A exploração de resíduos agroindustriais como matérias-primas aplicadas na conversão de lipídeos por leveduras, possibilitam um destino mais sustentável a estes resíduos, visto que matéria-prima lipídica possui grande interesse comercial, tanto para suplementação alimentar como na síntese de biocombustíveis e outros produtos da indústria oleoquímica. Foram avaliadas nove linhagens de leveduras, identificadas anteriormente como boas ou ótimas produtoras de lipídeos em meio mel, para seleção da estirpe mais adequada para a produção de lipídeos em meio de soro de queijo. O crescimento celular foi quantificado pela determinação gravimétrica da biomassa seca a 60ºC por 24 h e a extração dos lipídeos totais foi determinada utilizando o método de Bligh e Dyer. A maior produção de lipídeos totais foi de 1,27 g L-1 obtida pela linhagem de Cryptococcus laurentii, apresentando diferença significativa em relação às demais linhagens avaliadas, pelo teste de Tukey a 5% de significância. Posteriormente foi realizada a comparação de dois meios de cultivos e dois métodos de extração de lipídeos de cultura de C. laurentii. Os experimentos foram realizados com planejamento fatorial completo 22, com dois fatores e dois níveis. Os lipídeos foram extraídos em dois diferentes métodos: Bligh e Dyer e Folch et al.; as leveduras cultivadas em dois meios de cultivo: soro de queijo e YEPG líquido. Obteve-se conteúdo lipídico final superior em soro de queijo nas condições avaliadas, já o método de extração de Bligh e Dyer não apresentou diferenças estatísticas em comparação ao de Folch et al., contudo apresentou maiores médias, sendo adotado como método de extração dos experimentos seguintes. Realizou-se um estudo para otimização da produção de biomassa e lipídeos totais de C. laurentii, em meio de cultivo de soro de queijo suplementado com melaço de cana de açúcar. A primeira etapa consistiu no estudo do efeito do pH, tempo de fermentação e concentração de melaço. A segunda etapa consistiu no efeito da suplementação por extrato de levedura e sais inorgânicos (KH2PO4, Na2HPO4, MgSO47H2O, CaCl22H2O, FeCl36H2O e ZnSO4H2O). A condição ótima de cultivo para linhagem de C. laurentii em meio de soro de queijo foi definida com os seguintes fatores: 360 h de fermentação, pH do meio de cultivo de 6,5 e suplementação (g L-1): 50 melaço, 0,5 extrato de levedura, 4 K2PO4, 1 Na2PO4, 0,75 MgSO47H2O e 0,002 ZnSO4H2O. Os lipídeos totais produzidos na condição de cultivo alcançaram 2,96 g L-1, que representa um aumento de 133,1% na produção de lipídeos totais por C. laurentii em relação ao meio com soro de queijo sem suplementação. Ocorrendo predomínio de lipídeos neutros 85,76%, com alto teor de ácidos graxos saturados e monosaturados, de cadeia longa com 16 e 18 átomos de carbono, o que possibilita sua aplicabilidade como fonte de triglicerídeos para biodiesel. / The exploitation of agro-industrial wastes as raw materials applied in the conversion of lipids by yeasts, allows a more sustainable destination of such waste, since lipid feedstock has great commercial interest, both for food supplementation as in the synthesis of biofuels and other products for oleochemical industry. We have evaluated nine strains of yeast, previously identified as good or excellent producers of lipids in honey medium, for selecting the most suitable strain for the production of lipids in cheese whey medium. Cell growth was quantified by gravimetric determination of dry biomass at 60°C for 24 h and the extraction of total lipids was determined using the method of Bligh and Dyer. The highest yield of total lipids was 1.27 g L-1 produced by the strain of Cryptococcus laurentii, significant difference compared to other strains assessed by Tukey test at 5% significance level. Posteriorly was carried out a comparison of two culture media and two lipid extraction methods for culture of C. laurentii. The experiments were performed with 22 full factorial design used two factors and two levels. Lipids were extracted by two different methods: Bligh and Dyer and Folch et al.; Yeasts grown in two culture media: cheese whey and liquid YEPG. Was achieved lipid content upper in cheese whey under the conditions evaluated, since the extraction method of Bligh and Dyer showed no statistical differences compared to that of Folch et al., but had higher average, used as a method of extraction in following experiments. Was conducted a study to optimize the production of biomass and lipid content of C. laurentii, in culture medium of whey supplemented with sugar cane molasses. The first step was to study the effect of pH, fermentation time and molasses concentration. The second step was the effect of supplementation by yeast extract and inorganic salts (KH2PO4, Na2HPO4, MgSO47H2O, CaCl22H2O, FeCl36H2O, and ZnSO4H2O). The optimum condition for growing strain of C. laurentii in the cheese whey medium was set to the following factors: 360 h fermentation, 6,5 pH and supplementation of (g L-1): 50 molasses, 0.5, yeast extract, 4 K2PO4,1 Na2PO4, 0.75 MgSO47H2O and 0.002 ZnSO4H2O. The total lipid produced in the culture condition reached 2.96 g L-1, which represents an increase of 133.1% total lipid in the production of C. laurentii in relation to the cheese whey medium without supplementation. Predominantly occurred neutral lipids 85.76%, with high content of saturated and monosaturated fatty acids, long chain with 16 and 18 carbon atoms, which makes its applicability as a source of triglycerides for biodiesel

