Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Ciências Médicas, Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas, 2014 / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-12-05T11:12:00Z No. of bitstreams: 1 2014_TamiresEmanueleVital.pdf: 3153936 bytes, checksum: 3f104b75aa30292abcd502b8f5831f57 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-12-05T11:25:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_TamiresEmanueleVital.pdf: 3153936 bytes, checksum: 3f104b75aa30292abcd502b8f5831f57 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-05T11:25:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_TamiresEmanueleVital.pdf: 3153936 bytes, checksum: 3f104b75aa30292abcd502b8f5831f57 (MD5) / A leishmaniose é uma zoonose transmitida por flebotomíneos e causada por várias espécies do gênero Leishmania. Na região Amazônica, em particular no estado do Pará, a doença de Chagas e as leishmanioses compartilham área de transmissão, o que leva frequentemente à presença de infecções mistas. A ocorrência dessas foi verificada em estudo prévio em população de chagásicos da Amazônia, identificando a presença de anticorpos anti-Leishmania spp. em 50% das amostras. No sêmen dos mesmos indivíduos, também foi detectado DNA do Trypanosoma cruzi, sugerindo a possibilidade de transmissão sexual. Com poucos relatos sobre a transmissão sexual das infecções causadas por tripanossomatídeos, a real importância epidemiológica dessa via de transmissão permanece desconhecida. Assim, o este estudo avaliou a presença de infecções mistas causadas por Leishmania spp. e T. cruzi, mediante a análise dos resultados obtidos no diagnóstico sorológico por ELISA e molecular por PCR ITS1, em uma população residente no estado do Pará. Além disso, foi realizada a pesquisa de DNA de Leishmania spp. em amostras de esperma dessa população. Os resultados sorológicos revelaram que 50/108 (46,29%) dos indivíduos apresentavam anticorpos específicos contra antígenos de Leishmania spp., enquanto que a reação de PCR foi positiva em somente 20/108 (18,51%) dos indivíduos testados, evidenciando uma clara discrepância de 27,78% entre os métodos de diagnóstico. O teste de PCR demonstrou-se mais eficiente para identificação dos indivíduos com infecção mista, já que o teste sorológico apresentou um elevado número de reações cruzadas. O método molecular também foi capaz de detectar DNA nuclear do parasito no esperma de 53,1% dos indivíduos. O sequenciamento dos produtos amplificados permitiu identificar as espécies L. amazonensis e L. infantum nas amostras, demonstrando que a possibilidade de transmissão sexual das leishmanioses necessita de estudos mais aprofundados. Nossos resultados reafirmam a necessidade de aprimorar as técnicas de diagnóstico utilizadas na rotina laboratorial e aponta a técnica de PCR como ferramenta promissora na identificação das infecções causadas por Leishmania spp. A pesquisa realizada apresenta informações relevantes sobre diagnóstico e vias de transmissão das leishmanioses na região Amazônica, que poderá favorecer o aprimoramento de medidas de controle, prevenção e assistência à população. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmanias is is a zoonosis transmitted by sandflies and caused by various species of the genus Leishmania. In Amazon, particularly at Pará State, Chagas disease and leishmaniasis share a common transmission area, which often leads to mixed infections. This scenario was observed in a previous study in a chagasic population of Amazon, which demonstrated the presence of anti-Leishmania spp. antibodies in almost 50% of the samples. Furthermore, itwas detected Trypanosoma cruzi DNA in semen from infected people, suggesting the possibility of sexual transmission of the parasite. There are few reports regarding the sexual transmission of infections caused by trypanosomatids and the actual epidemiologic alimportance of this transmission route remains unknown. Thus, the present study aimed to evaluate the presence of mixed infections caused by Leishmania spp. and T. cruzi byserological ELISA and molecular diagnosis PCR LITSR, in an endemic population at ParáState. Moreover, Leishmania spp. DNA search was carried out in sperm samples of this population. The results of serological tests revealed that 50/108 (46,29%) individuals hadspecific antibodies against Leishmania spp. antigens, whereas PCR was positive in only20/108 (18,51%) of tested samples, showing a clear discrepancy 27,78% between these methods. The study showed PCR was more efficient to identify individuals with mixedinfection, since serological assay showed a large number of cross-reactions. Molecularmethod was able to detect parasite nuclear DNA in semen from 53.1% individuals.Amplicons sequencing allowed us to identify the species L. amazonensis and L. infantum insamples, demonstrating the possibility of leishmaniasis sexual transmission needs to befurther investigated. Our results reaffirm the requirement of improve diagnostic techniquescurrently used in routine, and PCR arises as a promising tool for identification of infectionscaused by Leishmania spp. The study presented relevant information about diagnosis andleishmaniasis transmission routes at the Amazon region, which may favor the improvement of control measures, prevention and population care.