Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-08-13T13:42:55Z No. of bitstreams: 1 2013_FelixJavierLeonMolinet.pdf: 1600942 bytes, checksum: a50699577ef3ad61a53a9718e8a70628 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-08-15T11:50:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_FelixJavierLeonMolinet.pdf: 1600942 bytes, checksum: a50699577ef3ad61a53a9718e8a70628 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-15T11:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_FelixJavierLeonMolinet.pdf: 1600942 bytes, checksum: a50699577ef3ad61a53a9718e8a70628 (MD5) / Antecedentes: A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é um problema relevante de saúde pública no Brasil. Na última década tem sido constatada a falha do tratamento com antimoniato de meglumina e até o momento não existem informações consistentes na literatura sobre os fatores associados ao prognóstico da doença. Metodologia: Foi realizado um estudo de prognóstico, baseado numa corte clínica de 178 pacientes com diagnóstico de Leishmaniose Cutânea Localizada (LCL) residentes em área endêmica para LTA por Leishmania braziliensis com o objetivo de desenvolver uma regra de predição clínica para predizer o prognóstico de pacientes tratados com antimoniato de meglumina. Os pacientes foram acompanhados durante o ano de 1996 e no período de 2001 a 2004. Foi identificada a associação das características clínicas com o desfecho de falha terapêutica, três meses após a conclusão do tratamento, por meio da análise bivariada, e a magnitude das associações foram ajustadas utilizando-se o modelo de regressão logística. Os dados da força da associação foram utilizados para explorar a possibilidade de desenvolver um escore de prognóstico utilizando curvas ROC. Resultados: Dos 178 pacientes, 69 (38,8%) apresentaram falha terapêutica e 109 61,2%) curaram. Cinco características estiveram associadas independentemente ao desfecho de falha terapêutica: “localização das lesões cutâneas acima da cintura versus outras localizações” OR = 4,6 (IC95% 2,2 a 9,8); “área ulcerada da lesão >2,5 cm²” OR = 2,6 (IC95% 1,3 a 5,2); “diâmetro da reação de Montenegro < 15 mm” OR = 2,8 (IC95% 1,4 a 5,5); “aparecimento do acometimento linfático antes da lesão cutânea” OR = 1,9 (IC95% 0,9 a 3,9) e “presença de qualquer sintoma nas lesões na pele” OR = 5,8 (IC95% 1,6 a 20,5). Não foi possível construir um escore que apresentasse acurácia razoável para discriminar pacientes com mau prognóstico. Conclusões: A predição acurada do prognóstico de pacientes com LCL tratados com antimonial pentavalente não foi viável a partir da identificação de variáveis clínicas de fácil mensuração ou da combinação dessas variáveis com o resultado da intradermorreação de Montenegro. Na amostra estudada, apesar de haver cinco características independentemente associadas ao desfecho do estudo, não foi possível a elaboração de uma regra de predição clínica para falha terapêutica na amostra de pacientes com LCL tratados com antimoniato de meglumina. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Background: American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is a relevant public health problem in Brazil. Therapeutic failure with meglumine antimoniate has been observed during the past decade and there is no consistent information in the literature on factors associated with the prognosis of the disease. Methods: We conducted a prognosis study base on a clinical cohort of 178 patients with diagnosis of localized cutaneous leishmaniasis (LCL), all residents in a Leishmania braziliensis ATL endemic area. The study purpose was the development of a clinical prediction rule to predict the prognosis of patients treated with meglumine antimoniate. Patients were enrolled and follow-up during 1996 and from 2001 to 2004. The association of clinical features and the study endpoint of therapeutic failure was evaluated three months after treatment conclusion through bivariate analysis and the magnitude of associations was adjusted using a logistic regression model. Data on the association strength were used to explore the possibility of developing a prognostic score plotting ROC plots. Results: Sixty-nine (38.8%) out of 178 patients had therapeutic failure and 109 (61.2%) patient cured. Five characteristics were independently associated with therapeutic failure: “cutaneous lesions localized above the waist versus any other localization” OR = 4.6 (95%CI 2.2 a 9.8); “ulcerated area > 2.5 cm²” OR = 2.6 (95%CI 1.3 a 5.2); “Montenegro skin test diameter < 15 mm” OR = 2.8 (IC95% 1.4 a 5.5); “lymphatic involvement before cutaneous lesion onset” OR = 1.9 (95%CI 0.9 a 3.9) and “presence of any symptom in the skin lesions” OR = 5.8 not possible the construction of a score with reasonable accuracy to discriminate patients with poor prognosis. Conclusion: Accurate prognosis prediction of patients with LCL treated with pentavalent antimonial is not feasible through the identification of clinical features of the disease which are easily measured or the combination of those variables plus the result of the Montenegro skin test. In spite of having five characteristics independently associated with the study endpoint we failed to develop a clinical prediction rule to predict poor outcome in patients with LCL treated with meglumine antimoniate.