Utilizando modelo de coinflamação tuberculose e alergia (TB/OVA), nosso grupo mostrou que camundongos BALB/c coinflamados apresentaram diminuição significativa no número de bacilos, associada com diminuição no infiltrado granulomatoso no pulmão, aumento na produção de leucotrieno B4 e no número de células CD8+, quando comparados ao grupo infectado com Mycobacterium tuberculosis (TB). No presente estudo, nosso objetivo foi avaliar os mecanismos envolvidos na restrição ao crescimento dos bacilos nos animais do grupo TB/OVA. Quatro estratégias foram usadas: I) Para avaliar o papel dos linfócitos CD8+ no modelo TB/OVA, foram utilizados camundongos deficientes para a molécula CD8 (CD8KO). Foi observado que não houve diferenças significativas no crescimento do bacilo no pulmão dos animais CD8KO-TB/OVA e WT-TB/OVA. No entanto, nos pulmões dos animais WT-TB/OVA houve maior crescimento de bacilos em relação aos animais WT-TB, diferente do previamente observado com os animais TB/OVA da linhagem BALB/c. Para avaliar o papel dos leucotrienos foram usadas as seguintes estratégias: II). Camundongos da linhagem 129Sv tratados com MK886, inibidor da enzima 5-lipoxigenase (5LO), envolvida na síntese de mediadores lipídicos; III) animais 129Sv, deficientes para a expressão da 5LO (5LOKO). Foi observado que o tratamento com MK886 não afetou o número de bacilos no pulmão do grupo coinflamado TB/OVA quando comparado ao grupo TB/OVA. Além disso, diferente do que foi previamente observado em animais BALB/c, os animais 129Sv coinflamados foram mais susceptíveis que os animais 129Sv infectados. Do contrário, animais 5LOKO-TB/OVA foram mais resistentes que os camundongos WT-TB/OVA. Para avaliar se alterações no infiltrado granulomatoso estavam relacionadas com o infiltrado de macrófagos no pulmão, usamos a quarta estratégia: IV) quantificação das populações de macrófagos M1 e M2. Foi observado que os animais TB/OVA apresentaram aumento da população de macrófagos M2 no pulmão, enquanto a população de macrófagos M1 manteve-se inalterada comparado-se ao grupo apenas infectado. A diminuição no crescimento de bacilos nos animais TB/OVA foi dependente dos macrófagos M2, pois animais deficientes para a expressão do receptor de IL-33 submetidos ao protocolo de coinflamação tiveram diminuição da população de macrófagos M2, e foram susceptíveis à infecção. Esses resultados mostram que a diminuição no crescimento de bacilos nos animais coinflamados TB/OVA é dependente do aumento da população de macrófagos M2. / Using model of coinfection allergy and tuberculosis (TB / OVA), our group showed that coinfected BALB/c showed a significant decrease in the number of bacilli, associated with a decrease in granulomatous infiltrate the lung, increased production of leukotriene B4 and the number of cells CD8+, compared to the group infected with Mycobacterium tuberculosis (TB). To evaluate the mechanisms involved in reducing the growth of bacilli in group TB/OVA, were used four strategies: I) To assess the role of CD8+ lymphocytes in model TB/OVA, we used mice deficient for the molecule CD8 (CD8KO).We was observed that the number of bacilli in the lungs of animals in the group CD8KO-TB/OVA and WT-TB/OVA was similar. However, the lungs of animals WT-TB/OVA growth of bacillus was higher compared to WT animals, TB, unlike what was previously observed with background genetic BALB/c. To evaluate the role of leukotrienes, we use the following strategies: II) strain 129Sv mice treated with MK886, an inhibitor of the enzyme 5-lipoxygenase (5LO), involved in the synthesis of lipid mediators, III) 129Sv animals deficient for the expression of 5LO (5LOKO). We observed that treatment with MK886 did not affect the number of bacilli in the lung of the coinfected group TB/OVA. Moreover, unlike what was previously observed in animals BALB/c mice, coinfected 129Sv were more susceptible than the animals infected 129Sv. On the contrary, 5LOKO-TB/OVA animals were more resistant than mice WT-TB/OVA. To assess whether changes in granulomatous infiltrates were related to macrophages, we use the fourth strategy: IV) quantification of macrophage populations M1 and M2. We observed that M2 population in animals TB/OVA showed increased lung. The decrease in bacilli growth of animals TB/OVA was dependent on macrophage M2, since animals deficient for the expression of IL-33 protocol submitted to coinfected protocol had decreased macrophage population M2, and were susceptible to infection. These results show that the reduction in growth of bacilli in coinfected animals TB/OVA is dependent increase in macrophage population M2.

