Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T17:57:16Z No. of bitstreams: 1 Franklin Souza da Silva_Dissertação.pdf: 2017504 bytes, checksum: 0bb3de10c14f9cc14cda994594ad320a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T17:57:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franklin Souza da Silva_Dissertação.pdf: 2017504 bytes, checksum: 0bb3de10c14f9cc14cda994594ad320a (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Leishmania spp são modelos de parasitas intracelulares de macrófagos que apresentam uma série de peculiaridades adaptativas nesta fase do seu ciclo biológico. A nossa hipótese é que fragmentos peptídicos da região COOH-terminal das cisteínas proteinases B de Leishmania (Leishmania) amazonensis atuem como uma dessas peculiaridades, modulando a resposta imune do hospedeiro vertebrado. Nesse trabalho, propomos definir a região bioativa (fragmento peptídico indutor da resposta imune) de dois peptídeos descritos como imunomoduladores durante a infecção experimental por L. (L.) amazonensis. Utilizando o servidor online SYFPEITHI, a partir dos peptídeos P1 (VMVEQVICFD) e P6 (EFCLGGGLCL) foi possível triar sequências peptídicas (P6.1 FCLGGGLCL, P6.2 EFCLGGGLCL, P6.3 EFCLGGGL, P6.4 CLGGGLCL, P6.5 EFCLGGGLC, P6.6 FCLGGGLC, P1.7 VMVEQVICF, P1.8 VMVEQVICFD, P1.9 MVEQVICFD, P1.10 VEQVICFD) que apresentaram um potencial de ligação favorável (escore > 8) aos dímeros de H-2 (H-2Db, H-2Kd, H-2Kk e H-2Ld). Os epítopos preditos foram sintetizados quimicamente e utilizados em ensaios ex vivo e in vitro com as linhagens de camundongos C57BL/6 (H-2Db) e BALB/c (H-2Ld). Os ensaios de quantificação dos linfócitos T CD8+ com o dimeric, H2-Db:Ig e H2-Ld:Ig complexadas aos peptídeos previstos, indicaram a presença de clones deste tipo celular para todos os peptídeos previstos, exceto para o P6.5 na linhagem C57BL/6, nos linfonodos drenantes da infecção. A propriedade de induzir proliferação de linfócitos T CD8+ in vitro foi observada apenas para sete peptídeos previstos (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 P1.8 e P1.10) nos ensaios com BALB/c e apenas dois epítopos (P1.7 e P1.10) nos ensaios com C57BL/6. Adicionalmente foram realizados ensaios de interação entre o H2-Db:Ig e H2-Ld:Ig e os peptídeos sintéticos, em tempo real, pela técnica de ressonância plasmônica de superfície. Os peptídeos testados com H-2Db (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.7, P1.8 e P1.10) e H-2Lb (P6.2, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 e P1.8 e P1.9) indicaram valores de Ka (~ 10+1-10+3 M-1 s-1) e de Kd ( ∼ 10-4 s-1 - 10-6 s-1) favoráveis para formar complexos com os dímeros H-2Db e H-2Lb em pH neutro. Os valores de G < 0 destes complexos (em ambos os haplotipos), sugeriram que os mesmos existam durante a resposta imune acarretada pela infecção por L. (L.) amazonensis em camundongos. / Leishmania spp are models of intracellular macrophage parasites that show several adaptive peculiarities during that particular phase of the biological cycle. We hypothesized that peptide fragments from the COOH-terminal region of a cysteine proteinase B from Leishmania (Leishmania) amazonensis act in such peculiar way by modulating the immune response of vertebrate hosts. The aim of this work is the determination of the bioactive region (peptide fragment inducer of immune response) of two peptides described as immunomodulating during experimental infection by L. (L.) amazonensis. Using the online server Syfpeithi for P1(VMVEQVICFD) and P6(EFCLGGGLCL) peptides, we selected short sequences (P6.1 FCLGGGLCL, P6.2 EFCLGGGLCL, P6.3 EFCLGGGL, P6.4 CLGGGLCL, P6.5 EFCLGGGLC, P6.6 FCLGGGLC, P1.7 VMVEQVICF, P1.8 VMVEQVICFD, P1.9 MVEQVICFD, P1.10 VEQVICFD) with favorable binding potential (score > 8) to H-2 dimmers (H-2Db, H-2Kd, H-2Kk and H-2Ld). The predicted epitopes were chemically synthesized and used for ex vivo and in vitro assays with isogenic mice C57BL6 (H-2Db) and BALB/C (H-2Ld). We have also performed a quantification assay of CD8+ T lymphocytes in draining lymph node from lesion. In this assay, we used dimeric, H2-Db:Ig and H2-Ld:Ig, complexed to predicted peptides. The results indicated the presence of CD8+ T lymphocytes clones, for all tested peptides, excep for P6.5 in C57BL/6 mice. The capacity to induce CD8+ T lymphocytes blastogenesis, in vitro, was only observed for seven predicted peptides (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 P1.8 and P1.10) in the assay with BALB/c mice cells and only for two peptides (P1.7 and P1.10) in C57BL/6 mice cell assay. Additionally, we performed a binding assay between H2-Db:Ig and H2-Ld:Ig and the synthetic peptides, in real time, by surface plasmon resonance. The peptides tested with H-2Db (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.7, P1.8 and P1.10) and H-2Lb (P6.2, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.8 and P1.9) indicated values of Ka (~ 10+1-10+3 M-1 s-1) and Kd (∼ 10-4 s-1 - 10-6 s-1 ) favorable to form complexes with H-2Db e H-2Lb dimmers at neutral pH. The G < 0 values of these complexes (for both haplotypes), suggest that they can exist during the immune response caused by L. (L.) amazonensis infection in mice.

