Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-10-29T14:03:53Z No. of bitstreams: 1 Niara de Jesus Almeida.Avaliação...2014.pdf: 2142198 bytes, checksum: c0f1caa073f88305a34bffb0a94263ff (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-29T14:03:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Niara de Jesus Almeida.Avaliação...2014.pdf: 2142198 bytes, checksum: c0f1caa073f88305a34bffb0a94263ff (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Camundongos CBA são resistentes à infecção por Leishmania major e permissivos à infecção por L. amazonensis. Adicionalmente, macrófagos de camundongos CBA controlam à infecção por L. major, mas não por L. mazonensis in vitro. Em estudo comparativo realizado por nosso grupo foi demonstrado que o receptor scavenger MARCO teve expressão aumentada em resposta à infecção por L. major, mas não na infecção por L. amazonensis. Ainda, o bloqueio do receptor com o anticorpo específico reduziu a infecção por L. major em 30%, indicando que esta proteína tem participação no reconhecimento de promastigotas de L. major em macrófagos de CBA. Assim, nossa hipótese é que o receptor MARCO participa do reconhecimento e fagocitose de L. major por macrófagos, direcionando o curso da infecção. O objetivo do presente estudo consistiu em evidenciar o papel do receptor MARCO na infecção de macrófagos por L. major. Inicialmente, células J774 foram transfectadas com os vetores pcDNA3.1-MARCO (J774-MARCO) ou pcDNA3.1 (J774-MOCK). Foi observado que a expressão do gene do MARCO foi cinco vezes maior nas células J774-MARCO em comparação às células J774-MOCK. Ao avaliarmos o efeito da superexpressão sobre o metabolismo de células J774-MARCO foi observado que a atividade metabólica mitocondrial foi maior nos clones J774-MARCO e J774-MOCK, 14% e 39% respectivamente, em comparação com as células J774 controle não transfectadas. Entretanto, a diferença no metabolismo não alterou a viabilidade celular dos clones transfectados. A superexpressão de MARCO não aumentou a ligação de L. major em células J774, mas favoreceu tanto o aumento no percentual de infecção de L. major como o número de parasitos/célula nos tempos iniciais até 24 h após a infecção (p ≤ 0,05). Adicionalmente, foi investigado se MARCO estaria induzindo modificações na membrana celular que favorecessem a entrada de L. major. Foi demonstrado que as células superexpressando MARCO (67%) apresentaram um maior espraiamento da membrana celular, com a formação de lamelipódios e estruturas semelhantes a filopódios, eventos observados em um número reduzido de células J774-MOCK (24%). Ao avaliarmos o efeito da superexpressão de MARCO na produção de quimiocinas e citocinas durante a infecção por L. major foi observado que a adição de L. major induziu níveis significativamente maiores de MCP-1 e TNF-α nos tempos de 24 e 48 h após a infecção em comparação com as células J774-MOCK (p < 0,01). Níveis maiores de IL-6 foram observados após 48 h de infecção por L. major nas células J774-MARCO em comparação às células controle (p < 0,05). Similarmente, em resposta à infecção por L. major, células J774-MARCO produziram maior quantidade de NO nos tempos de 24 (p < 0,001) e 48 h (p < 0,01) após a infecção. Todavia, a superexpressão de MARCO não teve efeito sobre a sobrevivência intracelular do parasito. Em suma, nossos achados sugerem que a superexpressão do receptor scavenger MARCO favorece a entrada de L. major em células J774, além de desencadear uma resposta imune efetora direcionando o curso da infecção por Leishmania. / CBA mice are resistant to Leishmania major yet permissive to L. amazonensis infection. In addition, CBA macrophages control L. major, but not L. amazonensis infection in vitro. In a comparative study performed by our group increase in expression of the scavenger receptor MARCO has been detected in response to L. major, but not to L. amazonensis infection. Moreover, ED31 monoclonal antibody against MARCO reduced by 30% L. major infection in CBA macrophages. These findings indicate that MARCO plays a role in L. major recognition by CBA macrophages. We hypothesized that MARCO receptor participates in the recognition and phagocytosis of L. major by macrophages, directing the outcome of infection. In the present study, we aimed to further disclose the role MARCO plays in L. major infection of murine macrophages. First J774 cells were transfected with pcDNA3.1-MARCO vector (MARCO-J774) or pcDNA3.1 vector (MOCK-J774). Expression of MARCO gene shown to be five times higher in MARCO-J774 cells compared to MOCK-J774 cells. Overexpression of MARCO enhanced mitochondrial metabolic activity in 14% and 39% of both MARCO-J774 and MOCK-J774, respectively, when compared to the control non-transfected J774 cells. However, enhancement in mitochondrial metabolic activity did not alter the cell viability of transfected clones. MARCO overexpression did not increase the binding of L. major in J774 cells, but increased both the percentage of infection of L. major and the number of parasites / cell until 24 h after infection (p ≤ 0,05). Additionally, we investigated whether MARCO be inducing changes in cell membrane that would favor L. major uptake by macrophages. We observed that MARCO-J774 cells (67%) showed a pronounced spread of cell membranes, with short microvilli and lamellipodia, events observed in a reduced number of MOCK-J774 (24%). Then, we evaluated production of pro-inflammatory chemokine and cytokine induced by L. major in MARCO-J774 cells. L. major addition to MARCO-J774 cells induced higher significantly levels of MCP-1 and TNF-α compared to MOCK-J774 cells at 24 and 48 h post infection (p < 0,01). Higher levels of IL-6 were also observed at 48 h of L. major infection in MARCO-J774 cells compared to control (p < 0,05). Similarly, NO production induced by L. major was much more higher in MARCO-J774 cells compared to MOCK-J774 at 24 and 48 h post infection (p ≤ 0,01). Although in MARCO-overexpressing cells, enhancement in pro-inflammatory chemokines and cytokines in response to L. major has been observed, no effect on parasite intracellular survival has been detected. In summary, our findings suggest that the scavenger receptor MARCO overexpression favors the entry of L. major in J774 cells, and trigger an effector immune response that directs outcome of Leishmania infection.