Orientadores: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro. Patrícia Ucelli Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:08:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thome_Rodolfo_M.pdf: 2705250 bytes, checksum: 05d8c21f84c00f9da679ff148b082292 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O camundongo BALB/c, linhagem geneticamente resistente à artrite induzida por colágeno (CIA), pode desenvolver um quadro similar ao de camundongos susceptíveis quando uma proteína não relacionada ao próprio, como a ovalbumina (OVA), é associada a colágeno tipo II (CII). Utilizando esse modelo, avaliamos se a tolerância oral a OVA poderia interferir nas respostas imunes contra CII, bem como o efeito da transferência adotiva de células dendríticas (DCs) tolerogênicas para camundongos artríticos. Para avaliação dos efeitos da tolerância oral sobre o desenvolvimento de artrite em BALB/c, os camundongos foram alimentados com OVA misturada à água de beber na concentração de 4mg/mL, por sete dias consecutivos, antes ou depois do desafio com CII+OVA (100?g/mL de cada antígeno). Para avaliar a participação de células dendríticas (DCs) tolerogênicas na modulação da artrite em BALB/c, células CD11c+ foram isoladas de baços de animais tolerantes à OVA e transferidas adotivamente para camundongos naïve, que foram subsequentemente imunizados com CII+OVA (100?g de cada antígeno). Para acompanhamento da evolução dos quadros de artrite, foram avaliados: o edema de patas, tomando-se regularmente as medidas de espessura de patas; realizadas análises histológicas dos tecidos articulares de joelhos e; conduzidas avaliações ex-vivo dos níveis séricos de anticorpos anti-CII e de respostas proliferativas e produção de citocinas de linfócitos T esplênicos. O tratamento com OVA antes da indução de CIA preveniu o desenvolvimento da artrite em todos os parâmetros analisados, enquanto que o tratamento com OVA após o estabelecimento da doença reduziu significativamente a inflamação e a produção de anticorpos anti-CII. Observamos ainda que a transferência de DCs tolerogênicas preveniu o aparecimento dos sinais clínicos da doença e o aumento dos níveis de anticorpos específicos no soro e reduziu significativamente a proliferação de linfócitos T CII-específicos. Enquanto a frequência de células CD4+CD25+Foxp3+ foi maior nas culturas de células de animais recipientes de DCs tolerogênicas, houve redução significativa na frequência de células produtoras de IFN? e IL-17. Os níveis de TGF-?, IL-4 e IL-10 foram significativamente mais elevados nas culturas de células esplênicas de animais recipientes de DCs tolerogênicas, enquanto que os de IFN-?, IL-6 e TNF-? foram mais reduzidos. Tomados em conjunto, nossos resultados indicam que a tolerância oral a um antígeno não relacionado ao próprio modifica o curso da artrite experimental em resposta ao colágeno, e que células dendríticas com perfil tolerogênico estão envolvidas nos fenômenos observados / Abstract: BALB/c mice, genetically resistant to collagen-induced arthritis (CIA), can develop a inflammatory condition resembling what is observed in susceptible strains when a non-related protein, such as ovalbumin (OVA), is associated with type II collagen (CII). Using this model, we evaluated whether oral tolerance to OVA could interfere in the immune response against CII, as well as the effect of adoptive transfer of tolerogenic dendritic cells (DCs) to arthritic mice. In order to evaluate the effect of oral tolerance over arthritis development in BALB/c mice, animals were fed with OVA in the drinking water at a 4mg/mL concentration, for seven consecutive days, before or after challenge with CII+OVA (100?g of each antigen). In order to evaluate the participation of tolerogenic DCs in the modulation of arthritis, splenic CD11c+ cells were isolated from OVA tolerant mice and adoptively transferred to naïve mice, which were subsequently immunized with CII+OVA. In order to monitor the evolution of the severity of arthritis, we evaluated paw edema, taking paw thickness regularly measured; performed histological analyses of articular knee tissues and, conducted ex-vivo evaluation of serum specific antibody levels and proliferation and cytokine secretion of splenic T lymphocytes. The treatment with OVA before CIA induction prevented the development of arthritis in all analyzed parameters, while the treatment after disease onset significantly reduced inflammation and CII-specific antibody production. We also observed that tolerogenic DC transfer prevented the appearance of clinical signs of arthritis, the increase of serum specific antibody levels and significantly reduced CII-specific T lymphocytes proliferation. While the frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells were higher in cell culture from tolerogenic DC recipient mice, frequency of IFN?