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by claudia teixeira (claudiadtx@gmail.com) on 2011-06-22T01:12:53Z No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-22T15:03:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-22T15:03:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / As leishmanioses, doenças infecciosas causadas por protozoários intracelulares do gênero Leishmania, apresentam manifestações clínicas diversas e tratamento de difícil administração com efeitos colaterais severos. Estas doenças ainda representam um relevante problema de saúde pública que somado a questão do tratamento, refletem a necessidade de se avançar na pesquisa e na busca por novos fármacos. As proteases, enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas de proteínas e cadeias polipeptídicas, desempenham alguns papéis chaves nos parasitos protozoários como na transição do ciclo de vida, invasão do hospedeiro, evasão imune do parasito e na patogênese de doenças parasitárias. Neste contexto, este trabalho se focaliza no estudo da otubaína de Leishmania chagasi, uma cisteíno protease pertencente às enzimas deubiquitinantes (DUBs). Algumas DUBs são essenciais na imunomodulação e regulação da resposta inflamatória. A otubaína 1 de humanos, por exemplo, possui como substrato a proteína E3 GRAIL associada à anergia dos linfócitos. Este trabalho teve como objetivo a clonagem e expressão da otubaína recombinante de L. chagasi (rOtuLc) bem como sua citolocalização, caracterização de sua atividade e proposição da sua estrutura por modelagem e dinâmica molecular. O gene da OtucLc foi amplificado e seu produto clonado no vetor de expressão, pET-19b, expresso em E. coli BL21 (DE3). A rOtuLc foi induzida com 0,1 mM IPTG, a 16 ºC por 16 h. A proteína recombinante solúvel foi purificada em coluna de agarose-níquel. Anticorpos anti-OtuLc foram produzidos em camundongos e sua especificidade foi confirmada por immunoblot. A imunocitolocalização da OtuLc em promastigotas de L. chagasi revelou sua localização em vesículas e uma marcação pontual de forte intensidade na região anterior, próximo ao cinetoplasto. Testes de atividade da rOtuLc contra os substratos Ub-AMC e Z-LRGG-AMC foram realizados e a rOtuLc mostrou-se inativa. Finalmente, a modelagem molecular por homologia e os ensaios de dinâmica molecular de equilíbrio indicaram que a OtuLc é composta por 10 hélices ? e 1 folha ?, de 4 fitas, e mantém conservado o posicionamento dos resíduos da tríade catalítica, estando o resíduo Cys81 no início de uma hélice ? direita próxima à fita ? onde se encontram os resíduos His261 e Asn263. Estes resultados iniciais poderão servir como ferramentas de grande valia para uma avaliação futura do potencial quimioterápico da OtuLc. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis are infectious diseases caused by intracellular protozoa of the genus Leishmania which have different clinical manifestations and treatment difficult to administer with serious secondary effects. These diseases still represent a significant public health problem and together with the difficulties encountered in the current treatment reflect the need to advance the search for new drugs. Proteases, enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds of proteins and polypeptide chains, play key roles in some protozoan parasites such as life cycle transition, host invasion, parasite immune evasion and parasitic diseases pathogenesis. In this context, this work focuses on studing Leishmania chagasi otubain, a cysteine protease belonging to deubiquitinating enzyme (DUBS). Some DUBs are essential in immunomodulation and regulation of the inflammatory response. The human otubain 1, for example, has the GRAIL E3 protein as substrate, associated with anergy in lymphocytes. The aim of this work was the cloning and expression of recombinant L. chagasi otubain (rOtuLc), the verification of its cytolocalization, the activity characterization and the structure proposition by molecular modeling and dynamics. The OtuLc gene was amplified and the product cloned into the expression vector pET-19b expressed in E. coli BL21 (DE3). Expression of recombinant protein condition was 0,1 mM IPTG, 16 °C for 16 h. The soluble recombinant protein was purified by nickel-agarose column. Anti-OtuLc antibodies were produced in mice and its specificity was confirmed by immunoblot. Cytolocalization of OtuLc in L. chagasi promastigotes revealed vesicular pattern localization and a high-intensity point labeled in the anterior region near the kinetoplast. rOtuLc activity tests against Ub-AMC and Z-LRGG-AMC substracts were performed and the recombinant protein was found to be inactive. Finally, homology molecular modeling and molecular dynamics assay indicated that OtuLc is composed of 10 α helices and 1 β sheet and retains the conserved residues of catalytic triad positioning with Cys81 residue at the beginning of a right handed α helix near to His261 and Asn263 at the β sheet. These initial results may serve as valuable tools for future assessement of the chemotherapeutic potential of OtuLc.