Glioblastoma multiforme (GBM) é o mais comum e mais maligno tumor cerebral. O péssimo prognóstico é parcialmente devido à baixa biodisponibilidade dos quimioterápicos no tecido tumoral, recorrência originada por células precursoras resistentes ao tratamento e um sistema imune comprometido. De fato, linfócitos regulatórios modulam o sistema imune para uma resposta pró-tumoral, tornando ainda mais difícil o tratamento. Nesse contexto, nanocápsulas lipídicas (LNCs) têm sido amplamente estudadas a fim de aumentar especificidade dos fármacos ao tecido tumoral. Metotrexato (MTX) e trans-resveratrol (RSV) possuem ação antitumoral já descrita, mas necessitam doses relativamente altas para ação anti-glioblastoma in vivo. O MTX também possui ação imunossupressora através do aumento de adenosina no meio extracelular. A Adenosina, por sua vez, pode modular tanto células efetoras quanto células regulatórias no microambiente tumoral. Dessa forma, a hipótese apresentada nessa tese é que o RSV e o MTX possam ser mais eficazes quando carreados por nanocápsulas em modelos de GBM. Além disso, buscamos avaliar se o MTX poderia interferir com enzimas do sistema purinérgico. Por fim, pesquisamos como a adenosina poderia modular linfócitos B e T através das enzimas CD39 e ecto-5’-NT/CD73. O RSV em nanocápsulas e o MTX em nanocápsulas (RSV-LNCs e MTX-LNCs) aumentaram a atividade anti-tumoral em relação aos compostos em solução, induzindo parada no ciclo celular e apoptose em células de GBM. O MTX diminuiu a expressão da proteína antiapoptótica BCL-2 e aumentou a caspase-3 ativa, levando as células de GBM à apoptose. Além disso, o MTX aumentou a expressão da enzima ecto-5’-NT/CD73 tanto em células de glioma quanto em linfócitos T presentes no microambiente dos gliomas. Esse aumento da expressão foi acompanhado da diminuição em linfócitos T efetores e T regulatórios. Também, demonstramos que linfócitos B que possuem alta expressão da enzima CD39, tem capacidade supressiva sobre linfócitos efetores. Em conjunto, os resultados apresentados nessa Tese apresentaram possíveis novas alternativas de tratamento e contribuíram para melhor compreender esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most malignant brain tumor. The awful prognosis is in part due to the low bioavailability of chemotherapy agents in the tumoral tissue, recurrence originated from treatment-resistant progenitor cells and an impaired immune system. Indeed, regulatory lymphocytes modulate the immune system toward a pro-tumoral response, turning the treatment even more difficult. In this sense, lipid-core nanocapsules (LNCs) have been widely studied to raise the drug specificity to the tumor. Methotrexate (MTX) and trans-resveratrol (RSV) have antitumoral activity, but need relatively high doses to the anti-glioblastoma outcome in vivo. MTX has immunosuppressive capability mediated by the increase of adenosine in the extracellular milieu. Adenosine in turn may modulate both effector and regulatory immune cells in the tumoral microenvironment. Thereby, the hypothesis presented is that RSV and MTX may have an antitumor improvement when loaded into LNCs in GBM models. Moreover, we sought to evaluate whether MTX could interfere with purinergic enzymes. Lastly, we evaluated how adenosine could modulate B- and T-lymphocytes through CD39 and ecto-5’NT enzymes. RSV- and MTX-loaded lipid-core nanocapsules (RSV-LNCs or MTX-LNCs) increased their antitumoral outcome in relation to the solution compounds, inducing both cell cycle arrest and apoptosis in GBM cells. MTX decreased the expression of the antiapoptotic protein BCL-2 and increased the active caspase-3, triggering glioblastoma cells to apoptosis. Furthermore, MTX increased the expression of ecto-5’-NT/CD73 in glioma cells and T lymphocytes of the glioma microenvironment. This up-regulation was followed by decreasing in T effector and T regulatory lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Taken together, the results presented herein indicate newfound treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

Introdução: O fator de transcrição FOXP3 está aumentado em pacientes com rejeição aguda do transplante renal, mas a sua influência na função e sobrevida do enxerto ainda não é clara. O objetivo deste estudo foi correlacionar a expressão gênica e protéica de FOXP3 com os desfechos do enxerto renal, e avaliar a sua associação com células apresentadoras do antígeno em biópsias do enxerto renal. Métodos: Foram avaliados 91 receptores de transplante renal submetidos à biópsia do enxerto por disfunção aguda ou crônica, classificados pela histologia de Banff. O RNAm de FOXP3 foi analisado por PCR em tempo real, e a proteína de FOXP3 e as células dendríticas CD83+ (CDs) por imuno-histoquímica. Todas as análises foram feitas em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina. A magnitude de expressão de FOXP3 foi estabelecida por curva ROC. A função e a sobrevida do enxerto em 5 anos pós-transplante foram avaliados, assim como fatores preditores de perda do enxerto. Resultados: A correlação da expressão intra-enxerto do gene e da proteína de FOXP3 foi positiva e significativa (r=0.541, p<0.001). Tanto o RNAm quanto a proteína de FOXP3 estavam aumentados em pacientes com rejeição aguda (RA), em comparação com aqueles sem rejeição (SR) (p=0,039 e p<0,001, respectivamente) ou fibrose intersticial/atrofia tubular (FI/AT) (p=0,035 e p=0,034, respectivamente). Níveis elevados do RNAm de FOXP3 (≥ 2,36 log10 RNAm) ou da proteína (≥ 2,5 células FOXP3+/mm2) não se correlacionaram com variáveis demográficas ou do transplante, mas pacientes com FOXP3 RNAm elevado tiveram maiores taxas de filtração glomerular estimada (TFGe) e uma tendência de variação positiva da TFG ao