A tecnologia anaeróbia tem sido utilizada com sucesso no tratamento de água residuária contendo compostos fenólicos. Recentes pesquisas incluem tais compostos entre aqueles que podem ser degradados através desse processo. O objetivo desse trabalho foi avaliar a degradação do fenol em diferentes condições nutricionais, com ênfase na redução do sulfato. Os experimentos foram realizados com meio de cultura específico para esses microrganismos anaeróbios. Foram realizados ensaios de degradação em reatores em batelada alimentados nas seguintes condições: (1) fenol e sulfato, a diferentes concentrações, com inóculo previamente enriquecido; (2) fenol, sulfato e co-substratos e; (3) fenol, sulfato e extrato de levedura. Todos os ensaios foram realizados em temperatura de 30 graus Celsius, sob agitação de 150 rpm. Foi avaliado o consumo de fenol e sulfato e, produção de metano, em função do tempo, para diferentes concentrações iniciais de fenol e sulfato. Nos ensaios com reatores alimentados com fenol (329,3 mg/l); fenol (307,3 mg/l) e sulfato (160 mg/l); fenol (322.3 mg/l), sulfato (160 mg/l) e lactato (478,16 mg/l); fenol (332,1 mg/l), sulfato (150 mg/l) e etanol (129,76 mg/l), a remoção foi de, respectivamente, 99,8%, 98,2%, 98,8% e 98,8%. Os reatores alimentados com fenol (239,7 mg/l) obtiveram 100% de eficiência na degradação em apenas 11 dias e, os reatores alimentados com fenol (234,3 mg/l) e sulfato (162,5 mg/l) e fenol (256,0 mg/l) e sulfato (500 mg/l) tiveram eficiências de degradação de, respectivamente, 98,8% e 99,3% com 17 dias de operação. Tais eficiências foram obtidas pelo acréscimo de extrato de levedura nos reatores, no início dos ensaios. A caracterização morfológica foi realizada através de microscopia óptica. A diversidade microbiana referente aos Domínios Bacteria e Archaea, além do grupo de bactérias redutoras de sulfato foi avaliada através da técnica de PCR DGGE, onde foram observadas alterações nas populações microbianas, em função das condições nutricionais. Para o Domínio Archaea não foram observadas diferenças nos ensaios realizados. Para o Domínio Bacteria e Grupo das BRS essas diferenças foram, mais facilmente, percebidas com relação ao inóculo e entre os diversos reatores. A alteração na diversidade microbiana pode ter sido decorrente da composição do meio que, nesse caso, foi específico para BRS e a composição do inóculo que continha parte previamente adaptada às BRS. Essas condições adequadas puderam propiciar surgimento e desenvolvimento de populações microbianas capazes de degradar fenol, utilizando sulfato. / The anaerobic technology has been successfully used to treat wastewater containing phenolic compounds. Recent research includes such compounds among those that can be degraded through this process. The goal of this project was to assess phenol degradation in different nutritional conditions, focusing on sulfate reduction. The essays were carried out in a specific culture mean for these kinds of anaerobic microorganisms. Degradation essays were carried out in a batch reactor fed in the following ways: (1) phenol and sulfate, in different concentrations, with previously enriched inoculum; (2) phenol, sulfate and co-substrates and; (3) phenol, sulfate and yeast extract. All the essays were carried out at 30 Celsius degrees, under 150 rpm agitation. The consumption of phenol and sulfate and, methane production, in function of time, for different initial concentrations of phenol and sulfate was assessed. In the essays the reactors were fed with phenol (329.3 mg/l); phenol (307.3 mg/l) and sulfate (160 mg/l); phenol (322.3 mg/l), sulfate (160 mg/l) and lactate (478.16 mg/l); phenol (332.1 mg/l), sulfate (150 mg/l) and ethanol (129.76 mg/l), the removal was of, respectively, 99.8%, 98.2%, 98.8% and 98.8%. The reactors fed with phenol (239.7 mg/l) obtained 100% degradation efficiency in only 11 days. The reactors fed with phenol (234.3 mg/l) and sulfate (162.5 mg/l) and phenol (256.0 mg/l) and sulfate (500 mg/l) obtained degradation efficiency of 98.8% and 99.3%, respectively, in only 17 days of operation. Such efficiencies were obtained by the increase of yeast extract in the reactors, in the beginning of the essays. The morphological characterization was carried out by optical microscopy. The microbial diversity regarding the Bacteria and Archaea Domain, besides the sulfate reducing bacteria group was assessed through the PCR DGGE technique, where alterations were seen in the microbial population, due to nutritional conditions. For the Archaea Domain, no differences were seen in all the essays. For the Bacteria Domain and the SRB Group these differences were easily seen, noticed by the inoculum and the diverse reactors. The alteration in the microbial diversity might have occurred due to culture mean composition that, in this case, was specific for SRB and also due to inoculum composition that contained a part previously adapted to SRB. These adequate conditions could promote appearance and development of microbial population capable of degrading phenol, using sulfate.