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-08-26T14:41:10Z No. of bitstreams: 1 2013_DandaraBragaSantana.pdf: 2501353 bytes, checksum: 6d96772a5d16d10a2900c58bb4539ea7 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-08-29T15:47:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_DandaraBragaSantana.pdf: 2501353 bytes, checksum: 6d96772a5d16d10a2900c58bb4539ea7 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-29T15:47:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_DandaraBragaSantana.pdf: 2501353 bytes, checksum: 6d96772a5d16d10a2900c58bb4539ea7 (MD5) / Tanto as infecções fúngicas quanto as leishmanioses são caracterizadas por tratamentos tóxicos, resistência crescente aos medicamentos disponíveis e manejo clínico com fármacos similares, como a anfotericina B. Diante desse cenário, descobrir novas alternativas terapêuticas para esses modelos biológicos torna-se uma ferramenta interessante para a comunidade acadêmica e necessária para a prática clínica. Os metabólitos secundários de plantas são uma fonte importante de moléculas promissoras para diversas doenças. Neste trabalho foi realizado uma triagem de extratos pertencentes a três espécies de plantas do Cerrado em Leishmania (Leishmania) amazonensis, dermatófitos e leveduras: Enterolobium ellipticum Benth. (Fabaceae), Sclerolobium aureum (Tul.) Baill. (Fabaceae) e Vatairea macrocarpa (Benth.) Ducke (Fabaceae). O extrato de Vatairea macrocarpa apresentou os melhores resultados nos micro-organismos testados, sendo que essa atividade ainda não havia sido relatada na literatura. O extrato acetato de etila da casca da raiz foi selecionado para o fracionamento químico e foram isolados e identificados os compostos dianellidina (D3) e vatacarpina (D93), sendo esta última não descrita na literatura. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis as well fungal infections are diseases which have toxic and similar treatments (i.e., amphotericin B) and increasing resistance to available drugs. So, finding out new therapeutic alternatives for these biologic models is essential to research and clinical practices. Plant secondary metabolites are an interesting avenue to find out promising molecules to several diseases. This work conducted a screening of Cerrado species extracts Enterolobium ellipticum Benth. (Fabaceae), Sclerolobium aureum (Tul.) Baill. (Fabaceae) e Vatairea macrocarpa (Benth.) Ducke (Fabaceae) against Leishmania (Leishmania) amazonensis, dermatophytes and yeasts. Vatairea macrocarpa extracts presented the most promising results against all three micro- organisms, which has not been described in the literature. The ethyl acetate extract of the root bark was selected for chemical fractionation and the following compounds were identified: ethanone (D3) and vatacarpina (D93), that hasn’t been previously reported.

Tese (doutorado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2009. / Submitted by samara castro (sammy_roberta7@hotmail.com) on 2011-04-07T18:47:06Z No. of bitstreams: 2 2009_JuliaSoniaAmpuero.pdf: 15052956 bytes, checksum: 6bed1f9a5fbec7544dd71bcacdfbdfe6 (MD5) 2009_JuliaSoniaAmpuero.pdf: 15052956 bytes, checksum: 6bed1f9a5fbec7544dd71bcacdfbdfe6 (MD5) / Rejected by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br), reason: Item está com dois arquivos iguais em anexo. Favor remover um. on 2011-04-14T23:56:21Z (GMT) / Submitted by samara castro (sammy_roberta7@hotmail.com) on 2011-04-27T17:43:24Z No. of bitstreams: 1 2009_JuliaSoniaAmpuero.pdf: 15052956 bytes, checksum: 6bed1f9a5fbec7544dd71bcacdfbdfe6 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-05-21T00:52:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_JuliaSoniaAmpuero.pdf: 15052956 bytes, checksum: 6bed1f9a5fbec7544dd71bcacdfbdfe6 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-21T00:52:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_JuliaSoniaAmpuero.pdf: 15052956 bytes, checksum: 6bed1f9a5fbec7544dd71bcacdfbdfe6 (MD5) / Foi desenvolvido, um ensaio clínico randomizado aberto para estimar a eficácia e segurança de uma dose de 5mg/kg/dia por 20 dias de antimoniato-N-metil-glucamina, no tratamento da leishmaniose cutânea (LC) por L. (V.) braziliensis, comparada com a dose padrão de 15mg/kg/dia por 20 dias (ClinicalTrials.gov número NCT00317980). Entre janeiro de 2006 e janeiro de 2007 foram incluídos 280 pacientes entre 7 e 50 anos de idade, de ambos os sexos com diagnóstico clínico e laboratorial de LC. Os pacientes foram alocados de maneira randômica, 140 pacientes em cada grupo de tratamento. Todos apresentavam até nove lesões cutâneas ulceradas com duração entre duas a 20 semanas. A cura clínica foi definida como a epitelização total de todas as lesões com ausência completa de eritema, edema, descamação e adenite ou linfangite regional, três meses após a finalização do tratamento. Segundo a análise por protocolo (180 pacientes), o coeficiente de incidência de cura foi 8,8% para o grupo que recebeu 5 mg/kg/d, e de 20,2% para o grupo que recebeu 