Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / Quase todos os patógenos intracelulares não virais de importância humana e animal penetram nas células hospedeiras por fagocitose “clássica” ou modificada. Por este motivo os fagossomos constituem o primeiro e, às vezes, o último habitat dos patógenos intracelulares. Sua sobrevida e multiplicação na célula hospedeira dependem da modulação do fenótipo composicional e funcional dos fagossomos em que habitam, como o pH intravacuolar, a aquisição de substratos e nutrientes pela presença de canais e transportadores e a fusão com lisossomos, outros fagossomos e vesículas. Cada fagossomo ou fagolisossomo é uma entidade particular, cuja biogênese depende de sinais expressos ou disparados pela célula e pela partícula ou organismo internalizado. Uma vez internalizados pelas células hospedeiras, alguns patógenos escapam do fagossomo e se instalam no citosol. Outros interferem com a maturação dos fagossomos, de forma a excluí-los das vias endocítica e secretória ou gerar vacúolos de capacidade fusogênica seletiva. Os parasitas do gênero Leishmania permanecem, durante todo o ciclo de vida intracelular no hospedeiro mamífero, em estruturas semelhantes a fagolisossomos denominadas vacúolos parasitóforos (VPs). A diversidade morfológica e bioquímica desses vacúolos foi pouco estudada. Os VPs formados pelas espécies mais estudadas – (L.) L. major, L. (L.) donovani e L. (V.) braziliensis - abrigam uma ou duas formas amastigotas e apresentam pouco espaço vacuolar livre. À medida que os amastigotas se dividem, os VPs que os hospedam fissionam, porém os mecanismos envolvidos neste processo são desconhecidos. Já parasitas do complexo (L.) (L.) mexicana, incluindo L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana e L. (L.) pifanoi, ocupam VPs espaçosos contendo mais de um amastigota. O presente estudo experimental teve como objetivo responder à questão: “qual a importância de um VP espécie-específico para o parasitismo intracelular de Leishmania?”. Nos experimentos descritos, macrófagos derivados de precursores de medula óssea de camundongo foram coinfectados por duas espécies de Leishmania para investigar a possibilidade de fusão entre VPs que hospedam diferentes parasitas e as consequências de uma possível coabitação intravacuolar sobre a viabilidade e multiplicação dos dois parasitas. Os macrófagos foram inicialmente infectados com L. (L.) amazonensis e em seguida superinfectados por L. (L.) major, espécies que desenvolvem VPs de tamanho, número de parasitas e biogênese distintos. Para permitir o reconhecimento inequívoco da espécie dos parasitas, os macrófagos foram infectados por amastigotas não fluorescentes de L. (L.) amazonensis e superinfectados com amastigotas ou promastigotas de L. (L.) major que expressam proteínas fluorescentes GFP ou DsRed2. Constatamos que os VPs contendo amastigotas de L. (L.) major aderiram aos espaçosos VPs de L. (L.) amazonensis mas a fusão entre os vacúolos não foi detectada. A multiplicação da L. (L.) major e a fissão de seus VPs nos macrófagos superinfectados não foram afetadas pela infecção pelos dois parasitas. Já os VPs contendo promastigotas da L. (L.) major se fundiram com os VPs da L. (L.) amazonensis. Nestes VPs “quiméricos” (contendo ambas as espécies de parasitas) os promastigotas de L. (L.) major dividiram-se mas não se diferenciaram em amastigotas. Essa diferenciação só ocorreu nos pequenos VPs que abrigavam exclusivamente a L. (L.) major. / Most non-viral intracellular pathogens gain entrance into human and animal host cells by “classic” or modifIed phagocytosis and are thus lodged in phagosomes which they may or not continue to occupy in the course of infection. Their survival and multiplication within host cells depend on modulation of the compositional and functional phenotypes of the phagosomes they occupy, including intravacuolar pH, substrate acquisition through membrane transporters and channels, and fusion with lysosomes, and other cell phagosomes and vesicles. Each phagosome thus exhibits particular features, whose biogenesis is conditioned to different signals triggered by both the host cell and the internalized particle/microorganism. Once internalized by host cells, some pathogens escape the phagosome and assume the host cell cytosol as their intracellular niche. Other pathogens interfere with phagosomal maturation, leading to the development of phagosomes excluded from host cell endocytic and secretory pathways or vacuoles with selective fusogenic properties. During their intracelular lifecycle, protozoan parasites of the genus Leishmania remain enclosed in phagolysosome-like structures called Parasitophorous Vacuoles (PVs). The morphological and biochemical diversity of Leishmania PVs were not extensively studied. Most species – such as L. major, L. donovani and L. braziliensis – are lodged in membrane-bound PVs, containing one or two amastigotes, that undergo fission as parasites divide. The mechanisms involved in PV fission remain to be elucidated. In contrast, species from the L. mexicana complex, such as L. amazonensis, L. mexicana and L. pifanoi, occupy large PVs which may contain many parasites. The present experimental aimed to answer the question: “what is the importance of a speciesspecific PV to Leishmania intracellular parasitism?”