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T16:07:48Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_FabianadaSilvaVieiraMatrangolo.pdf: 1842322 bytes, checksum: 73bd382ffd0cc26f8f984240d3143696 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T16:07:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_FabianadaSilvaVieiraMatrangolo.pdf: 1842322 bytes, checksum: 73bd382ffd0cc26f8f984240d3143696 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T16:08:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_FabianadaSilvaVieiraMatrangolo.pdf: 1842322 bytes, checksum: 73bd382ffd0cc26f8f984240d3143696 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T16:08:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_FabianadaSilvaVieiraMatrangolo.pdf: 1842322 bytes, checksum: 73bd382ffd0cc26f8f984240d3143696 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A emergência de espécies de Leishmania resistentes ao antimonial é um grave problema em vários países. A quimioterapia é a medida mais importante para o controle das leishmanioses, visto que não existe ainda uma vacina eficiente para uso em humanos. Além disso, o controle vetorial é difícil em razão das características ambientais muito diversas e da existência de um grande número de reservatórios domésticos e silvestres dificulta também o controle. Os antimoniais pentavalentes, SbV, são os medicamentos de primeira escolha no tratamento de todas as formas de leishmaniose em vários países. Apesar de serem amplamente utilizados na quimioterapia das leishmanioses por mais de setenta anos, apresentam alta toxicidade no tratamento clínico. Também, alguns pacientes são resistentes ao tratamento clínico com esses compostos. Neste trabalho, realizou-se uma análise proteômica comparativa entre linhagens de L. braziliensis e L. infantum sensíveis e resistentes ao SbIII mediante a utilização da metodologia 2-DE, seguida por espectrometria de massas (LC/MS/MS). Nesta tese utiliza-se a nomenclatura L. infantum (syn. L. chagasi). A análise comparativa dos perfis proteômicos entre as linhagens de Leishmania analisadas revelou que 192 spots foram únicos e/ou mais abundantes. Dos 132 spots proteicos submetidos à análise por MS, 80 foram identificados correspondendo a 57 proteínas distintas. A análise comparativa dos dados mostrou que a maioria das proteínas com abundância diferencial em ambas as espécies está envolvida na defesa antioxidante, na resposta geral ao estresse, no metabolismo de glicose e de aminoácidos e na organização do citoesqueleto. Cinco proteínas foram mais abundantes em ambas as linhagens de Leishmania resistentes ao SbIII: triparedoxina peroxidase, alfa-tubulina, HSP83, HSP70 e HSP60. Os ensaios de Western blotting 1-DE e 2-DE confirmaram os dados da análise proteômica. Estes ensaios revelaram que a ciclofilina-A é menos expressa em ambas as linhagens resistentes, LbSbR e LcSbR. De outro lado, a pteridina redutase é mais expressa na linhagem resistente LbSbR e apresenta nível de expressão similar entre as linhagens sensíveis e resistentes de L. infantum. A triparedoxina peroxidase é mais abundante em ambas as linhagens resistentes, LbSbR e LcSbR. Estes resultados sugerem que o aumento da expressão de enzimas da defesa antioxidante pode desempenhar papel significativo na resistência dos parasitos aos antimoniais. Em conjunto, os dados mostram que o mecanismo de resistência de Leishmania spp. ao antimônio é complexo e multifatorial. É importante ressaltar que entre as 57 proteínas identificadas como diferencialmente adundantes entre as linhagens de Leishmania spp. sensíveis e resistentes ao antimonial 17 foram identificadas anteriormente por outros autores e que as outras 40 foram observadas apenas em nossa análise proteômica de linhagens de Leishmania spp. Resistentes ao SbIII. Acreditamos que algumas dessas proteínas estejam associadas com a resposta geral ao estresse e que outras podem estar associadas ao mecanismo de resistência ao antimônio em Leishmania spp. Neste contexto, a futura análise funcional será muito importante para determinar a possível associação destas proteínas com o fenótipo de resistência de Leishmania aos antimoniais. / The emergence of drug-resistant Leishmania species is a significant problem in several countries. Chemotherapy is the most important alternative for controlling leishmaniases, since there is no effective vaccine for using in humans. Furthermore, the vector control is difficult due to different environmental characteristics and the existence of a large number of domestic and wild reservoirs. Pentavalent antimonials, Sb V, are the first-choice drugs in the treatment of all forms of leishmaniases in several Countries. Although they are widely used in the chemotherapy of leishmaniases for more than 60 years, they have high toxicity and some patients are resistant to clinical treatment with these compounds. In this study, we carried out a comparative proteomic analysis of antimony-susceptible and antimony-resistant Leishmania braziliensis (LbSbR) and Leishmania infantum (syn. L. chagasi) (LcSbR) lines using twodimensional gel electrophoresis (2-DE) followed by mass spectrometry (LC/MS/MS) for protein identification. Comparative analysis of proteomic profiles between the Leishmania lines analyzed showed that 192 spots were unique and/or most abundant. Out of 132 protein spots submitted to MS, we identified 80 that corresponded to 57 distinct proteins. Comparative analysis showed that most of the protein spots with differential abundance in both species are involved in antioxidant defense, general stress response, glucose and amino acid metabolism, and cytoskeleton organization. Five proteins were more abundant in both SbIII-resistant Leishmania lines: tryparedoxin peroxidase, alpha-tubulin, HSP83, HSP70, and HSP60. Analysis of protein abundance by Western blotting assays 1-DE e 2-DE confirmed our proteomic data. These assays revealed that cyclophilin-A is less expressed in both LbSbR and LcSbR lines. On the other hand, the expression of pteridine reductase is higher in the LbSbR line, and it has similar expression level between SbIII-susceptible and -resistant L. infantum lines. The tryparedoxin peroxidase is overexpressed in both LbSbR and LcSbR lines. These results suggest that an increased in expression of anti-oxidant defense enzymes may play a significant role in the antimonial resistance in these parasites. Together, these results showed that the mechanism of antimony-resistance in Leishmania spp. is complex and multifactorial. Interestingly, among the 17out of 57 proteins identified as differentially abundant between SbIII-susceptible and -resistant lines, were also previously identified by others authors and the other 40 proteins were observed only in our proteomic analysis of SbIII-resistant Leishmania spp. lines. We believe that some of them are associated with the general stress response and others may be associated with the mechanism of resistance of Leishmania spp. to antimony. In this context, functional analysis will be very important to determine a possible association of these proteins with the antimony-resistance phenotype in Leishmania.

