqsousa.pdf: 3937295 bytes, checksum: 23a7913c532b6643de8b65587ed11508 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-30T14:17:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_aqsousa.pdf: 3937295 bytes, checksum: 23a7913c532b6643de8b65587ed11508 (MD5) Previous issue date: 2009 / Cutaneous leishmaniasis is an important health problem in Brazil.The disease has spread to all regions and autochtonous cases have been reported from all states. The total number of cases reported in the country from 1980 to 2005, was 613, 644. In Ceará, cutaneous leishmaniasis is an endemic disease in all regions of the state and in many municipalities hundreds of cases are reported every year. In times of epidemics the number of cases has reached more than 4000 per year. In the 28 years from 1980 to 2008, 55.925 new cases were reported in the state. The first well documented cases of cutaneous leishmaniasis in Ceará date back to 1925. Even though it causes a great impact in public health, many informations related to the knowledge of the disease are lacking in its historical, clinical and therapeutics aspect. Objective:1.To study all relevant historical aspects related to the leishmaniasis;2. To investigate when and how it emerged in Ceará, as well as who studied it; 3. To describe in a detailed form the clinical manifestations of cutaneous leishmaniasis; 4. To describe the historical evolution of therapy as well as to propose a therapeutic alternative for the disease. Methods:We consulted primary and secondary sources. Secondary sources. 1. Old books (classics) on leishmaniais; Books and articles from the beginning of the XX century by writers from Ceará as well as thesis and articles from scientific journals. 2. Archives of Libraries in Fortaleza(Ce), Salvador(BA), Rio de Janeiro(RJ), São Paulo (SP), EUA( Universidade de Virginia, Universidade de Miami) and England (London School of Tropical Medicine & Hygiene and Wellcome Foundation); 3. Search in pubmed, Medline and lilacs; 4. To search information from microfilms of newspapers and reports from the Government Province of Ceará from 1850 to 1930 in the archives of Menezes Pimentel Public Library in Fortaleza (Ce); 5. WHO home page, yahoo.com and google.com, specially for scientists biographies. Primary sources: 1. Interview with researchers, family members of old researchers that made the history. 2. Author personal archives of photographs of cutaneous leishmaniasis patients skin and mucosal lesions as well as lymph nodes. Results: The first references to the existence of the disease (in books) in Ceará are form 1909 and in government reports are from 1917. The emergence of the disease in Ceará occurred after the great drought and the smallpox epidemic (1877-1879). These phenomenons forced migration of dozens thousands of people to the Amazon, to work on rubber production. In their return they brought with them the infection and the disease found here the appropriate conditions to develop. The first documented information on the disease in the Amazon region date back to 1820. From the clinical point of view, we documented that the infection by Leishmania braziliensis causes fever, malaise and satellite lymph nodes enlargement and in some patients liver and spleen enlargement is seen. Lymph nodes aspirates demonstrated Leishmania in most patients and Leishmania was cultured from Buffy coat of one patient. Concerning therapy, 21 patients were treated with fluconazole 7mg/kg/day for an average of 7 weeks, 18 were cured, and 2 of the three that did not responded to fluconazole initially, were cured with drugs associations that included fluconazole in the therapeutic scheme. Conclusion: 1. Cutaneous leishmaniasis in Ceará is an imported disease from the Amazon region, where the condition exists since the beginning of the XIX century and had its arrival in Ceará at the end of the XIX century; 2. Leishmania braziliensis infection causes a systemic disease due to parasite dissemination and it is probable in this phase, that leishmania locates in the mucosa, where it may causes disease in a later phase; 3. Fluconazole is a therapeutic alternative for cutaneous