. In the experiments herewith described, mouse bone marrow-derived macrophages were co-infected with two Leishmania species to investigate the possibility of fusion between PVs that shelter different parasites, and the consequences of a possible intravacuolar cohabitation on their survival and multiplication. Macrophages were initially infected with L. amazonensis and later on superinfected with L. major, which represent species with different PV size, parasite content and biogenesis. In order to distinguish the two species, macrophages were infected with non-fluorescent L. amazonensis amastigotes and superinfected with either amastigotes or promastigotes of L. major transfected with the fluorescent proteins GFP or DsRed2. Although PVs contacted each other, fusion between L. amazonensis and L. major amastigote PVs was not detected. Leishmania major multiplication and PV fission were not affected by coinfection. In contrast, PVs containing L. major promastigotes fused with pre-established L. amazonensis PVs. In these “chimeric” vacuoles (containing both Leishmania), L. major promastigotes multiplied, however they did not differentiate into amastigotes. The differentiation of L. major promastigotes into amastigotes occurred exclusively within their own, unfused PVs. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jeamile Lima Bezerra.pdf: 337120 bytes, checksum: 7cc500c98107677b77cd4a396bdb645d (MD5) Previous issue date: 2006-03-17 / The Leishmaniose, infectum-parasitic illness caused by protozoans of the Leishmania sort, is still one of the biggest problems of public health affecting about 12 millions of people in 88 countries, with the 1-2 register million new cases annually. Of all the cases of LT, 90% occur in Brazil, Peru, Afghanistan, Algeria, Saudi Arabia, Syria e Anger. In Brazil, leishmaniose is one antropozoonose emergent had mainly to occured changes in the chain epidemiologist, including alterations in the reservoirs, vectors and hosts, in result of the social, economic and cultural conditions of the population. The Leishmaniose American Tegumentar (LTA) has been pointed in practically all the Brazilian states with gradual increase of cases, registering in recent years in the regions North, Northeast, Center-West and South.Isolated natural composites of plants had had and continue having a great one impact in supervened and the treatment of some diseases human beings. Moreover, the plants they are important substance sources, many of which if they constitute in raw materials or archetypes for synthesis of new remedies. / A Leishmaniose Tegumentar (LT), doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, é ainda um dos maiores problemas de saúde pública afetando cerca de 12 milhões de pessoas em 88 países, com o registro de 1-2 milhões de novos casos anualmente. De todos os casos de LT, 90% ocorrem no Brasil, Peru, Afeganistão, Algéria, Arábia Saudita, Síria e Irã. No Brasil, a leishmaniose é uma antropozoonose emergente devido principalmente às mudanças ocorridas na cadeia epidemiológica, incluindo alterações nos reservatórios, vetores e hospedeiros, em decorrência das condições sociais, econômicas e culturais da população. A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) tem sido apontada em praticamente todos os estados brasileiros com aumento progressivo de casos nos últimos anos, registrando-se surtos nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste, Sudeste e Sul.Inúmeros compostos naturais isolados de plantas tiveram e continuam tendo um grande impacto na sobrevida e no tratamento de várias enfermidades humanas. Além disso, as plantas são importantes fontes de substâncias, muitas das quais se constituem em matérias-primas ou protótipos para síntese de novos fármacos.

L. (L.) amazonensis (La) e L. (V.) braziliensis (Lb) podem causar um espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas no homem, sendo La responsável pela forma anérgica difusa e Lb pela forma mucocutânea da doença, formas polares e de elevada gravidade. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar os aspectos da resposta imune celular no ponto de inoculação e no linfonodo de drenagem de camundongos BALB/c inoculados no coxim plantar com 106 promastigotas de La e Lb. A evolução da lesão foi avaliada semanalmente sendo que na 4ª e 8ª semana PI biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para determinação da densidade de células dendríticas (CD207+ e CD11c+), linfócitos T CD4+ e CD8+ e células iNOS+ por imunoistoquímica, e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de células dendríticas e de linfócitos T CD4 e CD8 por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-4, IL- 10 e IFN-g) e nitrito nos sobrenadantes. A infecção por La levou à progressão da doença, com aumento do tamanho da lesão e da carga parasitária tanto na pele quanto no linfonodo de drenagem, enquanto que a infecção por Lb mostrou um discreto aumento da lesão entre a 6ª e 7ª semana PI com posterior regressão e redução da carga parasitária na pele e no linfonodo de drenagem. Aumento do número de células dendríticas dérmicas e de Langerhans foi observado na pele de camundongos inoculados com La na 4ª semana PI, juntamente com o aumento no número de células de Langerhans nos linfonodos de drenagem. Resposta imune celular preferencial de células T CD4+ foi observada tanto na pele quanto no linfonodo de camundongos inoculados com La, que mostrou ser predominantemente do tipo Th2 com a produção aumentada de IL-10 e IL-4. Já a infecção por Lb levou ao aumento na expressão de células dendríticas dérmicas e Langerhans na pele dos animais inoculados com Lb somente na 8ª semana PI, assim como aumento do número de células dendríticas dérmicas no linfonodo. A resposta imune celular foi caracterizada por células T CD4+ e CD8+ em pele e linfonodo dos animais infectados com Lb, vinculada a um perfil Th1 com a produção preferencial de IFN-g e altos níveis de NO. Aumento no número de células T regulatórias foi observado na infecção por Lb, que mostrou correlação direta com o número de linfócitos T CD4+ produtores de IL-10. Assim, a infecção por La foi relacionada à suscetibilidade, enquanto que a infecção por Lb foi relacionada à resistência do hospedeiro vertebrado. Estes resultados evidenciam não só o papel do parasita na modulação da resposta imune do hospedeiro como também das células dendríticas à infecção por Leishmania / L. (L.) amazonensis (La) and L. (V.) braziliensis (Lb) are responsible for a spectrum of clinical and immunopathological manifestations in humans, La is able to cause anergic diffuse leishmaniasis and Lb mucocutaneous leishmaniasis, polar forms with high severity. In this way, the aim of the present study was to evaluate aspects of the cellular immune response in the site of infection and in the draining lymph node of BALB/c mice inoculated in the hind footpad with 106 promastigotes of La and Lb. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and in the 4th and 8th week PI biopsies from the site of infection were collected to determine the density of dendritic cells (CD207+ and CD11c+), CD4+ and CD8+ T cells and iNOS+ cells by immunohistochemistry, and the draining lymph node to characterize subsets of dendritic cells and CD4+ and CD8+ T cells by flow citometry. The draining lymph nodes cells were cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-4, IL-10 e IFN-g), and the nitric oxide in the supernatants. The infection caused by La led to the progression of disease with increase on lesion size and parasite load in the skin and draining lymph node, while Lb infection showed a discrete increase on the lesion size between 6th and 7th week PI with late regression and reduction in the skin as well as lymph node parasite load. An increase on the number of dermal dendritic and Langerhans cells were observed in the skin of BALB/c mice infected with La at 4th week PI together with an increase of Langerhans cells in the draining lymph node. The preferential CD4+ T cell immune response was observed in skin and lymph node of mice infected with La, which showed to be rather Th2 with an increase on the levels of IL-4 and IL-10. However, Lb infection led an increase of dermal dendritic cells and Langerhans cells in the skin only at 8th week PI, as well as an increase in the dermal dendritic cells in lymph node. The cellular immune response were characterized by CD4+ and CD8+ T cells in the skin and draining lymph node of mice infected with Lb, which was related to a Th1 immune response with production of high levels of IFN-g and nitric oxide. An increase of Regulatory T cells was observed in Lb infection, which showed the positive correlation with the IL-10 producing CD4+ T cells. So, the La infection was related to the susceptibility, while Lb infection was related to the resistance in the vertebrate host. These results emphasize the role of the parasite in the modulation of the host immune response to Leishmania infection

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) representa um sério problema de saúde pública. No Brasil muitas espécies são reconhecidas como patogênicas para o homem, portanto o diagnóstico diferencial é necessário para compreender o perfil epimemiológico da LTA em áreas endêmicas. Com o objetivo de identificar espécies de Leishmania utilizando ferramentas moleculares, cinquenta e três biópsias de pele de pacientes com LTA, fixadas em formalina e incluídas em parafina dos Estados do Pará (N=33) e Maranhão (20) foram submetidos a diferentes protocolos da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a identificação dos agentes causadores. Biopsias foram desparafinizadas e o DNA foi extraído usando o protocolo de fenol-clorofórmio, quantificado e submetido a reações de PCR, com base na sequência de nucleotídeos codificadora do RNA que compõe a subunidade menor do ribossomo (SSUrDNA) e da enzima Glicose 6-Fosfato Desidrogenase (G6PD). O alvo G6PD foi utilizado tanto em reações de PCR convencional (cPCR), como de PCR quantitativo (qPCR). As reações de cPCR e Nested PCR SSUrDNA apresentaram resultado positivo para o gênero Leishmania em 40 (83,3%) das amostras submetidas. Vinte e sete desses produtos de PCR foram sequenciados, sendo 17 identificados como L.(L.) amazonensis e 10 como L.(Viannia) sp. A cPCR G6PD identificou 9 amostras como L.(V.) braziliensis , sendo 7 do Maranhão (36%) e 2 do Pará (6%). O DNA de L.(Viannia) sp. foi quantificado em quatro amostras do Maranhão através da reação de qPCR G6PD, mesmo esse alvo sendo de cópia única. Esses resultados indicam que sequências especificas de Leishmania sp. presentes em múltiplas cópias devem ser escolhidas para a aplicação de cPCR em DNA provindo de amostras parafinadas,uma vez que é freqüente casos de LTA com baixo parasitismo e consequentemente, pequenas concentrações de DNA. E ainda a cPCR SSUrDNA pode ser um bom alvo para estudos diagnósticos e epidemiológicos.A qPCR G6PD permitiu a detecção, identificação e quantificação de L. (Viannia) sp. em uma única etapa de amplificação em quatro amostras que presentaram resultados positivos somente na Nested ou Semi-Nested PCR, demonstrando uma maior sensibilidade oferecida pela q PCR / American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) presents a serious problem of public healthy. In Brazil many species are recognized as pathogenic to humans, therefore differential diagnostic is necessary to understand the epidemiological profile of ACL in endemic areas. Fifty-three paraffinembedded skin biopsies of ACL patients from Pará (N=33) and Maranhão (20) States, were submitted to different protocols of polymerase chain reaction (PCR) for identification of their causative agents. Biopsies were deparaffinized and DNA were extracted using phenol-chloroform, quantified and submitted to PCR reaction, using small subunit coding sequence (SSUrDNA) and enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The target of G6PD was used both in conventional PCR reactions (cPCR) and quantitative PCR (qPCR). The reactions of cPCR and Nested PCR SSUrDNA showed positive result for the genus Leishmania in 40 (83.3%) of the samples. Twenty-seven positive samples were submitted to sequencing and 10 were identified as L. (Viannia) sp. and 17 as L. (L.) amazonensis. The G6PD PCR identified 9 samples as L. (V.) braziliensis, 2 from Pará (6%) and 7 from Maranhão (35%).Four samples were quantified in G6PD qPCR, even this is a single copy. These results indicate that specific sequences from Leishmania sp. present in multiple copies should be chosen in relation to those from unique copies in paraffin-embedded tissues, once is frequent cases of ACL with low parasitism, consequently small DNA concentrations and that SSUrDNA can be a good target to diagnostic and epidemiologic studies of ACL. The qPCR allowed the detection and identification of L. (Viannia) sp. in a single round of amplification in four samples that when showed positive results only in the Nested or Semi Nested cPCR suggesting a higher sensitivity offered by qPCR