15 mg/kg/d com uma diferença de risco de 11,4% (limite superior do IC95% unicaudal = 20,3). Na análise por intenção de tratar (280 pacientes), observou-se um coeficiente de incidência de cura de 9,3% para o grupo que recebeu dose baixa, e de 18,6% para o grupo que recebeu 15 mg/kg/d, com uma diferença de risco de 9,3% (limite superior do IC95% unicaudal = 16,2). A dose de 5 mg/kg/d mostrou ser inferior à dose de 15 mg/kg/d quando aplicado o teste de não inferioridade, comparando com a diferença proposta a priori de 15% para definir a dose baixa como não inferior. Os pacientes que receberam 15 mg/kg/d experimentaram maior quantidade de eventos adversos comparado com os pacientes que receberam dose baixa de antimonial. Não foi evidenciado desenvolvimento de lesões mucosas com dois anos de seguimento. Os pacientes que utilizaram dose baixa tiveram maior coeficiente de incidência de falhas entre os primeiros 20 a 40 dias de seguimento pós- tratamento, 28,6% (IC95% 20,0 a 38,5) versus 7,9% (IC95% 3,5 a 14,9) no grupo que recebeu 15 mg/kg/d (p < 0,001). Foram encontradas como variáveis preditoras de falha precoce a utilização da dose baixa, ser de sexo feminino, ter lesões localizadas na região de cabeça e pescoço e a presença de parasitos intestinais no momento do diagnóstico de leishmaniose. Em conclusão o coeficiente de incidência de cura da dose baixa foi consideravelmente inferior à dose de 15 mg/kg/dia, e a quantidade de eventos adversos foi maior no grupo que recebeu a dose padrão. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / A randomized open-label clinical trial was conducted to assess the efficacy and safety of an intravenous dose of 5 mg/kg/day antimony-N-methyl-glucamine for 20 days compared with the conventional dose of 15mg/kg/day for 20 days for treatment of cutaneous leishmaniasis (CL) associated with L. (V.) braziliensis infection. This trial was registered with clinicaltrials.gov, number: NCT00317980. From January 2006 to January 2007 were enrollment 280 patients aged 7 to 50 years old, of both sexes with clinical and laboratory diagnosis of CL. The volunteers were randomly assigned to one of the two treatment groups. All patients presented with up to nine ulcerated cutaneous lesions with less than twenty weeks of disease evolution. Clinical cure was defined as complete healing of the lesions defined as complete epithelization plus absence of erythema, oedema, flaking, and regional adenitis or lymphangitis, three months after finishing the exposure to the drug. According to the per-protocol analysis (180 patients) the cure rate was 8.8% and 20.2% for the group receiving 5 mg/kg/d and 15mg/kg/d respectively, and the cure rate difference was 11.4% (upper limit of a 1-sided 95% IC = 20.3). The intention-to-treat analysis (280 patients) showed effectiveness rate of 9.3% and 18.6% for the group receiving 5 mg/ kg/d and 15mg/kg/d respectively, and the cure rate difference was 9.3% (upper limit of a 1-sided 95% IC = 16.2), confirming the findings of the per-protocol analysis. The dose of 5mg/kg/d was shown to be inferior than 15 mg/kg/d when the non-inferiority test was applied compared to the proposed a priori difference of 15%. Patients who received the 15 mg/kg/d dose experienced more adverse events compared with patients who received the low dose schedule. By the end of the second year of follow-up there were no patients diagnosed with mucosal disease. Patients who received low dose had a higher failure rate between the first 20 to 40 days of followup, 28.6% (95% CI 20.0 to 38.5) versus 7.9% (CI 95% 3.5 to 14.9) in the group receiving 15 mg/kg/d (p < 0.001). Risk factors for early treatment failure identified in the final multivariate model were: exposition to the low dose schedule, to be female, to have lesions in the head and neck and the presence of intestinal parasites at the time of diagnosis of leishmaniasis. In conclusion, the incidence rate of cure of low dose was significantly lower than 15 mg/kg/d, and the number of adverse events was higher in the group receiving the standard dose.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Nas infecÃÃes experimentais, estudos utilizando inÃculo purificado de Leishmania, com populaÃÃes metacÃclicas mais homogÃneas, tem sido importantes por se aproximarem mais da condiÃÃo de infecÃÃo natural e por eliminar uma possÃvel resposta inflamatÃria induzida por restos parasitÃrios. A superfÃcie dos vÃrios parasitos reveste-se por diversos glicoconjugados. Estes, por sua vez, podem ser reconhecidos especifica e reversivelmente por lectinas, proteÃnas que possuem afinidade a carboidratos. Por conta disso, tem-se tentado purificar promastigotas metacÃclicas de culturas de Leishmania atravÃs de aglutinaÃÃo mediada por lectinas. Com esse intuito, buscou-se avaliar se lectinas de diferentes especificidades seriam capazes de aglutinar promastigotas de L. amazonensis em diferentes estÃgios evolutivos. Para isso, foi utilizado um painel de 7 lectinas, e a especificidade de ligaÃÃo aos carboidratos de superfÃcie foi analisada atravÃs de ensaios de aglutinaÃÃo, sendo a lectina de Dioclea violacea (DVL) selecionada para a realizaÃÃo dos ensaios in vivo. A DVL foi capaz de aglutinar L. amazonensis num percentual de 78% em cultura de fase logarÃtmica e 52% em fase estacionÃria. Em seguida, promastigotas de fase estacionÃria foram incubadas com DVL para avaliar se a aglutinaÃÃo era estÃgio-especifica. Posteriormente, realizou-se infecÃÃo experimental em hamsters dourados (106 promastigotas/animal) para avaliar a infectividade das fraÃÃes purificadas. Os animais foram divididos em 3 grupos: FraÃÃo aglutinada (FA) (n=8); FraÃÃo nÃo aglutinada (FNA) (n=9); Controle positivo (CT) (n=8). A evoluÃÃo da infecÃÃo foi acompanhada pelo tamanho da lesÃo, nas 6 semanas pÃs-infecÃÃo e pela quantificaÃÃo da carga parasitÃria no linfonodo regional, por diluiÃÃo limitante, bem como pela anÃlise anatomopatolÃgica das lesÃes. Em todos os grupos as lesÃes iniciaram na 3 semana. O tamanho da lesÃo foi muito semelhante em todos os grupos, com exceÃÃo da 4 e 5 semanas, onde FNA apresentou uma variaÃÃo transitÃria (p<0,01). Quanto à carga parasitÃria e Ãs alteraÃÃes histopatolÃgicas nÃo houve diferenÃa entre os grupos avaliados. Esses dados sugerem que, embora a DVL seja capaz de se ligar especificamente aos glicoconjugados de superfÃcie das promastigotas, induzindo importante poder de aglutinaÃÃo nas duas fases de crescimento, ela nÃo foi capaz de selecionar formas infectantes de L. amazonensis. / In experimental leishmaniasis infections, the use of metacyclic enriched inoculum is very important because it can simulate the natural infection and avoids the inflamatory response induced by the high density parasite inoculum. The surface of different evolutionary forms of Leishmania is coated by several glycoconjugates that can be recognized specifically and reversibly by lectins, proteins that have affinity with carbohydrates. This being the case, one could use lectins in order to purify metacyclic Leishmania. The aim of the current study was to evaluate whether lectins of different specificities would agglutinate L. amazonensis promastigotes of different evolutionary forms. A panel of 7 lectins were used. The binding specificity was analyzed by agglutination tests. DVL agglutinated 78% of L. amazonensis promastigotes from logarithmic phase culture and 52% from stationary phase, and therefore was selected for in vivo tests. Stationary phase promastigotes were incubated with DVL to evaluate if the agglutination was stage-specific and it was purified the agglutinated and non agglutinated fractions. Golden hamsters were infected with 106 promastigotes and grouped as: Agglutinated fraction (FA) (n=8); Non agglutinated fraction (FNA) (n=9); Control (CT) (n=8). The lesion size was measured over the course of 6 weeks. The parasite load of regional lymph node was quantified by limiting dilution and histopathological analysis of the lesions were performed on their paws. The lesions began at the third week in all groups. The lesionâs size was similar in all of them, except at the fourth and fifth weeks that FNA presented a transitory reduction (p<0,01). There were no significant differences concerning the parasite load and histopathologic changes among the groups. These data suggest that DVL did not select effectivelly infective forms of L. amazonensis, although it agglutinates promastigotes from the two culture growth phases.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-04-26T17:20:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Ludmila Arruda de Assis.pdf: 13439374 bytes, checksum: dd4819668c7a765708f6e46f9e768946 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T17:20:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Ludmila Arruda de Assis.pdf: 13439374 bytes, checksum: dd4819668c7a765708f6e46f9e768946 (MD5) Previous issue date: 2015-03-11 / CNPQ / A iniciação da síntese protéica em eucariotos depende da ação dos chamados fatores de iniciação da tradução ou eIFs. Dentre esses, destacam-se dois complexos: eIF4F, formado pelos eIF4A, eIF4E e eIF4G; e eIF3, que em mamíferos compreende 13 subunidades (eIF3a até eIF3m). Suas ações permitem o reconhecimento dos mRNAs, via eIF4E, e o recrutamento do ribosomo, mediado pelo eIF3 que por sua vez interage com o eIF4F. Em espécies de Leishmania seis homólogos de eIF4E foram identificados (EIF4E1 a 6) que parecem divergir funcionalmente enquanto o complexo eIF3 ainda é pouco caracterizado. Este trabalho buscou avaliar a presença, composição e função do eIF3 em Leishmania. Um total de 11 subunidades do complexo foram confirmadas a partir de ensaios de imunoprecipitação (IP) e espectrometria de massa utilizando soro direcionado a subunidade EIF3E. Visando uma melhor caracterização, seis dessas subunidades tiveram seus genes clonados e foram expressas em L. infantum, fusionadas ao peptídeo HA. Quatro destas proteínas heterólogas foram utilizados em novas IPs, com soro anti-HA, onde se avaliou sua capacidade de copurificar com o EIF3E. Todas mostraram essa interação, confirmando sua presença em complexos eIF3 íntegros. Homólogos de eIF4E de L. infantum também foram expressos fusionados a HA e utilizados em IPs semelhantes. Dois destes, EIF4E2 e EIF4E3, mostraram uma associação, direta ou indireta, com a subunidade EIF3E do complexo eIF3, indicando um papel relevante na tradução. / The initiation of protein synthesis in eukaryotes depends on the action of the translation initiation factors or eIFs. Among these, two major complexes are: eIF4F, formed by eIF4A, eIF4E and eIF4G; and eIF3, which comprises 13 subunits in mammals (eIF3a to eIF3m). Their actions allow the recognition of mRNAs via eIF4E, and the recruitment of the ribosome, mediated by eIF3 which interacts with eIF4F. In Leishmania species, six eIF4E homologues have been identified (EIF4E1 to 6) that seem to differ functionally, and the eIF3 complex is not well characterized. This study aimed to evaluate the presence, composition and function of eIF3 in Leishmania. A total of 11 subunits from the complex were confirmed through immunoprecipitation assays (IP) and mass spectrometry using serum directed to the EIF3E subunit. For a better characterization, six of these subunits had their genes cloned and expressed in L. infantum, fusioned to a HA peptide. Four of the resulting heterologous proteins have been used in new IPs with anti-HA serum, which were evaluated for their ability to copurify with EIF3E. All showed this interaction, confirming their presence in intact eIF3 complexes. L. infantum eIF4E homologues were also expressed fusioned to HA and used in similar IPs. Two of these, EIF4E2 and EIF4E3 showed an association, direct or indirect, with the EIF3E subunit of eIF3 complex, indicating a relevant role during translation initiation.

Submitted by Rafael Santana (rafael.silvasantana@ufpe.br) on 2018-01-23T19:32:16Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao_Crhisllane_Genetica.pdf: 1853232 bytes, checksum: 496b497eae0c5059051f87124fbccc04 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao_Crhisllane_Genetica.pdf: 1853232 bytes, checksum: 496b497eae0c5059051f87124fbccc04 (MD5) Previous issue date: 2016-03-11 / De acordo com a Organização Mundial de Saúde, 1-2 milhões de novos casos de leishmaniose ocorrem a cada ano. As drogas disponíveis para tratamento têm sérias desvantagens e nenhuma vacina eficaz foi desenvolvida. Assim, são necessárias aplicações utilizando abordagens sistêmicas para descoberta de novos alvos para drogas/vacinas. Uma destas abordagens é o estudo de redes de interação proteica. Portanto, o objetivo principal deste trabalho é modelar redes de interação de proteínas para Leishmania braziliensis e Leishmania infantum a partir de seus proteomas preditos com base em informações estruturais. Para isso, as sequências das proteínas dos organismos alvos foram obtidas do TritrypDB e suas estruturas preditas através dos pacotes de programas MODELLER e Modpipe e dos servidores MHOLline e Phyre2. Posteriormente, essas estruturas passaram por processos de refinamento e foram então avaliadas. Um total de 480 e 463 proteínas de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, respectivamente, tiveram suas estruturas preditas dentro dos parâmetros estereoquímicos e energéticos aceitáveis. Estas foram divididas em subgrupos de acordo com sua localização subcelular, e a predição de interação foi realizada através do consenso entre o método de acoplamento de corpo rígido e acoplamento baseado em modelo. As redes resultantes se apresentaram biologicamente consistentes com diferença significativa quando comparado às redes aleatórias, e a partir destas, foi possível obter informações sobre estrutura, localização subcelular, interações entre proteínas e selecionar proteínas importantes para a estabilidade da rede de interação proteica. / According to the World Health Organization, 1-2 million new cases of leishmaniasis occur each year. Available drugs for treatment have serious disadvantages, and no effective vaccine has been developed. Thus, applications using systemic approaches to discover new targets for drugs/vaccines are needed. One such approach is the study of protein interaction networks. Therefore, the main objective of this work is to model protein interaction networks for Leishmania braziliensis and Leishmania infantum from their predicted proteomes, based on structural information. In order to accomplish this, the protein sequences from the target organisms were obtained from TritrypDB, and their structures predicted through the MODELLER and Modpipe program packages and MHOLline and Phyre2 servers. Subsequently, these structures had undergone refining processes, and were evaluated. A total of 480 and 463 proteins of Leishmania braziliensis and Leishmania infantum, respectively, had their structures predicted within the acceptable stereoisomers and energy parameters. These were divided into subgroups according to their subcellular localization, and the prediction of interaction was carried out through consensus between the rigid body docking and docking based on model. The resulting networks were found to be biologically consistent with significant differences when compared against random networks, and from them, it was possible to obtain information on structure, subcellular localization, interactions between proteins in each proteome and select proteins important for the stability of the protein-protein network.