Made available in DSpace on 2015-10-21T12:19:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 raquel_pinna_ioc_mest_2012.pdf: 8018423 bytes, checksum: 9f16cf6eca4656de14583749757d974f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Doenças negligenciadas tais como Malária e Leishmaniose são endêmicas em diversas regiões do mundo, inclusive no Brasil. A coinfecção por diferentes parasitos é comumente observada na natureza e representa um desafio no estudo da ecologia dos parasitos e da saúde humana. Atualmente, não existem dados epidemiológicos a respeito das coinfecções por Plasmodium spp. e Leishmania spp. no Brasil, apesar da área de distribuição das duas doenças causadas por esses parasitos se sobreporem. Dentro desse contexto, achamos importante avaliar o impacto que uma infecção pode ter sobre a resposta imune e a evolução clínica da outra. Para tal, camundongos BALB/c foram coinfectados com P. yoelii 17XNL e L. braziliensis, L. major ou L. amazonensis e o curso das infecções e da resposta imunológica acompanhados por 77 dias. A coinfecção com diferentes espécies de leishmânia determina um curso distinto na infecção malárica. Assim, a coinfecção com L. braziliensis parece ter um efeito benéfico enquanto as coinfecções com L. major ou L. amazonensis aumentam a gravidade da malária levando a morte de alguns animais. Já a malária parece ter um efeito benéfico no desenvolvimento da leishmaniose causada por L. major ou L. amazonensis. O perfil da resposta imune foi determinado através de citometria de fluxo multiparamétrica em esplenócitos e da dosagem de citocinas séricas nos dias 5, 10, 17 e 77 após infecção com P. yoelii 17XNL. Foi verificada uma redução no percentual de células CD4+e CD8+no baço dos animais mono e coinfectados durante a fase aguda da malária Apesar disso, o percentual de células CD4+IFN-\F067+e CD4+IL4+aumentou nesse período. Além disso, o percentual de células CD4+IL10 maior no grupo dos animais coinfectados emrelação aos dos monoinfectados. Quanto às células CD8+, houve aumento percentual de células produtoras de IFN-\F067 e IL-4 nos grupos monoinfectado e coinfectados com P. yoelii 17XNL, durante a fase aguda da infecção malárica. Um aumento substancial no percentual de células CD8+IL10+, no dia 77, foi observado apenas nos grupos dos coinfectados com leishmânia. No grupo coinfectado com L. amazonensis houve uma aumento importante no percentual dessas células, no dia 5, aparentemente induzido pela L. amazonensis. O percentual de células CD4+CD2 +Foxp3+e CD4+ CD25+aumenta durante a fase aguda da malária nos grupos mono e coinfectados com P. yoelii 17XNL. Todos os grupos coinfectados apresentaram percentuais de células CD14+IL10+elevados no dia 77 em relação aos grupos monoinfectados. A concentração sérica das citocinas IFN-\F067, TNF, IL-6 e IL-10 aumentou durante a fase aguda da malária nos camundongos mono e coinfectados. Nos grupos coinfectados com P. yoelii 17XNL e L. braziliensis ou L. major, entretanto, esse aumento foi menor do que o grupo monoinfectado com P. yoelii 17XNL no dia 5. Em resumo, nossos dados sugerem que a coinfecção altera tanto a resposta imune quanto o curso da infecção por plasmódio ou leishmânia sendo essas alterações dependentes da espécie de parasito envolvida / Neglected tropical diseases such a s Malaria and Leishmaniasis are endemic in several regions of the world, including Brazil. Co - infection by multiple parasite species is commonly observed in nature and represents a complex challenge in studies of parasites ecology and human health. At present time, there are no available data concerning prevalence of Malaria and Leishmaniasis co - infection s in the Brazil ian territory . In this contex t, we believe that i s important to study the impact that one infection can have on the immune response and the clinical outcome of the other. Therefore, BALB/c mice were co - infected with P. yoelii 17XNL and L . braziliensis , L. major or L. amazonensis and b oth the course of each disease and its immune response were followed - up for 77 days. In coinfection, we observed that , depending on the species of Leishmania , the course of malaria disease wa s altered in a different way. I t seems that co - infection with L. braziliensis causes a beneficial effect while co - infections with L. major or L. amazonensis increases gravity leading some animals to death. Malaria infection, o n the other hand, had a beneficial effect in leishmaniasis caused by L. major or L. amazonensis . Immune response was accessed “ex vivo” by multiparametric flow citometry using splen ocytes and by measurement of serum cytokine levels 5, 10, 17 and 77 days post P. yoelii infection. There was a decrease on the percentage of CD4 + and CD8 + spleno c ytes dur ing malaria acute phase in both mono and co - infected groups. Besides that, there was an increase in the percentage of CD4 + IFN -  + and CD4 + IL - 4 + cells. Also, it was observed that CD4 + IL - 10 + cells enhanced in co - infected groups compared to control and mono - infected groups. Regarding CD8 + cells, there was an increase in IFN -  e IL - 4 produc ing cells during malaria infection in P. yoelii mono - infected and co - infected groups. Percentage of CD8 + IL - 10 + cells was transiently increased in P. yoelii mono - infect ed group but significantly enhanced in co - infected groups, mainly on day 77. L. amazonensis co - infected group presented an increase in CD8 + IL - 10 + on day 5 compared to control and P. yoelii mono - infected groups that is apparently due to L. amazonensis infection since this L. amazonensis mono - infected group had an increase on the