Atualmente, a busca por opções de tratamento com medicações financeiramente mais acessíveis e menos agressivas ao organismo, aliada à uma visão mais humana de tratar o paciente, fez da homeopatia uma prática mais utilizada. Em se tratando de uma das sete endemias de maior impacto mundial, a Leishmaniose é uma doença negligenciada causada pelo parasita do gênero Leishmania, com estimativas alarmantes de novos casos e óbitos por ano, se tornando um grande problema de saúde pública. No Brasil, a Leishmaniose Visceral em áreas urbanas se destaca pelo fato de ser uma zoonose que possui como principal reservatório também o cão, que sempre esteve presente e em estreito contato com grande parte das famílias brasileiras. O mesmo, quando infectado pela doença, é submetido à eutanásia como norma do Ministério da Saúde, por apresentar riscos à população. Utilizando-se a Lei da Similitude, instruída por Hahnemann, chegou-se à medicação Antimonium crudum para possível tratamento e profilaxia da Leishmaniose Visceral Canina. Portanto, no presente trabalho, visou-se o estudo da ação da medicação homeopática Antimonium crudum, in vitro, diretamente em promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, através do teste de MTT (brometo de 3-[4.5 dimetitiazol- 2- il) 2,5 difenil- 2 H- tetrazólio), que visa mensurar a atividade metabólica e a observação da curva de crescimento do parasito na forma promastigota, bem como a ação na infecção das Leishmanias em macrófagos da linhagem J774, em sua forma amastigota. Os resultados obtidos para a forma promastigota mostram que o estímulo homeopático não teve influência direta sobre os parasitos, tanto no teste de MTT quanto na curva de crescimento, corroborando os estudos que sugerem que a homeopatia não age diretamente sobre o parasito e sim em conjunto com o sistema imune do hospedeiro. Já nos resultados dos ensaios infectivos, observa-se, em geral, maior porcentagem de macrófagos infectados, assim como maior taxa de fagocitose nos grupos tratados com Antimonium crudum, o que sugere uma maior atividade dos mesmos levando à uma resposta imune secundária mais representativa e consequentemente, à destruição do antígeno. Quando se verificou o pré e o pós-tratamento de macrófagos, observou-se que as potências mais baixas, CH6 e CH12, parecem ter maior eficiência e quando a infecção já está instalada, a potência CH30 parece ter uma maior significância na profilaxia da infecção. Apesar disso, a resolução da doença dependerá da ação imunológica de cada hospedeiro, que irá controlar o crescimento e manutenção do parasito ou não / Currently, the search for treatments with medicines that are financially affordable, less aggressive to the host, and more humane in treating the patient, homeopathy is the most practical course. When it comes to one of the seven largest worldwide impact endemics, Leishmaniasis is a neglected public health complex with alarming estimates of new cases and deaths per year. In Brazil, urban Visceral Leishmaniasis also stands out because the reproductive cycle of this zoonotic disease can include the dog, which has always been present and in close contact with most Brazilian families. Dogs, when infected by the disease are euthanized as a rule from the Ministry of Health to prevent risks to the population. Using the Law of Similars, developed by Hahnemann, the medication Antimonium crudum was identified as possible treatment and prophylaxis for Canine Visceral Leishmaniasis. Therefore, the present work was to study the direct action of the homeopathic medicine Antimonium Crudum in vitro against the promastigotes of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, through the MTT test (3- [4.5 - dimetitiazol- 2-yl) - 2.5 diphenyl tetrazolium H 2), which aims to measure the metabolic activity; the promastigote growth curve; as well as the performance of promastigote infectivity in J774 macrophages. The results from both the MTT assay as well as the growth curve show that the homeopathic stimulus did not directly influence the promastigote form of the parasites, corroborating studies that suggest that homeopathy has no direct action on the parasite, but may function together with the host\'s immune system. Treatment with Antimonium crudum led to a higher percentage of infected macrophages in the infectivity assays and a higher rate of phagocytosis, which suggests increased activity leading to a stronger secondary immune response and as a result, antigen destruction. Assays in which macrophages were treated before or after infection suggest that lower concentrations (CH6 and CH12) seem most effective when the cells are already infected, however a higher concentration (CH30) appears to have greater activity in preventing infection. Ultimately, the resolution of the disease depends on the immunological action of each host, which may control the growth and maintenance of parasite

A capacidade de sobrevivência da Leishmânia no interior de células especializadas na destruição de patógenos deve-se à capacidade do parasito de burlar a propriedade microbicida pela produção de moléculas denominadas fatores de virulência. Dentre as proteínas diferencialmente expressas em um estudo prévio de nosso laboratório, encontramos isoformas da OPB, uma serino peptidase e da CPX, proteína antioxidante. De fato, promastigotas de L. (L.) major deficientes em OPB apresentaram significante redução na infecção e sobrevivência em macrófagos in vitro e lesões de evolução mais lenta no modelo murino de infecção na pata. De forma análoga, promastigotas de L. (L.) donovani superexpressoras de CPX apresentaram maior carga parasitária em macrófagos in vitro. Considerando essas informações e a importância da L. (L.) amazonensis na epidemiologia da leishmaniose no Brasil, nosso objetivo é analisar a importância da OPB e CPX na virulência desta espécie utilizando parasitas superexpressores e proteínas solúveis em modelos murinos de infecção in vitro e in vivo. / The survivability of Leishmania within specialized cells in the destruction of pathogens due to the parasite\'s ability to circumvent the microbicidal property for the production of molecules called virulence factors. Among the proteins differentially expressed in a previous study from our laboratory, we found isoforms of OPB, a peptidase serine and CPX, antioxidant protein. Indeed, promastigotes of L. (L.) Major disabled in OPB showed a significant reduction in infection and survival in macrophages in vitro and slower evolution of lesions in a murine model of infection in the leg. Similarly, promastigotes of L. (L.) Donovani overexpressors CPX showed higher parasite load in macrophages in vitro. Given this information and the importance of L. (L.) amazonensis in the epidemiology of leishmaniasis in Brazil, our goal is to analyze the importance of OPB and CPX virulence of this species using overexpressors parasites and soluble proteins in murine models of infection in vitro and in alive.