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-10T14:52:17Z No. of bitstreams: 1 Emanuel Feitosa de Assuncao.pdf: 874050 bytes, checksum: ab87c3228b1c082ff8bd7fcd620e23f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-10T14:52:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Emanuel Feitosa de Assuncao.pdf: 874050 bytes, checksum: ab87c3228b1c082ff8bd7fcd620e23f2 (MD5) Previous issue date: 2015-07-24 / The stain-de-alternaria caused by the fungus Alternaria brassicicola is considered one of the most common and destructive fungal diseases the brassica. The control of Alternaria is based on preventive sprays or after the appearance of first symptoms with fungicides. An alternative to controlling the disease is the use of biological control. In this context, yeasts emerge as a new class of biocontrol agents. This study aimed to: isolate, select and evaluate the potential of yeasts in biocontrol stain-of-alternaria, in kale; verify production Killer toxin, biofilm formation and production of volatile metabolites in vitro, as well as evaluate the yeast as resistance inducing agents in kale, through enzymatic analysis catalase and ascorbate peroxidase. Initially, 18 isolates of A. brassicicola were evaluated in greenhouse for their ability to cause disease in kale, being isolated 91 from the pathogen selected for biocontrol assays. 39 yeast isolates obtained from leaves of healthy plants brassica were evaluated in greenhouse, being five isolates selected for the assays in vivo and in vitro. In the assay biocontrol, kale plants were sprayed with 15 mL of the suspension (1x107 cells mL-1) of yeasts (L32, L40, L44, L47 and L57) in the periods (72, 48, 24 hours before inoculation the pathogen), and immediate (followed of the pathogen inoculation). The yeast isolates (L46, L32, L44 and L40) were the most effective in reducing the severity of the stain-of-alternaria, accounting for severity index of 7,66%, 7,78, 8,13 e 9,07%, respectively. The periods 24 hours and immediate were the most significant in reduction disease. Among the evaluated yeasts, isolates L46 and L44 produced biofilm (weak 1+) and the others did not produce biofilm. As the Killer activity, the five evaluated yeasts produced the Killer toxin. It was also verified that the isolates (L46 and L40) inhibited in 60, 334% and 59,774%, respectively, growth in vitro of A. brassicicola and isolates (L32, L40, L44, L47 and L57) completely inhibited sporulation in vitro of the pathogen. The five isolates of yeasts evaluated provide kale plants higher levels of catalase enzyme in relation to the control treatment. The use of yeast proves to be a promising tool for the biological control of A. brassicicola in kale. / A mancha-de-alternaria causada pelo fungo Alternaria brassicicola é considerada uma das doenças fúngicas mais comuns e destrutivas das brássicas. O controle da alternariose baseia-se em pulverizações preventivas ou após o aparecimento dos primeiros sintomas com fungicidas. Uma alternativa para o controle da doença é o uso do controle biológico. Neste contexto, as leveduras surgem como uma nova classe de agentes de biocontrole. O presente estudo teve como objetivos: isolar, selecionar e avaliar o potencial de leveduras no biocontrole da mancha-de-alternaria, em couve-manteiga; verificar a produção de toxina Killer, formação de biofilme e produção de metabólitos voláteis in vitro, bem como, avaliar as leveduras como agentes indutores de resistência em couve-manteiga, através da análise enzimática da catalase e ascorbato peroxidade. Inicialmente, 18 isolados de A. brassicicola foram avaliados em casa de vegetação quanto à capacidade de causar doença em couve-manteiga, sendo o isolado 91 do patógeno selecionado para os ensaios de biocontrole. 39 isolados de leveduras obtidos de folhas de plantas sadias de brássicas foram avaliados em casa de vegetação, sendo cinco isolados selecionados para a realização dos ensaios in vivo e in vitro. No ensaio de biocontrole, plantas de couve-manteiga foram pulverizadas com 15 mL da suspensão (1x107 células mL-1) das leveduras (L32, L40, L44, L47 e L57), nos períodos (72, 48, 24 horas antes da inoculação do patógeno) e, imediato (seguido a inoculação do patógeno). Os isolados de leveduras (L46, L32, L44 e L40) foram os mais eficientes na redução severidade da mancha-de-alternaria, sendo responsáveis por índices de severidade de 7,66%, 7,78, 8,13 e 9,07%, respectivamente. Os períodos 24 horas e imediato foram os mais significativos na redução da doença. Dentre as leveduras avaliadas, os isolados L46 e L44 produziram biofilme (fraca 1+) e, os demais, não produziram biofilme. Quanto à atividade Killer, as cinco leveduras avaliadas produziram a toxina Killer. Também foi verificado que os isolados (L46 e L44) inibiram em 60, 334% e 59, 774%, respectivamente, o crescimento in vitro de A. brassicicola e, os isolados (L32, L40, L44, L47 e L57) inibiram completamente a esporulação in vitro do patógeno. Além disso, os cinco isolados de leveduras avaliados proporcionam nas plantas de couve-manteiga maiores níveis enzimáticos da catalase, em relação ao tratamento controle. O uso de leveduras demonstra ser uma ferramenta promissora para o controle biológico de A. brassicicola em couve-manteiga.