final do seguimento. O número de CDs CD83+ tendeu a ser maior nas biópsias com FI/AT em comparação com SR (p=0,065), mas não na RA. Pacientes com alta expressão de FOXP3 apresentaram maior número de CDs CD83+ na biópsia: 0,86 (0,25-4,0) vs. 0,44 (0-1,12) células/mm2, p=0,032. A sobrevida cumulativa do enxerto em 5 anos não foi influenciada pela expressão do RNAm de FOXP3 (p = 0,69, log-rank test). Na análise de regressão Cox, RNAm e proteína de FOXP3 não foram preditores independentes da perda do enxerto, somente maior TFGe foi fator protetor contra perda do enxerto. Conclusões: Este estudo mostra que a análise molecular de FOXP3 em tecido parafinado do enxerto renal é possível, uma vez que o RNAm e proteína correlacionaram-se positiva e significativamente. Como esperado, houve uma expressão aumentada de FOXP3 em biópsias com RA. Bióspias com alta expressão de FOX3 tiveram maior densidade de células dendríticas. Nesta coorte, o FOXP3 não foi associado à melhor função ou sobrevida do enxerto renal. / Background. The transcription factor FOXP3 is increased in acute rejection in renal transplant recipients, but its influence in graft function and survival is not clear yet. The aim of this study was to correlate FOXP3 gene and protein expression with graft outcomes, and to evaluate its association with antigen presenting cells in kidney graft biopsies. Methods. We assessed 91 kidney transplant recipients undergoing allograft biopsy for acute or chronic dysfunction, classified by Banff histology. FOXP3 mRNA was analyzed by real-time PCR, and FOXP3 protein and dendritic cells (CD83+ DCs) by immunohistochemistry. All analyzes were done in formalinfixed, paraffin-embedded tissue. The magnitude of FOXP3 expression was established by the receiver operating characteristics (ROC) curve. Graft function and survival at 5 years post transplantation were assessed, as well as independent predictors of graft loss. Results. Intra-graft FOXP3 gene and protein expression were significantly correlated (r=0.541, p<0.001). Both FOXP3 mRNA and protein were increased in patients with acute rejection (AR) as compared to those with no rejection (NR) (p=0.039 and p<0.001, respectively) or interstitial fibrosis/tubular atrophy (IF/TA) (p=0.035 and p=0.034, respectively). FOXP3-RNAmhigh (≥ 2.36 log10RNAm ) or FOXP3-proteinhigh (≥ 2.5 FOXP3+ cells/mm2) did not correlate with demographic or transplant variables, but patients with FOXP3-RNAmhigh had higher glomerular filtration rates (GFR) and tended to have a positive delta of GFR at last follow up. CD83+ DCs tended to be increased in biopsies with IF/TA as compared to NR (p=0.065), but were not associated to AR. Patients with FOXP3-RNAmhigh had more CD83+ DCs on biopsy: 0.86 (0.25-4.0) vs. 0.44 (0-1.12) cells/mm2, p=0.032. The cumulative 5-year graft survival of these renal allografts was not influenced by FOXP3 mRNA expression (p=0.69, log-rank test). Neither FOXP3 mRNA or protein were predictors of graft survival, only higher eGFR at biopsy was a protective factor against graft loss. Conclusions: This study gives support for performing FOXP3 molecular analysis in archival tissue of renal graft biopsies, where FOXP3 mRNA and protein had a good correlation. As expected, there was an increased FOXP3 expression in biopsies with AR, and biopsies with FOXP3-RNAmhigh associated with greater number of dendritic cells. In this cohort, FOXP3 was not associated with better renal graft outcomes.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O linfoma de Hodgkin classico (LHc) e a neoplasia linfoide mais comum em adultos jovens. Trata-se de doenca curavel em 75% dos casos, porem 25% dos pacientes vao apresentar doenca refrataria ou recidivada com pior evolucao. Diferente de todas as neoplasias humanas, as celulas malignas do LHc, denominadas Reed-Sternberg (RS), compoe 1 a 5% de toda a massa tumoral, sendo o restante composto por celulas inflamatorias normais. As celulas de RS perpetuam-se em meio a este microambiente devido a incapacidade do sistema imune em reconhece-las e combate-las. Linfocitos T reguladores (LTR) sao moduladores importantes do microambiente em doencas linfoproliferativas e tem a capacidade de limitar a funcao dos linfocitos T efetores (LTE). Ja foi descrito que, no microambiente tumoral, os LTR estao aumentados e os LTE diminuidos. Mas o comportamento destas celulas no sangue periferico de pacientes com neoplasias ainda nao esta bem explicado. Portanto, compreender qual o papel do desequilibrio imunologico no LHc e crucial para o desenvolvimento de novos fatores prognosticos e alvos terapeuticos. Objetivos: Quantificar os LTR e LTE no sangue periferico e microambiente de pacientes com LHc. Correlacionar a presenca dos LTR e LTE no microambiente tumoral com o sangue periferico. Correlacionar a presenca do EBV nas celulas RS com a quantificacao destas subpopulacoes de linfocitos T. Avaliar a importancia da presenca do EBV, dos LTR e LTE na resposta ao tratamento dos pacientes com LHc. Avaliar o impacto do tratamento na quantificacao de linfocitos T reguladores e TH17 de pacientes com LHc. Casuistica e Metodo: Foram recrutados para este estudo, prospectivamente, 60 pacientes diagnosticados com LHc entre marco de 2009 e marco de 2013 em dois servicos de Hematologia distintos da cidade de São Paulo. Foram incluidos, tambem, 19 controles saudaveis recrutados no banco de sangue do Hemocentro da UNIFESP apos serem aprovados para doacao. A quantificacao de LTR e LTE foi avaliada por citometria de fluxo utilizando os anticorpos CD3, CD4, CD25, FOXP3, GITR e IL17 e por imunoistoquimica utilizando o anticorpo FOXP3. Resultados: A quantificacao de celulas T CD4+FOXP3+ e CD4+GITR+ foi maior em pacientes que nos controles (36,92 u 23,5%; p=0,009 