Introdução: As leishmanioses são antropozoonoses que constituem um grave problema de saúde pública por apresentarem um complexo espectro clínico de manifestações e relevante diversidade epidemiológica. Aproximadamente 5% dos pacientes com leishmaniose cutânea não tratada adequadamente irão desenvolver a leishmaniose mucosa (LM). As principais opções terapêuticas disponíveis para esta apresentação da doença são os antimoniais pentavalentes, a pentamidina e as anfotericinas B. As formulações lipídicas da anfotericina B tem sido desenvolvidas na tentativa de melhorar a eficácia e a tolerabilidade das anfotericinas, entretanto, ainda há escassez de estudos que avaliem eficácia, dose e segurança da anfotericina B lipossomal (AFBL) no tratamento da LM. Objetivo: Relatar a experiência do ambulatório e da enfermaria de um hospital escola com medicamentos usados no tratamento da leishmaniose mucosa, comparando a eficácia e a segurança da anfotericina B lipossomal com as outras drogas. Métodos: Foram avaliados os prontuários de todos os pacientes do Ambulatório de Leishmanioses do Departamento de Moléstias Infecciosas e Parasitárias do HC-FMUSP com diagnóstico confirmado de LM e tratados no período de janeiro de 2000 a julho de 2015. Dados clínicos e epidemiológicos foram descritos, e também avaliados os efeitos adversos e os desfechos com o uso das principais drogas para LM. Resultados: Foram avaliados 71 pacientes com leishmaniose mucosa e um total de 106 tratamentos. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (60,6%) e da Região Nordeste do Brasil (50%). Observou-se associação de flebite (46,2%) e de tremor (30,8%) com o grupo que recebeu anfotericina B complexo lipídico e maior desenvolvimento de artralgia (16%) no grupo que recebeu o antimonial. Os pacientes tratados com anfotericina B desoxicolato apresentaram a maior taxa de insuficiência renal aguda (57,10%) em relação aos demais grupos de drogas. O grupo que usou antimonial pentavalente foi o único que desenvolveu alterações nas enzimas pancreáticas (28%) e alterações eletrocardiográficas (20%). Dos pacientes que usaram anfotericina B desoxicolato, 85,7% precisaram interromper definitivamente o tratamento, o que contribuiu para a pior taxa de cicatrização final (14,3%), enquanto a AFBL apresentou a melhor taxa (81,3%) quando comparada aos demais tratamentos, OR= 4,971 [1,829-13,508] (p= 0,001). O uso de itraconazol mostrou alta taxa de recidiva (63,6%). A dose média de AFBL usada no tratamento de LM foi 1907mg e 28,91mg/kg. Quando comparadas as drogas com a AFBL, a pentamidina foi a única que não apresentou diferença estatisticamente significante em relação aos desfechos de tratamento. Conclusão: A pentamidina e a AFBL mostraram-se, neste estudo, as melhores opções terapêuticas no tratamento da LM, sendo que a AFBL foi a droga com a maior taxa de cicatrização. Com base neste estudo e em outras experiências da literatura até o momento, o intervalo de dose compreendido entre 30 e 35 mg/kg é o que parece alcançar eficácia próxima a 100%. Sugerimos, portanto, uma dose cumulativa de 30 mg/kg para o tratamento da LM. Este estudo amplia a experiência com o uso do itraconazol e da pentamidina, e é o primeiro a descrever o uso da ABCL na LM. Apresenta, ainda, a maior casuística que conhecemos na literatura com o uso da AFBL, além de ser o primeiro estudo a compará-la com as demais drogas no tratamento da LMCRO / Introduction: Leishmaniases are anthropozoonoses that constitute a severe problem of public health as they present with a complex spectrum of manifestations and relevant epidemiologic diversity. Approximately 5% of patients with untreated cutaneous leishmaniosis will develop mucosal leishmaniasis (ML). The main treatment options for this presentation are: pentavalent antimonials, pentamidine, and amphotericins B. The lipid formulations of amphotericin B have been developed to improve efficacy and tolerability, however, there are few studies that evaluate efficacy, dosage, and safety of liposomal amphotericin B (LAB) for treatment of ML. Objective: To report outpatient and inpatient experience of a hospital school with medications used for treatment of mucosal leishmaniasis by comparing the efficacy and safety of liposomal amphotericin B with other drugs. Methodology: The medical records of all patients of the Leishmaniasis Outpatient Clinic of the Department of Infectious and Parasitic Diseases of the Hospital das Clínicas of University of São Paulo were assessed. The patients had diagnosis of ML and were treated between January 2000 and July 2015. Epidemiologic and clinical data were described, as well as adverse effects and outcomes of the main drugs for treatment of ML. Results: Seventy-one patients with ML and a total of 106 treatments were assessed. The majority of the patients were male (60.6%) and from the Northeast of Brazil (50%). There was an association of phlebitis (46.2%) and tremor (30.8%) to the group that received amphotericin B lipid complex (ABLC). There was a higher development of arthralgia (16%) in the group that received the antimonial. Patients treated with deoxycholate amphotericin B presented with the highest level of acute kidney injury (57.1%) when compared to other drugs. The group who received pentavalent antimonial was the only one to develop pancreatic enzymes abnormalities (28%) and electrocardiographic abnormalities (20%). Within the patients who used deoxycholate amphotericin B, 85.7% had to discontinue the treatment, contributing to the worst healing rate (14.3%). LAB presented with the best healing rate (81.3%) when compared to the other treatments, OR = 4.971 [1,829-13,508] (p=0,001). The use of itraconazole showed high recurrence rate (63.6%). The mean dosage of LAB for the treatment of ML was 1,907 mg and 28.91 mg/kg. When LAB was compared to other drugs, pentamidine was the only one with no statistical significance related to the outcomes of the treatment. Conclusion: In this study, pentamidine and LAB were the best therapeutic options for the treatment of ML; LAB was the drug with better healing rate. Based on this study and other references in the literature, the dosage interval between 30 and 35 mg/kg appears to reach efficacy close to 100%. Therefore, our recommendation is the use of a cumulative dosage of 30 mg/kg for the treatment of ML. This study enhances the experience of itraconazole and pentamidine, and it is the first one to describe the use of ABLC for the treatment of ML. In addition, it presents the largest casuistic known in the literature with the use of LAB, and it is a pioneer in comparing this drug with other drugs in the treatment of ML

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T15:42:13Z No. of bitstreams: 2 TESE Marília Barbosa do Nascimento.pdf: 2456653 bytes, checksum: 8b413c00bb26bd7b56a27464b3e5348a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T15:42:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Marília Barbosa do Nascimento.pdf: 2456653 bytes, checksum: 8b413c00bb26bd7b56a27464b3e5348a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / A Leishmaniose Visceral (LV) é a forma mais grave da doença causada por patógenos do gênero Leishmania, problema agravado pela falta de métodos eficientes de diagnóstico. Este trabalho buscou contribuir para a caracterização funcional de cinco proteínas hipotéticas de L. infantum, identificadas previamente como potenciais ferramentas para o diagnóstico da LV. As proteínas selecionadas (Lci5, Lci9, Lci11, Lci10 e Lci12), são em sua maioria ricas em motivos repetitivos e foram analisadas por bioinformática e em ensaios de “western-blot”, fracionamento celular, imunofluorescência e imunocitoquímica associada à microscopia eletrônica. Todas as proteínas são expressas constitutivamente em ambas as formas de L. infantum, uma delas (Lci10) é exclusiva das espécies de Leishmania e as demais são pouco ou moderadamente conservadas em Trypanosoma. Três destas apresentaram um padrão pontual de localização intracitoplasmático (Lci10 e Lci12) ou flagelar (Lci5), enquanto as Lci9 e Lci11 se dispersam por todo o citoplasma. Através de ensaios de ELISA indireto, utilizando soros de cães e humanos com LV, todas, com exceção da Lci5, foram mais antigênicas em cães do que em humanos. Quando se buscou investigar a importância dos motivos repetitivos para a antigenicidade das Lci10 e Lci12, não se observou uma correlação entre a sua presença e maior ou menor antigenicidade. Os resultados sugerem que estas proteínas devem ser utilizadas diferentemente para cães e humanos no diagnóstico da LV.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-02-25T18:10:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Elis Dionisio da Silva.pdf: 1632784 bytes, checksum: 0d3a3af1af4ee2e2fea17121f8199a1c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-25T18:10:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Elis Dionisio da Silva.pdf: 1632784 bytes, checksum: 0d3a3af1af4ee2e2fea17121f8199a1c (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / CAPES / A coinfecção Leishmania - HIV/aids é considerada uma doença emergente, devido à sobreposição geográfica das duas infecções em várias regiões no mundo. Tem sido observado em pacientes coinfectados uma diversidade clínica importante, pobre eficácia aos tratamentos leishmanicidas convencionais, além da dificuldade de um diagnóstico preciso. O objetivo desse estudo foi avaliar o uso da PCR-RFLP para identificação das espécies de Leishmania em pacientes com HIV/aids, fornecendo dados que auxiliem na correta abordagem clínico terapêutica. Participaram do estudo pacientes com HIV/aids internados em três Hospitais de Referência para HIV/aids da Região Metropolitana do Recife - PE no período de junho/2013 a dezembro/2014 que assinaram o TCLE; 5 mL de sangue periférico foram coletados para a pesquisa de DNA. A amplificação desse DNA foi realizada pela PCR, que teve como alvo a região ITS-1, utilizando os primers LITSR e L5.8S. A identificação das espécies, nos casos de coinfecção, foi realizada nos produtos amplificados pelo ITS-1PCR por análise do polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) e confirmadas por sequenciamento e alinhamento no GenBank. Foi encontrado em 21 pacientes DNA de Leishmania, utilizando a PCR - ITS1. Desses 66,% eram do sexo masculino, com faixa etária predominante de 25 à 39 anos e 80,9% provenientes de áreas urbanas. A identificação das espécies, nos casos de coinfecção pela PCR- RFLP identificou a espécie L.infantum em 15 (71,4%) dos pacientes e o sequenciamento dos amplicons indentificou em 17 (80,9%) a mesma espécie. Esse estudo sugere que a análise por RFLP do alvo ITS-1 da Leishmania spp. possa auxiliar no diagnóstico e na abordagem clínico-terapêutica dos casos de coinfecção Leishmania - HIV/aids, visto que na coinfecção, a leishmaniose pode não se apresentar na sua forma clássica. A RFLP-PCR destaca-se por ser mais simples e de baixo custo, comparada às técnicas de escolha, como eletroforese de isoenzimas e tipagem de microssatélites multilocus. A confirmação dos seus resultados pela análise de sequenciamento e alinhamento indica que a RFLP-PCR é uma técnica segura para identificar L. infantum em pacientes com HIV/aids. O uso da PCR-RFLP na rotina nos serviços de saúde pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias de prevenção, controle e na assistência médica prestada aos pacientes coinfectados. / Leishmania - HIV/AIDS coinfection is considered an emerging disease, due to the geographical overlap of the two infections in several regions in the world. It has been observed in patients coinfected an important clinical diversity, poor efficacy to conventional treatments antileishmanial, besides the difficulty of accurate diagnosis. The aim of this study was to evaluate the use of PCR-RFLP for identification of Leishmania species in patients with HIV / AIDS, providing data to assist in the correct clinical therapeutic approach. The study enrolled patients with HIV / AIDS admitted to three referral hospitals for HIV / AIDS in the Metropolitan Region of Recife - PE from June / 2013 to December / 2014 signed the informed consent form; 5 mL of peripheral blood were collected for the detection of DNA. Amplification of DNA was performed by PCR that targeted the ITS-1 region using the LITSR and L5.8S primers. The identification of species in cases of coinfection, the amplified products was performed by ITS1-PCR by analysis of restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis and confirmed by sequencing and alignment of the sequences in GenBank. It was found in 21 patients Leishmania DNA using ITS1-PCR. Of these 66% were male, with predominant age range 25 to 39 years and 80.9% in urban regions. Species identification in cases of co-infection by PCR-RFLP identified L.infantum species in 15 (71.4%) patients and the sequencing of amplicons indentificou in 17 (80.9%) the same species. This study suggests that RFLP analysis of the ITS-1 target of Leishmania spp. may assist in the diagnosis and clinical and therapeutic approach of cases of coinfection Leishmania - HIV / AIDS, whereas in coinfection, leishmaniasis can not stand in your way classic. The RFLP-PCR stands out due to its simplicity and low cost, compared to the choice of techniques such as electrophoresis of isoenzymes and microsatellite multilocus typing. Confirmation of results by sequence analysis and alignment indicates that the RFLP-PCR is a safe technique to identify L. infantum in patients with HIV /AIDS. The use of PCR-RFLP in the routine of health services can assist in developing strategies for prevention and control and medical assistance to co-infected patients.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-03T14:21:30Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Muriel Vilela Teodoro Silva - 2016.pdf: 1776615 bytes, checksum: bc5d7dd181834fb9ecdb5584e16756a9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-03T14:21:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Muriel Vilela Teodoro Silva - 2016.pdf: 1776615 bytes, checksum: bc5d7dd181834fb9ecdb5584e16756a9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T14:21:53Z (GMT). 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After 3, 6 and 9 weeks, the animals were euthanized for tissue parasitism analysis by the limiting dilution technique, in infected ears, draining lymph node and spleen of mice. The draining lymph node cells were incubated (48 h) in the presence or absence of L. amazonensis antigen (Ag) for analysis of cytokines by ELISA. IL-32γTg mice present IL-32 production in spleen, liver, lymph node and ear. IL-32γTg mice have a lower injury than the WT mice during the third week of infection. From the 5th to the 9th week of infection, the two groups had similar lesion development profiles. Interestingly, in the 3rd week of infection, the parasitic load in the lesion of IL-32γTg mice was 100 times greater than that of WT mice. After three weeks, IL-32γTg mice maintained the same parasitic load up to nine weeks. In WT mice, however, the number of parasites increased exponentially during weeks evaluated. The parasite load in the spleen and lymph node was lower in IL-32γTg mice when compared with WT mice. There was no difference in histological sections of the lesions in WT and IL-32γTg mice infected with L. amazonensis. We did not observe differences between WT and IL-32γTg groups on the product -10) by lymph node cells stimulated with Ag, in the 3rd, 6th and 9th week of infection. Our data suggest that IL-32γ favors infection by L. amazonensis in the early stages, allowing the growth of the parasites. However, this cytokine seems to limit the growth and spread of parasites in the later stages of infection. In vitro analyzes show the similar percentage of infected cells and the number of parasites per infected cell in WT macrophages and IL-32γTg after 3 and 48h of infection with L. amazonensis. However, the production of NO by macrophages seems to be lower in IL- 32γTg mouse cells during infection with L. amazonensis. Understanding the mechanisms by which IL-32γ modulates Leishmania amazonensis infection in mice is essential to define the components that control cutaneous leishmaniasis caused by this specie in humans. / A IL-32 é uma citocina pró-inflamatória que apresenta diferentes isoformas. A isoforma IL- 32γ é a mais potente e foi detectada em lesões de pacientes com leishmaniose tegumentar americana. Células murinas respondem à IL-32, no entanto, camundongos não têm o gene para essa citocina. Para entender o papel da IL-32 na infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis, foram utilizados camundongos transgênicos para a IL-32γ humana (IL-32γTg). Camundongos C57BL/6 (WT) e C57BL/6 IL-32γTg foram infectados com formas promastigotas de L. amazonensis na orelha. O desenvolvimento da lesão foi acompanhado semanalmente com paquímetro digital (medida em mm de lesão). Após 3, 6 e 9 semanas, os animais foram eutanasiados para análise de parasitismo tecidual, pela técnica de diluição limitante, nas orelhas infectadas, no linfonodo drenante e no baço dos camundongos. As células do linfonodo drenante foram incubadas (48 h), na presença ou ausência de antígeno de L. amazonensis (Ag), para análise de citocinas pela técnica de ELISA. Camundongos IL- 32γTg apresentam produção de IL-32 no baço, fígado, linfonodo e orelha. Camundongos IL- 32γTg apresentam uma lesão menor do que a lesão dos camundongos WT, na terceira semana de infecção. Da 5ª até a 9a semana de infecção, os dois grupos apresentaram perfis semelhantes de desenvolvimento da lesão. Curiosamente, na 3ª semana de infecção, a carga parasitária na lesão do camundongo IL-32γTg era 100 vezes maior do que a dos camundongos WT. Após três semanas, os camundongos IL-32γTg mantiveram a mesma carga parasitária até nove semanas. Em camundongos WT, no entanto, o número de parasitos aumentou exponencialmente durante as semanas avaliadas. A carga parasitária do linfonodo e no baço foi menor nos camundongos IL-32γTg, quando comparado com camundongos WT. Não foi observada diferença nos perfis histológicos das lesões nos camundongos WT e IL-32γTg infectados por L. amazonensis. Não foi observada nenhuma diferença entre os grupos WT e IL-32γTg em relação à produção de citocinas (IFNγ, TNFα e IL-10), pelas células dos linfonodos estimuladas com Ag, na 3a, 6a e 9a semana de infecção. Os nossos dados sugerem que a IL-32γ favorece a infecção por L. amazonensis nas fases iniciais, permitindo o crescimento do parasito; no entanto, essa citocina parece limitar o crescimento e a disseminação dos parasitos nas fases mais tardias da infecção. As análises in vitro mostraram porcentagem de células infectadas e número de parasitas por célula infectada semelhantes nos macrófagos dos WT e IL-32γTg com 3 e 48h de infecção por L. amazonensis. Entretanto, a produção de NO por macrófagos parece ser menor nas células de camundongos IL-32γTg durante a infecção por L. amazonensis. Compreender os mecanismos pelos quais a IL-32γ modula a infecção por L. amazonensis nos camundongos é fundamental para a definição dos componentes que controlam a leishmaniose tegumentar causada por esta espécie em seres humanos.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6288_1.pdf: 2921977 bytes, checksum: 99e4e2f0b07d7e3f569432b1a3b747af (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Em eucariotos, a etapa crítica de iniciação da síntese protéica é aquela mais sujeita a mecanismos de de regulação. Esta etapa requer a participação de um conjunto de fatores de iniciação de tradução (eIFs), além de subunidades ribossomais. Entre os eIFs se destaca o complexo eIF4F, composto pelas subunidades eIF4FA, eIF4FE e eIF4FG. Em Leishmania, o controle da síntese das proteínas é essencial para a regulação da expressão gênica, mas tem sido pouco estudada. Neste patógeno, múltiplos homólogos para a subunidade do complexo eIF4FEforam identificados e tiveram sua expressão quantificada na forma promastigota (pm) do seu ciclo de vida. Neste trabalho, iniciou-se o estudo em Leishmania de um homólogo da proteína ribossomal P0, componente da subunidade 60S. A partir da clonagem de seu gene, expressão em Escherichia coli e produção de soro policlonal específico partiu-se para a quantificação de seus níveis intracelulares na forma pm, que se mostraram elevados (6,6x10e5 moléculas/células) e superiores para os observados para os homólogos de eIF4F. Em seguida, visando a analisar sua expressão durante o ciclo de vida do parasita, otimizou-se as condições de crescimentode espécies representativas de Leishmania nas suas formas promastigos metacíclica (pm-mt) e amastigota (am). Buscou-se então a detecção de proteínas de expressão estágio-específicas (A2 - am; META1 - pm-mt) para validar as curvas de crescimento, mas apenas a expressão de META1 foi confirmada, embora a forma Am tenha sido confirmada por microscopia. A expressão da proteína P0 mostrou-se constante nessas várias formas celulares. Em comparação, a expressão de um homólogo da proteína eIF4G, LmeIF4G3, também se mostrou contante, enquanto que um segundo homólogo, LmeIF4G1, só foi detectado nas formas am e pmdo parasita. Ensaios com outors homólogos de eIF4F estão sendo realizados, esperando-se caracterizar melhor os processos que envolvem a iniciação da tradução em Leishmania e o controle de sua diferenciação celular

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6323_1.pdf: 573355 bytes, checksum: 59ba8561db1896f9dd82e25cb59e95e3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / A compreensão dos mecanismos de controle da expressão gênica e do processamento de RNA em Leishmania chagasi é importante na abertura de novos caminhos para o desenvolvimento de drogas e vacinas que poderão ser aplicadas no controle da leishmaniose visceral. A abundância de informação genética fornecida pelo Programa Genoma Nordeste (ProGeNE) para este parasito permite um estudo amplo de vários aspectos da genética e da biologia molecular da Leishmania chagasi. Neste estudo, o cluster montado com seqüências homólogas ao gene de HSP83 foi detalhadamente comparado a genes ortólogos de outros tripanossomatídeos, em busca de padrões que identificassem os sinais de trans-encadeamento e poli-adenilação, ainda não definidos para este parasito. Os resultados, amparados por uma análise similar envolvendo outros clusters completos do transcriptoma de L. chagasi, identificam claramente os sítios de processamento nos genes estudados, não apenas na L. chagasi, mas nos demais tripanossomatídeos para os quais seqüências de bases compreendendo as regiões 5 - não traduzida ou 3 - não traduzida para os genes em questão estão disponíveis em bancos de dados públicos. A região 3 - não traduzida mostrou-se especialmente adequada para estudos filogenéticos de espécies de Leishmania evolutivamente próximas. Além disso, as regiões variáveis na seqüência de aminoácidos da HSP83, evidenciadas pelo alinhamento com seqüências ortólogas em outros cinetoplastídeos e em organismos não relacionados, são candidatas a albergar um ou mais epitopos de linfócitos B e T, reconhecidos na infecção natural pelo parasito no homem e no cão, como também durante imunização com HSP83 purificada ou recombinante