Yes / We examined six skeletons from mediaeval contexts from two sites in England for the presence of Mycobacterium leprae DNA, each of the skeletons displaying osteological indicators of leprosy. Polymerase chain reactions directed at the species-specific RLEP multicopy sequence produced positive results with three skeletons, these being among those with the clearest osteological signs of leprosy. Following in-solution hybridization capture, sufficient sequence reads were obtained to cover >70% of the M. leprae genomes from these three skeletons, with a mean read depth of 4–10×. Two skeletons from a mediaeval hospital in Chichester, UK, dating to the 14th–17th centuries AD, contained M. leprae strains of subtype 3I, which has previously been reported in mediaeval England. The third skeleton, from a churchyard cemetery at Raunds Furnells, UK, dating to the 10th to mid-12th centuries AD, carried subtype 3K, which has been recorded at 7th–13th century AD sites in Turkey, Hungary and Denmark, but not previously in Britain. We suggest that travellers to the Holy Land might have been responsible for the transmission of subtype 3K from southeast Europe to Britain. / Funded by a studentship awarded by Majlis Amanah Rakyat (MARA) to A.K. and by the University of Bradford and the University of Manchester.

INTRODUÇÃO: A hanseníase é uma doença infectocontagiosa granulomatosa crônica, causada por Mycobacterium leprae e representa ainda um problema de saúde pública no Brasil. Em média 30-40% dos doentes tem risco de desenvolver reações hansênicas, que são considerados estados de exacerbação da resposta imunológica do hospedeiro a antígenos M. leprae. Está bem descrita a importância de células T reguladoras (Tregs) em infecções bacterianas crônicas. Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram aumento da proporção de Tregs in situ e em sangue periférico de pacientes multibacilares (mas não em paucibacilares), assim como diminuição da proporção de Tregs na reação tipo 2 (porém não na reação tipo 1), sugerindo a participação deste subtipo celular na imunopatogênese da hanseníase. Entretanto, a baixa frequência de Tregs tem dificultado o estudo da sua capacidade funcional. OBJETIVO: Estabelecer protocolo de expansão de Tregs funcionais em pacientes com hanseníase e, posteriormente, avaliar a capacidade funcional das Tregs expandidas. METODOLOGIA: Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram separadas e cultivadas, com anti-CD3 e anti-CD28, acrescidos de IL-2 e rapamicina, por 21 dias. Para avaliar a capacidade funcional das Tregs expandidas, realizou-se um ensaio de co-cultivo das Tregs expandidas e PBMCs autólogas (marcadas com CFSE). Utilizou-se diferentes proporções de Tregs:PBMCs (1:1, 1:2 e 1:5). A casuística foi composta por 29 indivíduos diagnosticados com hanseníase, divididos em quatro grupos, de acordo com a classificação de Ridley e Jopling. Além disso, coletou-se material de 6 indivíduos saudáveis, com a finalidade de caracterizar o pool celular do protocolo de expansão. Para isso, culturas de expansão de indivíduos saudáveis foram submetidas a dois protocolos distintos de purificação celular (beads magnéticas e cell sorting), além de imunofenotipagem das moléculas CD39, PD-1 e LAG3. RESULTADOS: Tregs dos pacientes multibacilar sem reação, nas proporções 1:2 e 1:5, e no grupo reacional tipo 2, na proporção 1:5, mostraram maior capacidade supressora, quando comparados aos grupos pacubacilar sem reação e reacional tipo 2, respectivamente. No grupo de indivíduos saudáveis não houve diferenças na capacidade supressora das Tregs obtidas por separação por beads magnéticas e Tregs obtidas por cell sorting, e não houve expressão significativa de células PD-1+ e LAG-3+ nas culturas de expansão. CONCLUSÃO: Em todos os indivíduos testados, independente da classificação clínica da hanseníase, o protocolo proposto resultou em uma expansão exponencial de uma linhagem de Tregs com atividade supressora, porém com sugestão preliminar de maior eficiência supressora das Tregs na forma MB (com ou sem reação), corroborando a correlação entre atividade supressora de Tregs e maior carga bacilar. Além disso, o protocolo com beads magnéticas se mostrou tão eficaz quanto o protocolo de purificação por cell sorting. A imunofenotipagem das Tregs expandidas de indivíduos saudáveis indicou que não havia número significativo de células exaustas ao fim de nosso protocolo, assim como não houve crescimento concomitante de células T reguladoras do tipo 1 na cultura de expansão / INTRODUCTION: Leprosy is a chronic granulomatous infectious disease caused by Mycobacterium leprae and a public health problem in Brazil. On average, 30-40% of patients are at risk of developing leprosy reactions, which are considered as states of exacerbation of the host\'s immune response to M. leprae antigens. The importance of regulatory T cells (Tregs) in chronic bacterial infections has been well described, but their role in leprosy remains unclear. Previous studies from our group have shown increased proportions of Tregs in situ and in peripheral blood of multibacillary patients (but not in paucibacillary patients), and decrease in the proportion of Tregs in type 2 reaction (but not type 1 reaction), reinforcing the role played by these cells in the immunopathogenesis of leprosy. However, the low numbers of Tregs preclude further studies on their functional capabilities. OBJECTIVE: To establish a protocol for expansion of functional Tregs in patients with leprosy and evaluate the functional capacity of the expanded Tregs. METHOD: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were separated and cultured under