leishmaniasis. / A leishmaniose cutânea é um importante problema de saúde no Brasil, existindo como doença autóctone em todos os estados brasileiros. No período de 1980 a 2005, foram registrados 613.644 casos no país. No Ceará, é uma doença endêmica em várias regiões e em muitos municípios faz centenas de vítimas todos os anos. Em épocas de epidemias, o número de registros tem chegado a mais de 4000 notificações por ano. Nos últimos 28 anos (1980-2008) foram diagnosticados 55.925 pessoas acometidas da doença, o que reflete uma média de 2000 vítimas de leishmaniose cutânea por ano. Sabe-se que os primeiros registros da doença no Ceará datam de 1925. Apesar de ter todo este impacto na saúde pública do estado, existem muitas lacunas no conhecimento desta infecção, quer seja do ponto de vista histórico; do ponto de vista clínico e relacionadas ao tratamento. Objetivo: Fazer um levantamento sobre os aspectos históricos e as descobertas mais relevantes relacionadas às leishmanioses; investigar quando e como foi introduzida no estado do Ceará, bem como seus descobridores; descrever de modo detalhado as manifestações clínicas da leishmaniose cutânea no Ceará; relatar a evolução histórica do tratamento, bem como apresentar uma alternativa de tratamento para a leishmaniose cutânea. Metodologia: Foram consultadas fontes primárias e fontes secundárias. Fontes Secundárias 1. Livros textos clássicos sobre leishmaniose; livros de escritores cearenses sobre tema envolvendo saúde do início do século passado; teses; artigos de revistas científicas. 2. Acervo de bibliotecas em Fortaleza (CE), Salvador (BA), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo(SP), Estados Unidos (Universidade de Virgínia, Universidade de Miami) e Inglaterra (London School of Tropical Medicine & Hygiene e Fundação Wellcome). 3. Pesquisas no Pubmed, Lilacs e Medline; 4. Pesquisa de microfilmes de jornais e de Relatórios da Provincia do Ceará, do período de 1850 a 1930, do Acervo da Biblioteca Pública Menezes Pimentel (Fortaleza-CE). 5. Pesquisa nas páginas da OMS e do yahoo e google, em especial para as biografias. Fontes Primárias: 1. Entrevistas com pesquisadores que viveram a história da leishmaniose, com familiares de pesquisadores que fizeram a história; 2. Dados e fotografias de lesões de pacientes de acervo pessoal. Resultados: Os primeiros registros da doença (em livros) no Ceará são de 1909 e registros oficiais (documentos de governo) somente existem a partir de 1917. O surgimento da leishmaniose cutanea ocorreu após a grande seca e a epidemia de varíola (1877-1879), que forçaram a migração de milhares de cearenses para a região Amazônica, para trabalhar na exploração da borracha. Ao retornarem para o Ceará trouxeram a infecção, que aqui encontrou condições propícias para se transmitir. Os primeiros registros da leishmaniose na Amazônia datam de 1820. Do ponto de vista clínico observamos que a infecção pela Leishmania braziliensis causa febre, adinamia e linfadenopatia satélite e alguns pacientes apresentam hepatoesplenomegalia. O aspirado dos linfonodos mostrou, na maioria dos casos, a presença de leishmania e a cultura do creme leucocitário em um paciente isolou o parasita. Do ponto de vista terapêutico, de 21 pacientes tratados com fluconazol na dose de 7mg/kg/dia, durante uma média de 7 semanas, 18 tiveram as úlceras totalmente cicatrizadas e dois pacientes dos três que inicialmente não responderam, obtendo a cura com associações de medicamentos que incluíram o fluconazol como uma das drogas administradas. Conclusão: A leishmaniose cutânea do Ceará é uma doença importada da Amazônia, onde a enfermidade já existia desde o início do século XIX e que deve ter chegado no Ceará antes do inicio do século XX; a infecção pela Leishmania braziliensis causa uma doença sistêmica devido ao parasitismo e é provavelmente nesta fase que a leishmania se localiza nas mucosas onde poderá causar doença mais tarde; o fluconazol é uma alternativa para o tratmento da leishmaniose cutânea.
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Análise proteômica de isolados de Leishmania (Leishmania) chagasi sensíveis e resistente à Miltefosina.