- and IL-17- producing cells were significantly reduced. We observed that levels of TGF-?, IL-4 and IL-10 were significantly higher in cultures of splenic cells from mice recipient of tolerogenic DC, while levels of IFN-?, IL-6 and TNF-? were reduced. Taken together, our results indicate that oral tolerance to a non-related antigen modifies the course of experimental arthritis in response to collagen, and that dendritic cells with a tolerogenic profile are involved in the observed phenomena / Mestrado / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Para serem apresentados pelo MHC I em células dendríticas, os antígenos são processados pelo imunoproteassomo. O objetivo do trabalho foi examinar o efeito de pró-oxidantes em DC para avaliação da proliferação de linfócitos T CD8+, com foco no sistema ubiquitina-proteassomo. Os resultados mostram que o sistema Xantina/Xantina Oxidase aumentou a proliferação de T CD8+ isolados de camundongos imunizados com DNA-HSP65 após a co-cultura destas células com DC tratadas com XaXO. O XaXO promoveu maior maturação de DC em relação ao LPS, assim como uma queda da atividade catalítica do IP, sugerindo que o aumento da proliferação de T CD8+ não está diretamente relacionado à atividade do IP. A incubação de DC com XaXO não alterou a expressão da unidade catalítica 20S, da unidade regulatória 19S ou da subunidade <font face=\"Symbol\">&#9465i. Observou-se aumento da expressão da unidade regulatória 11S e do conteúdo de proteínas ubiquitinadas. Sugere-se que 11S se acoplaria a 20S deslocando 19S, promovendo o acúmulo de proteínas ubiquitinadas e direcionando mais fragmentos para a apresentação antigênica. / To be presented in dendritic cells MHC I, antigens are processed by immunoproteasome. The aim of the study was to examine the effect of pro-oxidants in dendritic cell-induced T CD8+ lymphocyte proliferation with focus on ubiquitin-proteasome system. The co-culture of DC incubated with Xanthine/Xanthine Oxidase system and T CD8+ isolated from mice immunized with DNA-HSP65 promoted T CD8+ proliferation. XaXO incubation was more efficient in promoting DC maturation compared to LPS. In addition, XaXO incubation decreased IP catalytic activity in relation to LPS, suggesting that increased T CD8+ proliferation is not directly related to IP activity. XaXO incubation did not alter the expression of 20S catalytic subunit, 19S regulatory unit or <font face=\"Symbol\">&#9465i subunit. XaXO incubation increased 11S regulatory unit content as well as that of ubiquitinated proteins. We suggest that the DC incubation with XaXO increased 11S content favoring its coupling to 20S in detriment of 19S. This would increase ubiquitinated protein levels and direct more peptide fragments for antigen presentation.

Este trabalho objetivou avaliar os efeitos imunomoduladores das células-tronco imaturas da polpa dentária (CTIPD) sobre a diferenciação, maturação das células dendríticas derivadas de monócitos (mo-DC), sua capacidade para ativar linfócitos T (Lin T), bem como verificar fatores solúveis liberados nos cocultivos celulares. As analises foram feitas por citometria de fluxo. Foi observado que mo-DC tiveram a diminuição de moléculas relacionadas à diferenciação para mo-DC e o aumento de moléculas relacionados ao estado precursor, o que parece ter refletido na maturação para mDC, verificado pela diminuição das moléculas de maturação. As mo-DC tiverem sua função em induzir a proliferação de Lin T reduzida, além, de favorecer o aumento da proporção de Lin T CD4+FoxP3+IL-10+ e Lin T CD4+FoxP3+IFN-<font face=\"Symbol\">g+. A mensuração dos fatores solúveis dos cocultivos mostrou que houve aumento de fatores anti-inflamatórios e redução de fatores pró-inflamatórios. Futura investigações podem suportar o uso das CTIPD em uma abordagem imunomoduladora utilizando DC em aplicações clínicas. / This study aimed to evaluate the immunomodulatory effects of immature stem cells from dental pulp on differentiation, maturation of monocyte-derived dendritic cells (mo-DC), their ability to activate T cells, as well as identify soluble factors released in cellular cocultures. The analyzes were performed by flow cytometry. It was observed a decrease of molecules related to mo-DC differentiation and an increase of molecules related to precursor state, which seems to have reflected to mDC maturation verified by reduction of maturation molecules. The mo-DC have their role in inducing T cells proliferation reduced, in addition, favored increase CD4+FoxP3+IL-10+ and CD4+FoxP3+IFN-<font face=\"Symbol\">g+ T cells population proportion. The measurement of soluble factors from coculture showed an increase of anti-inflammatory factors and a reduction of pro-inflammatory factors. Future research may support the use immature stem cells from dental pulp in an immunomodulatory approach using DC in clinical applications.