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1082163 bytes, checksum: 6015c927f35c9baea1ec1c536ac57b01 (MD5) Previous issue date: 2014-05-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Leishmaniasis are diseases caused by different species of parasites in the genus Leishmania. Isogenous mice are widely used in the investigation of immunopathological processes associated with these diseases. However, there are few studies of experimental leishmaniasis with heterogeneous mice with a diverted genetic makeup are few. This work evaluated the behavior of heterogeneous Swiss mice infected with the species L. (V.) braziliensis and/or L. (L.) amazonensis. Initially, the Swiss mice were infected in the paw with the promastigote stage of L. braziliensis and L. amazonensis singly; the progression of the wound was monitored for nine weeks, and the parasitic load and the levels of the cytokines IFN-γ, TFN-α, and NO were measured. After six and seventeen weeks, the Swiss mice previously coinfected with L. braziliensis were infected in the other paw with L. amazonensis; The progression of the infection was analyzed. At the eighth or ninth weeks following the double infection, the parasitic load, the levels of cytokine IFN-γ, TNF-α, and NO in cells of the spleen and the popliteal lymph node were determined. Infected mice with L. braziliensis developed a small wound at the site of infection (0,26 ± 0,05 mm). However, the infection remained unaltered without traces of progression and without detection of parasites in the spleen, but showed an increase in the levels of IFN-γ in cells of the spleen. Conversely, the Swiss mice infected with L. amazonensis developed wounds with continuous and progressive growth, with the presence of parasites in the spleen in spite of a significant increase in the synthesis of IFN-γ. With respect to doubly infected animals, the wound in the site of the infection by L. amazonensis also presented a progressive growth. However, from the second week the wounds in these animals were significantly smaller than the wounds in the animals infected only with L. amazonensis. In the eighth week of assessment, a difference in the size of the wound (2,54 ± 0,57 mm) between these last two groups of animals was observed. This decrease in the wounds size correlated with increased levels of IFN- γ and NO in the spleen cells in the animals doubly infected. With the obtained results, it can be concluded that Swiss mice develop a phenotype of susceptibility to infection by L. amazonensis. Moreover, the previous infection with L. braziliensis confers a partial protection against L. amazonensis associated with a large production of IFN-γ. / As leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de parasitos do gênero Leishmania. Camundongos isogênicos são amplamente utilizados na investigação dos processos imunopatológicos associados a essas enfermidades. Contudo, poucos são os estudos de leishmaniose experimental com camundongos que possuem uma constituição genética variada, os denominados heterogênicos. No presente trabalho foi investigado o comportamento de camundongos Suíços (heterogênicos) infectados com as espécies L. (V.) braziliensis e/ou L. (L.) amazonensis. Inicialmente, os camundongos Suíços foram infectados na pata com formas promastigotas de L. braziliensis e L. amazonensis isoladamente; a evolução da lesão foi monitorada por nove semanas, e foram determinadas a carga parasitária e os níveis das citocinas IFN-γ, TNF-α e do NO. Posteriormente, camundongos Suíços foram previamente infectados com L. braziliensis, e após seis ou dezessete semanas de infecção, foram coinfectados na outra pata com L. amazonensis; analisando a evolução da lesão e após oito ou nove semanas de coinfecção, foram determinadas a carga parasitária, os níveis de IFN-γ e de NO pelas células do baço e do linfonodo poplíteo. Os camundongos infectados com L. braziliensis desenvolveram uma pequena lesão no sítio de infecção (0,26 ± 0,05 mm), permanecendo de forma inalterada, sem indícios de evolução, sem a detecção de parasitos no baço e apresentando um aumento nos níveis de IFN-γ pelas células do baço. De modo diferente, os camundongos Suíços infectados com L. amazonensis desenvolveram lesões com crescimento progressivo e contínuo, com a detecção de parasitos no baço, apesar de também aumentarem significativamente a síntese de IFN-γ. Nos animais coinfectados, a lesão no sítio de infecção por L. amazonensis também apresentou um crescimento progressivo. Contudo, a partir da segunda semana de infecção, as lesões nestes animais foram significativamente menores do que as lesões dos animais infectados apenas com L. amazonensis. Na oitava semana de avaliação foi observada uma diferença no tamanho da lesão entre esses dois últimos grupos de animais de 2,54 ± 0,57 mm. A diminuição da lesão foi correlacionada com o aumento dos níveis de IFN-γ e de NO por células do baço desses animais coinfectados. Diante dos resultados obtidos, pode-se concluir que camundongos Suíços desenvolvem um fenótipo de resistência à infecção por L. braziliensis e um fenótipo de susceptibilidade à infecção por L. amazonensis. Adicionalmente, a infecção prévia com L. braziliensis confere proteção parcial a uma posterior infecção com L. amazonensis, associada a uma maior síntese de IFN-γ.