percentage of CD8 + IL - 10 + on days 5, 10 and 17. The percentages of CD4 + CD25 + Foxp3 + cells (Tregs) and CD4 + CD25 + were higher during malaria acute phase in both P. yoelii mono - infe cted and co - infected groups. C o - infected groups exhibited an enhancement in the percentage of splenic CD14 + IL - 10 + cells on day 77 in comparison to control and mono - infected groups. The serum concentration s of IFN -  , TNF, IL - 6 e IL - 10 w ere enhanced during malaria acute stage in both P. yoelii mono - infected and co - infected mice. However, L. braziliensis and L. major co - infected groups presented not as much alteration in serum cytokine concentration when compar ed to P. yoelii mono - infected gr oup. Briefly, it seems that co - infections alter both the course and the immune response of Plasmodium or Leishmania infection in a way that appears to be dependent on the specie s of parasite s involved.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T15:41:20Z No. of bitstreams: 1 Rayssa Maria de Araujo Carvalho Estudo da coinfecção...2015.pdf: 2144928 bytes, checksum: 48b23a40107abab111363e306597b10d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T15:41:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Rayssa Maria de Araujo Carvalho Estudo da coinfecção...2015.pdf: 2144928 bytes, checksum: 48b23a40107abab111363e306597b10d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-04T15:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rayssa Maria de Araujo Carvalho Estudo da coinfecção...2015.pdf: 2144928 bytes, checksum: 48b23a40107abab111363e306597b10d (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / A Erliquiose Monocítica Canina (EMC) e a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) são duas doenças, transmitidas por vetores, com ampla distribuição mundial. Os agentes causadores dessas doenças são Ehrlichia canis e Leishmania infantum, respectivamente. Enquanto a EMC é transmitida por carrapatos, principalmente Rhipicephalus sanguineus, a Leishmania é inoculada no hospedeiro através do inseto-vetor da subfamilia Phlebotominae. A maioria dos sinais físicos são comuns às duas enfermidades, o que dificulta o diagnóstico clínico e o tratamento, especialmente em áreas endêmicas. Poucos são os estudos relacionados à coinfecção da erliquiose e leishmaniose caninas no Brasil. No Piauí, particularmente em Teresina, ainda não se tem dados concretos sobre a prevalência dessas afecções.Os sinais físicos variam com a severidade da infecção, a resposta imune do hospedeiro e a presença de coinfecção. Assim, buscamos avaliar cães, independente dos sinais físicos, atendidos no hospital universitário e clínicas particulares da cidade de Teresina, Piauí quanto a frequência de erliquiose e leishmaniose caninas no período de março de 2012 a setembro de 2014, independente de sexo, raça, idade e suspeita clínica, excetuando os cães que vinham apenas para vacinação. Foi realizado exame clínico e colhidas amostras sanguíneas para exame hematimétrico, bioquímico, parasitológico e molecular. Dos 664 cães avaliados para E. canis, 22,9% tiveram o DNA amplificado somente para esta bactéria. No caso de Leishmania infantum, houve amplificação de DNA em 29,1% dos 664 cães, sendo que, destes, 80 (12,1%) estavam coinfectados com E.canis. Anemia e trombocitopenia foram as principais alterações hematológicas observadas em cães infectados tanto com E. canis, como com L. infantum e coinfectados. As principais alterações bioquímicas nos cães com infecção apenas por L. infantum, assim como nos coinfectados, foram hipoglobulinemia e hiperproteinemia. Já nos monoinfectados por E. canis a hipoalbuminemia e a uremia foram as principais alterações. Perda de peso, úlceras, apatia, conjuntivite, palidez nas mucosas, alópecia e linfoadenomegalia são mais frequentes em cães monoinfectados com L. infantum do que nos infectados apenas com E. canis. Além disso, os cães coinfectados apresentam uma doença mais severa do que os monoinfectados. Concluímos que a presença da coinfecção por esses agentes infecciosos é endêmica na cidade de Teresina-Piauí e que existe um sinergismo entra as duas doenças.Portanto, destacamos aqui a relevância dos estudos voltados a epidemiologia e melhoria dos testes diagnósticos para uma prevenção e/ou controle mais eficazes dessas doenças. Palavras / The Canine Monocytic Ehrlichiosis (CME) and Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) are the two vector-borne diseases with worldwide distribution. The causative agents of these diseases are Ehrlichia canis and Leishmania infantum, respectively. While CME is transmitted by ticks, especially Rhipicephalus sanguineus, Leishmania is inoculated into the host through the insect vector of the subfamily Phlebotominae. Most clinical signs are common to both conditions, which hinders the clinical diagnosis and treatment, especially in endemic areas. There are few studies related to the coinfection of canine ehrlichiosis and leishmaniasis in Brazil. In Piaui, particularly in Teresina, there is not yet concrete data on the prevalence of these diseases. The clinical signs vary according to the severity of the infection, to the host immune response and to the presence of coinfection. Thus, we sought to evaluate dogs, regardless of clinical signs, seen at university hospital and private clinics in the city of Teresina, Piauí, for the frequency of canine ehrlichiosis and leishmaniasis from March 2012 to September 2014, regardless of sex, race, age and clinical suspicion, except dogs that came just to vaccination purposes. Clinical examination was performed and blood samples for erythrocyte