e 39,63 - 14,3%; p<0,0001 respectivamente). O tratamento do LHc reduz a quantificacao de linfocitos T CD4+GITR+ (19,44 - 16,8%; p=0,036). A contagem de linfocitos T CD4+FOXP3+, CD4+CD25highFOXP3+ e CD4+IL17+ e maior nos pacientes que nos controles (32,1 u 24,24%; p=0,009, 31,28 u 21,79%; p=0,037, 32,9 - 18,71%; p=0,002 e 33,00 u 18,53; p=0,001, respectivamente). Os pacientes com sintomas B apresentaram quantificacao de linfocitos CD4+FOXP3+ no microambiente maior (p=0,032). Conclusoes: Houve correlacao positiva e significante entre a quantificacao de LTR circulante e no microambiente e o estadiamento avancado da doenca e entre a quantificacao de LTR e LTE circulantes nos pacientes e nos controles. Nao houve correlacao da quantificacao de LTR e LTE no sangue periferico ou no microambiente com a presenca do virus EBV nas celulas de RS ou entre a quantificacao de LTR e LTE em sangue periferico e a quantificacao de LTR no microambiente tumoral dos pacientes estudados. O tratamento quimio e radioterapico diminuiu a quantificacao de LTR e LTE circulantes. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-10-31 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Evidências indicam que tumores necessitam constante influxo de células mielo- monocíticas para sustentar seu comportamento maligno. Esse fato é devido a fatores derivados do tumor, os quais recrutam e induzem diferenciação funcional de células mielo-monocíticas, das quais a maioria são macrófagos. Embora os precursores clássicos de macrófagos sejam linhagens mielóides, linhagens linfóides como células B-1, subtipo de linfócitos B encontrados predominantemente nas cavidades pleural e peritoneal são também capazes de migrar para focos inflamatórios e se diferenciar em fagócitos mononucleares apresentando fenótipo semelhante ao dos macrófagos. No presente trabalho foi avaliada a interação entre células B16 de melanoma murino e células B-1 durante o co-cultivo e se esta interação influencia ativação de vias de transdução de sinal envolvidas com progressão e metástases. Utilizando sistema de co-cultura in vitro, foi mostrado que células B16 e células B-1 interagem fisicamente após 48 horas de co-cultura. Além disso, esta interação resulta em aumento da expressão de genes associados com metástases como MMP-9 e CXCR4 nas células B16 que favorecem o aumento na capacidade metastática destas células, como revelado por ensaios experimentais de metástases in vivo. Este trabalho também revela evidências de que células B16 apresentam marcado aumento na fosforilação da quinase regulada por sinais extracelulares (ERK) após contato com células B-1. A inibição da fosforilação de ERK com inibidor farmacológico da quinase ascendente de ERK, MEK1/2, suprime fortemente a expressão de MMP-9 e CXCR4 e inibe o aumento da capacidade metastática das células B16 induzido por contato com xxi células B-1. Adicionalmente, níveis constitutivos de ERK fosforilado nas células B- 1 são necessários para que estas células sejam capazes de induzir aumento no potencial metastático das células B16. Nossos resultados em conjunto mostram que células B-1 podem contribuir na aquisição de um fenótipo mais agressivo das células tumorais. / Increasing evidence indicates that tumors require a constant influx of myelomonocytic cells to support their malignant behavior. This is caused by tumor- derived factors, which recruit and induce functional differentiation of myelomonocytic cells, most of which are macrophages. Although myeloid lineages are the classical precursors of macrophages, B lymphoid lineages such as B-1 cells, a subset of B lymphocytes found predominantly in pleural and peritoneal cavities, are also able to migrate to inflammatory sites and differentiate into mononuclear phagocytes exhibiting macrophage-like phenotype. Here we examined the interplay of B-1 cells and tumor cells and checked whether this interaction provides signals to influence melanoma cells metastases. Using in vitro coculture experiments we showed that B16, a murine melanoma cell line, and B-1 cells physically interact. Moreover, interaction of B16 with B-1 cells leads to upregulation of metastasis-related genes expression (MMP-9 and CXCR-4), increasing its metastatic potential, as revealed by experimental metastases assays in vivo. We also provide evidences that B16 cells exhibit markedly upregulated phosphorylation of the extracellular signalregulated kinase (ERK) when co-cultured with B-1 cells. Inhibition of ERK phosphorylation induced by B-1 cells with an inhibitor of MEK1/2 strongly suppressed the induction of MMP-9 and CXCR-4 mRNA expression and impaired the increased metastatic behavior of B16. In addition, constitutive levels of ERK1/2 phosphorylation in B-1 cells are necessary for their commitment to affect the metastatic potential of B16 cells. Our findings show for the first time, that B-1 80 lymphocytes can contribute to tumor cell properties required for invasiveness during metastatic spread. / FAPESP: 03/05176-8 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-08-03T18:29:13Z No. of bitstreams: 1 Raimundo Coutinho Junior. Reatividade de Linfócitos T de indivíduos infectados pelo HIV-1 contra epitopos GAG e NEF de diferentes subtipos HIV-1. Dissertação Mestrado - CPqGM - 2008.pdf: 883674 bytes, checksum: e99dbac32085a623e129289408e7f7d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-03T18:29:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raimundo Coutinho Junior. Reatividade de Linfócitos T de indivíduos infectados pelo HIV-1 contra epitopos GAG e NEF de diferentes subtipos HIV-1. Dissertação Mestrado - CPqGM - 2008.pdf: 883674 bytes, checksum: e99dbac32085a623e129289408e7f7d6 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O Vírus da