L. (L.) amazonensis (La) e L. (V.) braziliensis (Lb) podem causar um espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas no homem, sendo La responsável pela forma anérgica difusa e Lb pela forma mucocutânea da doença, formas polares e de elevada gravidade. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar os aspectos da resposta imune celular no ponto de inoculação e no linfonodo de drenagem de camundongos BALB/c inoculados no coxim plantar com 106 promastigotas de La e Lb. A evolução da lesão foi avaliada semanalmente sendo que na 4ª e 8ª semana PI biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para determinação da densidade de células dendríticas (CD207+ e CD11c+), linfócitos T CD4+ e CD8+ e células iNOS+ por imunoistoquímica, e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de células dendríticas e de linfócitos T CD4 e CD8 por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-4, IL- 10 e IFN-g) e nitrito nos sobrenadantes. A infecção por La levou à progressão da doença, com aumento do tamanho da lesão e da carga parasitária tanto na pele quanto no linfonodo de drenagem, enquanto que a infecção por Lb mostrou um discreto aumento da lesão entre a 6ª e 7ª semana PI com posterior regressão e redução da carga parasitária na pele e no linfonodo de drenagem. Aumento do número de células dendríticas dérmicas e de Langerhans foi observado na pele de camundongos inoculados com La na 4ª semana PI, juntamente com o aumento no número de células de Langerhans nos linfonodos de drenagem. Resposta imune celular preferencial de células T CD4+ foi observada tanto na pele quanto no linfonodo de camundongos inoculados com La, que mostrou ser predominantemente do tipo Th2 com a produção aumentada de IL-10 e IL-4. Já a infecção por Lb levou ao aumento na expressão de células dendríticas dérmicas e Langerhans na pele dos animais inoculados com Lb somente na 8ª semana PI, assim como aumento do número de células dendríticas dérmicas no linfonodo. A resposta imune celular foi caracterizada por células T CD4+ e CD8+ em pele e linfonodo dos animais infectados com Lb, vinculada a um perfil Th1 com a produção preferencial de IFN-g e altos níveis de NO. Aumento no número de células T regulatórias foi observado na infecção por Lb, que mostrou correlação direta com o número de linfócitos T CD4+ produtores de IL-10. Assim, a infecção por La foi relacionada à suscetibilidade, enquanto que a infecção por Lb foi relacionada à resistência do hospedeiro vertebrado. Estes resultados evidenciam não só o papel do parasita na modulação da resposta imune do hospedeiro como também das células dendríticas à infecção por Leishmania / L. (L.) amazonensis (La) and L. (V.) braziliensis (Lb) are responsible for a spectrum of clinical and immunopathological manifestations in humans, La is able to cause anergic diffuse leishmaniasis and Lb mucocutaneous leishmaniasis, polar forms with high severity. In this way, the aim of the present study was to evaluate aspects of the cellular immune response in the site of infection and in the draining lymph node of BALB/c mice inoculated in the hind footpad with 106 promastigotes of La and Lb. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and in the 4th and 8th week PI biopsies from the site of infection were collected to determine the density of dendritic cells (CD207+ and CD11c+), CD4+ and CD8+ T cells and iNOS+ cells by immunohistochemistry, and the draining lymph node to characterize subsets of dendritic cells and CD4+ and CD8+ T cells by flow citometry. The draining lymph nodes cells were cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-4, IL-10 e IFN-g), and the nitric oxide in the supernatants. The infection caused by La led to the progression of disease with increase on lesion size and parasite load in the skin and draining lymph node, while Lb infection showed a discrete increase on the lesion size between 6th and 7th week PI with late regression and reduction in the skin as well as lymph node parasite load. An increase on the number of dermal dendritic and Langerhans cells were observed in the skin of BALB/c mice infected with La at 4th week PI together with an increase of Langerhans cells in the draining lymph node. The preferential CD4+ T cell immune response was observed in skin and lymph node of mice infected with La, which showed to be rather Th2 with an increase on the levels of IL-4 and IL-10. However, Lb infection led an increase of dermal dendritic cells and Langerhans cells in the skin only at 8th week PI, as well as an increase in the dermal dendritic cells in lymph node. The cellular immune response were characterized by CD4+ and CD8+ T cells in the skin and draining lymph node of mice infected with Lb, which was related to a Th1 immune response with production of high levels of IFN-g and nitric oxide. An increase of Regulatory T cells was observed in Lb infection, which showed the positive correlation with the IL-10 producing CD4+ T cells. So, the La infection was related to the susceptibility, while Lb infection was related to the resistance in the vertebrate host. These results emphasize the role of the parasite in the modulation of the host immune response to Leishmania infection