examination, biochemical, and molecular parasitology were collected. From 664 dogs evaluated for E. canis, 22, 9% showed amplified DNA, to this bacterium only . Regarding to Leishmania infantum, there was DNA amplification in 29, 1% out of the 664 dogs, and, from these, 80 (12, 1%) were coinfected with E. canis. Anemia and thrombocytopenia were major hematologic changes observed in dogs infected with Leishmania, E.canis and coinfected dogs. The main biochemical findings in dogs infected by L. infantum and coinfected were hyperalbuminemia, hypoglobulinemia and hyperproteinemia. In those infected only by E. canis, hypoalbuminemia and uremia were the main changes. Weight loss, skin lesions, lethargy, conjunctivitis, pale mucous membranes, alopecia and enlarged lymphnodes are more common in dogs with L. infantum than in dogs infected only with E.canis. In addition, the coinfected dogs have a more severe disease than the ones with only one infection. We conclude that the presence of coinfection by these infectious agents are endemic in the city of Teresina, Piauí, and that there is a synergism between the two diseases. Therefore, we highlight here the relevance of studies regarding epidemiology and improvement of diagnostic tests for prevention and / or control of the diseases in a more effective way.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T15:52:03Z No. of bitstreams: 1 Lais da Silva Pereira Co-infecção...2015.pdf: 2458556 bytes, checksum: 23a6b27a228ed08f29d7e68206a6a31d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T15:52:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Lais da Silva Pereira Co-infecção...2015.pdf: 2458556 bytes, checksum: 23a6b27a228ed08f29d7e68206a6a31d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-04T15:52:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lais da Silva Pereira Co-infecção...2015.pdf: 2458556 bytes, checksum: 23a6b27a228ed08f29d7e68206a6a31d (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / Os resultados das co-infecções nas leishmanioses cutânea (LC) são variáveis. Neste estudo, demonstramos o desfecho da co-infecção com Trypanosoma brucei brucei sobre a LC, causada por L. major. Infectamos camundongos C57BL/6 com T. b. brucei e estes foram tratados com o Berenil para controlar a infecção antes da transmissão da L. major por picadas de Lutzomyia longipalpis infectados. Nossos resultados revelam que, a infecção ativa com o T. b. brucei controla a patologia da LC causada por L. major. Comparados aos controles, camundongos coinfectados mostraram uma diminuição significativa do tamanho da lesão até 6 semanas após infecção. Adicionalmente, uma diminuição significativa da carga parasitária foi observada 3 semanas após a infecção. É importante salientar que a proteção observada não foi devido a reação cruzada entre os antígenos do T. b. brucei e L. major, mas por uma ativação não específica das células T efetoras, tanto sistemicamente como localmente no sítio da infecção, induzindo uma resposta inflamatória intensa, em particular com a produção de IFN-γ e em menor concentração de IL-10. Concluímos que a ativação das células T pelo curso da infecção com T. b. brucei, modulou a infecção com L. major, resultando em proteção. / The outcome of co-infections on cutaneous leishmaniasis (CL) is variable. Here, we determined the outcome of a co-infection with Trypanosoma brucei brucei on CL caused by L. major. We infected C57BL/6 mice with T. b. brucei and treated them with Berenil to control parasite growth prior to L. major transmission by infected Lutzomyia longipalpis bites. Our results revealed that an active infection with T. b. brucei controls the pathology of CL by L. major. Compared to controls, co-infected mice show a significant decrease in lesion size up to 6 weeks post-infection. Additionally, a significant decrease in the parasite load was observed at 3 weeks post-infection. Importantly, the observed protection was not due to cross-reactivity between antigens of T. b. brucei and L. major but to a non-specific activation of effector T cells, both at the site of infection and systemically, that induces a strong inflammatory response, in particular IFN-γ and at a lower IL-10 level. We conclude that activation of T cells by an ongoing T. b. brucei infection modulates the outcome of infection with L. major resulting in protection.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-08-09T19:14:17Z No. of bitstreams: 1 Camila Victória Sousa Oliveira Avaliaçao do papel... 2015.pdf: 3464299 bytes, checksum: ca91c962ae5b021bf250ea2db05e1dd6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-08-09T19:21:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Camila Victória Sousa Oliveira Avaliaçao do papel... 2015.pdf: 3464299 bytes, checksum: ca91c962ae5b021bf250ea2db05e1dd6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T19:21:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camila Victória Sousa Oliveira Avaliaçao do papel... 