Resumo não disponível.

A resposta imune ao P. chabaudi se caracteriza pela ativação policlonal de linfócitos B na fase aguda da doença, que resulta em uma intensa produção de anticorpos IgM e IgG de baixa afinidade e autoanticorpos. Apesar de esses anticorpos contribuírem para o controle da infecção, pode retardar a geração de anticorpos de alta afinidade que garantem a destruição dos parasitas e a proteção contra infecções subseqüentes. O nosso objetivo foi caracterizar os mecanismos envolvidos na ativação policlonal dos linfócitos B na infecção pelo P. chabaudi AS. Os nossos resultados mostraram que a cooperação T-B e importante nessa fase da infecção. Os ensaios in vitro mostraram que os linfócitos T da fase aguda da infecção são capazes de estimular linfócitos B naives, aumentando a expressão do CD69 e induzindo proliferação e produção de anticorpos. A molécula de classe II do MHC é importante na ativação policlonal dos linfócitos B, aumentando a expressão do CD69 e induzindo a proliferação de anticorpos, devido ao seu envolvimento na ativação dos linfócitos T. Assim, moléculas como CD28, CD40L e ICOS são importantes na ativação, proliferação e produção de anticorpos. / Polyclonal B cell activation is a feature of the early spleen B cell response to human and murine malaria, which results in intense production of parasite low-affinity IgM and IgG and autoantibodies. Although this response may contribute for the initial parasite control, it may also hinder the generation of high-affinity IgG that guarantees parasite elimination and protection against secondary infections. To characterize the mechanism involved in the polyclonal B cell response to P. chabaudi AS, we have analyzed in vivo and in vitro the role of several molecules known to be involved in antibody production. According to our in vivo results, this response depends on the cooperation of CD4+ T cells with B cells. The in vitro assays shows that the expression of MHC class II molecules is crucial for B cell activation in terms of CD69 expression, proliferation and antibody production, apparently due to their requirement for T cell activation. Signaling pathways mediated by the co-stimulatory receptor CD28, CD40L and ICOS has a central role for B cell proliferative response and antibody production. This study may help to clarify the molecular basis of polyclonal B cell activation induced during acute malaria.

Introdução: A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) é a imunodeficiência primária mais prevalente na prática clínica. Suas manifestações vão desde infecções de repetição (que são as mais prevalentes) à neoplasias e doenças autoimunes. Admite-se que o quadro clínico da ICV esteja associado a alterações na diferenciação de linfócitos B (LB), mas também em linfócitos T, monócitos e células dendríticas, além de mutações em genes relacionados a interações entre linfócitos T e B ou homeostasia de linfócitos B. Isto determina uma grande complexidade na classificação destes pacientes, sendo a correlação entre características clínicas e fenotípicas essencial para o melhor entendimento da doença e acompanhamento dos pacientes. Objetivo: Descrever o fenótipo clínico e das subpopulações de LB da coorte de pacientes com ICV acompanhados no Ambulatório de Imunodeficiências Primárias do Hospital das Clínicas e verificar o modelo de classificação que melhor se adequa a estes pacientes. Materiais e Métodos: Após a separação de PBMC e imunofenotipagem dos subtipos de LB de amostras de 70 pacientes, estes foram classificados segundo os critérios das classificações de Freiburgo, Paris e EUROclass. Também foram realizadas a análise das manifestações clínicas; a correlação entre as células de memória e as concentrações séricas das imunoglobulinas e a correlação entre os subtipos de LB e as principais manifestações clínicas desta coorte. Resultados: Esta coorte apresentou um grande distúrbio na distribuição das subpopulações de LB, sendo que todos os pacientes apresentaram redução na frequência de LB de memória com troca de isotipo, mas apenas as pacientes mulheres apresentaram aumento estatisticamente significante nas frequências de LB naive e LB CD21low e redução na frequência de plasmoblastos. Os subtipos de LB transitório e LB de zona marginal não apresentaram diferenças significativas entre pacientes e controles. Não observamos correlação entre as células B de memória e os níveis séricos de imunoglobulinas. A análise clínica revelou diferenças na prevalência de algumas complicações clínicas, entretanto, a correlação entre os subtipos de LB e estas manifestações mostrou associação apenas entre linfadenopatia e redução de plasmoblastos. Por fim, a classificação quanto aos três modelos propostos, revelou que nenhum deles se adequou para esta coorte de pacientes brasileiros. Conclusão: verificamos uma diversidade tanto nas subpopulações de LB quanto na prevalência de algumas manifestações clínicas e por conta destas alterações, até o momento nenhuma classificação se mostrou apropriada para esta coorte. Estes achados reforçam o conceito de heterogeneidade da doença e confirmam a