O citomegalovírus (CMV) é uma séria ameaça aos receptores de transplante de medula óssea. A reativação está associada com uma imunidade mediada por células TCD8+ defeituosa. Nosso objetivo foi correlacionar as diferentes subpopulações de células TCD8+ com a reconstituição imunológica dos pacientes, especificamente a imunidade anti-CMV, analisando as subpopulações de células T infundidas nas diferentes modalidades de transplante de medula óssea. Receptores de transplante alogênico de células tronco mobilizadas para o sangue periférico (n=16) ou coletadas diretamente da medula óssea (n=28) e receptores de transplante autólogo de células tronco mobilizadas para o sangue periférico (n=22) foram avaliados. Verificamos que as transferências de células mobilizadas para o sangue periférico dos doadores, tanto nos transplantes alogênicos como autólogos, são proporcionalmente enriquecidas por subpopulações de células memória efetora e efetora, comparadas às transferências de células procedentes diretamente da medula óssea. Este enriquecimento por subpopulações de células TCD8+ mais diferenciadas foi também correlacionado com maior número de células contendo altos níveis de granzima B, considerado um marcador para linfócitos citotóxicos, sendo também encontrado em maior número nas transferências de células do sangue periférico. Entretanto, no pós-transplante, observou-se que somente os receptores de transplante autólogo de células tronco mobilizadas para o sangue periférico, e não os das outras modalidades de transplante, exibiam números elevados de células T CD8+ de memória-efetora e efetora. Ao mesmo tempo, estes receptores apresentaram menos freqüentemente episódios de reativação pelo CMV, e mais freqüentemente produziram IFN-gama em resposta ao CMV. Portanto, a transferência de células do sangue periférico, desde que em ambiente autólogo, está associada não só com a transferência de células TCD8+ com um fenótipo mais maduro, mas também com uma persistência mais prolongada das mesmas, podendo proporcionar uma resposta imunológica antiviral mais rápida e eficiente, como esperado para as células de memória versus naïve. / Cytomegalovirus (CMV) is a serious threat to the recipients of bone marrow transplantation. Reactivation is associated with defective CD8+ T cell-mediated immunity. We aimed to correlate the different subsets of CD8+ T cells with the patients\' immune reconstitution, specifically anti CMV immunity, by analyzing the CD8+ T cell subsets infused in the different types of bone marrow transplantation. Recipients of allogeneic transplant of peripheral blood stem cells (n=16) or bone marrow (n=28) and recipients of autologous transplant of peripheral blood stem cells (n=22) were evaluated. We show that infusions of stem cells derived from donor\'s peripheral blood, either allogeneic or autologous, are proportionally enriched for the memory-effector and effector phenotypes, compared to the infusions of stem cells of bone marrow origin. This increased number of more differentiated subsets of CD8+ T cells was also correlated with an increased number of cells containing high levels of granzyme B, which is another reliable marker of cytotoxic lymphocyte, and which was also more evident in autologous recipients. However, post-transplant, we observed that only the recipients of autologous peripheral blood cells, and not the recipients of the other transplant modalities, exhibited very high numbers of memory-effector and effector TCD8+ cells. At the same time, they less frequently presented CMV reactivation, and more frequently produced IFN-gama in response to CMV antigens. Thus, transfer of stem cells from peripheral blood, provided in an autologous setting, is associated with transfer and prolonged survival of CD8+ T cells with a more mature phenotype, which may provide a more rapid and efficient anti-viral immune response, as expected for memory versus naïve cells.

O citomegalovírus (CMV) é uma séria ameaça aos receptores de transplante de medula óssea. A reativação está associada com uma imunidade mediada por células TCD8+ defeituosa. Nosso objetivo foi correlacionar as diferentes subpopulações de células TCD8+ com a reconstituição imunológica dos pacientes, especificamente a imunidade anti-CMV, analisando as subpopulações de células T infundidas nas diferentes modalidades de transplante de medula óssea. Receptores de transplante alogênico de células tronco mobilizadas para o sangue periférico (n=16) ou coletadas diretamente da medula óssea (n=28) e receptores de transplante autólogo de células tronco mobilizadas para o sangue periférico (n=22) foram avaliados. Verificamos que as transferências de células mobilizadas para o sangue periférico dos doadores, tanto nos transplantes alogênicos como autólogos, são proporcionalmente enriquecidas por subpopulações de células memória efetora e efetora, comparadas às transferências de células procedentes diretamente da medula óssea. Este enriquecimento por subpopulações de células TCD8+ mais diferenciadas foi também correlacionado com maior número de células contendo altos níveis de granzima B, considerado um marcador para linfócitos citotóxicos, sendo também encontrado em maior número nas transferências de células do sangue periférico. Entretanto, no pós-transplante, observou-se que somente os receptores de transplante autólogo de células tronco mobilizadas para o sangue periférico, e não os das outras modalidades de transplante, exibiam números elevados de células T CD8+ de memória-efetora e efetora. Ao mesmo tempo, estes receptores apresentaram menos freqüentemente episódios de reativação pelo CMV, e mais freqüentemente produziram IFN-gama em resposta ao CMV. Portanto, a transferência de células do sangue periférico, desde que em ambiente autólogo, está associada não só com a transferência de células TCD8+ com um fenótipo mais maduro, mas também com uma persistência mais prolongada das mesmas, podendo proporcionar uma resposta imunológica antiviral mais rápida e eficiente, como esperado para as células de memória versus naïve. / Cytomegalovirus (CMV) is a serious threat to the recipients of bone marrow transplantation. Reactivation is associated with defective CD8+ T cell-mediated immunity. We aimed to correlate the different subsets of CD8+ T cells with the patients\' immune reconstitution, specifically anti CMV immunity, by analyzing the CD8+ T cell subsets infused in the different types of bone marrow transplantation. Recipients of allogeneic transplant of peripheral blood stem cells (n=16) or bone marrow (n=28) and recipients of autologous transplant of peripheral blood stem cells (n=22) were evaluated. We show that infusions of stem cells derived from donor\'s peripheral blood, either allogeneic or autologous, are proportionally enriched for the memory-effector and effector phenotypes, compared to the infusions of stem cells of bone marrow origin. This increased number of more differentiated subsets of CD8+ T cells was also correlated with an increased number of cells containing high levels of granzyme B, which is another reliable marker of cytotoxic lymphocyte, and which was also more evident in autologous recipients. However, post-transplant, we observed that only the recipients of autologous peripheral blood cells, and not the recipients of the other transplant modalities, exhibited very high numbers of memory-effector and effector TCD8+ cells. At the same time, they less frequently presented CMV reactivation, and more frequently produced IFN-gama in response to CMV antigens. Thus, transfer of stem cells from peripheral blood, provided in an autologous setting, is associated with transfer and prolonged survival of CD8+ T cells with a more mature phenotype, which may provide a more rapid and efficient anti-viral immune response, as expected for memory versus naïve cells.