2015.pdf: 3464299 bytes, checksum: ca91c962ae5b021bf250ea2db05e1dd6 (MD5) Previous issue date: 2015-09-25 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose é uma antropozoonose causada por protozoários do gênero Leishmania e é considerada uma das principais doenças negligenciadas. Modelos experimentais são amplamente utilizados para uma melhor compreensão da doença e dos mecanismos relacionados à resistência e susceptibilidade à infecção. Macrófagos de camundongos CBA controlam a infecção por Leishmania major ao passo que são permissivos a Leishmania amazonensis. Além disso, estudos baseados em abordagem proteômica demonstraram padrões distintos de expressão proteica em macrófagos derivados de medula óssea (BMMΦ) infectados por essas espécies de Leishmania. Dentre as proteínas diferentemente expressas, foram identificadas proteínas envolvidas no metabolismo de ferro moduladas positivamente em macrófagos infectados por L. amazonensis. Adicionalmente, embora ainda existam controvérsias, diversos estudos têm abordado a participação do elemento ferro na interação parasito-hospedeiro e no estabelecimento das infecções por tripanossomatídeos, incluindo Leishmania. Assim, para melhor compreender os mecanismos envolvidos nessa doença, o presente estudo buscou explorar o modelo comparativo de resistência e suscetibilidade do camundongo CBA para determinar o papel do ferro na infecção por Leishmania. Nossa hipótese é que a expressão de proteínas envolvidas no metabolismo de ferro é modulada diferentemente em macrófagos de camundongos CBA infectados por L. amazonensis, em comparação à L. major, favorecendo a sobrevivência intracelular do parasito. Nosso objetivo foi avaliar a expressão de proteínas que participam do metabolismo de ferro, como receptor de transferrina (Tf), CD71, e heme oxigenasse-1, HO-1, e determinar o efeito da modulação da disponibilidade de ferro na infecção por Leishmania. Observamos maior expressão de HO-1 em BMMΦ infectados por L. amazonensis (18,34 ± SD ng/mL), quando comparados a BMMΦ infectados por L. major (7,07 ± SD ng/mL), utilizando ELISA. Maior expressão de CD71 também foi observada na infecção por L. amazonensis (MFI 2.103) em comparação à infecção por L. major (MFI 472), utilizando FACS, além de uma maior ligação e captação de HoloTf (Tf carregada com ferro). Embora tenha sido observado que essas proteínas encontram-se diferentemente expressas em BMMΦ infectados por essas duas espécies de Leishmania, não foram observadas diferenças significativas na concentração intracelular do ferro. Em seguida, ensaios funcionais a partir da modulação da disponibilidade intracelular de ferro foram realizados com o objetivo de avaliar seu papel no desfecho da infecção por Leishmania. Os resultados mostraram que a depleção de ferro reduz em 90% o percentual de BMMΦ infectados por L. amazonensis e 70% dos infectados por L. major. Adicionalmente, a suplementação de ferro aumenta o percentual de BMMΦ infectados por L. amazonensis, de 69,64 para 82,79%, e a carga parasitária, de 2,996 para 4,001 parasitos/célula, assim como a viabilidade intracelular de L. amazonensis e L. major. Em conjunto, os dados obtidos nesse estudo indicam que, apesar de L. amazonensis modular positivamente a expressão de proteínas envolvidas no metabolismo de ferro, esse metal apresenta um papel importante na infecção pelas duas espécies de Leishmania, favorecendo a sobrevivência intracelular desse parasito. / Leishmaniasis is an anthropozoonosis caused by the protozoan parasite Leishmania and is considered one of the main neglected diseases. Animal models are widely used to better understand the disease and the mechanisms involved in resistance and susceptibility to infection. CBA mouse macrophages control the infection by L. major, while are permissive to L. amazonensis. Proteomic studies showed different protein profiles in bone marrow macrophages (BMMΦ) infected these species of Leishmania. We also observed that proteins involved in iron metabolism were positively modulated in L. amazonensis-infected macrophages. In addition, although literature review showed controverse data, several studies have addressed the role iron plays in host-parasite interaction and the establishment of trypanosomatids infections, including Leishmania. To better understand the mechanisms of the disease, this study sought to evaluate in a comparative model of resistance and susceptibility, using CBA macrophages, the role iron plays in Leishmania infection. Our hypothesis is that the expression of proteins involved in iron metabolism is differently modulated in CBA mice macrophages infected with L. amazonensis in comparison to L. major, favoring the intracellular survival of the parasite. Our goal was to evaluate the expression of proteins involved in iron metabolism of CBA mice macrophages, such as transferrin receptor (Tf), CD71, and heme oxygenase 1 (HO-1) and determine the effect of the modulation of intracellular iron in Leishmania infection. Using ELISA, we confirmed a higher expression of HO-1 in L. amazonensis- (18.34 ng/mL) compared to L. major-infected CBA macrophages (7.07 ng/mL). Using FACS analysis, CD71 showed to be higher expressed in L. amazonensis- (MFI 2.103) than in L. major-infected macrophages (MFI 472), in addition to higher binding and take up of HoloTf in these cells. Although it has been observed that proteins involved in iron metabolism were differently expressed in BMMΦ infected with these Leishmania species, no significant differences were observed in intracellular iron concentration. To further evaluate the role iron plays in the outcome of Leishmania infection, we modulated iron availability to Leishmania-infected cells using iron chelates or iron supplements. The results show that iron depletion reduces in 90% L. amazonensis infection and in 70% L. major infection. In addition, iron supplementation increased the percentage of L. amazonensis-infected cells from 69.64 to 82.79% and parasite load from 2,996 to 4,001 Leishmania/cell, as well as in the intracellular viability of both Leishmania species. In sum, these data indicate that although there is a positive modulation of proteins involved in iron metabolism in L. amazonensis infection, this metal seems to favor the survival of both parasite species in CBA macrophages.