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) representa um sério problema de saúde pública. No Brasil muitas espécies são reconhecidas como patogênicas para o homem, portanto o diagnóstico diferencial é necessário para compreender o perfil epimemiológico da LTA em áreas endêmicas. Com o objetivo de identificar espécies de Leishmania utilizando ferramentas moleculares, cinquenta e três biópsias de pele de pacientes com LTA, fixadas em formalina e incluídas em parafina dos Estados do Pará (N=33) e Maranhão (20) foram submetidos a diferentes protocolos da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a identificação dos agentes causadores. Biopsias foram desparafinizadas e o DNA foi extraído usando o protocolo de fenol-clorofórmio, quantificado e submetido a reações de PCR, com base na sequência de nucleotídeos codificadora do RNA que compõe a subunidade menor do ribossomo (SSUrDNA) e da enzima Glicose 6-Fosfato Desidrogenase (G6PD). O alvo G6PD foi utilizado tanto em reações de PCR convencional (cPCR), como de PCR quantitativo (qPCR). As reações de cPCR e Nested PCR SSUrDNA apresentaram resultado positivo para o gênero Leishmania em 40 (83,3%) das amostras submetidas. Vinte e sete desses produtos de PCR foram sequenciados, sendo 17 identificados como L.(L.) amazonensis e 10 como L.(Viannia) sp. A cPCR G6PD identificou 9 amostras como L.(V.) braziliensis , sendo 7 do Maranhão (36%) e 2 do Pará (6%). O DNA de L.(Viannia) sp. foi quantificado em quatro amostras do Maranhão através da reação de qPCR G6PD, mesmo esse alvo sendo de cópia única. Esses resultados indicam que sequências especificas de Leishmania sp. presentes em múltiplas cópias devem ser escolhidas para a aplicação de cPCR em DNA provindo de amostras parafinadas,uma vez que é freqüente casos de LTA com baixo parasitismo e consequentemente, pequenas concentrações de DNA. E ainda a cPCR SSUrDNA pode ser um bom alvo para estudos diagnósticos e epidemiológicos.A qPCR G6PD permitiu a detecção, identificação e quantificação de L. (Viannia) sp. em uma única etapa de amplificação em quatro amostras que presentaram resultados positivos somente na Nested ou Semi-Nested PCR, demonstrando uma maior sensibilidade oferecida pela q PCR / American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) presents a serious problem of public healthy. In Brazil many species are recognized as pathogenic to humans, therefore differential diagnostic is necessary to understand the epidemiological profile of ACL in endemic areas. Fifty-three paraffinembedded skin biopsies of ACL patients from Pará (N=33) and Maranhão (20) States, were submitted to different protocols of polymerase chain reaction (PCR) for identification of their causative agents. Biopsies were deparaffinized and DNA were extracted using phenol-chloroform, quantified and submitted to PCR reaction, using small subunit coding sequence (SSUrDNA) and enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The target of G6PD was used both in conventional PCR reactions (cPCR) and quantitative PCR (qPCR). The reactions of cPCR and Nested PCR SSUrDNA showed positive result for the genus Leishmania in 40 (83.3%) of the samples. Twenty-seven positive samples were submitted to sequencing and 10 were identified as L. (Viannia) sp. and 17 as L. (L.) amazonensis. The G6PD PCR identified 9 samples as L. (V.) braziliensis, 2 from Pará (6%) and 7 from Maranhão (35%).Four samples were quantified in G6PD qPCR, even this is a single copy. These results indicate that specific sequences from Leishmania sp. present in multiple copies should be chosen in relation to those from unique copies in paraffin-embedded tissues, once is frequent cases of ACL with low parasitism, consequently small DNA concentrations and that SSUrDNA can be a good target to diagnostic and epidemiologic studies of ACL. The qPCR allowed the detection and identification of L. (Viannia) sp. in a single round of amplification in four samples that when showed positive results only in the Nested or Semi Nested cPCR suggesting a higher sensitivity offered by qPCR

Les cellules exposent à leurs surface glycoconjugués qui jouent important dans des événements biologiques importants tels que la communication entre cellules, la croissance de cellules saines ou cancéreuses et les processus d'infection d'agents pathogènes. Certaines structures polysaccharidiques qui contiennent le résidu Galf ont attiré beaucoup d’intérêt au cours des dernières décennies. En effet, le galactofuranose peut être exprimé chez de nombreuses espèces pathogènes, telles que Mycobacterium tuberculosis, Aspergillus et Leishmania, mais il est absent chez les mammifères. Par conséquent, ces glycoconjugués sont considérés comme des cibles intéressantes pour des approches thérapeutiques.Les galactofuranosyltransférases (GalfT) catalysent le transfert des résidus de galactofuranose dans les structures des glycoconjugués. Cependant, ces GalfT sont des enzymes faiblement décrites, malgré leur rôle crucial dans la virulence ainsi que dans la pathogénicité de nombreux micro-organismes. Jusqu'à présent, seule la GalfT2 de Mycobacterium tuberculosis a été entièrement caractérisée.Dans cette thèse, quatre GalfTs de Leishmania major, l'agent responsable de la leishmaniose, ont été caractérisées. Elles ont été d'abord clonées, surexprimées dans E. coli et purifiées. Ensuite, leurs paramètres cinétiques respectifs ont été déterminés. De plus, puisque ces GalfT sont situées dans l'appareil de Golgi de Leishmania, nous avons supposé que leur glycosylation pourrait être un élément important pour leur stabilité etleur