Submitted by Rafael Santana (rafael.silvasantana@ufpe.br) on 2018-03-07T18:39:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tese Completa Mari Marques Final.pdf: 4240571 bytes, checksum: b948f5d1f90614e5f2096e402ebecbf8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-07T18:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tese Completa Mari Marques Final.pdf: 4240571 bytes, checksum: b948f5d1f90614e5f2096e402ebecbf8 (MD5) Previous issue date: 2013-06-28 / FACEPE, CNPQ / A iniciação da tradução em eucariotos é um ponto crucial no processo de síntese protéica e de sua regulação. Nesta etapa atua o complexo heterotrimérico eIF4F (formado pelas subunidades eIF4E, eIF4G e eIF4A), que atua recrutando a subunidade ribossomal 40S para o mRNA, para iniciar a tradução. O reconhecimento dos mRNAs se dá pela ligação da subunidade eIF4E no cap presente na sua extremidade 5’, junto com a ligação da proteína de ligação ao poli-A (PABP), que interage diretamente com o eIF4G, na extremidade 3’ destes mesmos mRNAs. Vários homólogos destes fatores foram encontrados nos tripanosomatídeos, indicando uma complexidade na iniciação da tradução que pode estar associada aos ciclos de vida únicos destes parasitas. Destes, dois complexos eIF4F típicos foram caracterizados, baseados em dois homólogos de eIF4E denominados de EIF4E3 e EIF4E4. Neste trabalho, a análise da expressão destas duas proteínas em Leishmania amazonensis mostrou que ambas são alvos de modificações pós-traducionais, identificadas como fosforilação, gerando múltiplas isoformas. O padrão de expressão dos dois conjuntos de isoformas é alterado com a inibição do processamento de mRNAs e a inibição da tradução interfere especificamente com as isoformas do EIF4E3. Curvas de sincronização celular sugerem uma associação de isoformas específicas com o ciclo celular do parasita. Múltiplos eventos de fosforilação parecem agir, porém de forma diferenciada, sobre os dois homólogos eIF4E. Diferentemente do EIF4E4, o EIF4E3 possui diferenças de expressão entre espécies de Leishmania, com uma banda de maior peso molecular, típica de células estressadas, encontrada apenas em L. amazonensis. A análise da seqüência do gene EIF4E3 de três espécies de Leishmania mostrou que poucas mudanças de aminoácidos levam a diferenças marcantes de migração das respectivas proteínas em gel desnaturante. Ensaios de mutagênese, associados a expressão ectópica do EIF4E3 contendo um epítopo HA em células de Leishmania transfectadas, identificou a serina 75, exclusiva de L. amazonensis, como sítio responsável pela geração da isoforma específica desta espécie. Análises em gel bidimensional mostraram que esta isoforma não está associada a alterações no ponto isoelétrico, indicando que outro tipo de modificação, além das fosforilação, deve ter como alvo o EIF4E3. Experimentos de interação in vitro e in vivo demonstraram que os EIF4E3 e 4 interagem diferencialmente com homólogos de PABP e realizam outras interações conservadas em espécies de tripanosomatídeos. Os resultados obtidos neste trabalho indicam uma complexa regulação destes fatores, através de múltiplos sítios de fosforilação, provavelmente relacionada com o ciclo celular do parasita. / Translation initiation in eukaryotes is a critical stage within the process of protein synthesis and its regulation. A major player is the heterotrimeric eIF4F complex (formed by the eIF4E, eIF4G and eIF4A subunits) which acts by recruiting the 40S ribosomal subunit to the mRNA to initiate translation. mRNA recognition occurs through the binding of the eIF4E subunit to its 5 'end cap as well as the binding of the poly-A binding protein (PABP), which interacts directly with eIF4G, to its 3' end poly-A tail. Various homologues for the eIF4F subunits were found in trypanosomatids, indicating a greater complexity within translation initiation which can be associated with the parasites unique life cycle. Two typical eIF4F complexes were characterized based on two eIF4E homologues, named EIF4E3 and EIF4E4. In this study, expression analysis of both proteins in Leishmania amazonensis showed that both are targets for post-translational modifications, identified as phosphorylation, leading to multiple isoforms. The expression pattern of the two sets of isoforms is altered with inhibition of mRNA processing but translation inhibition specifically interferes with the EIF4E3 isoforms. Cell synchronization curves suggest an association of specific isoforms with the parasite cell cycle. Multiple phosphorylation events appear to differentially target the two eIF4E homologues. Unlike EIF4E4, expression of EIF4E3 differs between Leishmania species, with a higher molecular weight band, typical of stressed cells, found only in L. amazonensis. Sequence analysis of the EIF4E3 gene from three Leishmania species showed that few amino acid changes lead to marked differences in migration of the respective proteins in denaturing gel. Mutagenesis assays associated with ectopic expression of an HA-tagged EIF4E3 in transfected Leishmania identified serine 75, exclusive of L. amazonensis, as a site responsible for generating the isoform specific to this species. Two-dimensional gel analysis showed that this isoform is not associated with changes in isoelectric point, indicating that other modifications, in addition to phosphorylation, must target EIF4E3. In vitro and in vivo interaction studies demonstrated that EIF4E3 and 4 differentially bind to PABP homologues as well as performing other interactions conserved in various trypanosomatid species. The results produced in this study indicate a complex regulation of these factors through multiple phosphorylation sites, probably related to the cell cycle of the parasite.