A identificação de genes relacionados com resistência a compostos antiparasitários tem contribuído para um melhor entendimento do mecanismo de ação de alguns desses compostos. Utilizando a estratégia que permite a indução de super-expressão após transfecção gênica, isolamos dois loci relacionados com resistência ao análogo tóxico de purina, tubercidina (TUB). Em um desses locus identificamos um ortólogo do gene TOR (TOxic nucleoside Resistance) em L. (L.) major (TOR-Lm), capaz de conferir altos níveis de resistência a TUB. A identificação e localização cromossomal do segundo locus foi obtida, mas os testes funcionais em presença de TUB não foram tão significativos quanto os obtidos após a transfecção do TOR-Lm. Na segunda parte desta dissertação avaliamos a eficácia da associação de TUB com um inibidor específico do transporte de nucleosídeos em mamíferos, nitrobenziltioinosina (NBMPR), visando reverter a toxicidade de TUB apenas no hospedeiro. Demonstramos que TUB tem uma potente ação anti-parasitária em culturas de Leishmania spp., e que o inibidor NBMPR é capaz de proteger células mamíferas de camundongos infectados da ação tóxica de TUB. / Gene identification associated with drug resistance has contributed to a better understanding of the mechanism of action of anti parasitic compounds. Using transfection and over-expression selection strategy we isolated two loci related with the resistance of tubercidin (TUB), a toxic analog purine. In the first locus we identified an ortholog of the TOR gene (TOxic nucleoside Resistance) in L. (L.) major (TOR-Lm), capable to render wild cells resistance to TUB after transfection and over-expression. Chromosomal location and identification of the second locus was done, but functional tests in the presence of TUB were not as significant as those obtained after TOR-Lm transfection. In the second part of this work, we evaluate the effectiveness of the association of TUB with an inhibitor specific to the mammals nucleoside transport, as nitrobenzylthioinosine (NBMPR), aimed at reversing the TUB toxicity only on the host. We first demonstrate that TUB has a potent anti-parasitic action in cultures of Leishmania spp. Then, we discuss the capacity of the NBMPR inhibitor to protect infected macrophages from the toxic effects of TUB.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-21Bitstream added on 2014-06-13T18:51:20Z : No. of bitstreams: 1 calado_amc_me_jabo.pdf: 1098325 bytes, checksum: e69e94e5c8654a5cdbae32a66649fbe3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença sistêmica e imunomediada. É provocada pelo protozoário da espécie Leishmania (L.) chagasi, que é transmitido ao homem e aos animais através da picada do vetor infectado, o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. Até o momento não há tratamento que leve a cura parasitológica dos cães e o arsenal de fármacos leishmanicidas é limitado. A resistência aos medicamentos constitui um impedimento importante para o controle de enfermidades e a manifestação de resistência a vários medicamentos é conhecida como MDR (“multidrug resistance”). Um desses mecanismos de resistência a múltiplas drogas é o aumento da expressão da glicoproteína-P (gp-P), um sistema de efluxo de xenobióticos codificadas pelo gene MDR1. Na presente pesquisa, buscou-se avaliar a possibilidade do fenômeno de resistência a múltiplas drogas em cães naturalmente parasitados por Leishmania (L.) chagasi . Foram objetivos do estudo avaliar a expressão da glicoproteína-P (gp-P) e da proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP) por meio da imuno-histoquímica, em amostras fígado, adrenais, rins, baço e pele de cães portadores da LV. Os resultados mostraram que o fígado, rins e adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais gp-P do que a pele e o baço; também que as adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele e o baço e que este ultimo expressa significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele. Quando se comparou os dois anticorpos verificou-se que o fígado, rins e adrenais expressam porcentagens semelhantes de células imunomarcadas e que o MRP é significativamente (p<0,01) mais reativo na pele que a gp-P. Esses resultados poderiam justificar a redução da carga parasitária na pele que se acompanha durante o tratamento. Todavia, a não obtenção da cura parasitológica poderia ser devido a alta expressão... / Canine visceral leishmaniasis (LVC) is a systemic immunomediated disease. It is caused by the protozoary from the Leishmania (L.) chagasi species, wich is transmitted to man and animals through the infected vector bite, the phlebotomine sand fly Lutzomyia longipalpis. Until present, there is no treatment leading to a parasitologic cure for dogs and the leishmanicide medicine arsenal is limited. Drug resistance is one of the important impediments for infirmity control and the resistance manifestation to multiple drugs is known as MDR. One of those multiple drugs resistance mechanisms is the increase of the glycoprotein-P (gp-P) expression, a xenobiotic efflux system encoded by the MDR1 gene. At the present research, it aimed to evaluate the possibility of resistance phenomenon the multiple drugs in dogs naturally parasited by Leishmania (L.) chagasi. The objectives of this study was to evaluate glycoprotein-P (gp-P) and multiple drugs resistance protein (MRP) immunohistochemical expressions in LVC infected dogs’ liver, adrenals, kidneys, spleen and skin samples. Results showed that liver, kidneys and adrenals express significantly (p<0,001) more gp-P than skin and spleen; also, adrenals express significantly (p<0,001) more MRP than skin and spleen and that spleen express significantly (p<0,001) more MRP than skin. When the two antibodies were compared, it was verified that liver, kidneys and adrenals express similar percentages of immunomarked cells and that MRP is significantly more reactive in skin than gp-P. These results could justify the parasitary load reduction in skin during treatment. Nevertheless, the lack of parasitologic cure could be due to the high pg-P and MRP1 expressions in liver, adrenals and kidneys, which could increase the pharmac efflux at these organs