TRINDADE, J. B. C. 05 April 2011 (has links)
Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_4754_.pdf: 2849281 bytes, checksum: c3db49853a54a0d93c32aa4621d48f0d (MD5) Previous issue date: 2011-04-05 / Leishmaniose visceral (LV) é uma doença sistêmica, fatal se não tratada, causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania complexo donovani, o qual abriga a espécie L. chagasi. O tratamento da LV conta com poucas opções terapêuticas, incluindo os antimoniais petnavalentes, anfotericina B e a miltefosina. A miltefosina foi recentemente aprovada como a primeira droga de administração oral para o tratamento da LV. Os mecanismos de resistência à miltefosina estão sendo elucidados em linhagens experimentais de Leishmania spp. resistentes a esta droga. Entretanto, os mecnaismos de resistência à miltefosina em isolados clínicos de Leishmania são poucos conhecidos. Neste estudo foi utilizada a técnica de eletroforese bidimensional acoplada à espectrometria de massas com o objetivo de destacar e identificar proteínas que são diferencialmente experessas entre formas promastigotas de isolados clínicos de L. chagasi sensíveis (S: S1 e S2) e resistentes (R: R1 e R2) Pa miltefosina, obtidos de pacientes com LV que participaram de um estudo clínico realizado no Brasil para avaliar a eficácia dessa droga. Os perfis protéicos obtidos dos isolados clínicos apresentaram em média 459 "spots" correpondendo a 5,7% dos produtos gênicos prditos para Leishmania spp. A análise comparativa entre os perfis protéicos dos isolados clínicos S e R permitiu a detecção de 80 "spots" diferencialmente expressos. Desses 18 "spots" foram encontrados exclusivamente no perfil do grupo S e apenas 1 no grupo R, enquanto 48 "spots" apresentaram diferença quantitativa na expressão protéica entre os grupos. Os demais "spots" foram encontrados em um único isolado (7 em S1, 3 em S2 e 2 em R1) ou em três isolados simultaneamente (1 em S1, S2 e R1). A análise deses "spots" por expectrometria de massas em sistema MALDI/TOF-TOF identificou 49 "spots" (61,3%), os quais correspondem a 32 proteínas distintas e 7 proteínas hipotéticas. Entre proteínas identificadas, a peroxirredoxina (expressão aumentada em R) e uma cistéino peptidase semelhante à calpaína (exclusica do grupo S) forma destacadas por indicar que os isolados resistentes são menos susceptíveis ao processo de morte celular programada. Estes dados sugerem que estas proteínas podem estar relacionadas com o fenótipo resistência à miltefosina. PALAVRAS CHAVES: Leishmania chagasi, miltefosina, resistência, proteoma.
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Comparação dos métodos parasitológico, imunológico e molecular na detecção de Leishmaniose Tegumentar Americana no estado de Santa Catarina

Machado, Priscilla Emmanuelle January 2004 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T16:19:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 202333.pdf: 3239923 bytes, checksum: 183f5c1614e5718a56e46b2b07869aa4 (MD5) / O presente estudo teve como objetivo verificar a eficácia da PCR no diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) em pacientes do Estado de Santa Catarina comparando com a microscopia e intradermorreação. Duas formas de preservação das amostras e de extração de DNA foram testadas: imprinted em papel de nitrocelulose (NP) e imersão em etanol 70% (EB). A extração do imprinted em papel de nitrocelulose (NP) foi realizada por eluição e a imersão em etanol 70% (EB) pelo método do fenol-clorofórmio. As amostras foram analisadas por PCR, utilizando oligonucleotídeos direcionados a região conservada do minicírculo do DNA cinetoplástico (kDNA). A microscopia detectou a presença de Leishmania sp. 80% das 55 amostras analisadas enquanto a PCR detectou a presença de Leishmania sp. em 74,5% das 55 amostras e em 75,5% de 45 amostras de pacientes submetidos ao Teste de Montenegro. A extração de DNA pelo fenol-clorofórmio das amostras EB mostrou-se mais eficiente quando comparada com a extração por eluição das amostras NP. Além disso, a PCR-RFLP foi empregada para a identificação das espécies de Leishmania das amostras de pacientes. A maioria das amostras foi identificada como L. (Viannia) braziliensis. Este trabalho sugere o uso da PCR para a confirmação dos casos de ACL onde a microscopia ou intradermorreação sejam negativas e mostra a predominância de L. (V.) braziliensis como espécie causadora da LTA em SC.
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Dinâmica populacional de minicírculos de cinetoplastos em Leishmania infantum chagasi

Gushi, Letícia Tsieme [UNESP] 25 July 2012 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-25Bitstream added on 2014-06-13T19:02:42Z : No. of bitstreams: 1 gushi_lt_dr_botib.pdf: 860668 bytes, checksum: f4640ec40c34a33b45f1c604d7f189d2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Leishmaniose Visceral Americana (LVA) é uma doença tropical negligenciada em expansão no Brasil, ocorrendo em áreas onde antes não havia registro. Seu agente etiológico e a Leishmania chagasi um protozoário pertencente à classe Kinetoplastida caracterizada por uma organela denominada cinetoplasto a qual possui um DNA organizado em uma rede contendo maxicírculos, responsáveis pelas funções respiratórias e minicírculos, envolvidos na pordução de RNAs-guia, os quais possuem um papel importante na edição dos RNAs dos maxicírculos. Os minicírculos são divididos em uma região convervada de aproximadamente 120 p.b. e uma região variável de aproximadamente 600 p.b. O foco desse estudo está na análise das seqüências da região variável a fim de entender sua distribuição nos diferentes estágios de vida da L. chagasi. As amostras foram coletadas de cães e pacientes sintomáticos por aspiração dos linfonodos e, em alguns casos, foram obtidas culturas primárias. A extração do DNA foi realizada com o kit comercial Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) seguindo as instruções do protocolo. O kDNA foi amplificado por PCR, utilizando o par de oligonucleotídeos LIN R4 - forward (5’-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) e LIN 19 - reverse (5’-GAA CGC CCC TAC CCG-3’), produzindo um fragmento de aproximadamente 720 p.b. Os produtos da PCR foram clonados no vetor pTZ57R/T de acordo com o protocolo do InsTAclone PCR cloning kit. As seqüências (aproximadamente 182) foram individualmente comparadas com as depositadas no GenBank, alinhadas com o software Clustal X2 e tiveram uma árvore filogenética construída utilizando o software MEGA 4.0 adotando o algoritmo UPGMA e escolhendo um bootstrap com 1000 replicatas. A distribuição entre os diferentes hospedeiros foi homogênea. A princípio, um lato polimorfismo é observado, mas... / American Visceral Leishmaniasis (AVL) is a neglected tropical disease in expansion in Brazil currently occurring in areas where there has never been reports. Its etiologic agent is Leishmania chagasi, a protozoan belonging to the order Kinetoplastida characterized by an organelle named kinetoplast wich has a DNA organized in a network containing maxicircles, responsible for respiratory functions and minicircles, involved in the production of guide RNAs, which play a role in the RNA editing of maxicircles. The minicircles are divided into an approximately 120 b.p. conserved region and an approximately 600 b.p. variable region. The focus of this study is on the sequence analysis of the minicircles variable region in order to understand its distribution on different life stages of L. chagasi. Samples were collected from dogs and symptomatic patients by lymphonod aspiration and, in some cases, primary cultures were obtained. DNA extraction was carried out with the commercial kit Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) following its protocol. kDNA was amplified by PCR, using a pair of oligonucleotides LIN R4 - forward (5’-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) and LIN 19 - reverse (5’-GAA CGC CCC TAC CCG-3’), producing a fragment of 720 b.p. PCR products were cloned in pTZ57R/T vector according to the InsTAclone PCR cloning kit protocol. Sequences (182) were individually compared with the ones deposited at the GENBANK, aligned with Clustal X2 software and had a phylogenetic tree constructed utilizing MEGA 4.0 software adopting UPGMA algorithm and choosing bootstrap with 1000 replicates. Sequences distribution among different hosts was homogeneous. At first, high polymorphism is observed but, when analyzed in more detail, i.e. by branch, sequences proved to be conserved and minimal SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was found... (Complete abstract click electronic access below)

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