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:56:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11084_HUMBERTO GRIPP DE FARIA.pdf: 2199739 bytes, checksum: 09716c6c2dca5b5ab95102956c696470 (MD5) Previous issue date: 2017-06-06 / Considerando a importância dos flebotomíneos nos ciclos de transmissão das leishmanioses, este estudo teve como objetivo avaliar a fauna local das espécies vetores da doença em área de transmissão endêmica para a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Foram realizadas coletas de amostras nas regiões rurais do município de Iúna, estado do Espírito Santo, Brasil. As capturas dos dípteros abrangeram cinco localidades rurais aonde casos de LTA já haviam sido previamente relatados. Quatorze pontos de coletas foram estabelecidos no peridomicílio de moradores dessas localidades. Os critérios de escolha para a instalação das armadilhas foram propriedades com histórico anterior de casos clínicos humanos de leishmanioses tegumentares e atualmente com a presença de cães sem sinais clínicos da doença, podendo ser soropositivos ou não para antígenos de Leishmania (Viannia) braziliensis pela técnica de ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) indireta convencional, assim como terem sido vacinados contra Leishmaniose Visceral Canina com vacinas comerciais. As capturas foram realizadas em dezembro de 2015 respeitando os hábitos comportamentais dos insetos. As coletas realizaram-se com o auxílio de armadilhas luminosas do tipo CDC (Centers for Diseases Controls) instaladas às 18h00min e recolhidas às 06h00min totalizando 336 horas de funcionamento. Entre quatorze pontos de coletas, dez apresentaram a presença de flebotomíneos sendo um total de 1148 espécimes. Uma parcela de 60 fêmeas, sendo 20 de cada um dos três pontos com maiores frequências de flebotomíneos, foram separadas e submetidas à extração de DNA e posteriormente a reação em cadeia da polimerase (PCR), com o intuito de se verificar a presença de ácidos nucleicos condizentes com o gênero Leishmania spp. nos seus tubos digestivos, porém, todas as análises apresentaram resultado negativos. Os 1088 flebotomíneos restantes foram processados e posteriormente identificados. A espécie Migonemyia migonei a foi a que se apresentou mais abundante sendo responsável por 71,7% dos espécimes, seguida por Nyssomyia intermedia 21,5%, somando as demais espécies capturadas 6,8%. Considerando a capacidade vetorial de Mg. migonei e Ny. intermedia , bem como seus hábitos antropofílicos já descritos na literatura, podemos sugerir que essas espécies possam estar atuando como transmissoras de LTA na região

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:56:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8418_Stela Rechinelli Passos20150320-144338.pdf: 800053 bytes, checksum: 20d6b00ed79c0b7b4582a1d57097cca7 (MD5) Previous issue date: 2014-03-14 / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA ) é um problema de saúde pública em países da América subtropical. A eutanásia de cães infectados não é obrigatória como na leishmaniose visceral, e o tratamento desses animais com fármacos utilizados para tratamento humano da leishmaniose é proibido. Objetivou-se com o presente estudo avaliar a eficácia do tratamento com furazolidona e domperidona em cães sintomáticos para LTA causada por Leishmania (Viannia) braziliensis. A confirmação da infecção foi realizada por cultura do parasita a partir de amostra de tecido coletada da borda da lesão e PCR de amostra da cultura. Após um período de adaptação de 60 dias, os animais foram divididos em grupo controle (n = 4) e grupo tratado (n = 8). O grupo tratado recebeu furazolidona durante 21 dias, intercalada com domperidona durante 10 dias. Os cães que não mostraram remissão da lesão durante este período receberam novamente o mesmo ciclo de tratamento até um total de 93 dias. Entre os oito animais tratados, sete (87,5%) apresentaram remissão da ferida após o tratamento. O animal que não obteve cura clínica apresentou redução de medidas da lesão 93 dias de tratamento. Todos os animais foram observados durante 12 meses após o início da administração dos fármacos. Não observou-se recidiva de lesões nos animais em que houve sua remissão ou autocura nos animais do grupo controle durante este período. Nossos dados sugerem que o tratamento com furazolidona e domperidona é eficaz para o tratamento das lesões de cães sintomáticos para LTA causada por L. (V.) braziliensis.