necessidade de um novo modelo de classificação que compreenda outros marcadores. / Introduction: Common Variable Immunodeficiency (CVID) is the primary antibody deficiency most often seen in clinical practice. Patients present different clinical features ranging from recurrent infections (most prevalent) to malignancies and autoimmune disorders. It is accepted that this clinical picture is associated with alterations in the differentiation of B cells but also in T cells, monocytes and dendritic cells, besides mutations in genes related to interactions between T and B cells or in B cell homeostasis. This makes the classification of CVID patients very difficult, on the other hand the association between clinical and immunological phenotype is essential for better understanding of the disease and follow-up of patients. Objective: To describe the clinical and immunological phenotype of a Brazilian cohort of CVID patients followed at the Division of Clinical Immunology and Allergy of University of São Paulo Medical School and to classify them and analyze which is the most appropriated classification for this cohort. Methods and Results: Seventy patients were studied and flow cytometric B cell phenotyping was performed in PBMCs, using a mixture of monoclonal antibodies. The samples were classified according to the Freiburg, Paris and EUROclass classifications. We also analyzed the major clinical manifestations and correlated them to B cell phenotypes, besides correlating memory B cell frequency and serum IgA, IgG and IgM levels. Comparing patients and controls, we found a disturbed frequency of B cell subtypes in this cohort. Both male and female patients presented a reduction on switched memory B cells. However, only female patients had a significant increase on naïve B cells, CD21low B cells and reduction of plasmablasts. Marginal zone and transitory B cells showed no statistical differences between groups. There was no correlation between memory B cell frequency and serum immunoglobulin levels. Clinical analysis revealed a disturbed prevalence in some features but the correlation between B cell subtypes and clinical manifestations revealed only an association between lymphadenopathy and plasmablast reduction. Finally, the classification of this cohort according to the three proposed models revealed that none of them were appropriated to this Brazilian cohort. Conclusion: We observed a diversity in B cell subtypes frequency and the profile of some clinical complications. Because of these findings in both clinical and B cell subtypes, until now no proposed classification is appropriated for this cohort. These findings reinforce the concept of CVID heterogeneity and confirm the necessity of a new classification model that involves other markers

A sepse é a Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica decorrente de uma infecção por gram positivos/negativos, fungos ou vírus. É caracterizada por alta liberação de mediadores inflamatórios podendo levar à morte. As células B-1 são encontradas em cavidades peritoneal e pleural de camundongos e sua origem e função ainda não são completamente conhecidas. Apresentam marcadores de superfície de linhagem mielóide e linfóide e migram para focos inflamatórios comportando-se como macrófagos. Objetivo: investigar o papel da célula B-1 na resposta inflamatória após estímulo com lipopolissacáride (LPS) in vitro e in vivo. Métodos: TNF-, IL-6, IL-10 (ELISA) e nitrito (Griess) foram dosados em sobrenadante de cultura celular (106 cel./ml). As células em cultura receberam por 24h de estímulo com 10 g/mL de LPS de Escherichia coli (026:B6 Sigma®). Foram realizados os seguintes grupos cultura de célula B-1 (Balb/c), cultura de macrófagos de linhagem (RAW 264.7) coculturas (macrófagos de linhagem RAW 264.7 e células B-1 (Balb/c, C57BL/6 e C57BL/6 IL-10 -/-), e células peritoneais de camundongos Balb/c e Balb/Xid (imunodeficiente em célula B-1) A endotoxemia foi induzida com injeção de LPS 15 mg/kg (i.p.) em camundongos Balb/c e Balb/Xid. Foram quantificados, TNF-, IL-6, IL-10 e nitrito em soro, pulmão e intestino dos animais após 1,5, 4 e 6 horas após a injeção de LPS. Ensaios de inoculação de células B-1 (Balb/c) em camundongos Balb/Xid foram realizados, e curva de sobrevida foi analisada após indução de endotoxemia. Resultados: Após o estímulo com LPS, células B-1 produziram IL-10 e a presença destas células em cocultura com macrófago promoveu a diminuição na produção de TNF-, IL-6, Nitrito e aumento de IL-10. Contudo, célula B-1 (IL-10 -/-) em cocultura com macrófagos, não inibem a produção de mediadores pro inflamatórios. Análise com macrófagos peritoneais de camundongo Balb/Xid e Balb/c após estímulo com LPS em cultura mostrou reprodução do fenômeno encontrado com os experimentos com cultura de célula imortalizada, isto é, maior produção de TNF-, IL-6 e NO em Balb/Xid (B-1 deficiente). Os estudos in vivo mostraram 60% de mortalidade em camundongo Balb/Xid comparando com Balb/c (0%) após 16 horas de injeção de LPS. Nos animais Balb/Xid encontramos padrão pro inflamatório exacerbado com maiores concentrações de TNF-, IL-6 