INTRODUÇÃO: A hanseníase é uma doença infectocontagiosa granulomatosa crônica, causada por Mycobacterium leprae e representa ainda um problema de saúde pública no Brasil. Em média 30-40% dos doentes tem risco de desenvolver reações hansênicas, que são considerados estados de exacerbação da resposta imunológica do hospedeiro a antígenos M. leprae. Está bem descrita a importância de células T reguladoras (Tregs) em infecções bacterianas crônicas. Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram aumento da proporção de Tregs in situ e em sangue periférico de pacientes multibacilares (mas não em paucibacilares), assim como diminuição da proporção de Tregs na reação tipo 2 (porém não na reação tipo 1), sugerindo a participação deste subtipo celular na imunopatogênese da hanseníase. Entretanto, a baixa frequência de Tregs tem dificultado o estudo da sua capacidade funcional. OBJETIVO: Estabelecer protocolo de expansão de Tregs funcionais em pacientes com hanseníase e, posteriormente, avaliar a capacidade funcional das Tregs expandidas. METODOLOGIA: Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram separadas e cultivadas, com anti-CD3 e anti-CD28, acrescidos de IL-2 e rapamicina, por 21 dias. Para avaliar a capacidade funcional das Tregs expandidas, realizou-se um ensaio de co-cultivo das Tregs expandidas e PBMCs autólogas (marcadas com CFSE). Utilizou-se diferentes proporções de Tregs:PBMCs (1:1, 1:2 e 1:5). A casuística foi composta por 29 indivíduos diagnosticados com hanseníase, divididos em quatro grupos, de acordo com a classificação de Ridley e Jopling. Além disso, coletou-se material de 6 indivíduos saudáveis, com a finalidade de caracterizar o pool celular do protocolo de expansão. Para isso, culturas de expansão de indivíduos saudáveis foram submetidas a dois protocolos distintos de purificação celular (beads magnéticas e cell sorting), além de imunofenotipagem das moléculas CD39, PD-1 e LAG3. RESULTADOS: Tregs dos pacientes multibacilar sem reação, nas proporções 1:2 e 1:5, e no grupo reacional tipo 2, na proporção 1:5, mostraram maior capacidade supressora, quando comparados aos grupos pacubacilar sem reação e reacional tipo 2, respectivamente. No grupo de indivíduos saudáveis não houve diferenças na capacidade supressora das Tregs obtidas por separação por beads magnéticas e Tregs obtidas por cell sorting, e não houve expressão significativa de células PD-1+ e LAG-3+ nas culturas de expansão. CONCLUSÃO: Em todos os indivíduos testados, independente da classificação clínica da hanseníase, o protocolo proposto resultou em uma expansão exponencial de uma linhagem de Tregs com atividade supressora, porém com sugestão preliminar de maior eficiência supressora das Tregs na forma MB (com ou sem reação), corroborando a correlação entre atividade supressora de Tregs e maior carga bacilar. Além disso, o protocolo com beads magnéticas se mostrou tão eficaz quanto o protocolo de purificação por cell sorting. A imunofenotipagem das Tregs expandidas de indivíduos saudáveis indicou que não havia número significativo de células exaustas ao fim de nosso protocolo, assim como não houve crescimento concomitante de células T reguladoras do tipo 1 na cultura de expansão / INTRODUCTION: Leprosy is a chronic granulomatous infectious disease caused by Mycobacterium leprae and a public health problem in Brazil. On average, 30-40% of patients are at risk of developing leprosy reactions, which are considered as states of exacerbation of the host\'s immune response to M. leprae antigens. The importance of regulatory T cells (Tregs) in chronic bacterial infections has been well described, but their role in leprosy remains unclear. Previous studies from our group have shown increased proportions of Tregs in situ and in peripheral blood of multibacillary patients (but not in paucibacillary patients), and decrease in the proportion of Tregs in type 2 reaction (but not type 1 reaction), reinforcing the role played by these cells in the immunopathogenesis of leprosy. However, the low numbers of Tregs preclude further studies on their functional capabilities. OBJECTIVE: To establish a protocol for expansion of functional Tregs in patients with leprosy and evaluate the functional capacity of the expanded Tregs. METHOD: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were separated and cultured under anti-CD3 and anti-CD28 stimulation, plus IL-2 and rapamycin for 21 days. To evaluate the functional capacity of the expanded Tregs, a co-culture assay of the expanded Tregs and autologous PBMCs (labeled with CFSE) was performed. Different ratios of Tregs: PBMCs (1: 1, 1: 2 and 1: 5) were used. The sample consisted of 29 individuals diagnosed with leprosy, divided into four groups, according to the Ridley and Jopling classification. In addition, samples from 6 healthy individuals were collected to characterize better the cellular characteristics of the expansion protocol. For this, cultures of healthy individuals PBMC were submitted to two distinct cell purification protocols (magnetic beads and cell sorting), as well as immunophenotyping of the molecules CD39, PD-1 and LAG3. RESULTS: Expanded Tregs from the multibacillary patients without reaction, at 1:2 and 1:5 ratios, and with type 2 reaction, at 1: 5 ratio, showed greater suppressive capacity that the respective paucibacillary groups. Tregs from healthy individuals obtained through magnetic beads separation and through cell sorting did not show differences in suppressor capacity, and there was no significant expression of PD-1 + and LAG-3 + on cells of the expansion cultures. CONCLUSION: In all individuals tested, irrespective of the leprosy classification, the proposed protocol resulted in an exponential expansion of Tregs with suppressive capacity; however, preliminary evidence indicated stronger suppressor activity of the Tregs from multibacillary patients (with or without reaction), suggesting a direct correlation between Tregs activity and bacillary load in leprosy. In addition, our protocol with magnetic beads proved to be as effective as the cell sorting protocol. Immunophenotyping of expanded Tregs from healthy subjects revealed that there was no significant number of exhausted cells at the end of our protocol, nor there was the concomitant outgrowth of type 1 regulatory T cells in the expansion protocol

Introdução: A sepse é causada por uma resposta desregulada a uma infecção cujo tratamento é de suporte, inexistindo alternativas imunomoduladoras. Linfócitos T reguladores são responsáveis por limitar a inflamação, mas podem causar imunossupressão e os Th17 são pró-inflamatórios e responsáveis pela imunidade de mucosas; ambos apresentam-se elevados nos pacientes com sepse. A PARP é uma enzima sensor de dano ao DNA que é continuamente ativada na sepse, sendo importante também na diferenciação¸ dos linfócitos T reguladores e como coativador de NF-kB. Neste estudo, avaliamos se o tratamento com inibidor de PARP é capaz de manter os linfócitos Th17 e T reguladores próximos aos valores basais, impedindo que ocorra a resposta exacerbada causada por estas células e servindo, portanto, como opção de tratamento imunomodulador. Métodos: Camundongos machos da linhagem C57Bl/6 com 7 semanas de idade e pesando entre 20-25 gramas foram submetidos à ligadura e punção cecal e receberam tratamento com olaparibe (10mg/Kg) após 30 minutos e após 8 horas da cirurgia. Baço, timo e sangue foram coletados e utilizados para análise das populações de linfócitos T reguladores e Th17, citocinas e miRNAs. Resultados: O modelo de ligadura e punção cecal foi capaz de mimetizar a linfopenia encontrada em pacientes e o aumento de linfócitos T reguladores e Th17. O tratamento com olaparibe reduziu os linfócitos T reguladores no baço tanto em porcentagem quanto em quantidade de células. Tanto o nível de IL-10 quanto a expressão do miRNA 146a-5p caíram em ambos os grupos CLP, sugerindo menor atividade supressora destes linfócitos. No sangue houve aumento dos linfócitos T reguladores, mas apenas o grupo não tratado apresentou alta de IL-10, sugerindo que o tratamento conteve o perfil supressor. No timo o tratamento parece agir por uma forma diferente; embora ocorra aumento dos linfócitos T reguladores, o grupo tratado teve aumento da expressão do miRNA 17a-5p, que reduz a atividade supressora desses linfócitos, mostrando que as células produzidas tem sua atividade supressora alterada, o que é corroborado pelo não aumento de IL-10 nesse grupo. Os linfócitos Th17, que são pró-inflamatórios, foram controlados com o tratamento no baço e no sangue. Isso possivelmente ocorreu pela ação da PARP que impediu o aumento de citocinas como IL-1beta, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, INF-y, que estavam elevadas apenas no grupo não tratado. Além disso, a relação entre linfócitos Th17 e T reguladores foi controlada, sugerindo melhora no desfecho clínico. Conclusões: O tratamento com olaparibe se mostrou eficiente em reduzir as respostas inflamatória (causada pelo Th17) e supressora (causada pelo Treg) neste modelo, talvez pela alteração de citocinas e da expressão dos miRNA 17a-5p e 146a-5p / Introduction: Sepsis is caused by a dysregulated response to an infection whose treatment is supportive, and there are no immunomodulatory alternatives. Regulatory T lymphocytes are responsible for limiting inflammation but may cause immunosuppression and Th17 are proinflammatory and responsible for mucosal immunity; both are elevated in patients with sepsis. PARP is a DNAdamaging enzyme that is continuously activated in sepsis, also important in the di_erentiation of regulatory T lymphocytes and as a cofactor of NF-kB. In this study, we evaluated whether treatment with PARP inhibitor is able to keep the T regulatory and Th17 lymphocytes close to the baseline values, preventing the exacerbated response caused by these cells and therefore serving as an option for immunomodulatory treatment. Methods: C57Bl male mice at 7 weeks of age weighing between 20-25 grams were submited at cecal binding and puncture and received treatment with olaparib (10mg/kg) after 30 minutes and after 8 hours of the surgery. Spleen, thymus and blood cells have been used for analysis of T regulatory and Th17 lymphocytes populations, cytokines and miRNA. Results: The cecal ligation and puncture model was able to mimic the lymphopenia found in patients and the increase of T regulatory and Th17 lymphocytes. Treatment with olaparib reduced the T regulatory lymphocytes in the spleen in both percentage and number of cells. Both the IL-10 level and the 146a-5p miRNA expression fell in both CLP groups, suggesting lower suppressor activity of these lymphocytes. In the blood there was an increase in the T regulatory lymphocytes, but only the untreated group showed high IL-10, suggesting that the treatment contained the suppressor profile. In the thymus the treatment seems to act in a di_erent way; although there is an increase in the T regulatory lymphocytes, the treated group had increased expression of 17a-5p miRNA, which reduces the suppressive activity of these lymphocytes, showing that the cells produced have their supressor activity altered, which is corroborated by the non-increase of IL- 10 in this group. Th17 lymphocytes, which are proinflammatory, were controlled with treatment in the spleen and blood. This was possibly due to the action of PARP which prevented the increase of cytokines such as IL-1beta, IL-6, TNF-alpha, IL-17A, INF-y which were raised only in the group not treated. In addition, the ratio between Th17 and T regulatory lymphocytes was controlled, suggesting improvement in clinical outcome. Conclusions: The treatment with olaparib was e_cient in reducing inflammatory responses (caused by Th17) and suppressor (caused by Treg) in this model, perhaps due to the alteration of cytokines and the expression of miRNAs 17a-5p and 146a-5p

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa, crônica, não contagiosa, causada por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. A interação entre a espécie de Leishmania e os mecanismos da resposta imune do hospedeiro resulta em um amplo espectro de manifestações clínicas, histopatológicas e imunopatológicas na infecção humana. No Brasil, esta endemia representa um sério problema de saúde pública, sendo o estado do Maranhão responsável por 13% da casuística nacional. O objetivo deste estudo foi caracterizar o perfil imunopatológico de lesões cutâneas de 22 pacientes com LTA, causada por Leishmania (Viannia) sp, oriundos do estado do Maranhão. A reação de imunoistoquímica em biópsias de pele foi realizada empregando os anticorpos monoclonais anti-humano CD68, CD1a, fator XIIIa, CD4, CD8, IL-10 e IFN-g e os anticorpos policlonais anti-Lisozima, Foxp3 e TGF-b. A análise histológica das lesões demonstrou a presença de intenso infiltrado inflamatório na derme composto de macrófagos, linfócitos e plasmócitos com formação de granuloma na maioria dos casos. Formas sugestivas de Leishmania foram observadas em 90,9% dos casos examinados. A análise imunoistoquímica mostrou densidade superior de macrófagos ativados (4824,0 células/mm²) quando comparados aos não ativados 3458,9 células/mm²). Foi detectada densidade de células de Langerhans (CD1a+) de 310,4 células/mm² na epiderme e células dendríticas dérmicas (fator XIIIa+) de 633,6 células/mm² na derme. Foi verificada ainda, predominância de linfócitos T CD8+ (2374,1células/mm²) em relação a T CD4+ (1267,6 células/mm²). A densidade de células Treg Foxp3+ foi de 301,3 células/mm². A análise de correlação mostrou correlação positiva entre células TGF-b+ e T CD8+ e fator XIIIa+; e uma correlação negativa entre a densidade de células IFN-g+ e TGF-b+. As lesões de pacientes infectados com L. (Viannia) sp, apresentaram maior densidade de células Treg Foxp3+, e IL-10+ e IFN-g+ quando comparadas a de pacientes infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis. A densidade de células TGF-b+ mostrou-se semelhante nos dois grupos de pacientes. A avaliação dos marcadores de acordo com o tempo de evolução da doença, não mostrou diferenças entre as densidades de células imunomarcadas. Esses dados indicam que embora exista um perfil imunopatológico associado ao controle da infecção, a presença de uma resposta regulatória no sítio