A espécie Leishmania (Viannia) shawi foi caracterizada recentemente pelo grupo de Lainson. Estudos recentes indicam o importante papel médico epidemiológico deste parasito no Brasil. Portanto, os objetivos do presente estudo foram caracterizar o modelo experimental murino desta infecção, purificar antígenos protéicos e avaliar seus graus de proteção após desafio. Para caracterizar o modelo murino de infecção, camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 foram infectados na pata com formas promastigotas e os achados histopatológicos e imunológicos foram avaliados durante a evolução da infecção. Para os estudos de imunização foram utilizados 10 diferentes antígenos: três secretados/excretados pelas formas promastigotas de L. (V.) shawi, dois intracelulares solúveis das formas amastigotas (AgAma) e promastigotas (AgPro), e cinco frações protéicas purificadas a partir do antígeno intracelular solúvel das formas promastigotas. Estes antígenos foram utilizados para imunizar camundongos da linhagem BALB/c duas vezes, subcutaneamente no dorso. Após uma semana da última imunização, os animias foram desafiados com formas promastigotas. O desenvolvimento das lesões nos animais foram acompanhadas por seis ou oito semanas pós desafio (PD), quando os animais foram sacrificados para análise da carga parasitária e dos aspectos relacionados às respostas imune celular e humoral. Camundongos da linhagem BALB/c foram altamente susceptíveis à infecção, uma vez que as mudanças histopatológicas e da imunidade humoral foram mais pronunciadas nos camundongos BALB/c que em C57BL/6. Os antígenos secretados/excretados de baixa massa molecular induziram alta taxa de proteção em comparação aos animais não imunizados, já os antígenos secretados/excretados de média massa molecular protegeram intermediariamente os animais, possivelmente pela alta expressão de IFN-g e IL-4 nos linfócitos T CD8+. AgAma e AgPro tiveram uma resposta antagônica nos animais, pois o AgAma suprimiu a produção de IFN-g e IL-12, contudo houve maior produção de TGF-b, facilitando o aumento do parasitismo na pele e em linfonodos. A despeito da detecção de TGF-b nos animais imunizados com AgPro, houve um balanço entre a produção de citocinas, com a participação de IL-12 e IFN-g, que levou a um controle do parasitismo em pele. Através da purificação do AgPro foi visto que os antígenos F1 e F5 protegeram os animais da infecção na pele após desafio, e ainda F1 também protegeu os linfonodos destes animais. Os antígenos F3 e F4 levaram a exacerbação das lesões de pele. A identificação, por espectrometria de massa, do antígeno F1 revelou a presença de 67 componentes, sendo que a maioria deles não possui identificação. Ainda, o antígeno F1 protegeu duradouramente os animais associado à estimulação de linfócitos T CD8+ de memória, contudo a presença de baixos números de parasitos pode ser o reflexo da alta produção de IL-10. Estes dados indicam que o antígeno F1 pode representar um importante candidato vacinal contra a Leishmaniose Tegumentar Americana / Leishmania (Viannia) shawi specie was recently characterized by Lainson group. Currently, studies indicate important medical and epidemiological role of this parasite in Brazil. Therefore, the aims of this study were to characterize the experimental murine model of this infection, purify proteic antigens and evaluate their protection degrees after challenge. To characterize the murine model of infection, BALB/c and C57BL/6 mice were infected in the footpad with promastigote forms, and the histopathological and immunological findings were evaluated during the evolution of infection. For the immunization studies, 10 different antigens were used, as follow: three released/excreted by promastigote forms of L. (V.) shawi; two intracellular soluble antigens from amastigote (AgAma) and promastigote forms (AgPro), and 5 proteic fractions purified from soluble intracellular antigens from promastigote forms. These antigens have been used to immunize BALB/c mice twice, subcutaneously in the rump. After 1 week of last immunization, the animals were challenged. The lesion developments in animals were followed during either six or eight weeks post-challenge (PC), when the animals were sacrificed to evaluate the parasite load and aspects of cellular and humoral immune responses. BALB/c mice were the most susceptible to L. (V.) shawi infection, since the histopathological and humoral changes were higher in BALB/c than C57BL/6 mice. Secreted/excreted antigens of low molecular mass induced high protection rate compared to non-immunized mice, already mice immunized with secreted/released antigens of medium molecular mass showed mild protection, possibly caused by high expression of IFN-g and IL-4 by CD8+ T lymphocytes. AgAma and AgPro showed antagonic response in animals, since AgAma suppressed the IFN-g and IL-12 production, however high level of TGF-b has been detected, allowing the increasing of parasitism in the skin and lymph nodes. In spite of the detection of TGF-b in AgPro-immunized mice, there was a balance in the cytokines production, with the participation of IFN-g and IL-12, leading to parasite control in skin. Through the purification of AgPro, it was observed a protective effect of F1 and F5 antigens in the skin after challenge; in addition, F1 also protected the lymph nodes of BALB/c mice. Both F3 and F4 antigens exacerbated the skin infection. The identification, by mass spectrometry, revealed that F1 was composed by 67 components, and the majority has not been identified till now. Moreover, F1 induced long-lasting immunity in BALB/c mice, associated to generation of memory CD8+ T lymphocytes, however low parasitism could be the reflect of high production of IL-10. These data indicate which F1 antigen could be an important vaccine candidate against American Tegumentar Leishmaniasis