e menores concentrações de IL-10 no plasma e tecidos quando comparamos com Balb/c. Conclusões: Nossos dados mostraram que a presença de células B-1 promoveram diminuição de mediadores pro inflamatórios e aumento de IL-10 em coculturas com macrófagos e que a modulação da resposta inflamatória pode ser devida a secreção de IL-10 pela célula B-1. Este padrão de resposta pro inflamatória se repete in vivo e é a possível causadora da maior taxa de mortalidade em camundongos da linhagem Balb/Xid. / Sepsis syndrome is caused by inappropriate immune activation due to bacteria and bacterial components released during infection. This syndrome is the leading cause of death in intensive care units. Specialized B-lymphocytes located in the peritoneal and pleural cavities are known as B-1 cells. These cells produce IgM and IL-10, both of which are potent regulators of cell-mediated immunity. It has been suggested that B-1 cells modulate the systemic inflammatory response in sepsis. In this study, we conducted in vitro and in vivo experiments in order to investigate a putative role of B-1 cells in a murine model of LPS-induced sepsis. Macrophages and B-1 cells were studied in monocultures and in co-cultures. The B-1 cells produced the anti-inflammatory cytokine IL-10 in response to LPS. In the B-1 cell-macrophage co-cultures, production of proinflammatory mediators (TNF-, IL-6 and nitrite) was lower than in the macrophage monocultures, whereas that of IL-10 was higher in the co-cultures. Co-culture of B-1 IL-10/ cells and macrophages did not reduce the production of the proinflammatory mediators (TNF-, IL-6 and nitrite). After LPS injection, the mortality rate was higher among Balb/Xid mice, which are B-1 cell deficient, than among wild-type mice (65.0% vs. 0.0%). The Balb/Xid mice also presented a proinflammatory profile of TNF-, IL-6 and nitrite, as well as lower levels of IL-10. In the early phase of LPS stimulation, B-1 cells modulate the macrophage inflammatory response, and the main molecular pathway of that modulation is based on IL-10-mediated intracellular signaling.

A presente tese aborda os principais aspectos da biologia do vírus Epstein-Barr (EBV), suas relações com doenças, seu potencial uso como ferramenta para a biologia celular e a reprodutibilidade desta célula para o auxílio no diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM) através da medida de atividades de hidrolases lisossômicas. Os objetivos deste trabalho foram investigar as alterações celulares e morfológicas nos linfócitos B infectados com EBV, afim de confirmar a transformação celular nos 12 dias de cultura, para certificação do protocolo empregado; determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180, 365 e 730 dias de criopreservação em nitrogênio líquido, das enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a- glicosidase e a-iduronidase em Linhagens Celulares Linfoblastóides (LCL) transformados com EBV de indivíduos normais e determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180 dias de criopreservação das enzimas β-glicosidase, a-galactosidase e a- iduronidase em LCLs transformados com EBV de pacientes com doenças de Gaucher e Fabry e Mucopolissacaridose tipo I. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo EBV através das 3 ferramentas utilizadas: imunohistoquímica, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia confocal. Foram observados, através destes instrumentos, o aparecimento de clusters celulares, vacúolos citoplasmáticos, binucleação e aumento no conteúdo de organelas, o que é esperado em células infectadas por EBV. Foi observado também que as células cultivadas por 12 dias com EBV apresentavam a atividade da β-glicosidase e da a-iduronidase diferente significativamente daquela de linfócitos não infectados. Após 6 meses, 1 e 2 anos de criopreservação das células transformadas com EBV, em nitrogênio líquido, as enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a-glicosidase e a-iduronidase mantiveram suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. O mesmo ocorreu quando utilizamos amostras de pacientes com doença de Gaucher, Fabry e Mucopolissacaridose tipo I após 6 meses de criopreservação. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo vírus Epstein Barr e que uma vez congeladas até pelo menos 1 ano em nitrogênio líquido, todas as enzimas analisadas mantém suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. / The present study addresses the main aspects of the biology of the Epstein-Barr virus (EBV) and its relationships with diseases, its potentials as a tool in cell biology, and the reproducibility of EBV-infected cells to assist in the diagnosis of Inborn errors of metabolism (IEM) using a measure of the activities of lysosomal hydrolases. The objectives of this study were (i) to investigate the cellular and morphological changes in B-lymphocytes infected with EBV to confirm cell transformation within the 12-day culturing period in order to verify the applicability of the method; (ii) to determine the activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-iduronidase, α-galactosidase and α- glucosidase in lymphoblastoid cell lines at the moment of collection (12-day culturing) and immediately after 180, 365 and 730 days in lymphoblastoid cell lines (LCLs) transformed with EBV of normal individuals frozen in liquid nitrogen and (iii) to determine the activities of the enzymes β-glucosidase, α- galactosidase and α-iduronidase at the moment of collection (12 days of culturing) and immediately after 180 days in LCLs transformed by the EBV of patients with Gaucher and Fabry diseases and with muccopolysaccharidosis type I frozen in liquid nitrogen. The results showed that the protocol was efficient to transform B-lymphocytes by EBV using three tools: immunohistochemistry, transmission electron microscopy and confocal microscopy. The technique afforded to observe the emergence of clusters, cytoplasm vacuoles, binucleatoon and increased organelle contents, which are expected in EBV-infected cells. Also, it was observed that cells cultured with EBV for 12 days presented β-glucosidase and α-iduronidase significantly different from that of non-infected lymphocytes. Activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-galactosidase. α-glucosidase and α- iduronidase measured after 180, 635 and 730 days in cryopreservation of EBVtransformed cells in liquid nitrogen were similar to that of samples after 12-day culturing of cells. The same was observed when we used samples from patients with Gaucher, Fabry and muccopolysaccharidosis type I after a 6-month cryopreservation period. This study shows that the protocol was efficient in transforming B-lymphocytes by EBV and that the activities of all enzymes frozen for at least one year in liquid nitrogen remained similar to that of samples collected after 12-day culturing.

A sepse é causada por microorganismos tais como: bactérias Gram-negativas, Gram-positivas, fungos e vírus. A sepse grave e o choque séptico estão associados a taxas de mortalidade de 40 a 60%. O evento mais importante para a evolução do quadro séptico é a apoptose das células efetoras do sistema imune. A eliminação de um grande número de células do sistema imune compromete a defesa efetiva do hospedeiro. Para estudarmos o papel das células imunes na sepse utilizamos o modelo de tolerância ao LPS. Em nossos estudos induzimos tolerância ao LPS em camundongos Balb-C e analisamos os padrões da expressão gênica nos linfócitos do baço. Para o mapeamento dos genes, utilizamos o macroarray, identificamos o grupo funcional de genes que tem maior relevância na proteção induzida pela tolerância, e em seguida confirmamos os resultados encontrados através do RT-PCR, Western Blotting, atividade de caspase 1 e citometria de fluxo. Encontramos uma importante redução na expressão de genes, como heat shock proteins, óxido nítrico e apoptose. Após análise da membrana contendo os genes integradores da resposta produzida pela tolerância, optamos por enfatizar inicialmente os genes envolvidos no processo apoptótico devido à relevância deste processo no quadro séptico conforme mostraram os trabalhos encontrados na literatura. Demonstramos que animais tolerantes ao LPS apresentam diminuição dos eventos apoptóticos, com redução na expressão dos genes ligados às caspases 7, 8 e 11, assim como a redução dos genes ligados ao Bid e Apaf-1. Ao analisarmos o RNAm através do RT-PCR, encontramos redução na Caspase 3, Bax e Bcl2, resultado que se confirmou ao analisarmos a expressão protéica através do Western- Blotting. Realizamos citometria de fluxo para avaliarmos a ocerrência de apoptose nos linfócitos dos animais submetidos à ligadura cecal. Confirmamos uma redução da apoptose e necrose em linfócitos dos animais tolerantes em relação aos controles. Com estes resultados podemos propor que a tolerância seria benéfica na redução da apoptose e controle do quadro séptico, além disso, a diminuição na expressão do gene ligado à caspase 11 estaria contribuindo para a diminuição do quadro inflamatório, pois a caspase 11 é um mediador essencial na resposta ao choque séptico. / Sepses are caused by microorganisms such as: Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, fungus and virus. Several sepses and the septic shock have been associated with the mortality rates from 40 to 60%. One of the most important events for the septic evolution is the apoptosis cells of the immune system. The cells immune system elimination compromises the host. We induced LPS tolerance in Balb-C mice and analyzed genes expressions in spleens; we found an important reduction in the genes expressions like: heat shock proteins, nitric oxide and apoptosis. After analysis of the membrane containing the sepses genes produced by tolerance, we emphasized initially the genes involved in the apoptosis. Demonstrated that animals LPS tolerants presented decrease in apoptotic events, with reduction in the genes expression related caspases 7, 8, 11, Bid and Apaf-1. In the mRNA by RT-PCR, we found a reduction in Caspase 3, Bax and Bcl2, and these results were confirmed by Western-blot. We realized flow cytometry and we showed that the results are maintained, presenting reduction in both the apoptotic and necrotic events in tolerants animals. These results showed that the tolerance would be favorable in the apoptosis reduction and control of the sepsis, moreover, the expression reduction to caspase 11 genes would be contributing to the inflammatory reduction because Caspase 11 is an essential mediator in the septic shock.

A presente tese aborda os principais aspectos da biologia do vírus Epstein-Barr (EBV), suas relações com doenças, seu potencial uso como ferramenta para a biologia celular e a reprodutibilidade desta célula para o auxílio no diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM) através da medida de atividades de hidrolases lisossômicas. Os objetivos deste trabalho foram investigar as alterações celulares e morfológicas nos linfócitos B infectados com EBV, afim de confirmar a transformação celular nos 12 dias de cultura, para certificação do protocolo empregado; determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180, 365 e 730 dias de criopreservação em nitrogênio líquido, das enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a- glicosidase e a-iduronidase em Linhagens Celulares Linfoblastóides (LCL) transformados com EBV de indivíduos normais e determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180 dias de criopreservação das enzimas β-glicosidase, a-galactosidase e a- iduronidase em LCLs transformados com EBV de pacientes com doenças de Gaucher e Fabry e Mucopolissacaridose tipo I. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo EBV através das 3 ferramentas utilizadas: imunohistoquímica, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia confocal. Foram observados, através destes instrumentos, o aparecimento de clusters celulares, vacúolos citoplasmáticos, binucleação e aumento no conteúdo de organelas, o que é esperado em células infectadas por EBV. Foi observado também que as células cultivadas por 12 dias com EBV apresentavam a atividade da β-glicosidase e da a-iduronidase diferente significativamente daquela de linfócitos não infectados. Após 6 meses, 1 e 2 anos de criopreservação das células transformadas com EBV, em nitrogênio líquido, as enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a-glicosidase e a-iduronidase mantiveram suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. O mesmo ocorreu quando utilizamos amostras de pacientes com doença de Gaucher, Fabry e Mucopolissacaridose tipo I após 6 meses de criopreservação. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo vírus Epstein Barr e que uma vez congeladas até pelo menos 1 ano em nitrogênio líquido, todas as enzimas analisadas mantém suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. / The present study addresses the main aspects of the biology of the Epstein-Barr virus (EBV) and its relationships with diseases, its potentials as a tool in cell biology, and the reproducibility of EBV-infected cells to assist in the diagnosis of Inborn errors of metabolism (IEM) using a measure of the activities of lysosomal hydrolases. The objectives of this study were (i) to investigate the cellular and morphological changes in B-lymphocytes infected with EBV to confirm cell transformation within the 12-day culturing period in order to verify the applicability of the method; (ii) to determine the activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-iduronidase, α-galactosidase and α- glucosidase in lymphoblastoid cell lines at the moment of collection (12-day culturing) and immediately after 180, 365 and 730 days in lymphoblastoid cell lines (LCLs) transformed with EBV of normal individuals frozen in liquid nitrogen and (iii) to determine the activities of the enzymes β-glucosidase, α- galactosidase and α-iduronidase at the moment of collection (12 days of culturing) and immediately after 180 days in LCLs transformed by the EBV of patients with Gaucher and Fabry diseases and with muccopolysaccharidosis type I frozen in liquid nitrogen. The results showed that the protocol was efficient to transform B-lymphocytes by EBV using three tools: immunohistochemistry, transmission electron microscopy and confocal microscopy. The technique afforded to observe the emergence of clusters, cytoplasm vacuoles, binucleatoon and increased organelle contents, which are expected in EBV-infected cells. Also, it was observed that cells cultured with EBV for 12 days presented β-glucosidase and α-iduronidase significantly different from that of non-infected lymphocytes. Activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-galactosidase. α-glucosidase and α- iduronidase measured after 180, 635 and 730 days in cryopreservation of EBVtransformed cells in liquid nitrogen were similar to that of samples after 12-day culturing of cells. The same was observed when we used samples from patients with Gaucher, Fabry and muccopolysaccharidosis type I after a 6-month cryopreservation period. This study shows that the protocol was efficient in transforming B-lymphocytes by EBV and that the activities of all enzymes frozen for at least one year in liquid nitrogen remained similar to that of samples collected after 12-day culturing.

A presente tese aborda os principais aspectos da biologia do vírus Epstein-Barr (EBV), suas relações com doenças, seu potencial uso como ferramenta para a biologia celular e a reprodutibilidade desta célula para o auxílio no diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM) através da medida de atividades de hidrolases lisossômicas. Os objetivos deste trabalho foram investigar as alterações celulares e morfológicas nos linfócitos B infectados com EBV, afim de confirmar a transformação celular nos 12 dias de cultura, para certificação do protocolo empregado; determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180, 365 e 730 dias de criopreservação em nitrogênio líquido, das enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a- glicosidase e a-iduronidase em Linhagens Celulares Linfoblastóides (LCL) transformados com EBV de indivíduos normais e determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180 dias de criopreservação das enzimas β-glicosidase, a-galactosidase e a- iduronidase em LCLs transformados com EBV de pacientes com doenças de Gaucher e Fabry e Mucopolissacaridose tipo I. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo EBV através das 3 ferramentas utilizadas: imunohistoquímica, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia confocal. Foram observados, através destes instrumentos, o aparecimento de clusters celulares, vacúolos citoplasmáticos, binucleação e aumento no conteúdo de organelas, o que é esperado em células infectadas por EBV. Foi observado também que as células cultivadas por 12 dias com EBV apresentavam a atividade da β-glicosidase e da a-iduronidase diferente significativamente daquela de linfócitos não infectados. Após 6 meses, 1 e 2 anos de criopreservação das células transformadas com EBV, em nitrogênio líquido, as enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a-glicosidase e a-iduronidase mantiveram suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. O mesmo ocorreu quando utilizamos amostras de pacientes com doença de Gaucher, Fabry e Mucopolissacaridose tipo I após 6 meses de criopreservação. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo vírus Epstein Barr e que uma vez congeladas até pelo menos 1 ano em nitrogênio líquido, todas as enzimas analisadas mantém suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. / The present study addresses the main aspects of the biology of the Epstein-Barr virus (EBV) and its relationships with diseases, its potentials as a tool in cell biology, and the reproducibility of EBV-infected cells to assist in the diagnosis of Inborn errors of metabolism (IEM) using a measure of the activities of lysosomal hydrolases. The objectives of this study were (i) to investigate the cellular and morphological changes in B-lymphocytes infected with EBV to confirm cell transformation within the 12-day culturing period in order to verify the applicability of the method; (ii) to determine the activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-iduronidase, α-galactosidase and α- glucosidase in lymphoblastoid cell lines at the moment of collection (12-day culturing) and immediately after 180, 365 and 730 days in lymphoblastoid cell lines (LCLs) transformed with EBV of normal individuals frozen in liquid nitrogen and (iii) to determine the activities of the enzymes β-glucosidase, α- galactosidase and α-iduronidase at the moment of collection (12 days of culturing) and immediately after 180 days in LCLs transformed by the EBV of patients with Gaucher and Fabry diseases and with muccopolysaccharidosis type I frozen in liquid nitrogen. The results showed that the protocol was efficient to transform B-lymphocytes by EBV using three tools: immunohistochemistry, transmission electron microscopy and confocal microscopy. The technique afforded to observe the emergence of clusters, cytoplasm vacuoles, binucleatoon and increased organelle contents, which are expected in EBV-infected cells. Also, it was observed that cells cultured with EBV for 12 days presented β-glucosidase and α-iduronidase significantly different from that of non-infected lymphocytes. Activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-galactosidase. α-glucosidase and α- iduronidase measured after 180, 635 and 730 days in cryopreservation of EBVtransformed cells in liquid nitrogen were similar to that of samples after 12-day culturing of cells. The same was observed when we used samples from patients with Gaucher, Fabry and muccopolysaccharidosis type I after a 6-month cryopreservation period. This study shows that the protocol was efficient in transforming B-lymphocytes by EBV and that the activities of all enzymes frozen for at least one year in liquid nitrogen remained similar to that of samples collected after 12-day culturing.

A sepse é a Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica decorrente de uma infecção por gram positivos/negativos, fungos ou vírus. É caracterizada por alta liberação de mediadores inflamatórios podendo levar à morte. As células B-1 são encontradas em cavidades peritoneal e pleural de camundongos e sua origem e função ainda não são completamente conhecidas. Apresentam marcadores de superfície de linhagem mielóide e linfóide e migram para focos inflamatórios comportando-se como macrófagos. Objetivo: investigar o papel da célula B-1 na resposta inflamatória após estímulo com lipopolissacáride (LPS) in vitro e in vivo. Métodos: TNF-, IL-6, IL-10 (ELISA) e nitrito (Griess) foram dosados em sobrenadante de cultura celular (106 cel./ml). As células em cultura receberam por 24h de estímulo com 10 g/mL de LPS de Escherichia coli (026:B6 Sigma®). Foram realizados os seguintes grupos cultura de célula B-1 (Balb/c), cultura de macrófagos de linhagem (RAW 264.7) coculturas (macrófagos de linhagem RAW 264.7 e células B-1 (Balb/c, C57BL/6 e C57BL/6 IL-10 -/-), e células peritoneais de camundongos Balb/c e Balb/Xid (imunodeficiente em célula B-1) A endotoxemia foi induzida com injeção de LPS 15 mg/kg (i.p.) em camundongos Balb/c e Balb/Xid. Foram quantificados, TNF-, IL-6, IL-10 e nitrito em soro, pulmão e intestino dos animais após 1,5, 4 e 6 horas após a injeção de LPS. Ensaios de inoculação de células B-1 (Balb/c) em camundongos Balb/Xid foram realizados, e curva de sobrevida foi analisada após indução de endotoxemia. Resultados: Após o estímulo com LPS, células B-1 produziram IL-10 e a presença destas células em cocultura com macrófago promoveu a diminuição na produção de TNF-, IL-6, Nitrito e aumento de IL-10. Contudo, célula B-1 (IL-10 -/-) em cocultura com macrófagos, não inibem a produção de mediadores pro inflamatórios. Análise com macrófagos peritoneais de camundongo Balb/Xid e Balb/c após estímulo com LPS em cultura mostrou reprodução do fenômeno encontrado com os experimentos com cultura de célula imortalizada, isto é, maior produção de TNF-, IL-6 e NO em Balb/Xid (B-1 deficiente). Os estudos in vivo mostraram 60% de mortalidade em camundongo Balb/Xid comparando com Balb/c (0%) após 16 horas de injeção de LPS. Nos animais Balb/Xid encontramos padrão pro inflamatório exacerbado com maiores concentrações de TNF-, IL-6 e menores concentrações de IL-10 no plasma e tecidos quando comparamos com Balb/c. Conclusões: Nossos dados mostraram que a presença de células B-1 promoveram diminuição de mediadores pro inflamatórios e aumento de IL-10 em coculturas com macrófagos e que a modulação da resposta inflamatória pode ser devida a secreção de IL-10 pela célula B-1. Este padrão de resposta pro inflamatória se repete in vivo e é a possível causadora da maior taxa de mortalidade em camundongos da linhagem Balb/Xid. / Sepsis syndrome is caused by inappropriate immune activation due to bacteria and bacterial components released during infection. This syndrome is the leading cause of death in intensive care units. Specialized B-lymphocytes located in the peritoneal and pleural cavities are known as B-1 cells. These cells produce IgM and IL-10, both of which are potent regulators of cell-mediated immunity. It has been suggested that B-1 cells modulate the systemic inflammatory response in sepsis. In this study, we conducted in vitro and in vivo experiments in order to investigate a putative role of B-1 cells in a murine model of LPS-induced sepsis. Macrophages and B-1 cells were studied in monocultures and in co-cultures. The B-1 cells produced the anti-inflammatory cytokine IL-10 in response to LPS. In the B-1 cell-macrophage co-cultures, production of proinflammatory mediators (TNF-, IL-6 and nitrite) was lower than in the macrophage monocultures, whereas that of IL-10 was higher in the co-cultures. Co-culture of B-1 IL-10/ cells and macrophages did not reduce the production of the proinflammatory mediators (TNF-, IL-6 and nitrite). After LPS injection, the mortality rate was higher among Balb/Xid mice, which are B-1 cell deficient, than among wild-type mice (65.0% vs. 0.0%). The Balb/Xid mice also presented a proinflammatory profile of TNF-, IL-6 and nitrite, as well as lower levels of IL-10. In the early phase of LPS stimulation, B-1 cells modulate the macrophage inflammatory response, and the main molecular pathway of that modulation is based on IL-10-mediated intracellular signaling.

A sepse é causada por microorganismos tais como: bactérias Gram-negativas, Gram-positivas, fungos e vírus. A sepse grave e o choque séptico estão associados a taxas de mortalidade de 40 a 60%. O evento mais importante para a evolução do quadro séptico é a apoptose das células efetoras do sistema imune. A eliminação de um grande número de células do sistema imune compromete a defesa efetiva do hospedeiro. Para estudarmos o papel das células imunes na sepse utilizamos o modelo de tolerância ao LPS. Em nossos estudos induzimos tolerância ao LPS em camundongos Balb-C e analisamos os padrões da expressão gênica nos linfócitos do baço. Para o mapeamento dos genes, utilizamos o macroarray, identificamos o grupo funcional de genes que tem maior relevância na proteção induzida pela tolerância, e em seguida confirmamos os resultados encontrados através do RT-PCR, Western Blotting, atividade de caspase 1 e citometria de fluxo. Encontramos uma importante redução na expressão de genes, como heat shock proteins, óxido nítrico e apoptose. Após análise da membrana contendo os genes integradores da resposta produzida pela tolerância, optamos por enfatizar inicialmente os genes envolvidos no processo apoptótico devido à relevância deste processo no quadro séptico conforme mostraram os trabalhos encontrados na literatura. Demonstramos que animais tolerantes ao LPS apresentam diminuição dos eventos apoptóticos, com redução na expressão dos genes ligados às caspases 7, 8 e 11, assim como a redução dos genes ligados ao Bid e Apaf-1. Ao analisarmos o RNAm através do RT-PCR, encontramos redução na Caspase 3, Bax e Bcl2, resultado que se confirmou ao analisarmos a expressão protéica através do Western- Blotting. Realizamos citometria de fluxo para avaliarmos a ocerrência de apoptose nos linfócitos dos animais submetidos à ligadura cecal. Confirmamos uma redução da apoptose e necrose em linfócitos dos animais tolerantes em relação aos controles. Com estes resultados podemos propor que a tolerância seria benéfica na redução da apoptose e controle do quadro séptico, além disso, a diminuição na expressão do gene ligado à caspase 11 estaria contribuindo para a diminuição do quadro inflamatório, pois a caspase 11 é um mediador essencial na resposta ao choque séptico. / Sepses are caused by microorganisms such as: Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, fungus and virus. Several sepses and the septic shock have been associated with the mortality rates from 40 to 60%. One of the most important events for the septic evolution is the apoptosis cells of the immune system. The cells immune system elimination compromises the host. We induced LPS tolerance in Balb-C mice and analyzed genes expressions in spleens; we found an important reduction in the genes expressions like: heat shock proteins, nitric oxide and apoptosis. After analysis of the membrane containing the sepses genes produced by tolerance, we emphasized initially the genes involved in the apoptosis. Demonstrated that animals LPS tolerants presented decrease in apoptotic events, with reduction in the genes expression related caspases 7, 8, 11, Bid and Apaf-1. In the mRNA by RT-PCR, we found a reduction in Caspase 3, Bax and Bcl2, and these results were confirmed by Western-blot. We realized flow cytometry and we showed that the results are maintained, presenting reduction in both the apoptotic and necrotic events in tolerants animals. These results showed that the tolerance would be favorable in the apoptosis reduction and control of the sepsis, moreover, the expression reduction to caspase 11 genes would be contributing to the inflammatory reduction because Caspase 11 is an essential mediator in the septic shock.