da lesão pode estar relacionada à persistência parasitária. / American tegumentary leishmaniasis (ATL) is a chronic, non contagious, infectious disease caused by different protozoan parasite species of the genus Leishmania. The interaction between Leishmania species and host response results in a wide spectrum of clinical, histopathological and immunopathological presentations in humans infection. In Brazil, this endemic disease is a serious public health problem and Maranhão State is responsible for 13% of Brazilian cases. The aim of this study was to characterize the immunopathology of lesions from 22 biopsies of patients with ATL, caused by Leishmania (Viannia) sp, from Maranhão State. Immunohistochemistry was carried out by incubating skin biopsies with monoclonal mouse anti- human CD68, CD1a, XIIIa factor, CD4, CD8, IL-10 and IFN-g and polyclonal rabbit\'s anti- human lysozyme, Foxp3 and TGF-b. Analysis of skin biopsies demonstrated a dense inflammatory infiltrate in the dermis, characterized by the presence of mononuclear cells, mainly lymphocytes, macrophages, plasma cells and granulomas in most samples. Suggestive forms of amastigotes were detected in 90.9% samples observed. Immunohistochemistry showed high levels of activated macrophages (4824.0 cell/mm²) when compared to inactive macrophages (3458.9 cells/mm²). In the epidermis, the densities of Langerhans Cells (CD1a+) were 310.4 cells/mm², while in the dermis the densities of dermal dendritic cells (factor XIIIa+) were 633,6 cells/mm². High density of CD8 T+ lymphocytes (2374.1 cell/mm²) has been found compared to CD4+ T lymphocytes (1267.6 cell/mm²). The cellular density of Treg (Foxp3+) was 301 cells/mm². Among cell markers there were positive correlations between TGF-b-producing cells and CD8+ T lymphocytes and between TGF-b-producing cells and dendritic dermal cells, as well as a negative correlation between TGF-b-producing cells and IFN-g-producing cells. Patients infected with L. (Viannia) sp. presented increased densities of Treg cells and IL-10 and IFN-g- producing cells compared to Leishmania (Viannia) braziliensis infected patients. The density TGF-b+ producing cells was similar in both groups of patients. Evaluation of Immunological markers according time of infection showed no differences in the densities of immunostain cell. Results suggest that the profile of immunopathological response is associated to the control of infection, although the presence of a regulatory response at the site of infection can be responsible to the persistence of parasite in skin.

Para elucidar os mecanismos envolvidos na inibição da hipersensibilidade do tipo I em proles murinas mediada pela imunização materna com Ovalbumina (OVA), as proles foram avaliadas quanto aos linfócitos T&#947;&#948; produtores de IL-17 (CD27-). A imunização materna com OVA reduziu a expressão de CD27, o que também se refletiu nos pulmões, e a produção de IL-17 por linfócitos T&#947;&#948; das proles. A redução da expressão de CD27 também foi evidenciada em linfócitos T&#947;&#948; intratímicos das proles após a transferência passiva de anticorpos IgG alérgeno específicos para fêmeas gestantes não imunizadas e in vitro em resposta a estes mesmos anticorpos, efeito que parece envolver a expressão de receptores para IgG expressos por outras células presentes no timo. As evidências obtidas indicam que a imunização materna influi na maturação tímica de linfócitos inibindo a população que colaborara com a inflamação alérgica. Aparentemente, os anticorpos IgG maternos são responsáveis por este fenômeno e a população estudada está envolvida na inibição da inflamação alérgica observada nas proles. / To elucidate the mechanisms involved in inhibition of type I hypersensitivity in murine offsprring mediated by maternal immunization with Ovalbumin (OVA), the offspring were evaluated as IL-17-producing &#947;&#948;T cells (CD27-). Maternal immunization with OVA reduced the expression of CD27, which was also reflected in the lungs, and the production of IL-17 by &#947;&#948;T cells of offspring. Reduction of CD27 expression was also evidenced in intrathymic &#947;&#948;T cells of offspring after passive transfer of allergen-specific IgG antibodies to non-immunized pregnant females and in vitro in response to these same antibodies, effect that seems to involve the expression of IgG receptors expressed by other cells present in the thymus. Evidence obtained indicates that maternal immunization influences the thymic maturation of lymphocytes by inhibiting the population that collaborate with allergic inflammation. Apparently, maternal IgG antibodies are responsible for this phenomenon and the population studied is involved in the inhibition of allergic inflammation observed in offspring.