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 josaneRL.pdf: 1324406 bytes, checksum: 22ffd7cc30434eb0cb8d5f0e9616a218 (MD5) Previous issue date: 2001-03-08 / GB virus type C (GBV-C) appears to promote a Th1 response and is associated with prolonged survival in HIV-infected people. L. chagasi causes a spectrum of illness that varies from severe visceral leishmaniasis, a disease that in the majority of cases is fatal if not treated, to self resolution of infection and development of positive DTH response that is protective against symptomatic disease. To determine if GBV-C viremia might influence the outcome of Leishmania infection, we characterized GBV-C status in a cohort of subjects residing in a L. chagasi endemic area in Brazil. GBV-C viremia was more prevalent in blood donors from urban than in periurban regions of Natal, Brazil (16% and 7.5% respectively). Evidence of prior GBV-C (anti-E2 antibodies) was detected in 24% and 12%of these groups respectively. Anti-E2 increased with age (p= 0.0121). No difference in GBV-C viremia was found in the DTH+ and VL groups (p= 0.269); however, subjects with visceral leishmaniasis were more likely to have anti-E2 than DTH+ subjects (p=0.0012), and DTH induration was smaller in subjects with E2 antibodies (4.5 mm) compared those without (7.12 mm) (p= 0.002). Furthermore, the size of the Leishmania DTH response was greater in GBV-C viremica subjects (6.8 mm) compared to non-viremic subjects (3.3 mm; p= 0.0054). There findings suggest that GBV-C virus may promote a type 1 immune response that could influence the outcome of Leishmania infection / GBV-C ? um v?rus membro da fam?lia dos Flavivirus, que tem um aparente papel indutor da resposta Th1 e est? associado ao prolongamento da sobrevida, em pessoas infectadas com HIV. L. chagasi ? respons?vel por um amplo espectro que variam da forma assintom?tica, com resolu??o espont?nea da infec??o e, consecutivamente, desenvolvimento resposta positivo para o DTH; a forma severa da leishmaniose visceral (LV), que na maioria dos casos pode ser fatal se n?o tratada. Para determinar se o GBV-C pode influenciar na resolu??o da infec??o por Leishmania, n?s pesquisamos a preval?ncia de GBV-C em uma popula??o residente em ?rea end?mica para L. chagasi no Brasil. Foi observado que a viremia de GBV-C foi maior em indiv?duos residentes na regi?o urbana, que nos residentes em regi?o periurbana de Natal, Brasil (16% e 7,5%, respectivamente). Evidencia de previa infec??o de GBV-C (anticorpo anti-E2) foi detectada em 24% e 12% nesses grupos respectivamente, aumentando com a idade (p= 0.0121). N?o foi encontrada diferen?a da viremia de GBV-C entre os grupos DTH+ e LV (p= 0.269); Contudo, o grupo dos indiv?duos LV teve mais casos de anti-E2 (p= 0,0012), e a endura??o do DTH foi menor em indiv?duos com anti-E2 comparado aos sem anti-E2 (4.5 mm x 7.12 mm, respectivamente; p= 0,002). O inverso foi observado para os indiv?duos positivos para RNA de GBV-C (6.8 mm) comparados aos sem (3.3 mm; p= 0.0054). Esses achados sugerem que o GBV-C pode promover o tipo 1 de resposta imune e pode com isso influenciar na resolu??o da infec??o por Leishmania

Orientador: Valeria Marçal Felix de Lima / Banca: Maria cecilia Rui Luvizotto / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Resumo: Leishmania são protozoários intracelulares obrigatórios que infectam células fagocitárias de mamíferos ocasionando a leishmaniose visceral canina (LVC). Por apresentarem um intenso parasitismo cutâneo, os cães infectados possuem papel chave na transmissão da doença. Para sobreviver no hospedeiro, as leishmanias são capazes de desenvolver mecanismos de escape por alterações das respostas de células fagocitárias, tais como o NO e o ROS responsáveis pela morte intracelular do parasita. A HO-1 também pode estar envolvida na regulação da resposta imune, porém seu papel na leishmaniose visceral canina ainda não está claro. A produção excessiva de NO, ROS e HO-1 pode ser prejudicial e estar relacionada com a apoptose e desregulação imunológica na LVC. Assim o este estudo teve a finalidade de investigar os níveis de ROS, NO e atividade HO-1 em células mononucleares do sangue periférico e leucócitos do baço e sua correlação com a apoptose celular. Para isso foram utilizadas células mononucleares sanguíneas e leucócitos de baço de cães infectados e saudáveis. As células foram isoladas e cultivadas durante 24 horas, na sequencia foram incubadas com sondas para NO ou ROS e foi determinada a apoptose celular. Todos as análises foram realizadas por citômetria de fluxo. Após a lise das células em cultura, a atividade HO-1 foi determinada no lisado celular por método colorimétrico. O metabolismo oxidativo estava reduzido e a taxa de apoptose dos mononucleares sanguíneos aumentada, por influê... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leishmania are obligate intracellular protozoan that infects phagocytic mammalian cells causing canine visceral leishmaniasis (CVL). Because they have an intense cutaneous parasitism, infected dogs have key role in disease transmission. To survive in the host, the Leishmania are able to develop escape mechanisms by changes in phagocytic cell responses, such as the NO and the ROS responsible for the death of intracellular parasites. The HO-1 may also be involved in regulating the immune response, but their role in canine visceral leishmaniasis is not yet clear. The excessive production of NO, ROS and HO-1 can be detrimental and to be related to immune dysregulation and apoptosis in LVC. So this study aimed to investigate the levels of ROS, NO and HO-1 activity in mononuclear cells of peripheral blood leukocytes and spleen and its correlation with cell apoptosis. For this they used blood mononuclear cells and spleen leukocytes from infected and healthy dogs. Cells were isolated and cultured for 24 hours following probes were incubated with NO or ROS and cell apoptosis was determined. All analyzes were performed by flow cytometry. After lysis of the cells in culture, HO-1 activity in cell lysate was determined by a colorimetric method. Oxidative metabolism was reduced and the apoptosis rate of increased blood mononuclear, influenced by ROS. The levels of ROS and NO were decreased in leukocytes from the spleen of infected dogs, and increased apoptotic rate was observed in spleen ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre