O desenvolvimento de novas ferramentas para manipulação genética é necessário para um melhor entendimento da biologia de protozoários que causam doenças sérias e negligenciadas. Neste contexto, apresentamos uma nova aplicação do sistema Cre recombinase em Leishmania major, utilizado para a expressão condicional de genes de interesse. Como prova de conceito demonstramos por ensaios de PCR, western blotting e imunofluorescência que o gene da Proteína Fluorescente Verde (Green Fluorescent Protein, GFP) é condicionalmente expresso em função do tempo e dose de rapamicina necessários para a ativação da recombinase. A aplicação do sistema diCre em L. major é feita com o estudo da proteína Rad9, que participa na sinalização e resposta a danos ao DNA. A Rad9 de L. major possui um domínio C-terminal desestruturado, que no homólogo humano não é essencial para a formação do complexo 911 (Rad9-Hus1-Rad1), mas possui sítios de fosforilação importantes para a cascata de sinalização que mantém a integridade do DNA. Usando predições da estrutura de Rad9, a proteína foi dividida em domínios e foram geradas linhagens que expressam, condicionalmente, versões truncadas de Rad9. Por análises de PCR, western blotting, citometria de fluxo e imunofluorescência, acessamos alguns dos papeis que o domínio C-terminal de Rad9 pode desempenhar em L. major. / The development of new tools for genetic manipulation is necessary for a better understanding of the biology of protozoa that cause severe and neglected diseases. In this context, we present a new application of the Cre recombinase system in Leishmania major, using it for the conditional expression of genes of interest. As proof of concept we show by PCR, western blotting and immunofluorescence assays that the Green Fluorescent Protein (GFP) gene can be conditionally expressed depending on the time and dose of the rapamycin treatment required for the recombinase activation. The application of the diCre system in L. major was tested with the study of the Rad9 protein, which participates in the parasite\'s DNA damage response. Rad9 from L. major presents an unstructured C-terminal domain, which in the human homolog is not essential for the 911 (Rad9-Hus1-Rad1) complex formation, but has phosphorylation sites that are important in the signaling cascade that maintains the DNA integrity. Using structure predictions of Rad9, the protein was divided into specific domains and cell lines were generated conditionally expressing truncated versions of Rad9. By PCR, western blotting, flow cytometry and immunofluorescence assays, we assessed some of the roles that the C-terminal domain of Rad9 can perform in L. major.

Entre as estratégias que os protozoários do gênero Leishmania apresentam para o escape da resposta imune do hospedeiro vertebrado, há a ocorrência de um tipo de morte celular programada, conhecida como apoptose. Quando em contato com o macrófago, a Leishmania é fagocitada de forma silenciosa, evitando a resposta inflamatória do hospedeiro vertebrado. Alguns autores defendem que a Leishmania mimetiza a apoptose, expondo entre outras moléculas um fosfolipídio que sinalizaria para o macrófago que está em apoptose, e esse mecanismo é denominado na literatura como mimetismo apoptótico. O objetivo desta tese foi elucidar como ocorre esse escape com o enfoque nos fosfolipídios presentes e expostos em parasitas mutantes de L. (L.) amazonensis com características fenotípicas distintas, utilizando diferentes estratégias: transfecção com cosmídeos contendo frações do genoma de L. (L.) amazonensis; identificação e clonagem do gene pi4k contido no cosmídeo em vetor de expressão em Leishmania; seleção de parasitas resistentes a miltefosina, mantidos ou não sob pressão do antibiótico, seleção de parasitas na 28a passagem em cultura; seleção de parasitas purificados de macrófagos de linhagem RAW. A caracterização desses mutantes foi realizada em relação à ligação de anexina V-FITC, infectividade em macrófagos da linhagem RAW, tomada de fosfolipídios fluorescentes (NBD), IC50 de células tratadas com os antibióticos duramicina, miltefosina e anfotericina B. De acordo com os ensaios de ligação à anexina V-FITC, identificamos que os mutantes pi4k-pSNBR e os mutantes resistentes à miltefosina apresentaram maior ligação à anexina V-FITC. O gene que codifica a fosfatidilinositol (PI) 4-kinase, fez com que os parasitas que continham tanto o cosmídeo como o superexpressor pi4k, apresentassem menor infectividade em relação ao controle selvagem. O mesmo ocorreu para os parasitas resistentes à miltefosina. Em contrapartida, os parasitas derivados desses resistentes, mas mantidos sem pressão do antibiótico, recuperaram os valores de infectividade comparáveis ao grupo controle. Interessante é que os parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão, assim como o parasita superexpressor do gene pi4k apresentaram maior ligação à anexina V-FITC em relação ao controle selvagem, indicando que a ligação à anexina V-FITC não se correlaciona com infectividade. Parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão apresentaram maior sensibilidade à duramicina, e quando tratados com anfotericina B, esses parasitas apresentaram maior resistência. Uma outra abordagem analisada nessa tese foi elucidar qual o fosfolipídio é reconhecido pelo macrófago durante a infecção por L. (L.) amazonensis. Como resultado, observamos que os lipossomas contendo PC levam à diminuição dose-dependente da infecção, o que não foi visto em PS ou PC:PE. Esse resultado sugere a importância de PC para o estabelecimento da infectividade. / Among the strategies that Leishmania protozoans present to escape the immune response of the vertebrate host, there is a type of programmed cell death, known as apoptosis. When in contact with the macrophage, Leishmania is phagocytized in a silent manner, avoiding the inflammatory response of the vertebrate host. Some authors argue that Leishmania mimics apoptosis, exposing among other molecules a phospholipid that would signal to the macrophage that is in apoptosis, and this mechanism is denominated in the literature as apoptotic mimicry. The objective of this thesis was to elucidate how this escape occurs with the focus on the phospholipids present and exposed in mutant parasites of L. (L.) amazonensis, with distinct phenotypic characteristics, using different strategies, such as selection of parasites showing higher attachment to annexin V-FITC. After transfection with cosmids containing the genome of L. (L.) amazonensis; identification and cloning of the pi4k gene contained in the cosmid in Leishmania expression vector; selection of parasites resistant to miltefosine, whether or not under antibiotic pressure, selection of parasites at the 28th passage in culture; selection of purified strains of RAW lineage macrophages. The characterization of these mutants was performed in relation to the annexin V-FITC binding, infectivity in RAW lineage macrophages, fluorescent phospholipid (NBD) uptake, IC50 of cells treated with the antibiotics duramycin, miltefosine and amphotericin B. According to the binding assays to Annexin V-FITC, we have identified that pi4k-pSNBR mutants and miltefosin-resistant mutants showed higher attachment to annexin V-FITC. The gene coding for phosphatidylinositol (PI) 4-kinase caused the parasites containing both the cosmid and the pi4k superexpressor to have less infectivity than the wild-type control. The same occurred for parasites resistant to miltefosine. In contrast, the parasites derived from these resistant, but kept without antibiotic pressure, recovered infectivity values, comparable to the control group. Interestingly, miltefosine-resistant parasites, whether or not under pressure, as well as the overexpressing parasite of the pi4k gene showed greater attachment to annexin V-FITC over wild-type control, indicating that attachment to annexin V-FITC does not correlate with infectivity. Parasites resistant to miltefosine, whether or not under pressure, showed greater sensitivity to duramycin, and when treated with amphotericin B, these parasites showed greater resistance. Another approach analyzed in this thesis was to elucidate the phospholipid recognized by the macrophage during infection by L. (L.) amazonensis. As a result, we observed that PC-containing liposomes lead to dose-dependent decrease of infection, which has not been seen in PS or PC: PE. This result suggests the importance of PC for the establishment of infectivity.

A identificação de genes relacionados com resistência a compostos antiparasitários tem contribuído para um melhor entendimento do mecanismo de ação de alguns desses compostos. Utilizando a estratégia que permite a indução de super-expressão após transfecção gênica, isolamos dois loci relacionados com resistência ao análogo tóxico de purina, tubercidina (TUB). Em um desses locus identificamos um ortólogo do gene TOR (TOxic nucleoside Resistance) em L. (L.) major (TOR-Lm), capaz de conferir altos níveis de resistência a TUB. A identificação e localização cromossomal do segundo locus foi obtida, mas os testes funcionais em presença de TUB não foram tão significativos quanto os obtidos após a transfecção do TOR-Lm. Na segunda parte desta dissertação avaliamos a eficácia da associação de TUB com um inibidor específico do transporte de nucleosídeos em mamíferos, nitrobenziltioinosina (NBMPR), visando reverter a toxicidade de TUB apenas no hospedeiro. Demonstramos que TUB tem uma potente ação anti-parasitária em culturas de Leishmania spp., e que o inibidor NBMPR é capaz de proteger células mamíferas de camundongos infectados da ação tóxica de TUB. / Gene identification associated with drug resistance has contributed to a better understanding of the mechanism of action of anti parasitic compounds. Using transfection and over-expression selection strategy we isolated two loci related with the resistance of tubercidin (TUB), a toxic analog purine. In the first locus we identified an ortholog of the TOR gene (TOxic nucleoside Resistance) in L. (L.) major (TOR-Lm), capable to render wild cells resistance to TUB after transfection and over-expression. Chromosomal location and identification of the second locus was done, but functional tests in the presence of TUB were not as significant as those obtained after TOR-Lm transfection. In the second part of this work, we evaluate the effectiveness of the association of TUB with an inhibitor specific to the mammals nucleoside transport, as nitrobenzylthioinosine (NBMPR), aimed at reversing the TUB toxicity only on the host. We first demonstrate that TUB has a potent anti-parasitic action in cultures of Leishmania spp. Then, we discuss the capacity of the NBMPR inhibitor to protect infected macrophages from the toxic effects of TUB.

As doenças denominadas como negligenciadas têm causado nos últimos anos uma preocupação muito acentuada na comunidade científica e para as autoridades de saúde, relacionada às suas terapêuticas, no sentido de que os medicamentos existentes não se apresentam totalmente eficazes, além de determinarem efeitos colaterais extremamente elevados. Nesse perfil se encaixam a doença de Chagas e as Leishmanioses, etiologias determinadas respectivamente por Trypanosoma cruzi e parasitas do gênero Leishmania. Como proposta de encontrarmos uma alternativa para o tratamento dessas parasitoses, avaliamos o potencial terapêutico de três estatinas (sinvastatina, pravastatina e mevastatina), comercialmente encontradas para o tratamento de níveis elevados de colesterol e triglicérides, baseado no princípio de que a rota bioquímica para a formação de colesterol é semelhante à do ergosterol, componente da membrana plasmática desses protozoários. Foram realizadas avaliações in vitro e in vivo das estatinas puras e de suas associações com o benzonidazol, medicamento de referência no tratamento da doença de Chagas e com a anfotericina B, medicamento de referência no tratamento das leishmanioses, partindo do pressuposto que a substituição do benzonidazol / anfotericina B ou a diminuição de suas doses em combinação com as estatinas, atuando como coadjuvantes, pudessem auxiliar no tratamento e diminuir os efeitos colaterais provocados pela medicação. Observou-se nos ensaios com T. cruzi in vitro boa atividade antiparasitária, com valores de porcentagem de lise celular mais altos ou comparados aos encontrados para o benzonidazol, já in vivo, apenas a mevastatina apresentou redução da parasitemia em relação ao controle positivo e às outras estatinas testadas. Nos ensaios com L. braziliensis e L. major não foi observado resultado significante, tanto in vitro como in vivo, apesar de em algumas situações encontrarmos resultados próximos ao controle positivo. / Over recent years, neglected diseases has been a problem to the scientific community and health associations due the absence of total efficacy of drugs, and by their potential side effects. Chagas\' disease and Leishmaniasis - both caused respectively by Trypanosoma cruzi and by parasites the genus Leishmania fit on this profile. Aiming to find an alternative treatment of these parasitosis we evaluated the potential therapeutic of three statins (simvastatin, pravatatin, and mevastatin) which are commercially employed for treatment of high levels of cholesterol and triglycerides, based on the similarity of the biochemical route of cholesterol and ergosterol formation, being the ergosterol a component of plasmatic membrane of these protozoa. In vitro and in vivo evaluation were made by the association of these statins with benznidazole and amphotericin B used for Chagas\' disease and Leishmaniasis treatment respectively, hypothesizing that the replacement of benznidazole/amphotericin B or the reduction of the doses in combination with statins as coadjuvants could provide better treatment and side effects reduction caused by the commercial drugs. In vitro assays under T. cruzi showed significant antiparasitic activity when compared with benzonidazole to all statins. On the other hand in vivo assays showed parasitic reduction only by mevastatin when it was compared with positive control. L. braziliensis and L. major in in vivo assay didn´t show significant results despite the results have been similar to the positive control.

O vírus de Leishmania 1-4 ( do inglês Leishmania RNA virus 1-4 ou LRV1-4) é um vírus da família Totiviridae, e que possui capsídeo icosaédrico e RNA dupla-fita que codifica duas proteínas (proteína capsidial e RNA polimerase). Dados recentes indicam o envolvimento do LRV1-4 na patogênese de Leishmania no hospedeiro humano, tornando seu estudo de fundamental importância para o entendimento dessa doença e de seu papel na relação parasito-hospedeiro. Há relatos sobre a purificação do vírus a partir do seu hospedeiro natural (Leishmania guyanensis) e a partir de sistemas de expressão heteróloga. Este trabalho tem por objetivo estabelecer os métodos de purificação para posteriores estudos estruturais por Microscopia Eletrônica de Transmissão por Contraste Negativo (NS-TEM) e por Crio-Microscopia Eletrônica (Cryo-EM). Os estudos aqui propostos irão permitir a construção de um modelo estrutural do capsídeo do LRV1-4 e sua identificação correta dentre os totivírus. Além das contribuições ao conhecimento da biologia/patogenia do LRV1-4 este estudo representa a primeira caracterização estrutural de um capsídeo viral realizada no Brasil, e assim um avanço importante para a área de virologia e biologia estrutural no pais. Foram realizadas ultracentrifugações biológicas, utilizando gradientes de sacarose, para a purificação do vírus a partir do extrato celular de L. guyanensis. As frações que apresentaram RNA viral foram analisadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (Campinas LNNano CNPEM). Além disso, foram realizadas tentativas de expressar a proteína do capsídeo (ORF2) em Leishmania tarentolae e Escherichia coli. Foram também realizados esforços para a obtenção de anticorpos a partir de peptídeos sintetizados após análise computacional da sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo. As amostras obtidas a partir do hospedeiro natural do vírus se apresentaram heterogêneas quando analisadas por NS-TEM, de modo que não foi possível a realização de uma análise estrutural. Porém, a presença de partículas do tamanho esperado para o vírus em amostras em que foi detectado o RNA viral indicam que são necessários esforços para obtenção de uma amostra de maior pureza e homogênea. Além disso, não foi possível obter a proteína do capsídeo nos sistemas de expressão heteróloga. A presença de 25 resíduos de cisteína pode estar levando a proteína à degradação rápida em bactéria. Os experimentos de expressão em células de Leishmania ainda não foram conclusivos. Foi obtido um anticorpo anti-peptídeo que reconhece a proteína do capsídeo, tornando possíveis experimentos como imunolocalização e imunoprecipitação do vírus. / The Leishmania RNA virus 1-4 (LRV1-4) belongs to the Totiviridae family. It has an icosahedral capsid and a double-strand RNA encoding two proteins (capsid protein and RNA polymerase). Recent data indicate the involvement of LRV1-4 in the pathogenesis of Leishmania in the human host, making their study of fundamental importance for the understanding of this disease and its role in host-parasite relationship. There are reports on the purification of the virus from its natural host (Leishmania guyanensis) and from the same heterologous expression systems such as Escherichia coli.This work aims to stablish purification methods for further structural studies by Negative Stain Transmission Microscopy (NS-TEM) and Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM). The studies proposed here will allow the construction of a structural model of the coat protein of LRV1-4 and their correct identification amongst the Totiviridae. In addition to the contributions to the knowledge of the biology and pathogenesis of LRV1-4, this study represents the first structural characterization of a viral capsid held in Brazil and thus an important step forward for the field of virology and structural biology in the country. Sucrose for virus purification gradients were performed from the cell extract of L. guyanensis. Fractions that showed viral RNA were analised by Transmission Electron Microscopy (Campinas LNNano - CNPEM). Furthermore, attempts have been made to express the capsid protein (ORF2) in Leishmania tarentolae and Escherichia coli. There has also been made efforts to obtain antibodies from peptides synthesized accordingly to the computer analysis of the amino acid sequence of the capsid protein. The samples obtained from the natural host of the virus showed a heterogeneous distribution of particles when examined by NS-TEM so that it was not possible to perform a structural analysis. However, the presence of particles of the size expected for the virus particles in samples where the viral RNA was detected indicate that efforts are necessary to obtain a more homogeneous and pure sample. Moreover, it was not possible to obtain the capsid protein in heterologous expression systems. The presence of 25 cysteine residues could have led to the protein rapid degradation in the bacteria host. The expression experiments in Leishmania cells were not yet conclusive. It was also possible to obtain an anti-peptide antibody recognizing the capsid protein, enabling immunoprecipitation and immunolocalization experiments.

A leishmaniose é causada por protozoários do gênero Leishmania e no Brasil, as principais espécies causadoras da leishmaniose cutânea são Leishmania (V.) braziliensis e Leishmania (L.) amazonenses. O tratamento da leishmaniose apresenta diversas dificuldades, portanto é fundamental a descoberta de novos fármacos ativos, podendo ser detectada em células cultivadas in vitro e também em animais íntegros, através da técnica de bioimageamento. Neste trabalho, propusemo-nos a produzir linhagens de L. (V.) braziliensis e L. (L) amazonenses expressoras de luciferase e caracterizar o comportamento das linhagens mutantes em testes de sensibilidade a fármacos e de infecção in vitro e in vivo. Foi confirmada a emissão de luz pelas linhagens mutantes das duas espécies de Leishmania, em promastigotas e amastigotas. O comportamento das linhagens mutantes obtidas em relação a curvas de crescimento, sensibilidade aos fármacos tamoxifeno e anfoterina B em promastigotas, perfil de infectividade e sobrevivência em macrófagos e sensibilidade de amastigotas à anfotericina B foi comparado ao comportamento das linhagens parentais, não sendo observadas diferenças significativas. Camundongos BALB/c infectados com a linhagem expressora de luciferase de L. (L.) amazonenses desenvolveram lesões comparáveis aos animais infectados com a cepa selvagem, sendo possível quantificar a carga parasitária nesses animais por bioimageamento. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que os parasitas mutantes expressores de luciferase obtidos podem ser utilizados em testes de sensibilidade a fármacos tanto in vitro como in vivo, representando um avanço metodológico nessa área de pesquisa. / Leishmaniasis is caused by protozoan parasites in Brazil, the main causative species of cutaneous leishmaniasis are Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonenses. The treatment of leishmaniasis presents several difficulties, and the discovery of new active drugs for the treatment of leishmaniasis is therefore fundamental. The enzyme luciferase is a reporter widely used in screening tests for new drugs. This enzyme catalyzes the oxidation of luciferase in the presence of ATP emitting light that can be detected in cultured cells in vitro as well as in intact animals, using the technique of bioimaging. In this work, we sought to produce strains of L. (V.) braziliensis and L. (L) amazonenses expressing luciferase and characterize the behavior of these mutant strains in drug susceptibility tests and in in vitro and in vivo infections. Production of light was detected in mutants of both species, in all life cycle stages. Mutant strains were compared to their corresponding parental lines as to their growth pattern, infectivity and survival profile in macrophages and sensitivity to amphotericin B and tamoxifen. No significant differences were observed for these parameters. BALB/c mice infected with the luciferase expressing line of L. (L.) amazonenses developed lesions comparable to those in animals infected with the wild-type strain. The parasite load in these animals was quantified through bioimaging. The results obtained of this study indicate that the mutant parasites expressing luciferase can be used for drug susceptibility testing in vitro and in vivo, representing a methodological advance in this area of research.

A leishmaniose é uma doença parasitária de ampla distribuição e de difícil tratamento. Recentemente foi identificada a atividade leishmanicida de tamoxifeno, levando à proposta de sua utilização como alternativa para o tratamento de leishmaniose. Neste trabalho, propusemo-nos a caracterizar a atividade de ceramida sintase (CerS) em L. amazonensis e testar a interferência do tamoxifeno nesta enzima. Identificamos, no genoma de L. amazonensis, uma ORF que codifica uma proteína similar à CerS de Saccharomyces cerevisiae, com seis domínios transmembrana e um motivo Lag1 característico. A caracterização da atividade enzimática in vitro mostrou que a enzima reconhece esfingosina/esfinganina e palmitoil/miristoil CoA como precursores. A enzima não é sensível à fumonisina B2 ou a tamoxifeno. Isto indica que esta droga não atua através da inibição da CerS. A caracterização completa desta enzima fornecerá dados valiosos sobre o metabolismo de esfingolipídeos nestes protozoários. / Leishmaniasis is a widely distributed parasitic disease with difficult treatment. The leishmanicidal activity of tamoxifen was recently identified, leading to its proposal as an alternative treatment for leishmaniasis. In this work, we aimed at characterizing the activity of ceramide synthase (CerS) in L. amazonensis and testing whether this enzymatic activity in inhibited by tamoxifen. We have identified, in the L. amazonensis genome, an ORF which encodes a protein similar to the Saccharomyces cerevisiae CerS, with six transmembrane domains and a characteristic Lag1 motif. The characterization of the in vitro enzymatic activity showed that the enzyme recognizes sphingosine/sphinganine as well as palmitoyl/miristoyl CoA as precursors. This enzyme is not sensitive to fumonisin B2 or tamoxifen. This indicates that this drug does not act through the inibition of CerS. The complete characterization of this enzyme will provide valuable information about the sphingolipid methabolism of these protozoa.

Os tripanosomatídeos utilizam aminoácidos, particularmente a prolina, como fontes de carbono e energia. Essas moléculas estão também envolvidas em outros processos fisiológicos como a metaciclogênesis, osmorregulação, ou resistência a diferentes condições de estresse. Duas enzimas, prolina desidrogenase e <font face=\"Symbol\">D1-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase catalisam a oxidação de prolina a glutamato. Embora a presença dessa via em algumas espécies do gênero Leishmania seja amparada por dados do projeto genoma, ainda não ha evidências bioquímicas de sua atividade. Nesse trabalho focamos alguns aspectos dessa via em L. (L.) amazonensis. Demonstramos a presença das ORFs de ambos os genes dessa via (que denominamos LaPRODH e LaP5CDH) e dos seus produtos. Constatamos que ambas enzimas são mitocondriais. Também demonstramos que esses genes complementam cepas de Saccharomyces cerevisiae mutantes para <font face=\"Symbol\">Dput1 ou <font face=\"Symbol\">Dput2, ortólogos de LaPRODH e LaP5CDH respectivamente. Em conjunto, os dados obtidos sugerem a presença e funcionalidade da via prolina-glutamato em L. (L.) amazonensis. / Trypanosomatids use amino acids, particularly proline, as a carbon and energy sources. In addition, they are involved in other physiological processes such as metacyclogenesis, osmorregulation or resistance to different stress conditions. Two enzymes, proline dehydrogenase and <font face=\"Symbol\">D1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase catalyze the oxidation from proline to glutamate. Although, the presence of this pathway in some species of the Leishmania is supported by the genome project, no biochemical data on their activities were shown up to now. In this work we focus on some aspects of the proline-glutamate pathway in L. (L.) amazonensis. We demonstrate the presence of ORFs for both genes (which we called LaPRODH and LaP5CDH) and their products. We also showed that both enzymes are mitochondrial. We could also demonstrate that both genes complement Saccharomyces cerevisiae strains mutant for <font face=\"Symbol\">Dput1 or <font face=\"Symbol\">Dput2, orthologs of LaPRODH and LaP5CDH respectively. Taken together, these data show the presence and functionality of the proline-glutamate pathway in L. (L.) amazonensis.