imunodeficiência humana é o agente causador da AIDS. Apesar de existir tratamento para a infecção do HIV-1, este não leva a cura dos pacientes. A identificação de epitopos de proteínas virais do HIV-1 reconhecidos por linfócitos T pode ser eficiente para o desenvolvimento de uma vacina. Neste trabalho foi avaliado o padrão da resposta imune de indivíduos infectados pelo HIV -1 frente às proteínas GAG e NEF de diferentes subtipos do HIV-1. Foi utilizado PBMC de pacientes infectados pelo HIV-1 sob o uso de terapia antiretroviral. Foram utilizados 23 pools de peptídeos do HIV-1 na concentração de 2μg/mL derivados dos subtipos brasileiros BBR, C, F e do isolado de referencia B (HXB2), em ensaio de ELISPOT. Todos os pacientes responderam a pelo menos um dos pools de peptídeos. Destes, 41% responderam para os pools de proteínas do isolado HXB2 e 49% para os pools de proteínas do subtipo brasileiro BBR, C e F. Isoladamente, as maiores freqüências de respondedores foram para os pools de proteínas do isolado HXB2 NEF 3 (68%) e HXB2 NEF 2 (63%). Da mesma forma, os pools de peptídeos das seqüências brasileiras BBR, C e F que apresentaram as maiores freqüências de respondedores foram NEF F (87%), NEF C (62%), GAG F1 (62%). A magnitude da resposta foi em média de 2174 SFCX106 PBMC para os pools do isolado HXB2 e de 1331 SFCX106 PBMC para os pools dos subtipos brasileiros. O pool que apresentou a maior magnitude da resposta foi GAG p24-1 do isolado HXB2 com 3290 SFCX106 PBMC. Estes resultados demonstram que os pacientes infectados pelo HIV-1 respondem aos pools de peptídeos das proteínas GAG e NEF do isolado HXB2 e dos subtipos brasileiros BBR, C e F. / The human immunodeficiency virus is the etiological agent of AIDS. The antiretroviral treatment is efficient, however the cure is not reach. The identification of T cell epitopes from HIV-1 proteins could be an efficient approach for development of an HIV-1 vaccine. In this work, we evaluated the immune responses of HIV-1 infected individuals to GAG and NEF HIV-1 proteins from different virus subtypes. Pools of peptides of proteins from Brazilians HIV-1 subtypes BBR, C, F sequences and from HIV-1 subtype B isolate (HXB2) were tested by ELISPOT assay. All tested pools were recognized. PBMC of 41% of patients recognized subtype HXB2 pools and 49% recognized the pools from Brazilians subtypes. The most frequently recognized pools were NEF3 (68%) and NEF2 (63%) from HXB2 isolated. The most frequently recognized pool from Brazilians subtypes were NEF F (87%), NEF C (62%), GAG F1 (62%). On average, the magnitude of responses to HXB2 isolate pools were 2174 SFCX106 PBMC and 1331 SFCX106 PBMC for Brazilians pools. The highest magnitude of response was directed to GAG p24-1 from HXB2 subtype with 3290 SFCX106 PBMC. These results indicated that peptides from NEF and GAG proteins from HXB2 isolated or Brazilians subtypes BBR, C and F sequences are recognized by HIV-1 infected patients and may have the potential for inclusion in a vaccine against HIV-1.

Made available in DSpace on 2016-04-15T12:58:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 jesuito_dantas_ioc_mest_2015.pdf: 8011040 bytes, checksum: c494775b2a194ca3921d445d202df24a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os pacientes infectados pelo vírus HIV apresentam alta frequência de dermatoses, sendo essas a primeira (sinal precoce) e, às vezes, a única manifestação do estágio da doença. Para tanto, torna-se imprescindível conhecer a distribuição dessas doenças cutâneas nos pacientes acometidos pelo HIV/AIDS no Instituto de Doenças Tropicais Natan Portella \2013 IDTNP, considerado hospital de referência para o tratamento do HIV no Estado do Piauí. O objetivo deste trabalho foi, portanto, identificar as dermatoses que afetam os pacientes com HIV/AIDS no IDTNP, segundo o grau de imunossupressão por eles apresentado, e correlacioná-las com variáveis clínicas e epidemiológicas. O estudo foi descritivo do tipo relato de série de casos. Foram analisados 151 pacientes com HIV/AIDS, atendidos no IDTNP no período de janeiro a abril de 2015. As doenças cutâneas foram caracterizadas, do ponto de vista clínico-epidemiológico, em sete grupos: I) fúngicas; II) virais; III) bacterianas; IV) por protozoários; V) por artrópodes; VI) neoplasias cutâneas; e VII) miscelânea, assim entendidas aquelas não enquadradas nas categorias anteriores. Para o diagnóstico das dermatoses, foram utilizados exames clínicos e laboratoriais, dos quais se podem destacar: micológico direto, cultura de bactérias e fungos, estudo anatomopatológico, contagem de linfócitos CD4, carga viral etc. Constatou-se que, entre os pacientes, a maioria eram homens (n=110 72,8%). A média de idade dos homens (40,9 ± 11,9 anos) foi ligeiramente inferior à das mulheres (41,4 ± 10,2 anos). Entre os homens, 31% declararam manter relações sexuais com homens. O grau de instrução predominante foi o Ensino Fundamental. Cerca de um quarto dos pacientes atendidos não residia no Piauí Entre estes, predominaram pacientes do estado do Maranhão (22,5%) e, entre os municípios, da cidade de Teresina/PI (58,3%). Foram frequentes os estágios avançados da infecção pelo HIV. As médias de contagem de linfócitos CD4 foram 272,6 ± 271,1 entre os homens e 338,9 ± 351 entre as mulheres. De acordo com a categoria etiológica, 93 (61,6%) tinham afecções do grupo miscelânea, 50 (33,1%) tinham infecções cutâneas de etiologia fúngica, 40 (26,4%) tinham infecções bacterianas, 35 (23,2%) apresentavam dermatoses virais, 16 (10,6%) dos pacientes tinham dermatoses neoplásicas, 5 (3,3%) tinham doenças causadas por artrópodes e 4 (2,6%) doenças causadas por protozoários. As dermatoses prevalentes nos pacientes observados foram prurigo do HIV com 35 pacientes