activité. Ainsi, des GalfT glycosylés ont été produites à l'aide de Leishmania tarentolae et les résultats préliminaires de leur activité enzymatiques ont été obtenus.Les GalfT leishmaniennes démontrent des résultats prometteurs pour le développement de nouvelles stratégies chimio-enzymatiques pour la synthèse de glycoconjugués contenant du Galf, ainsi que pour la conception de nouveaux médicaments contre la leishmaniose. / Cells are heavily decorated by diverse glycoconjugates that are involved in important biological events such ascell-cell communication, growth of healthy or cancerous cells and pathogens infection process. Among these polysaccharidic structures, Galf-containing glycans have been the subject of increasing interest in the last decades. Indeed, the galactofuranose can be found in many pathogenic species, such as Mycobacteriumtuberculosis, Aspergillus and Leishmania, but is absent in mammals. Therefore, these glycoconjugates are considered as interesting targets for therapeutic approaches.Galactofuranosyltransferases (GalfTs) catalyse the transfer of galactofuranose residues into glycoconjugatesstructures. However, GalfTs are poorly described enzymes despite their crucial role in the virulence and the pathogenicity of numerous microorganisms. Up to date, only one mycobacterial GalfT has been fully characterized.In this thesis, four putative GalfTs of Leishmania major, the causing agent of leishmaniosis diseases, were characterized. They were first cloned, overexpressed in E. coli and purified. Then, their respective kineticparameters were determined. In addition, since these GalfT are located in the Golgi apparatus of Leishmania, we assumed that their glycosylation could be an important element for their stability and activity. So, glycosylatedGalfTs were produced using, Leishmania tarentolae, and preliminary results of their enzymatic activity were obtained.Still, leishmanian GalfTs demonstrate promising results for the development of new chemoenzymatic strategies for Galf-containing glycoconjugates synthesis, as well as the design of new drugs against leishmaniasis.

A identificação de genes relacionados com resistência a compostos antiparasitários tem contribuído para um melhor entendimento do mecanismo de ação de compostos antileishmania. Pouco se sabe sobre o mecanismo de ação do análogo de purina tubercidina (TUB) em Leishmania. Utilizando a estratégia de superexpressão após transfecção gênica, isolamos um locus de Leishmania (Leishmania) major, de 31 kb, capaz de conferir níveis de resistência quatro vezes maior que o parasita selvagem. Várias deleções desse locus foram geradas e a construção de 3 kb (pSNBR/3kbClaI-EcoRI) também conferiu níveis de resistência quando comparado ao parasita elvagem. Através de análises no genoma de L. (L.) major, localizamos esse locus no cromossomo 31 e, no fragmento de 3 kb, um gene que codifica para uma proteína com função desconhecida até o momento (LmjF.31.2010). Esta proteína foi relacionada com resistência a TUB em todas as linhagens transfectadas analisadas (cosTUB2 e pSNBR/3kbClaI-EcoRI), assim denominamos LmjF.31.2010, de proteína relacionada com resistência a TUB (PRRT). A quantificação relativa de transcritos de mRNA na construção pSNBR/3kbClaI-EcoRI apresentou níveis altos de transcritos da PRRT. Foram gerados ainda mutantes de L. (L.) major e L. (L.) amazonensis resistentes a TUB e estes se apresentaram bem adaptados a concentrações altas de TUB, apresentando razão de resistência maior que 200 vezes, quando comparado com os respectivos parasitas selvagens. A PRRT também foi relacionada na resistência a TUB nos mutantes gerados, pois houve amplificação gênica de prrt. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem dados para inferir a importância da PRRT no mecanismo relacionado com resistência a TUB. / The identification of genes associated with resistance to antiparasitic compounds has contributed to a better understanding of the mechanism of action of compounds against Leishmania. Little is known about the mechanism of action of purine analog tubercidin (TUB) in Leishmania. Using a strategy of gene overexpression after transfection, we isolated a locus of Leishmania (Leishmania) major, 31 kb, capable of conferring fold resistance four times greater than the wild type parasite. A set of deletions of this locus were generated and a 3 kb construction (pSNBR/3kbClaI-EcoRI) conferred fold resistance twice than the wild type. Analysis of L. (L.) major genome, located this locus on chromosome 31 and on 3 kb fragment we identified a gene encoding a protein with unknown function (LmjF.31.2010). This protein has been related to TUB resistance in all strains analyzed (cosTUB2 and pSNBR/3kbClaI-EcoRI), so we named mjF.31.2010 of protein related with resistance to TUB (PRRT). Relative quantification of mRNA transcripts in the construction pSNBR/3kbClaI-EcoRI showed high levels of PRRT transcripts.Mutants of L. (L.) major and L. (L.) amazonensis resistant to TUB were also generated and these were well adapted to high TUB concentrations, presenting fol resistance greater than 200 times when compared with their respective wild type. The PRRT was also related to TUB resistance mutants generated by PRRT gene amplification. Despite the high fold resistance presented by TUB resistant mutants, the ratio of expression of these mutant PRRT transfected and wild was similar to the wild type.

As chaperonas moleculares são proteínas que auxiliam no enovelamento correto de outras proteínas, entre outras funções importantes para as células, motivo pelo qual elas têm sido alvo para o combate de várias doenças. As Hsp90 (82-96 kDa) são chaperonas abundantes que interagem com diversas proteínas-cliente. São constituídas por três domínios: N-terminal, intermediário ou central (M) e C-terminal, o qual é responsável pela dimerização da proteína. A atividade da Hsp90 está diretamente relacionada à sua atividade ATPásica. Durante o ciclo funcional, as Hsp90 podem interagir com inúmeras co-chaperonas. Uma delas é a co-chaperona p23 (18-22 kDa) que interage com o dímero da Hsp90 e algumas das suas funções são a inibição da atividade ATPásica e atividade chaperona. O objetivo do trabalho foi obter a proteína recombinante Hsp90 de Leishmania braziliensis e os domínios N e N+M, determinar fatores importantes que relacionam mudanças conformacionais e função da Hsp90 e as bases moleculares da inibição por GA. Também obter as co-chaperonas Lbp23A e Lbp23B e investigar a interação com a LbHsp90 e suas funções. As proteínas produzidas foram purificadas e caracterizadas por técnicas biofísicas. Em solução, a LbHsp90 foi caracterizada como dímero assimétrico e as demais proteínas como monômeros assimétricos.A interação da LbHsp90 e domínios com nucleotídeos foi analisada por fluorescência e as constantes de dissociação ficaram em torno de 150 µM. A afinidade por GA foi maior que a verificada para ATP e em ordem crescente para LbHsp90, LbHsp90_NM e LbHsp90_N. A LbHsp90 apresentou grande atividade chaperona em relação à citrato sintase, de maneira independente de ATP. A LbHsp90 mostrou baixa atividade ATPásica, a qual foi inibida pela GA com IC50 de 0,7 µM. Tanto a Lbp23A quanto a Lbp23B inibiram a atividade ATPásica da LbHsp90, porém a Lbp23A aproximou-se de 100% de inibição e a Lbp23B apenas 30%. A interação in vitro entre a LbHsp90 e a Lbp23B foi observada por pull-down na presença/ausência de nucleotídeos e essa técnica não se mostrou adequada para a Lbp23A.O pioneirismo do trabalho com a Hsp90/p23 de L. braziliensis oferece uma grande contribuição para futuros trabalhos que visam o entendimento das relações funcionais entre essas proteínas e o contexto das Hsp90 no desenvolvimento da leishmaniose. / Molecular chaperones are proteins involved in proper folding of other proteins, and others important cellular functions, why they have been targeted for combating various diseases. The Hsp90 (82-96 kDa) are ubiquitous chaperones that interact with a wide range of client proteins. They are formed by three domains: N-terminal, central or middle (M), and C-terminal, which is responsible by its dimerization. The Hsp90 activity is related to its ATPase activity. During the Hsp90 functional cycle, diverse co-chaperones. One of them is the p23 (18 kDa), that interacts with one Hsp90 dimer, and some p23 functions are the inhibition of Hsp90 ATPase activity and chaperone activity. The aim of this work was obtain the Hsp90 recombinant Leishmania braziliensis Hsp90, the N and N+M domains, to determine the important factors related to conformational changes and Hsp90 function, and the molecular basis of GA inhibition. Also, to obtain the Lbp23A and Lbp23B co-chaperones in order to establish relevant aspects for LbHsp90 interaction and its co-chaperones functions. The recombinant proteins were produced, purified and characterized by biophysics techniques. The LbHsp90 was identified as an asymmetric dimer for whereas the others were identified as asymmetric monomers. The interactions between LbHsp90 and domains with nucleotides were determined by fluorescence and the dissociation constants were about 150 µM. The GA-affinity was greater than ATP one, in increasing order for LbHsp90, LbHsp90_NM, and LbHsp90_N. The LbHsp90 showed large chaperone activity related to citrate synthase independently of ATP. The LbHsp90 presented low ATPase activity, which was inhibited by GA with a IC50 of 0,7. The Lbp23A and Lbp23B inhibited the ATPase activity with different values, the Lbp23A inhibition was closed to 100% whereas the Lbp23B one was 30%. The in vitro interaction between the LbHsp90 and Lbp23B was observed by pull-down, in the absence or presence of nucleotides, and for Lbp23A this technique was not appropriated. The pioneering work with Hsp90/p23 from L. braziliensis offers an important contribution to future studies aimed at understanding the functional relationships between these proteins and the context of Hsp90 in the development of leishmaniasis.