anti-CD3 and anti-CD28 stimulation, plus IL-2 and rapamycin for 21 days. To evaluate the functional capacity of the expanded Tregs, a co-culture assay of the expanded Tregs and autologous PBMCs (labeled with CFSE) was performed. Different ratios of Tregs: PBMCs (1: 1, 1: 2 and 1: 5) were used. The sample consisted of 29 individuals diagnosed with leprosy, divided into four groups, according to the Ridley and Jopling classification. In addition, samples from 6 healthy individuals were collected to characterize better the cellular characteristics of the expansion protocol. For this, cultures of healthy individuals PBMC were submitted to two distinct cell purification protocols (magnetic beads and cell sorting), as well as immunophenotyping of the molecules CD39, PD-1 and LAG3. RESULTS: Expanded Tregs from the multibacillary patients without reaction, at 1:2 and 1:5 ratios, and with type 2 reaction, at 1: 5 ratio, showed greater suppressive capacity that the respective paucibacillary groups. Tregs from healthy individuals obtained through magnetic beads separation and through cell sorting did not show differences in suppressor capacity, and there was no significant expression of PD-1 + and LAG-3 + on cells of the expansion cultures. CONCLUSION: In all individuals tested, irrespective of the leprosy classification, the proposed protocol resulted in an exponential expansion of Tregs with suppressive capacity; however, preliminary evidence indicated stronger suppressor activity of the Tregs from multibacillary patients (with or without reaction), suggesting a direct correlation between Tregs activity and bacillary load in leprosy. In addition, our protocol with magnetic beads proved to be as effective as the cell sorting protocol. Immunophenotyping of expanded Tregs from healthy subjects revealed that there was no significant number of exhausted cells at the end of our protocol, nor there was the concomitant outgrowth of type 1 regulatory T cells in the expansion protocol

O diagnóstico etiológico da hanseníase, causada pelo bacilo Mycobacterium leprae, pode ser difícil na forma paucibacilar (PB), na qual os exames têm baixa sensibilidade na detecção do bacilo. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem se mostrado sensível para o diagnóstico da hanseníase. Amostras de linfa são rapidamente obtidas em campo e pouco invasivas. O objetivo principal deste trabalho foi comparar os resultados da PCR com 4 pares de primers (Ag85B, MntH, Pra-36kDa e RLEP), descritos na literatura para o diagnóstico da hanseníase, utilizando-se DNA extraído de amostras de linfa de orelhas, cotovelos e joelhos, coletadas em papel filtro. Além da comparação dos resultados da PCR com os 4 pares de primers, também foram comparados à baciloscopia de linfa no grupo MB e ao ELISA anti-PGL-1 nos grupos PB e MB, utilizando-se o teste de qui-quadrado de McNemar para amostras pareadas. Trinta e nove pacientes com hanseníase [12 (30,76%) na forma PB e 27 (69,23%), multibacilar (MB)], virgens de tratamento, atendidos consecutivamente no período de 2006 a 2010, foram incluídos. A detecção de bacilos à baciloscopia e na biópsia de pele foi confirmada em 55,55% e em 100% dos pacientes MB, respectivamente; e 67,56% dos pacientes (33,33% dos PB e 84% dos MB) apresentaram títulos de anti-PGL1 acima do cut-off no ELISA. A PCR foi positiva em 70,37% das 27 amostras de pacientes MB, considerando-se o resultado conjunto dos 4 primers (7,69% com Ag85B; 11,11% com MntH; 12,5% com Pra-36kDa; e 66,66% com RLEP). Uma amostra se mostrou positiva com os primers Ag85B, MntH e Pra-36kDa e negativa com RLEP. Não houve amplificação no grupo PB, portanto, os resultados do ELISA anti-PGL-1, embora não confirmatórios da etiologia, foram superiores para o diagnóstico da hanseníase PB. No grupo MB, os resultados da PCR com RLEP foram superiores àqueles com MntH, Ag85B e Pra- 36kDa (P<0,001); comparando-se MntH com Ag85B e Pra-36kDa (P=0,317; P=1,0, respectivamente), e Ag85B com Pra-36kDa (P=0,564), os resultados foramsemelhantes. A frequência de positividade da baciloscopia foi maior que a da PCR com MntH (P=0,001), Ag85B (P<0,001) e Pra-36kDa (P=0,004); semelhante ao RLEP (P=0,083); e menor, quando comparada ao resultado combinado dos 4 primers (P=0,046). Ainda no grupo MB, a frequência de positividade anti-PGL-1 foi superior à da PCR com MntH, Ag85B e Pra-36kDa (P<0,001) e à baciloscopia (P=0,011); porém, foi semelhante à PCR com RLEP (P=0,059) ou com os 4 primers combinados (P=0,102). A maior frequência de positividade da PCR com primers RLEP é explicada pela presença de múltiplas cópias RLEP no genoma do bacilo, aumentando a chance do anelamento e amplificação. Existe complementariedade entre os resultados com diferente primers, podendo uma mesma amostra apresentar diferentes resultados a depender da escolha destes. A frequência da positividade da PCR com par de primers RLEP, em amostras de linfa coletadas em papel filtro, mostrou-se semelhante à da baciloscopia e do ELISA anti-PGL-1 nos pacientes MB. Assim, encoraja-se seu emprego em trabalhos de campo devido à facilidade da coleta e possibilidade de remessa dos papéis filtro para centros de referência. / Leprosy\'s etiologic diagnosis may be difficult in paucibacillary (PB) patients, in which laboratory tests have low sensitivity for the detection of the causative agent, Mycobaterium leprae. Polymerase chain reaction (PCR) has shown good sensitivity in leprosy diagnosis. Lymph samples are readily acquired in the field and minimally invasive. The main objective of this paper is to compare the results of PCR with four sets of primers previously described in the literature (Ag85B, MntH, Pra-36kDa and RLEP), using DNA extracted from lymph samples from ear lobes, elbows and knees, stored in filter paper. We also aim to compare the PCR results to lymph bacilloscopy in the multibacillary (MB) group and to anti-PGL-1 serology in PB and MB group, using McNemar\'s chi-square test for paired samples. 39 treatment-naïve leprosy patients [12 (30.76%) PB and 27 (69.23%) MB] seen in the outpatient clinic of a referral center were included. Bacilli were detected in 55.55% of bacilloscopy samples and 100% of biopsies from MB patients; 67.56% of all patients (33.33% of PB and 84% of MB) had anti-PGL1 titers above the method\'s cut-off. PCR was positive in 70.37% of the 27 MB patients, taking in consideration the 4 primers combined (7,69% with Ag85B; 11,11% with MntH; 12,5% with Pra-36kDa; e 66,66% with RLEP). One sample was positive for primers Ag85B, MntH e Pra-36kDa and negative for RLEP. There was no DNA amplification in the PB group, in which antiPGL-1 ELISA, although not confirmatory of the disease, was superior in the diagnosis. In the MB group, PCR with RLEP primer was superior to Ag85B, MntH and Pra-36kDa (P<0,001); between MntH and Ag85B (P=0,317); MntH and Pra- 36kDa (P=1,0); and Ag85B and Pra-36kDa (P=0,564), results were similar. Bacilloscopy\'s frequency of positivity was greater than PCR with Ag85B (P<0,001), MntH (P=0,001) and Pra-36kDa (P=0,004); similar to RLEP (P=0,083); and inferior to the results of the four primers combined (P=0,046). Still in the MB group, anti-PGL-1 serology was superior to PCR with Ag85B, MntH and Pra-36kDa (P<0,001) and to bacilloscopy (P=0,011); its results were similar to PCR with RLEP (P=0,059) or with the four primers combined (P=0,102). RLEP\'s greater positivity is probably due to thepresence of multiple copies of the target DNA in the bacillus\' genome, enhancing the chances of primer annealing. The primers showed complementarity; therefore one sample may display different outcomes depending on primer choice. The frequency of positivity of PCR with RLEP primers, in lymph samples stored in filter paper, was similar to bacilloscopy and serology amongst MB patients. Hence, we encourage its use in fieldwork as a practical and easy method for acquiring samples that can be shipped for further processing in referral centers.

Ao longo dos anos, a humanidade contribuiu para o surgimento de diversos patógenos, tornando-se vítimas de doenças transmitidas dos animais para o homem, as chamadas antropozoonoses. Dentre os animais, os tatus, mamíferos selvagens primitivos, apresentam características anatômicas e fisiológicas peculiares, que os tornam mais susceptíveis à diversas doenças e potenciais reservatórios de patógenos zoonóticos, relevantes para a saúde pública. O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência de cinco patógenos zoonóticos (Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Leishmania spp, Mycobacterium leprae e Paracoccidioides brasiliensis) em quatro espécies de tatus; P. maximus, E. sexcinctus, D. novemcinctus e C. unicinctus do Pantanal e Cerrado do Mato-Grosso-do-Sul. Um total de 50 tatus foram analisados. Sendo, 43 amostras de soros de indivíduos de vida livre (16 Priodontes maximus; 17 Euphractus sexcinctus; 02 Dasypus novemcinctus e 08 Cabassous unicinctus) provenientes do Pantanal e 07 conjuntos de fragmentos de tecidos (pulmão, fígado e baço), de 06 E. sexcinctus e 01 (D. novemcinctus) atropelados em três rodovias do Cerrado do Mato-Grosso-do-Sul. Dos 43 indivíduos amostrados no Pantanal, 13/43 ou 30,23% apresentaram anticorpos anti-T. gondii; 01/43 ou 2,32% anti-T. cruzi e 4/43 ou 9,30% anti-Leishmania (L.) infantum chagasi. Amostras de fragmentos de orelha dos 43 indivíduos do Pantanal, e fragmentos de tecido (pulmão, fígado e baço) dos tatus do Cerrado, também foram analisadas para M. leprae e Leishmania spp através de biologia molecular, nas quais foram negativas. Dos tatus provenientes do Cerrado, analisados para P. brasiliensis, 07 ou 100% dos indivíduos foram positivos. Baseado nestes resultados, pode-se afirmar que os tatus apresentam uma relação e histórico de exposição a estes patógenos, seja através do contato com outras espécies, seres humanos ou condições ambientais onde ocorrem. Contudo, confirma-se a importância destas espécies para o entendimento dos ciclos de transmissão de patógenos e de forma estratégica, como indicadoras da saúde de um ecossistema em programas de investigação e monitoramento de doenças, especialmente as zoonoses. / Over the years mankind has contributed to the emergence of several diseases, while becoming victims of those passed among humans and other animals, known as zoonosis. Armadillos are primitive wild mammals who present peculiar anatomical and physiological characteristics which make them susceptible and potential reservoirs of zoonotic pathogens relevant to public health. The goal of the present study was to evaluate the prevalence of five zoonotic pathogens (Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Leishmania spp., Mycobacterium leprae and Paracoccidioides brasiliensis) in four armadillo species (Priodontes maximus, Euphractus sexcinctus, Dasypus novemcinctus and Cabassous unicinctus) found in Pantanal and Mato-Grosso-do-Sul tropical savanna ecoregion, the Cerrado. A total of 50 armadillos were sampled: 43 free living individuals from Pantanal (16 P. maximus; 17 E. sexcinctus; 02 D. novemcinctus and 08 C. unicinctus) and 07 individuals found dead in three different roads of the Cerrado. Of the 43 individuals sampled in Pantanal, 13 (30.23%) presented T. gondii antibodies; 01 (2.32%) showed antibodies anti-T. cruzi; and 04 (9.30%) showed anti-Leishmania (L.) infantum chagasi antibodies. All 50 samples were also analyzed by molecular biology based on the polymerase chain reaction (PCR). None of the samples tested positive for M. leprae and Leishmania spp. And all seven or (100%) individuals from the Cerrado were tested positive for P. brasiliensis. The results suggest that the armadillos have been exposed to these pathogens, either by contact with other species, including humans or by their own environmental conditions in certain ecosystems. The armadillo species studied may have a greater susceptibility to these pathogens in the natural environment where they occur. Armadillos are key species in understanding diseases transmission cycle, especially regarding zoonotic pathogens and they can strategically act as an indicator of ecosystem health for research programs and zoonotic diseases monitoring.

A hanseníase é geralmente agravada pelo aparecimento de reações, que são quadros inflamatórios de difícil tratamento e a principal causa de seqüelas. Nossa hipótese é de que deficiência e/ou perda da função das células T reguladoras (Tregs) podem estar envolvidas no desenvolvimento das reações. Além da avaliação da frequência das Tregs circulantes em pacientes com reação tipo 1 (R1) e reação tipo 2 (R2), também foi avaliada a frequência in situ de FoxP3, IL-17, IL-6 e TGFbeta. Pacientes com R2 apresentaram expressiva diminuição na frequência das Tregs circulantes e in situ em comparação com pacientes com R1 e com os controles. Paralelamente a diminuição das Tregs nas R2 foi observado aumento da expressão de IL-17 in situ e diminuição da expressão de TGFbeta. Biópsias obtidas de pacientes com R1 e R2 antes do episódio reacional mostraram números de células FoxP3+ e IL-17+ similares entre os dois grupos. Entretanto, nas biópsias obtidas durante a reação foi observado diminuição de Tregs e aumento de células IL-17+ em pacientes com R2, enquanto que pacientes com R1 apresentaram o oposto: aumento de Tregs e diminuição de células IL-17+. Além disso, foi observada diminuição da expansão das Tregs frente ao estímulo in vitro com Mycobacterium leprae e uma tendência a baixa expressão de FoxP3 e da molécula imunossupressora CTLA-4 em Tregs de pacientes com R2. Nossos resultados sugerem que nas R2, a diminuição na frequência de Tregs possa estar favorecendo o desenvolvimento de uma resposta Th17, a qual é característica deste tipo de reação. Adicionalmente, com a finalidade de obter um número suficiente de Tregs para realização de ensaios funcionais com estas células, uma vez que se trata de uma subpopulação com baixa freqüência no sangue periférico ( < 10%), foram estabelecidos e avaliados três protocolos distintos para expansão in vitro de Tregs: protocolo Rapamicina, protocolo TGFbeta e protocolo Vitamina D3. Todos os protocolos foram capazes de induzir expansão de Tregs viáveis nos grupos estudados (paucibacilares e multibacilares sem reação, R1 e R2). Em todos os grupos estudados as Tregs expandidas apresentaram capacidade de suprimir a proliferação de linfócitos TCD4+ e TCD8+. Apesar dos três protocolos testados apresentarem capacidade de expandir Tregs in vitro, selecionamos para ensaios futuros os protocolos Rapamicina e TGFbeta por apresentarem melhor custo-benefício. A expansão in vitro será utilizada para estudos funcionais das Tregs buscando melhor entendimento do envolvimento desta subpopulação na patogenia das reações hansênicas / Leprosy is frequently complicated by the appearance of reactions that are difficult to treat and are the main cause of sequelae. We speculated that disturbances in regulatory T-cells (Tregs) could play a role in leprosy reactions. We determined the frequency of circulating Tregs in patients with type 1 reaction (T1R) and type 2 reaction (T2R). The in situ frequency of FoxP3 and interleukin (IL)-17, IL-6, and transforming growth factor beta (TGF)-beta expressing cells was also determined. T2R patients showed markedly lower number of circulating and in situ Tregs than T1R patients and controls. This decrease was paralleled by increased in situ IL-17 expression but decreased TGF-beta expression. Biopsies from T1R and T2R patients before the reaction episodes showed similar number of forkhead box protein P3 + (FoxP3+) and IL-17+ cells. However, in biopsies taken during the reaction, T2R patients showed a decrease in Tregs and increase in IL-17+ cells, whereas T1R patients showed the opposite: Tregs increased but IL17+ cells decreased. We also found decreased expansion of Tregs upon in vitro stimulation with Mycobacterium leprae and a trend for lower expression of FoxP3 and the immunosuppressive molecule CTLA-4 in T2R Tregs. Our results provide some evidence to the hypothesis that, in T2R, downmodulation of Tregs may favor the development of T-helper-17 responses that characterize this reaction. In addition, aiming to provide sufficient number of Tregs to perform functional assays with these cells, as they correspond to a subtle subpopulation among the peripheral blood mononuclear cells ( < 10%), we established and analyzed three different protocols for in vitro Tregs: a Rapamycin protocol, a TGFbeta protocol and a Vitamina D3 protocol. All three protocols were able to induce the expansion of viable in the four types of patients of the study (paucibacillary and multibacillary patients without reaction, and R1 and R2 patients). In these four groups the tregs were able to suppress the proliferative response of TCD4+ e TCD8+ lymphocytes. Although the three protocols resulted in expansion of Tregs, we selected two of them, Rapamycin and TGFbeta for further assays since they showed better cost-benefit. The in vitro expansion will be used to perform functional assays of the Tregs aiming at a better understanding of the involvement of this subpopulation in the pathogenesis of the leprosy reaction episodes

As Hsp são utilizadas nos tratamentos de autoimunidades e tumores, mas seus mecanismos de ação não foram esclarecidos. Para verificar o efeito da Hsp65 no envelhecimento, analisamos leucócitos em &#9792; HIII envelhecidas e, utilizando-se camundongos F1, investigou-se a influência genética na susceptibilidade. &#9792;HIII velhas apresentaram aumento de linfócitos T ativados e B no baço, e de APC no sangue. A sobrevida em &#9792;F1H injetadas foi menor e semelhante aos dados obtidos em &#9792;HIII. A produção de IgG aumentou nos &#9794;F1 tratados, e a de IgM foi maior nos animais inoculados independente do sexo. Nos híbridos, apenas &#9792;F1 envelhecidas apresentaram maior porcentagem de linfócitos T CD4 e CD8 ativados e de células CD11c. A Hsp65 induz, in vivo, ativação imune em &#9792;HIII e &#9792;F1 velhas; a susceptibilidade parece ser ligada a um efeito do sexo feminino e à influência genética da linhagem HIII. / Hsp are used for the development of autoimmunities and tumors treatments, however, the mechanism of action has not been fully enlightened. To verify the effect of Hsp65 in the aging, we analyzed aged &#9792;HIII leukocytes; using F1 hybrid mice we studied the genetic influence in Hsp65 susceptibility. Aged &#9792;HIII presented increase of T and B lymphocytes in the spleen and augmented APC in the blood. The survival of aged &#9792;F1H was reduced, similarly to aged &#9792;HIII previous results. The anti-Hsp65 IgG production increased in &#9794;F1 males, and the IgM was greater in all groups regardless of gender. In hybrid mice, only &#9792;F1 mice presented increased percentage of CD4 and CD8 activated T cells and of CD11c cells. The Hsp65 induces in vivo, activation of the immune system in aged &#9792;HIII and &#9792;F1 mice; the susceptibility to the protein can be given by specific gender effects and the genetic influence of the HIII strain.

A hanseníase é geralmente agravada pelo aparecimento de reações, que são quadros inflamatórios de difícil tratamento e a principal causa de seqüelas. Nossa hipótese é de que deficiência e/ou perda da função das células T reguladoras (Tregs) podem estar envolvidas no desenvolvimento das reações. Além da avaliação da frequência das Tregs circulantes em pacientes com reação tipo 1 (R1) e reação tipo 2 (R2), também foi avaliada a frequência in situ de FoxP3, IL-17, IL-6 e TGFbeta. Pacientes com R2 apresentaram expressiva diminuição na frequência das Tregs circulantes e in situ em comparação com pacientes com R1 e com os controles. Paralelamente a diminuição das Tregs nas R2 foi observado aumento da expressão de IL-17 in situ e diminuição da expressão de TGFbeta. Biópsias obtidas de pacientes com R1 e R2 antes do episódio reacional mostraram números de células FoxP3+ e IL-17+ similares entre os dois grupos. Entretanto, nas biópsias obtidas durante a reação foi observado diminuição de Tregs e aumento de células IL-17+ em pacientes com R2, enquanto que pacientes com R1 apresentaram o oposto: aumento de Tregs e diminuição de células IL-17+. Além disso, foi observada diminuição da expansão das Tregs frente ao estímulo in vitro com Mycobacterium leprae e uma tendência a baixa expressão de FoxP3 e da molécula imunossupressora CTLA-4 em Tregs de pacientes com R2. Nossos resultados sugerem que nas R2, a diminuição na frequência de Tregs possa estar favorecendo o desenvolvimento de uma resposta Th17, a qual é característica deste tipo de reação. Adicionalmente, com a finalidade de obter um número suficiente de Tregs para realização de ensaios funcionais com estas células, uma vez que se trata de uma subpopulação com baixa freqüência no sangue periférico ( < 10%), foram estabelecidos e avaliados três protocolos distintos para expansão in vitro de Tregs: protocolo Rapamicina, protocolo TGFbeta e protocolo Vitamina D3. Todos os protocolos foram capazes de induzir expansão de Tregs viáveis nos grupos estudados (paucibacilares e multibacilares sem reação, R1 e R2). Em todos os grupos estudados as Tregs expandidas apresentaram capacidade de suprimir a proliferação de linfócitos TCD4+ e TCD8+. Apesar dos três protocolos testados apresentarem capacidade de expandir Tregs in vitro, selecionamos para ensaios futuros os protocolos Rapamicina e TGFbeta por apresentarem melhor custo-benefício. A expansão in vitro será utilizada para estudos funcionais das Tregs buscando melhor entendimento do envolvimento desta subpopulação na patogenia das reações hansênicas / Leprosy is frequently complicated by the appearance of reactions that are difficult to treat and are the main cause of sequelae. We speculated that disturbances in regulatory T-cells (Tregs) could play a role in leprosy reactions. We determined the frequency of circulating Tregs in patients with type 1 reaction (T1R) and type 2 reaction (T2R). The in situ frequency of FoxP3 and interleukin (IL)-17, IL-6, and transforming growth factor beta (TGF)-beta expressing cells was also determined. T2R patients showed markedly lower number of circulating and in situ Tregs than T1R patients and controls. This decrease was paralleled by increased in situ IL-17 expression but decreased TGF-beta expression. Biopsies from T1R and T2R patients before the reaction episodes showed similar number of forkhead box protein P3 + (FoxP3+) and IL-17+ cells. However, in biopsies taken during the reaction, T2R patients showed a decrease in Tregs and increase in IL-17+ cells, whereas T1R patients showed the opposite: Tregs increased but IL17+ cells decreased. We also found decreased expansion of Tregs upon in vitro stimulation with Mycobacterium leprae and a trend for lower expression of FoxP3 and the immunosuppressive molecule CTLA-4 in T2R Tregs. Our results provide some evidence to the hypothesis that, in T2R, downmodulation of Tregs may favor the development of T-helper-17 responses that characterize this reaction. In addition, aiming to provide sufficient number of Tregs to perform functional assays with these cells, as they correspond to a subtle subpopulation among the peripheral blood mononuclear cells ( < 10%), we established and analyzed three different protocols for in vitro Tregs: a Rapamycin protocol, a TGFbeta protocol and a Vitamina D3 protocol. All three protocols were able to induce the expansion of viable in the four types of patients of the study (paucibacillary and multibacillary patients without reaction, and R1 and R2 patients). In these four groups the tregs were able to suppress the proliferative response of TCD4+ e TCD8+ lymphocytes. Although the three protocols resulted in expansion of Tregs, we selected two of them, Rapamycin and TGFbeta for further assays since they showed better cost-benefit. The in vitro expansion will be used to perform functional assays of the Tregs aiming at a better understanding of the involvement of this subpopulation in the pathogenesis of the leprosy reaction episodes

Ao longo dos anos, a humanidade contribuiu para o surgimento de diversos patógenos, tornando-se vítimas de doenças transmitidas dos animais para o homem, as chamadas antropozoonoses. Dentre os animais, os tatus, mamíferos selvagens primitivos, apresentam características anatômicas e fisiológicas peculiares, que os tornam mais susceptíveis à diversas doenças e potenciais reservatórios de patógenos zoonóticos, relevantes para a saúde pública. O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência de cinco patógenos zoonóticos (Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Leishmania spp, Mycobacterium leprae e Paracoccidioides brasiliensis) em quatro espécies de tatus; P. maximus, E. sexcinctus, D. novemcinctus e C. unicinctus do Pantanal e Cerrado do Mato-Grosso-do-Sul. Um total de 50 tatus foram analisados. Sendo, 43 amostras de soros de indivíduos de vida livre (16 Priodontes maximus; 17 Euphractus sexcinctus; 02 Dasypus novemcinctus e 08 Cabassous unicinctus) provenientes do Pantanal e 07 conjuntos de fragmentos de tecidos (pulmão, fígado e baço), de 06 E. sexcinctus e 01 (D. novemcinctus) atropelados em três rodovias do Cerrado do Mato-Grosso-do-Sul. Dos 43 indivíduos amostrados no Pantanal, 13/43 ou 30,23% apresentaram anticorpos anti-T. gondii; 01/43 ou 2,32% anti-T. cruzi e 4/43 ou 9,30% anti-Leishmania (L.) infantum chagasi. Amostras de fragmentos de orelha dos 43 indivíduos do Pantanal, e fragmentos de tecido (pulmão, fígado e baço) dos tatus do Cerrado, também foram analisadas para M. leprae e Leishmania spp através de biologia molecular, nas quais foram negativas. Dos tatus provenientes do Cerrado, analisados para P. brasiliensis, 07 ou 100% dos indivíduos foram positivos. Baseado nestes resultados, pode-se afirmar que os tatus apresentam uma relação e histórico de exposição a estes patógenos, seja através do contato com outras espécies, seres humanos ou condições ambientais onde ocorrem. Contudo, confirma-se a importância destas espécies para o entendimento dos ciclos de transmissão de patógenos e de forma estratégica, como indicadoras da saúde de um ecossistema em programas de investigação e monitoramento de doenças, especialmente as zoonoses. / Over the years mankind has contributed to the emergence of several diseases, while becoming victims of those passed among humans and other animals, known as zoonosis. Armadillos are primitive wild mammals who present peculiar anatomical and physiological characteristics which make them susceptible and potential reservoirs of zoonotic pathogens relevant to public health. The goal of the present study was to evaluate the prevalence of five zoonotic pathogens (Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Leishmania spp., Mycobacterium leprae and Paracoccidioides brasiliensis) in four armadillo species (Priodontes maximus, Euphractus sexcinctus, Dasypus novemcinctus and Cabassous unicinctus) found in Pantanal and Mato-Grosso-do-Sul tropical savanna ecoregion, the Cerrado. A total of 50 armadillos were sampled: 43 free living individuals from Pantanal (16 P. maximus; 17 E. sexcinctus; 02 D. novemcinctus and 08 C. unicinctus) and 07 individuals found dead in three different roads of the Cerrado. Of the 43 individuals sampled in Pantanal, 13 (30.23%) presented T. gondii antibodies; 01 (2.32%) showed antibodies anti-T. cruzi; and 04 (9.30%) showed anti-Leishmania (L.) infantum chagasi antibodies. All 50 samples were also analyzed by molecular biology based on the polymerase chain reaction (PCR). None of the samples tested positive for M. leprae and Leishmania spp. And all seven or (100%) individuals from the Cerrado were tested positive for P. brasiliensis. The results suggest that the armadillos have been exposed to these pathogens, either by contact with other species, including humans or by their own environmental conditions in certain ecosystems. The armadillo species studied may have a greater susceptibility to these pathogens in the natural environment where they occur. Armadillos are key species in understanding diseases transmission cycle, especially regarding zoonotic pathogens and they can strategically act as an indicator of ecosystem health for research programs and zoonotic diseases monitoring.

Submitted by Lara Oliveira (lara@ufersa.edu.br) on 2017-05-19T20:57:26Z No. of bitstreams: 1 Ismênia_DISSERT.pdf: 2286785 bytes, checksum: fe512f9cb09ab8ccaeca35cce30794cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T20:57:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ismênia_DISSERT.pdf: 2286785 bytes, checksum: fe512f9cb09ab8ccaeca35cce30794cc (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae and persists as a serious public health problem in Brazil. The fact that this microorganism is inculcable makes it difficult to diagnose and elucidate details of its transmissive chain. Aiming to clarify the role of house dust in the disease transmission route, this case-control study carried out in the Barrocas, Mossoró, RN, Brazil, the largest cluster in the state, compared clinical, epidemiological, slit skin smear and serological results of 22 newly diagnosed patients of the cluster, with molecular results of detection of the specific RLEP and 16S rRNA genomic regions of this bacillus in the nasal swab samples, saliva and house dust of these individuals and of the controls (44 household contacts and 44 endemic contacts) between november 2015 to november 2016. There was greater detection in women and school-age youth, with degree of disability, with predominance of paucibacillary forms. There was no statistical difference between the number of BCG vaccine scars from patients and endemic contacts, and 31.8% of the patients had no vaccine scar. The two rapid serological tests evaluated, ML-flow and OrangeLife® presented similar results, with a higher positivity among paucibacillary patients through the latter (54.5%). Both were superior to slit skin smear (9.1%). Regarding molecular research, the positivity in nasal swab and saliva of multibacillary patients with primer RLEP was 16.7% and 33.3%, respectively. There was no detection of bacterial DNA in domestic dust or between paucibacillary. Regarding the DNA analysis in saliva of endemic multibacillary contacts, there was 27.2% positivity. Associating molecular and serological results, it was possible to identify 4.5% of subclinicity between home contacts and 15% of asymptomatic carrier status. Regarding the risk variables, residing in dwellings with up to two windows offered 3.79 times more chance of progressing to this outcome, having a history of cases of leprosy in the family increased 2.89 times the risk of presenting seropositivity by the OrangeLife® serological test In this community and being over 60 years of age gave 3.6 times more chances of having positive serological reaction for leprosy with the test evaluated, which denotes prolonged exposure to the bacillus. Although not statistically significant, it was noted that the pattern of low schooling, low income, environmental insalubrity, population agglomeration and inadequate living habits made up a sociodemographic and epidemiological profile that attests to the context of social vulnerability of the affected population, requiring integrated actions of rehabilitation that go beyond the physical aspect of their dwellings, since they need to contemplate the human and social development of these people in the broad sense / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae e persiste como grave problema de saúde pública no Brasil. O fato deste micro-organismo ser incultivável dificulta o diagnóstico e elucidação de detalhes da sua cadeia transmissiva. Objetivando analisar a dinâmica de transmissão ambiental da hanseníase, este estudo caso-controle realizado no Bairro Barrocas, Mossoró/RN, maior cluster do estado, confrontou resultados de avaliação clínica, epidemiológica, baciloscópica e sorológica de 22 doentes recém-diagnosticados nas Barrocas, com resultados moleculares de detecção das regiões genômicas específicas RLEP e 16S rRNA deste bacilo nas amostras de swab nasal, saliva e poeira domiciliar destes indivíduos e dos seus controles (44 contactantes domiciliares e 44 contactantes endêmicos), entre novembro de 2015 a novembro de 2016. Os indivíduos foram diagnosticados através de busca ativa nos domicílios, nas escolas e na sede da unidade básica de saúde local. Houve maior detecção da doença em mulheres, nos menores de 15 anos, com grau 0 de incapacidade e predominância de formas paucibacilares. Não houve diferença estatística entre o número de cicatrizes vacinais de BCG de doentes e de contatos endêmicos, e 31,8% dos hansenianos não apresentaram cicatriz vacinal. Os dois testes rápidos sorológicos avaliados, ML-flow (IgM ND-O-BSA) e OrangeLife® (IgM e IgG anti NDO-LID 1) apresentaram resultados semelhantes, com maior positividade entre os paucibacilares através deste último (54,5%). Ambos foram superiores à baciloscopia (9,1%). Quanto à pesquisa molecular, a positividade em swab nasal e saliva de