acometidos, seguida de onicomicose (n=28), dermatite seborréica (n=18), hanseníase (n=17), herpes simples (n=14), candidose oral (n=12) e farmacodermia (n=10). Os grupos de dermatoses neoplásicas e virais foram mais comumente vistos em casos avançados de imunossupressão. Esta tendência não foi observada em pacientes com dermatoses bacterianas ou fúngicas. Observaram-se médias de contagem de CD4 inferiores e cargas virais superiores no grupo de pacientes com sarcoma de Kaposi e prurigo do HIV quando comparados com os pacientes com sífilis e hanseníase A candidose oral foi a patologia isolada que mais suscitou o médico a pedir o teste diagnóstico de infecção pelo HIV nos pacientes que ainda desconheciam seu estado sorológico e o sarcoma de Kaposi a patologia que mostrou maior correlação inversa entre número de linfócitos CD4 e superfície corpórea atingida. Percebeu-se uma média de número de dermatoses por pacientes superior nos pacientes com contagem de linfócitos CD4 inferior. Pretendeu-se com este estudo contribuir para o conhecimento sobre as doenças cutâneas encontradas nos pacientes com HIV/AIDS e propor uma melhor atenção a esses pacientes, por meio sobretudo de uma visão holística/interdisciplinar da doença / Abstract: Patients infected with HIV often have skin diseases such as dermathosis, this being the first (early sign) and sometimes the only manifestation of the disease. To this end, it is essential to know the distribution of these skin diseases in patients affected by HIV / AIDS at the Instituto de Doenças Tropicais Natan Portella - IDTNP, considered a reference whe it comes to hospitals for the treatment of HIV in the state of Piaui, Brazil. The objective of this study was therefore to identify the skin diseases that affect patients with HIV / AIDS in IDTNP according to the degree of immunosuppression they presented, and correlate them with clinical and epidemiological variables. The study was descriptive of the kind reported case series. This study analyzed 151 patients with HIV / AIDS who were attended at IDTNP from January to April 2015. Skin diseases have been characterized, from a clinical and epidemiological point of view, into seven groups: I) yeast; II) virus; III) bacterial; IV) by protozoa; V) by arthropods; VI) skin cancer; and VII) miscellany, understood those not falling into the above categories. For the diagnosis of skin diseases, they used clinical and laboratory tests, of which the following stand out: mycological, culture of bacteria and fungi, pathological studies, CD4 count, viral load, etc. It was found that, among patients, most were men (n = 110 72.8%). The average age of men (40.9 ± 11.9 years) was slightly lower than that of women (41.4 ± 10.2 years). Among men, 31% reported having sex with men. The predominant degree of education was elementary school. About a quarter of the patients seen were not resident in Piauí. Among these, the predominant patients were from the State of Maranhão (22.5%) and among the municipalities, the city of Teresina / PI (58.3%) It was quite frequente cases of advanced stages of HIV infection. The average CD4 count was 272.6 ± 271.1 for men and 338.9 ± 351 among women. According to etiological category 93 (61.6%) were miscellaneous group of diseases, 50 (33.1%) had skin infections fungal etiology, 40 (26.4%) had bacterial infections, 35 (23.2 %) had viral dermatoses, 16 (10.6%) patients who had neoplastic dermatoses 5 (3.3%), diseases caused by arthropod and 4 (2.6%) protozoal diseases. The prevalent dermatoses in patients observed were prurigo HIV with 35 patients affected, followed by onychomycosis (n = 28), seborrheic dermatitis (n = 18), leprosy (n = 17), herpes simplex (n = 14), oral candidiasis (n = 12) and adverse drug (n = 10). The groups of neoplastic and viral dermatoses are commonly seen in advanced cases of immunosuppression. This trend was observed in patients with bacterial or fungal skin diseases They observed mean CD4 count and viral load higher in patients with Kaposi's sarcoma and prurigo HIV compared with patients with syphilis and leprosy. Oral candidiasis was isolated pathology that most provoked the doctor to ask for the diagnosis of HIV infection in the patients still unaware of their HIV status and Kaposi's sarcoma pathology which showed higher inverse correlation between the number of CD4 lymphocytes and affected body surface. It was realized an average number of dermatoses per patient higher in patients with lower CD4 lymphocyte count. It was intended with this study contribute to knowledge about skin diseases found in patients with HIV / AIDS and offer better care to these patients, especially through a holistic / interdisciplinary view of the disease

Made available in DSpace on 2016-04-27T12:29:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 monica_chino_ioc_mest_2015.pdf: 4396839 bytes, checksum: 5ab00e786722dcd7034e91ef02840bd9 (MD5) 1_monica_chino_ioc_mest_2015.pdf: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A febre maculosa (Fm) é um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo, apresentando a bactéria Gram- negativa, Rickettsia ricketsii, como seu agente etiológico e transmitida pelo carrapato. Esse patógeno possui em sua superfície um conjunto de proteínas de membranas externas (OMP), sendo a OMP-A, um dos antígenos imunodominantes e exclusiva do grupo da Fm. Portanto, devido a inexistência de testes sorológicos sensíveis e específicos para o diagnóstico da Fm tivemos como objetivo mapear imunologicamente a OMP H6PGA4 usando uma biblioteca de peptídeos e soro de pacientes e cães com a doença e desenvolver testes diagnosticos mais específicos. Uma biblioteca de 84 peptideos com 15 residuos de comprimento cobrindo a extensão de 429 aminoácidos da proteína H6PGA4 e contendo sequências sobrepostas de nove aminoácidos foram sintetizadas pela técnica F-moc. Os peptídeos foram ligados quimicamente a uma membrana celulósica e feitos reagir independentemente com um \201Cpool\201D de soro de pacientes com febre maculosa (SP-Fm) e de soro de cães com febre maculosa (SC-Fm). Oito epitopos IgG foram identificados pelo soro de pacientes e três epitopos IgG pelo SC-Fm Todos os peptídeos foram análisados individualmente por ELISA-peptideo contra um painel de SP-Fm e SC-Fm. A análise realizada através da curva ROC indicou que os peptídeos E4 e E5 foram os mais imunogênicos com SP-Fm (especificidade de 90% e sensibilidade de 94%). Diferentemente os peptídeos E7 e E9 foram os que apresentaram especificidade e sensibilidade (p<0,05) acima de 90% e 94% com SC-Fm, repectivamente. Alternativamente, foi desenvolvido um imunosensor para diagnóstico da doença humana, baseado no peptídeo OMP3 e análise por voltametria cíclica. A acurácia foi demonstrada pela análise de 20 ciclos de varredura e a especificidade contra soros de indivíduos saudáveis. O chip imunosensor-peptideo foi reprodutível com um coeficiente de variação \226410,1% para SP-Fm. A sensibilidade de diluição do soro foi de até 1: 100 / Rocky Mountain spotted fever (Fm) is a serious public health problem in Brazil and in the world, presenting the Gram- negative bacteria, Rickettsia ricketsii, as its etiologic agent and transmitted by the bite of an infected tick. This pathogen has on its surface a set of outer membrane proteins (OMP), being the OMP-A one of the immunodominant and exclusive antigen of the Fm group. Therefore, due to the lack of sensitivity and specificity of the serologic tests for the diagnosis of Fm our objective was to map the immunologically OMP H6PGA4_ RICRI using a peptide library and serum of patients and dogs with the disease and develop more specific diagnostic tests. A library of 84 peptides with 15 residues in length covering the extension of 429 amino acids of the H6PGA4 protein and containing overlapping sequences of nine amino acids were synthesized by F-moc technique. The peptides were chemically bound to a cellulose membrane and reacted independently with serum from patients (n=5) with spotted fever (SP-Fm) and serum from dogs (n=5) with spotted fever (SC-Fm). Eight IgG epitopes were identified by the SP-Fm and three by the SC-Fm. All peptides were individually analyzed by ELISA-peptide using a panel of SP-Fm and SC-Fm The analysis of ROC curve indicated that the E4 and E5 peptides were the most immunogenic with a specificity of 90% and sensitivity of 94% for the SP-Fm. Unlike the E7 and E9 peptides were the most reactive for SC-Fm with a specificity of 90% and sensitivity of 94% (p <0.05). Alternatively, it was developed a cyclic voltametry E3 based immunesensor for the diagnosis of the human disease. The accuracy was demonstrated by the analysis of 20 cycles of scanning and the specificity against sera of healthy individuals. The peptide-imunosensor chip was reproducible with a coefficient of variation \2264 10,1% for SP-Fm. The sensitivity of serum dilution was 1: 100 / 2100-12-31

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:55:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 larissa_fontes_ioc_mest_2016.pdf: 4617034 bytes, checksum: eee0cf93cb18ec86d4b978b114c27212 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS \2013 \201CWiskott-Aldrich Syndrome\201D) é uma imunodeficiência primária associada a infecções recorrentes e ao desenvolvimento de doenças autoimunes e linfomas. Essa imunodeficiência se desenvolve em consequência de mutações no gene que codifica a proteína WASP (\201CWAS Protein\201D), expressa em células hematopoiéticas, e com funções reguladoras sobre os rearranjos do citoesqueleto de actina e na ativação de linfócitos T. Nesse sentido, camundongos deficientes em Wasp (Wasp \201Cknockout\201D \2013 WKO) apresentam desregulação de processos centrais para a resposta imunológica, resultando em migração leucocitária aberrante, proliferação linfocitária deficiente, e disfunção de células T reguladoras (Treg). De forma interessante, foi demonstrado que as células Treg, definidas pelo fenótipo CD4+CD25+Foxp3+ e com função imunossupressora, já se encontram em menor número no timo desses animais. Esse dado sugere que a deficiência em Wasp resulta em defeito na geração intratímica de células Treg. Nesse contexto, é importante salientar que a migração do timócito através do microambiente tímico é crucial para a formação das células T e, particularmente, a matriz extracelular exerce uma função determinante para os eventos de adesão e de-adesão da célula migrante. Assim, podemos postular que a matriz extracelular medeia interações cruciais para as células Treg tímicas (tTreg), fornecendo e facilitando o acesso aos diferentes sinais celulares durante o processo de maturação dessas células Nesse projeto, decidimos estudar a participação de ligantes e receptores da matriz extracelular na maturação de células tTreg e o possível envolvimento dessas moléculas na deficiência numérica de células tTreg em camundongos WKO. Foi observada uma diminuição da rede de fibronectina na região medular do timo dos animais WKO em relação ao controle. Além disso, observamos uma redução de células tTreg expressando VLA-4 e VLA-5 nos animais WKO em relação ao controle. As análises de proliferação, ativação e morte demonstraram que as células Treg de animais WKO apresentam alterações em relação às células precursoras (CD4+CD8-CD25+Foxp3-). De forma interessante, as análises de adesão em fibronectina demonstraram que as células Treg dos animais WKO apresentam menos filopódios que as células Treg do controle, e que essa diminuição é proeminente comparando-se às células T CD4 SP. Esses resultados sugerem que a fibronectina tenha importância na diferenciação das células tTreg / Abstract: The Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) is a primary immunodeficiency associated with recurrent infection and development of autoimmune diseases and lymphomas. This immune deficiency develops as a result of mutations in the gene encoding the WASP protein ("WAS protein"), expressed in hematopoietic cells, and with regulatory functions on the actin cytoskeleton rearrangements and activation of T lymphocytes. Accordingly, mice deficient in Wasp (Wasp "knockout" - WKO) present disruption in central processes to the immune response, resulting in aberrant leukocyte migration, impaired lymphocyte proliferation and dysfunction of regulatory T cells (Treg). Interestingly, it was shown that Treg cells defined by the CD4+CD25+Foxp3+ phenotype and immunosuppressive function, already decreased in the thymus of the animals. This suggests that the Wasp deficiency results in defective intrathymic generation of Treg cells. In this context, it is important to note that the migration of the thymocyte through the thymic microenvironment is crucial for the formation of T cells and, particularly, the extracellular matrix has a decisive role in the events of adhesion and de-adhesion of migrant cell Thus, we postulated that the extracellular matrix mediates interactions crucial for thymic Treg cells (tTreg) by providing and facilitating access to different cellular signals during the maturation process of these cells. In this project, we decided to study the role of ligands and receptors of extracellular matrix in the maturation of tTreg cells and the possible involvement of these molecules in numerical deficiency tTreg WKO cells in mice. We observed a decrease in fibronectin network in the medulla of the thymus of WKO animals compared to the control. In addition, a decrease in cells expressing VLA-4 and VLA-5 in WKO animals compared to the control. The analysis of proliferation, activation, and death demonstrated that Treg cells animals in WKO showed changes from precursor cells (CD4+CD8-CD25+Foxp3-). Interestingly, adhesion on fibronectin showed that Treg cells from WKO animals present less filopodia compared to control Treg cells and that this is a marked decrease as compared to the CD4 SP cells. These results suggest an important role for fibronectin in the differentiation of Treg cells

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 carla_honse_ipec_dout_2014.pdf: 2842248 bytes, checksum: 39c5ea2462ab403b73d9079b68c7156c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Foram avaliados quarenta e um cães adultos, machos e fêmeas, sem raça definida, provenientes de inquéritos sorológicos para leishmaniose visceral canina realizados pela Secretaria Municipal de Saúde do Rio de Janeiro. O objetivo deste estudo foi descrever as alterações citopatológicas da medula óssea e o perfil hematológico de cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi. A avaliação citológica da medula óssea incluiu a análise qualitativa e quantitativa. O perfil hematológico foi avaliado através de contador automático de células e esfregaços sanguíneos. Adicionalmente, foram realizadas a imunofenotipagem de linfócitos medulares, pesquisa de formas amastigotas na medula óssea e avaliação dos estoques de ferro medular. De acordo com os resultados obtidos, cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi apresentaram hiperplasia das séries mieloide, linfoide e monocítica, onde frequentemente foram observadas formas amastigotas, anemia normocítica normocrômica e aumento dos estoques de ferro medular Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre as populações de linfócitos T e linfócitos B medulares. Em conclusão, os cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi apresentaram alterações na medula óssea e no perfil hematológico independentemente da manifestação clínica apresentada pelo animal. Hiperplasia das linhagens hematopoiéticas, anemia, eritrofagocitose e aumento dos estoques de ferro medular possibilitaram uma melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na doença e a pesquisa de formas amastigotas na medula óssea contribuiu como uma importante ferramenta diagnóstica da leishmaniose visceral canina / Fourty one adult mongrel dogs from the VL serol ogical surveys done by Secretaria Municipal de Saúde of Rio de Janeiro were studied. The purpose of this study was to evaluate the occurrence of cytopathologycal changes of bone marrow and hematological changes in dogs naturally infected by Leishmania (Lei shmania) chagasi . Evaluation of bone marrow included the qualitative and quantitative analysis and c omplete blood count was performed with an automated cell counter and blood smears. Additionally , immunophenotyping of lymphocytes, search of amastigotes an d iron stores of bone marrow were performed . According to the results, dogs naturally infected by L. (L.) chagasi showed hiperplasia of myeloid, lymphoide and monocytic series, that often showed amastigotes form, normocytic normochromic anemia and i ncrease iron stores of bone marrow. No significant difference was observed among the T lymphocytes and B lymphocytes populations of bone marrow. In conclusion, dogs naturally infected by L. (L.) chagasi showed changes in bone marrow and blood profile regardless of the clinical manifestations. Hyperplasia of hematopoietic lineages, anemia, erythrophagocytosis and increase iron stores allowed a better understanding of the physiopathological mechanisms involved in disease and the search of amastigotes in bone marro w contributed as an important diagnostic tool of canine visceral leishmaniasis.