Submitted by MILENA HELOISA POZENATTO BICUDO TOGNETE null (mibicudo28@gmail.com) on 2017-03-28T20:38:07Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao versao final.pdf: 1702848 bytes, checksum: c8c7d8d8e47d1bf45f97875ac83a2798 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-30T17:07:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tognete_mhpb_me_sjrp.pdf: 1702848 bytes, checksum: c8c7d8d8e47d1bf45f97875ac83a2798 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-30T17:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tognete_mhpb_me_sjrp.pdf: 1702848 bytes, checksum: c8c7d8d8e47d1bf45f97875ac83a2798 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Este estudo tem como objetivo avaliar a matéria-prima e sua influência isolada no desempenho do rendimento fermentativo de uma linhagem padrão da levedura CAT-1 testada em 31 meios de cultivos provenientes do processo de fermentação alcoólica da Usina Virgolino de Oliveira – Unidade Catanduva. Os meios foram amostrados e compostos a cada quinzena durante toda as safras 2012 e 2013. O trabalho também tem como finalidade identificar a dinâmica populacional das leveduras do mesmo processo fermentativo, através da diferenciação das linhagens por cariotipagem. As cepas isoladas foram testadas em um meio de cultivo padrão para obtenção das características tecnológicas industriais através da metodologia da Capacidade Fermentativa. Os experimentos de fermentação foram realizados nos laboratórios da Usina Virgolino de Oliveira - Unidade Catanduva em escala reduzida sempre acompanhados de um ensaio padrão utilizando meio de cultivo sintético. O primeiro ponto de estudo consistiu na caracterização da matéria-prima, mosto, e sua capacidade isolada de perturbar o Rendimento Fermentativo. Enquanto que no segundo, onde onze diferentes cepas de levedura foram identificadas ao longo das duas safras, testadas em um mesmo meio de cultivo padrão para obtenção de parâmetros industriais tecnológicos como rendimento em produto (Yp/s), rendimento em célula (Yx/s), Velocidade de consumo do substrato (Vcs), Produtividade (PROD) e Conversão (CONV) e estudada a influência no Rendimento Fermentativo. O terceiro ponto de estudo foi a comparação entre os rendimentos fermentativos obtidos experimentalmente e os rendimentos fermentativos industriais da Planta. O impacto da presença das cepas com maior rendimento em etanol foi estudado em relação aos valores de rendimento fermentativo industrial. Os resultados mostraram diferenças de desempenho da Cepa Padrão na maioria das quinzenas testadas, o que significa que há variação da matéria-prima ao longo da safra e entre as safras capazes de afetar rendimento fermentativo. Diferenças de rendimento também foram observadas entre as onze cepas nativas testadas, porém com oscilações menores e menos consideráveis do que com a matéria-prima. Os resultados obtidos em escala reduzida com base nos balanços de massa se apresentaram valores semelhantes em relação aos números de referência o que sugere que a metodologia usada para avaliar a capacidade fermentativa das cepas e a qualidade da matéria-prima foi adequada. Apesar da forte influência dos fatores estudados, não foi possível afirmar, através destes experimentos, qual deles teve papel determinante no impacto do Rendimento Fermentativo. Isso sugere que outros fatores não estudados neste trabalho estão diretamente relacionados que são capazes de influenciar o Rendimento Fermentativo. / The purpose of this study is to evaluate the sucrose mash and its influence isolated on the performance of the Fermentative Yeld of a standard strain from CAT-1 yeast tested in 31 different culture medium formulation from the Virgolino de Oliveira Plant – Catanduva Unit alcoholic fermentation process. The culture medium formulation were sampled and composed every fortnight during the whole 2012 and 2013 harvest. The work also has as purpose to evaluate the yeasts population dynamics of the same fermentative process, through the differentiation of the strains by karyotyping. The isolated strains were tested in a standard culture medium to obtain the industrial technological characteristics through the Fermentative Capacity methodology. Fermentation experiments were carried out in mill’s laboratories on a reduced scale always accompanied by a standard assay using synthetic culture medium formulation. The first point of study consisted in the characterization of the raw material, sucrose mash, and its isolated capacity to disturb Fermentative Yield. In the second, eleven different strains of yeast identified during the two harvests, they were tested in the same culture medium to obtain industrial technological parameters as Yield in product (Yp/s), Yield in cell (Yx/s), Substrate consumption velocity (Vcs), Productivity (PROD) and Conversion (CONV) and studied their influence on the Fermentative Yield. The third point of study was the comparison between the fermentative yields obtained experimentally and the industrial fermentative yields of the Plant. The impact of the presence of strains with higher Yp/s was studied in relation to industrial fermentation yield values. The results showed differences in performance of the Standard Strain in most of the fortnight tested, which means that there is variation of the raw material during the harvest and between the crops capable of affecting fermentative yield. There were also Yeld difference observed among the eleven native strains tested, but with smaller and less considerable oscillations than with the raw material. The results obtained on a reduced scale based on the mass balances were within the range expected in relation to the reference values, which suggests that the methodology used to evaluate the fermentative capacity of the strains and the quality of the raw material was adequate. Despite the strong influence of the studied factors, it was not possible to prove, through these experiments, which one had a determinant role in the Fermentative Yield impact. This suggests that other factors not studied in this work are directly related that are able to influence Fermentative Yield.

O presente trabalho foi delineado considerando-se a importância de fungos filamentosos e leveduras, os quais estão associados a diversas patologias no homem e animais. Deve-se considerar ainda que o leite e seus derivados lácteos contaminados com estes microrganismos podem constituir potenciais vias de transmissão de zoonoses a eles relacionados. Foram analisadas amostras de leite cru dos tipos A, B e C colhidas nas próprias propriedades leiteiras, bem como amostras de leite comercializado diretamente ao consumidor, visando-se a comparação da qualidade destes produtos quanto à presença e quantidade de fungos. Procedeu-se ainda à avaliação da susceptibilidade dos fungos isolados das amostras de leite às relações temperatura/tempo empregados nos processos de pasteurização e avaliação da sensibilidade destes isolados à fervura do leite. Foram analisadas 70 amostras de leite, sendo 50 de tanques de refrigeração de propriedades leiteiras, 10 de latões de propriedades de exploração leiteira e 10 de latões de transportadores e distribuidores que armazenam e comercializam leite clandestino, sendo que não houve diferença estatisticamente significante entre as medianas das quantidades de unidades formadoras de colônias de fungos/mL de Leite das diferentes procedências, indicando que o nível de contaminação por fungos nas amostras destas três origens foi similar. Foram isolados, em diferentes percentagens, fungos filamentosos e leveduras de todas as amostras de leite das diferentes procedências: Candida spp. (C. krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. kefyr, dentre outras), Geotrichum spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., Aureobasidium sp., Penicillium spp., Acremonium spp., Chrysosporium sp., Mucor spp., Aspergillus spp. Todos os gêneros e espécies isoladas foram submetidos aos testes de pasteurização rápida e lenta, bem como a fervura. O processo de pasteurização rápida foi o procedimento no qual houve maior resistência (72,18%) por parte dos isolados de leveduras e fungos filamentosos submetidos ao teste na metodologia aplicada, seguido pelo processo de fervura (15,89%) e o de pasteurização lenta (0,99%). / The present study was outlined considering the importance of filamentous fungi and yeasts, associated to various pathologies in man and animals. It must be considered that milk and dairy products when contaminated with these microorganisms can represent a potential means of zoonosis transmission related to them. Samples of raw milk types A, B and C, collected in dairy farms, as well as milk sold directly to the consumer, were analysed, aiming the comparison of the quality of these products as to the presence and quantity of fungi. The susceptibility of the isolates to the temperature/time rates employed in pasteurization and boiling was also evaluated. Seventy samples of raw milk were analysed, 50 from bulk tanks, 10 from small tanks of milk from dairy farms, and 10 from transportation tanks and distributors that store and sell clandestine milk. No statistically significant difference was observed between medians of the quantity of colonies forming units of fungi/mL of milk from the different sources, indicating that the level of contamination by fungi was similar when the three sources were compared. Filamentous fungi and yeasts were isolated in different percentages from all the samples from the different sources: Candida spp. (C. krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. kefyr, etc.), Geotrichum spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., Aureobasidium sp., Penicillium spp., Acremonium spp., Chrysosporium sp., Mucor spp., Aspergillus spp. All isolates were submitted to pasteurization and boiling. Quick pasteurization was the procedure in which the highest resistance (72.18%) of the isolates was verified, followed by boiling (15.89%) and slow pasteurization (0.99%).

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-01-20T14:43:57Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Silva Araújo - 2014.pdf: 3446735 bytes, checksum: 4f2dc4a0223fe6a9d4d23c00cba6af45 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-20T14:44:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Silva Araújo - 2014.pdf: 3446735 bytes, checksum: 4f2dc4a0223fe6a9d4d23c00cba6af45 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-20T14:44:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Silva Araújo - 2014.pdf: 3446735 bytes, checksum: 4f2dc4a0223fe6a9d4d23c00cba6af45 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the important systemic mycosis in Latin America, with high incidence in Brazil, Argentina, Colombia and Venezuela. The disease has been attributed to the thermodimorphic fungus Paracoccidioides sp.. During the infective process, we can highlight the role of the cell wall, which is a dynamic structure, vital for growth, survival and morphogenesis of the fungus. In addition, this structure is constantly changing in response to environmental signals and different stages of the cycle of the fungus. The interest in the fungal cell wall occurs primarily by lack of this structure in mammalian cells; for this reason cell wall components are promising targets for antifungal drug design. In order to describe the profile of cell wall proteins (CWPs) of Paracoccidioides sp., it was used a proteomic approach coupling nanoscale liquid chromatography to multiplexed mass spectrometry (nanoUPLC-MSE) to identify the CWPs isolated from Paracoccidioides sp. yeast cells and mycelia. Among the identified proteins, it was found a transglycosylase orthologue to the Crh1p, which is a GPI anchored protein, known to be involved in attaching chitin to β-glucan. Adhesins previously described in Paracoccidioides sp. such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate, alcohol dehydrogenase, fructose-1,6-biphosphate aldose and some chaperones were also identified. Moreover, we identified formamidase that was previously described as localized in the fungus cell wall and may be involved in nitrogen metabolism besides contributing with antigenic properties. / Paracoccidioidomicose é uma importante micose sistêmica na América latina, com alta incidência no Brasil, Argentina, Colômbia e Venezuela. A doença é atribuída ao fungo termodimórfico Paracoccidioides spp.. Durante o processo infecioso podemos destacar o papel desempenhado pela parede celular, estrutura esta, vital para o crescimento, sobrevivência, e morfogênese do fungo, a qual está em constante mudança em resposta a sinais do ambiente. O interesse no estudo da parede celular de fungos ocorre principalmente pela ausência dessa estrutura nas células de mamíferos; por esse motivo os componentes da parede são alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas. Para descrever o perfil das proteínas constituintes da parede celular (PPCs) de Paracoccidioides sp. nas formas leveduriforme e miceliana, foi utilizada uma abordagem proteômica combinando cromatografia líquida em nanoescala com espectrometria de massas multiplexada (nanoUPLC-MSE). Entre as proteínas identificadas foi encontrada uma transglicosidase, homologa a Crh1p, correspondendo a uma proteína GPI ancorada, conhecida por estar envolvida em ligar quitina à β-glucana. Adesinas anteriormente descritas em Paracoccidioides sp. como enolase, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, álcool desidrogenase, frutose-1,6-bifosfato aldolase e algumas chaperonas também foram identificadas. Além disso, nós identificamos a formamidase que tem sido descrita como localizada na parede celular e pode estar envolvida no metabolismo de nitrogênio, além de contribuir com propriedades antigênicas.

Foram estudados a composição e o pH do meio de cultivo para a produção do fragmento de anticorpo (scFv) anti-LDL(-), expresso em Pichia pastoris recombinante. Os experimentos que definiram a composição e pH do meio assim como a concentração inicial de células na fase de indução foram realizados em agitador orbital a 250 rpm, com temperatura de 30 ºC na fase de crescimento e 20 ºC na fase de indução, durante 72 horas, com adição diária de 1% (v/v) de metanol. Para modificação do meio foi realizado um planejamento experimental empregando como variáveis independentes: extrato de soja, casaminoácidos e ureia, os quais substituíram o YNB e a biotina presentes no meio padrão (BMMY). Apesar de haver maior produção no meio com extrato de soja, o meio contendo 10 g.L-1 de casaminoácidos foi selecionado, uma vez que este favoreceu a etapa de purificação. A partir da faixa de pH estudada entre 3,0 e 8,0, determinou-se que o pH 8,0 no início da fase de indução favorece a maior produção. Finalmente, o meio BMMY-CA (pH 8,0) foi utilizado para cultivo em biorreator com volume de trabalho de 10L e a partir deste cultivo foram calculados os parâmetro cinéticos (velocidades de crescimento, de consumo de substrato e de produção, bem como produtividade). Diante do conjunto de experimentos realizados, foi possível otimizar a composição do meio de cultivo e as condições operacionais, que possibilitaram um aumento do rendimento bem como aumento do volume de produção do scFv anti-LDL(-) em biorreator. / Composition and pH culture medium for the production of anti- LDL(-) antibody fragment (scFv) were studied in recombinant yeast Pichia pastoris. The experiments that defined medium composition, pH and the initial cell concentration in the induction phase were carried out in baffled shaker flasks at 250 rpm, with temperature at 30°C for growth phase and 20°C for induction phase, during 72 hours with daily addition of 1% (v/v) methanol. A design of experiments employing for medium modification with independent variables: soy extract, casamino acids and urea, which replaced the YNB and biotin present in the standard medium (BMMY) was conducted for medium formulation. Even though, there was an increase in medium production with soy extract, the medium containing 10 g.L-1 casamino acids was selected since it favors the purification step. Through a pH range study (3.0 to 8.0), it was determined that pH 8.0 during induction phase offered higher levels. Then, the best results from shaker flask cultivation (BMMY-CA with casamino acids and pH 8.0) were carried out in 1L bioreactor, showing a biomass and a scFv production increase compared to the standard, BMMY (pH 6.0). Finally, the medium BMMY-CA (pH 8,0) was submitted to a volume scale-up into a 10L bioreactor, which was also used to evaluate kinetic parameters (rates of growth, substrate consumption and production as well as productivity). In conclusion, by optimizing culture medium and operating conditions it was possible to increase yield and scale-up the production of scFv anti-LDL(-) in bioreactor.

O câncer é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo. O envelhecimento da população mundial, especialmente nos países em desenvolvimento, indica que esse índice tende a aumentar a cada ano. Como o câncer é uma doença complexa, uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na carcinogênese e na resposta aos tratamentos atuais são essenciais para mudar esse cenário. Gemcitabina e rebecamicina são moléculas que apresentam atividade antitumoral, sendo que a primeira é usada como agente único no tratamento de adenocarcinoma pancreático, ou em conjunto com outras drogas em vários tipos de câncer, enquanto que alguns análogos da segunda já foram utilizados em testes clínicos de fase II em câncer de mama e pulmão. A gemcitabina é um análogo de desoxicitidina que interrompe a síntese de DNA, além de apresentar efeito inibitório sobre várias proteínas, como ribonucleotídeo redutase. A rebecamicina e vários de seus análogos são indolocarbazóis que incluem moléculas intercalantes de DNA, além de inibidores da topoisomerase I e de algumas proteína quinases, como PKC e Chk1. Alguns indolocarbazóis apresentam também importante atividade antimicrobiana. Os mecanismos de resistência a essas drogas são pouco conhecidos e alguns já foram sugeridos; porém, ainda não há consenso sobre as vias celulares envolvidas. A proposta desse trabalho foi identificar genes associados às respostas a gemcitabina e análogos de rebecamicina, usando Saccharomyces cerevisiae como modelo celular. Avaliamos a atividade biológica de nove análogos de rebecamicina sintéticos, destacando o composto mais promissor para estudos mais aprofundados. Por meio de análise direta de fenótipo em escala genômica, identificamos genes cuja deleção resulta em hipersensibilidade ao análogo de rebecamicina, dentre eles um sensor de estresse relacionado à via Pkc1/Mpk1 quinase (SLG1), uma lisina deacetilase (RPD3) e uma lisina demetilase (JHD2). Esses três genes estão relacionados a uma maior atividade de proteínas de resistência multidroga, sugerindo que diversas vias regulatórias são importantes na resposta a indolocarbazóis. Também verificamos, por análise quantitativa de fenótipo (ensaio Bar-Seq), que a deleção de genes com funções atualmente pouco relacionadas à gemcitabina conferiam maior sensibilidade a droga, como uma arginina metiltransferase (HMT1) e uma subunidade do complexo Cop9 sinalossomo (CSI1), o qual está relacionado a regulação da atividade de diversas proteínas, incluindo ribonucleotídeo redutase. Em conjunto, nossos resultados demonstram que vias ainda não relacionadas a resposta a esses compostos podem ser de grande contribuição para a compreensão dos mecanismos de resistência aos mesmos, auxiliando no desenvolvimento de novos tratamentos e fármacos. / Cancer is one of the main causes of death throughout the world. Population aging, especially in developing countries, points to an increase in cancer incidence over the coming years. As cancer is a complex disease, a better understanding of the mechanisms involved in carcinogenesis and in the current treatments is essential to change this scenario. Gemcitabine and rebeccamycin are molecules that present antitumoral activity. The first one is currently used as a single agent in pancreatic cancer treatment or in combination with other drugs in several types of cancer, while analogs of the second have been tested in phase II clinical trials in breast and lung cancers. Gemcitabine is a deoxycytidine analog that inhibits DNA synthesis, and also presents inhibitory effects over several proteins, such as ribonucleotide reductase. Rebeccamycin and its analogs are indolocarbazoles which include DNA intercalant molecules, as well as topoisomerase I and protein kinase inhibitors, such as PKC and Chk1. The mechanisms related to the resistance to these drugs are poorly understood and some of them have been suggested; even though, there is no consensus about the cellular pathways involved. The aim of this work was to identify genes associated to the response to gemcitabine and rebeccamycin analogs using Saccharomyces cerevisiae as a model cell. We evaluated the biological activity of nine synthetic rebeccamycin analogs, selecting the most promising compound for deeper studies. In a genome-wide qualitative phenotypic analysis, we have identified genes whose disruption resulted in hypersensitivity to the rebeccamycin analog. Among them, we found a stress-sensor involved in Pkc1/Mpk1 kinase pathway (SLG1), a lysine deacetylase (RPD3) and a lysine demethylase (JHD2). These three genes are related to an increased multidrug resistance activity, suggesting that several regulatory pathways play a role in the response to indolocarbazoles. We also found, by means of a quantitative phenotypic analysis (Bar-Seq assay), increased sensitivity to gemcitabine in null-mutants of genes whose functions are currently poorly related to the drug, like an arginine methyltransferase (HMT1) and a subunit of Cop9 signalosome complex (CSI1), which is related to activity regulation of several enzymes, including ribonucleotide reductase. Together, our results show that pathways which were previously unrelated to the response to these compounds can be useful for a better understanding of their resistance mechanisms, providing insights into new drug development and therapy.

Não consta resumo na publicação. / Abstract not available.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-01-10T11:33:17Z No. of bitstreams: 1 2016 - Fernanda Melo Pereira Taran.pdf: 1274160 bytes, checksum: 1abefb4abb6f8800458c7eb63d22a94c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-10T11:33:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Fernanda Melo Pereira Taran.pdf: 1274160 bytes, checksum: 1abefb4abb6f8800458c7eb63d22a94c (MD5) Previous issue date: 2016-01-06 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / This study aimed to evaluate the in vitro adsorption of fumonisin B1 (FB1) through the use of different strains and concentrations of Saccharomyces cerevisiae in conditions simulating the digestive tract of horses. The experimental design was completely randomized in a factorial 4x5 with four yeast strains (1, 2, 3 and 4) and five concentrations for each strain of 1x107, 5x107, 1x108, 5x108 and 1x109 CFU.mL-1 at pH 2 and 6.8 with three replicates per treatment. In vitro adsorption experiments were carried out in microcentrifuge tubes containing buffered solution mycotoxin and yeast at 39 ? C. The concentration of FB1 was 5 ?g.mL-1. The supernatant of samples containing fumonisin not adsorbed were analyzed and quantified by CLAE. The results of the in vitro adsorption were subjected to a regression analysis based on the S. cerevisiae concentration and yeast strains. It was observed at pH 2 and 6.8 a significant interaction between S. cerevisiae concentration and yeast strain (P <0.001). At pH 2, the the amount of FB1 adsorbed by different yeast strains did not differ with 1x107, 5x107, 1x108 CFU.mL-1, only showed effects for the highest concentrations of 5x108 and 1x109 CFU.mL-1 (P<0.001). At pH 6.8, the differences occurred to concentration of 1x108, 5x108 and 1x109 CFU.mL-1 (P<0.001), but had no effect on lower concentrations (5x107 and 1x107 celulas.mL-1). At the highest concentration of 1x109 CFU.mL-1, strain 4 (SC-47) demonstrated a greater capacity to adsorb FB1, 39.4% and 37.5% at pH 2.0 and 6.8, respectively. In addition, linear responses were observed in the adsorption capacity in all strains evaluated under conditions of acidic and neutral pH. The results demonstrate that the ability of S. cerevisiae to adsorb FB1 is strain-dependent and the pH value may influence the amount of FB1 removed from the solution according to the strain used / Avaliou-se a adsor??o in vitro de fumonisina B1 (FB1) atrav?s do uso de diferentes cepas e concentra??es de Saccharomyces cerevisiae em condi??es que simulam o trato digestivo de equinos. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 4x5, com quatro cepas de levedura (1, 2, 3 e 4) e cinco concentra??es para cada cepa de 1x107, 5x107, 1x108, 5x108 e 1x109 UFC.mL-1, sob pH 2 e 6,8 com tr?s repeti??es por tratamento. Os ensaios de adsor??o in vitro foram conduzidos em microtubos contendo solu??o tamponada de micotoxina e levedura a 39 ?C. A concentra??o de FB1 foi de 5 ?g.mL-1. As amostras do sobrenadante contendo as fumonisinas n?o adsorvidas foram analisadas e quantificadas por CLAE. Os resultados foram submetidos ? an?lise de regress?o em fun??o da concentra??o de levedura e cepas de levedura. Observou-se, tanto em pH 2 como a 6,8, intera??o significativa entre concentra??o de FB1 e cepa de levedura (P<0,001). No pH 2, as cepas de levedura n?o diferiram em rela??o a quantidade de FB1 adsorvida nas concentra??es de 1x107, 5x107, 1x108 UFC.mL-1, apenas apresentaram efeito significativo para as concentra??es mais elevadas de 5x108 e 1x109 UFC.mL-1 (P<0,001). Em pH 6,8, as diferen?as ocorreram para as concentra??es de 1x108, 5x108 e 1x109 UFC.mL-1 (P<0,001), n?o apresentando efeito significativo nas concentra??es mais baixas (1x107e 5x107 UFC.mL-1). Na concentra??o mais elevada de 1x109 UFC.mL-1, a cepa 4 (SC-47) demonstrou maior capacidade para adsorver FB1, 39,4% e 37,5% em pH 2,0 e 6,8, respectivamente. Al?m disso, foram observadas respostas lineares na capacidade de adsor??o em todas as cepas avaliadas sob condi??es de pH ?cido e neutro. Os resultados demonstram que a capacidade de adsor??o de FB1 pela S. cerevisiae ? cepa-dependente e que o valor de pH pode influenciar na quantidade de FB1 removida da solu??o de acordo a cepa utilizada.