doentes multibacilares com primer RLEP foi de 16,7% e 33,3%, respectivamente. Não houve detecção de DNA bacteriano na poeira doméstica nem entre os paucibacilares. Já em relação à pesquisa de DNA em saliva de contatos endêmicos de multibacilares, houve 27,2% de positividade. Associando-se resultados moleculares e sorológicos, foi possível identificar 4,5% de subclinicidade e 15% de status portador assintomático entre contatos domiciliares. Em relação às variáveis de risco de soropositivar com o teste OrangeLife®, este estudo revelou que residir em moradias com até duas janelas ofereceu 3,79 vezes mais chance de evoluir para este desfecho, ter histórico de casos de hanseníase na família aumentou 2,89 vezes o risco e ter mais de 60 anos de idade conferiu 3,6 vezes mais chances, o que denota exposição prolongada destes indivíduos ao bacilo. Embora sem significância estatística, fez-se notório que o padrão de baixa escolaridade, baixa renda, insalubridade ambiental, aglomeração populacional e hábitos de vida inadequados compuseram um perfil sociodemográfico e epidemiológico que atestou o contexto de vulnerabilidade social da população afetada, exigindo ações integradas de reabilitação que vão além do aspecto físico de suas moradias, pois necessitam contemplar o desenvolvimento humano e social dessas pessoas no seu sentido amplo / 2017-05-18

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SergioRFA_TESE.pdf: 7822699 bytes, checksum: 8e76eaff31bfe4bd8789eb8d81e15701 (MD5) Previous issue date: 2013-12-20 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / O tropismo do M. leprae pela pele e nervos perif?ricos, confere ? hansen?ase caracter?sticas peculiares, tais como perda de sensibilidade e deformidades teciduais. Hipotetizamos que a susceptibilidade do hospedeiro ? gerida por um complexo conjunto de fatores diferentes, como aumento da express?o dos genes ERBB2, PARK2 e PACRG e/ou o ganho de atividade dos seus produtos g?nicos, em virtude de polimorfismos nesses genes. Outro fator que hipotetizamos estar contribuindo com a susceptibilidade ? hansen?ase, juntamente com os fatores gen?ticos, ? a exist?ncia de elementos de risco entre pessoas suscept?veis, tais como, co-morbidades e exposi??o prolongada ao pat?geno. Tamb?m hipotetizamos que a distribui??o desigual da doen?a em algumas ?reas populacionais, com forma??o de aglomerados, seja devido, a elevada densidade populacional de pessoas suscept?veis em ?reas de risco por tempo prolongado. Portanto, para comprovar essas hip?teses tem-se os seguintes objetivos: 1) Testar o envolvimento de polimorfismos nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG com a hansen?ase em duas ?reas end?micas, mas com popula??es distintas; 2) Testar a rela??o de fatores de risco exposicionais e co-morbidades, dentre outros, com o aumento de susceptibilidade ? hansen?ase na popula??o do Rio Grande do Norte e 3) Avaliar se fatores como densidade demogr?fica e padr?o socioecon?mico e sanit?rio est?o contribuindo com a desigual distribui??o da doen?a em ?rea end?mica para a hansen?ase no estado do Rio Grande do Norte. Este estudo foi desenvolvido em 3 etapas: Foram genotipados marcadores no gene ERBB2 na popula??o de Bel?m/PA, usando uma abordagem familiar. Num segundo momento foram genotipados marcadores nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG na popula??o do Rio Grande do Norte, usando uma abordagem caso-controle. Num terceiro momento, foi avaliada a distribui??o espacial da hansen?ase em Nova Cruz/RN. Foram feitas an?lises in silico, que apontaram para uma muta??o delet?ria no gene ERBB2 (rs1058808) e outra no gene PARK2 (rs1801334). Atrav?s de an?lise de modelagem molecular tamb?m foi encontrada uma muta??o potencialmente capaz de alterar a fun??o da prote?na ErbB2 (rs1801200). A genotipagem da popula??o de Bel?m/PA mostrou como fatores de risco dentre as fam?lias analisadas os polimorfismos rs2517956 e rs1058808 no gene ERBB2. Na genotipagem da popula??o do Rio Grande do Norte, encontramos como fatores de risco, os polimorfismos rs6915128 e rs1801334 para a hansen?ase per se e suas formas cl?nicas e rs1333955 para o ENH. Encontramos dois fatores de risco que justificaram a distribui??o desigual dos casos de hansen?ase na cidade de Nova Cruz/RN, a elevada densidade demogr?fica e o maior tempo de moradia de pessoas suscept?veis em ?reas de risco. Os genes PARK2, PACRG e ERBB2 participam da patog?nese da hansen?ase e, portanto s?o s?rios candidatos a alvos para agentes terap?uticos. Nesse estudo foi encontrado um SNP que tamb?m j? havia sido associado ao mal de Parkinson, e portanto, pode haver um compartilhamento funcional da parquina entre a hansen?ase e o Parkinsonismo. Nesse estudo tamb?m foi encontrado pela primeira vez associa??o entre variantes gen?ticas de ERBB2 e a hansen?ase