As chaperonas moleculares são proteínas que auxiliam no enovelamento correto de outras proteínas, entre outras funções importantes para as células, motivo pelo qual elas têm sido alvo para o combate de várias doenças. As Hsp90 (82-96 kDa) são chaperonas abundantes que interagem com diversas proteínas-cliente. São constituídas por três domínios: N-terminal, intermediário ou central (M) e C-terminal, o qual é responsável pela dimerização da proteína. A atividade da Hsp90 está diretamente relacionada à sua atividade ATPásica. Durante o ciclo funcional, as Hsp90 podem interagir com inúmeras co-chaperonas. Uma delas é a co-chaperona p23 (18-22 kDa) que interage com o dímero da Hsp90 e algumas das suas funções são a inibição da atividade ATPásica e atividade chaperona. O objetivo do trabalho foi obter a proteína recombinante Hsp90 de Leishmania braziliensis e os domínios N e N+M, determinar fatores importantes que relacionam mudanças conformacionais e função da Hsp90 e as bases moleculares da inibição por GA. Também obter as co-chaperonas Lbp23A e Lbp23B e investigar a interação com a LbHsp90 e suas funções. As proteínas produzidas foram purificadas e caracterizadas por técnicas biofísicas. Em solução, a LbHsp90 foi caracterizada como dímero assimétrico e as demais proteínas como monômeros assimétricos.A interação da LbHsp90 e domínios com nucleotídeos foi analisada por fluorescência e as constantes de dissociação ficaram em torno de 150 &micro;M. A afinidade por GA foi maior que a verificada para ATP e em ordem crescente para LbHsp90, LbHsp90_NM e LbHsp90_N. A LbHsp90 apresentou grande atividade chaperona em relação à citrato sintase, de maneira independente de ATP. A LbHsp90 mostrou baixa atividade ATPásica, a qual foi inibida pela GA com IC50 de 0,7 &micro;M. Tanto a Lbp23A quanto a Lbp23B inibiram a atividade ATPásica da LbHsp90, porém a Lbp23A aproximou-se de 100% de inibição e a Lbp23B apenas 30%. A interação in vitro entre a LbHsp90 e a Lbp23B foi observada por pull-down na presença/ausência de nucleotídeos e essa técnica não se mostrou adequada para a Lbp23A.O pioneirismo do trabalho com a Hsp90/p23 de L. braziliensis oferece uma grande contribuição para futuros trabalhos que visam o entendimento das relações funcionais entre essas proteínas e o contexto das Hsp90 no desenvolvimento da leishmaniose. / Molecular chaperones are proteins involved in proper folding of other proteins, and others important cellular functions, why they have been targeted for combating various diseases. The Hsp90 (82-96 kDa) are ubiquitous chaperones that interact with a wide range of client proteins. They are formed by three domains: N-terminal, central or middle (M), and C-terminal, which is responsible by its dimerization. The Hsp90 activity is related to its ATPase activity. During the Hsp90 functional cycle, diverse co-chaperones. One of them is the p23 (18 kDa), that interacts with one Hsp90 dimer, and some p23 functions are the inhibition of Hsp90 ATPase activity and chaperone activity. The aim of this work was obtain the Hsp90 recombinant Leishmania braziliensis Hsp90, the N and N+M domains, to determine the important factors related to conformational changes and Hsp90 function, and the molecular basis of GA inhibition. Also, to obtain the Lbp23A and Lbp23B co-chaperones in order to establish relevant aspects for LbHsp90 interaction and its co-chaperones functions. The recombinant proteins were produced, purified and characterized by biophysics techniques. The LbHsp90 was identified as an asymmetric dimer for whereas the others were identified as asymmetric monomers. The interactions between LbHsp90 and domains with nucleotides were determined by fluorescence and the dissociation constants were about 150 &micro;M. The GA-affinity was greater than ATP one, in increasing order for LbHsp90, LbHsp90_NM, and LbHsp90_N. The LbHsp90 showed large chaperone activity related to citrate synthase independently of ATP. The LbHsp90 presented low ATPase activity, which was inhibited by GA with a IC50 of 0,7. The Lbp23A and Lbp23B inhibited the ATPase activity with different values, the Lbp23A inhibition was closed to 100% whereas the Lbp23B one was 30%. The in vitro interaction between the LbHsp90 and Lbp23B was observed by pull-down, in the absence or presence of nucleotides, and for Lbp23A this technique was not appropriated. The pioneering work with Hsp90/p23 from L. braziliensis offers an important contribution to future studies aimed at understanding the functional relationships between these proteins and the context of Hsp90 in the development of leishmaniasis.

Orientador: Maria Cano / Resumo: As leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas, causadas por protozoários do gênero Leishmania. Elas são consideradas pela Organização Mundial da Saúde como uma doença endêmica em muitos países, incluindo o Brasil. Assim, a busca por novas metodologias de combate e controle dessas doenças parasitárias se faz necessária. Uma das abordagens refere-se ao estudo da biologia molecular dos parasitos causadores da doença, como o estudo dos telômeros, os quais são repetições em tandem associadas a proteínas e localizadas nas extremidades dos cromossomos da maioria dos eucariontes. Sua função é diferenciar os terminais de cromossomos das quebras de DNA em dupla fita e assim proteger tais extremidades da degradação e dos mecanismos de reparo das células, que em muitos casos resulta na perda de material genético codificante ao fim de cada ciclo celular. Os estudos da biologia telomérica de Leishmania têm auxiliado bastante no entendimento deste organismo, no qual o complexo telomerase é composto minimamente por um componente proteico, TERT, e por um RNA, TER, sendo que a caracterização funcional destes componentes é uma das metas de nosso grupo de pesquisa. Tal caracterização tende a ser feita, principalmente, por meios de compostos inibitórios específicos da função desses componentes ou por meio de manipulação gênica, tal qual a tecnologia CRISPR-Cas, que tem possibilitado alterações genômicas precisas e pontuais bem como o silenciamento rápido e específico de genes em diferente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leishmaniasis are neglected tropical disease, caused by protozoa of the genus Leishmania, which according to the World Health Organization is endemic in many countries, including Brazil. Thus, the search for new alternatives to combat and control these parasitic diseases, are necessary. One of the current potential approaches are to study the biology of telomeres, which are tandemly repeated sequences associated with proteins located at the ends of the chromosomes of most eukaryotes. The main function of telomeres is to differentiate the chromosome end termini from double-stranded DNA breaks and thus, to protect the ends from degradation and damage repair mechanisms, which, at the end of each cell cycle, can result in loss of genetic material. The telomere biology studies of Leishmania have greatly improved our knowledge about this organism, in which the telomerase complex is composed minimally by a protein component, TERT, and by an RNA, TER. The functional characterization of these components is one of the goals of our research group. Such characterization is usually done by using inhibitory compounds specific to the function of these components or by gene manipulation, such as the CRISPR-Cas technology, which has enabled precise genomic alterations as well as the rapid and specific silencing of genes in different organisms, including Leishmania. Thus, we sought to observe the effects of inhibiting the L. major telomerase activity, using a specific TERT inhibitor, called BI... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre