Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-11T11:14:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1434365 bytes, checksum: 2f23d19c271ae947874a54a48ca53665 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T11:14:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1434365 bytes, checksum: 2f23d19c271ae947874a54a48ca53665 (MD5) Previous issue date: 2016-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O óleo de coco virgem (Cocos nucifera L.) apresenta composição diferenciada dos demais óleos, com maiores proporções de ácidos graxos saturados (SFA), sendo a maior parte ácidos graxos de cadeia média (AGCM). Desses, a maior proporção é representada pelo ácido láurico (C12:0), seguida pelo ácido mirístico (C14:0). Essa composição diferenciada está relacionada a diferenças em sua absorção e metabolismo no organismo. Contudo, os estudos não são claros quanto à quantidade desse óleo que deve ser ingerida por dia. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos metabólicos da substituição da fonte lipídica da dieta por óleo de coco virgem em ratas Wistar. Foi realizado um experimento laboratorial e foram utilizados 32 animais, aleatoriamente divididos em 4 grupos experimentais (n=8). Durante 10 semanas os animais receberam dietas normolipídicas, que diferiam de acordo com a fonte lipídica utilizada, sendo, G1 – controle AIN-93M, óleo de soja; G2 – substituição de 10,4% do total de lipídeos por óleo de coco; G3 – substituição de 50% do total de lipídeos por óleo de coco; G4 – substituição de 95% do total de lipídeos por óleo de coco. Ao final do período experimental, não foram observadas alterações nos parâmetros antropométricos advindos do consumo de óleo de coco (p>0,05), contudo, em G3 houve elevação das concentrações séricas de triglicerídeos, comparado aos demais grupos que receberam óleo de coco (p=0,004). Além disso, no tecido hepático dos animais de G4 foram encontrados maiores teores de ácido cáprico (C10:0) e de ácido mirístico, em comparação a G2 (p=0,002) e a G1 e a G2 (p<0,001), respectivamente. As quantidades de SFA total foram maiores nos grupos G3 e G4, em comparação com os demais grupos (p=0,002). Com relação aos diferentes tecidos adiposos, o tecido adiposo intra-abdominal apresentou maiores concentrações de C10:0 em G3 e G4 (p<0,001). Nos tecidos adiposos mesentérico e perirrenal, foram observadas maiores concentrações desse ácido graxo em G4, seguido por G3 (p<0,001 e p=0,001, respectivamente). As quantidades de C14:0 também foram maiores em G3 e G4 nos tecidos adiposos intra-abdominal (p<0,001) e perirrenal (p=0,001), em comparação aos demais grupos. Já no tecido adiposo mesentérico, esse ácido graxo apresentou-se aumentado em G4, seguido por G3 (p<0,001). A quantidade de SFA total foi maior em G4 nos tecidos adiposo intra- abdominal (p<0,001), mesentérico (p=0,008) e perirrenal (p=0,005). O consumo de óleo de coco também elevou as concentrações das citocinas pró-inflamatórias IL-1β (p=0,039) e IL-12 (p=0,014). Além disso, foi possível observar maior atividade da enzima catalase nos grupos que receberam óleo de coco (p<0,001) e redução de Malondialdeído em G3, em comparação a G1 (p=0,021). Assim, conclui-se que, apesar do consumo de óleo de coco, em uma dieta normolipídica, aumentar a atividade da enzima catalase e reduzir a peroxidação lipídica, a substituição de maiores quantidades dos lipídeos da dieta por óleo de coco pode elevar as concentrações plasmáticas de triglicerídeos, bem como levar ao maior acúmulo de C10:0, C14:0 e SFA total, tanto no fígado quanto nos diferentes tecidos adiposos. Esses resultados, associados ao aumento das concentrações de citocinas pró-inflamatórias no tecido adiposo, ressaltam que o consumo desse óleo deve ser realizado com cuidado e atenção e, portanto, mais estudos se fazem necessários para determinação da quantidade adequada a ser consumida. / Virgin coconut oil (Cocos nucifera L.) presents different composition compared to other oils, with higher proportions of saturated fatty acids (SFA), being most of them medium-chain fatty acids (MCFA). The lauric acid (C12:0) represents the largest proportion, followed by myristic acid (C14:0). This different composition is related to differences in their absorption and metabolism in the body. However, the studies are not clear about the amount of this oil should be consumed per day. Thus, the aim of this study was to evaluate the metabolic effects of replacing the fat source of the diet for virgin coconut oil in Wistar rats. A laboratory experiment was conducted using 32 animals randomly divided into 4 experimental groups (n=8). For 10 weeks, the animals received normolipidics diets, which differed according to the lipid source used, being G1 - AIN-93M control soybean oil; G2 - replacing 10.4% of total lipids for coconut oil; G3 - replacement of 50% of total lipids for coconut oil; G4 - replacing 95% of total lipids for coconut oil. At the end of the trial period, no changes were observed in anthropometric parameters arising from coconut oil consumption (p>0.05), however, in G3 there was an increase of serum triglycerides, compared to other groups who received coconut oil (p=0.004). Furthermore, in liver tissue of animals G4 were found higher capric acid content (C10:0) and myristic acid, in comparison to G2 (p=0.002) and G1 and G2 (p<0.001), respectively. The total amounts SFA were higher in groups G3 and G4, as compared to the other groups (p=0.002). With regard to the different adipose tissue, intra-abdominal adipose tissue showed higher concentrations of C10:0 in G3 and G4 (p<0.001). In perirenal and mesenteric adipose tissue were observed higher concentrations of this fatty acid in G4, followed by G3 (p<0.001 and p=0.001, respectively). The amounts of C14:0 were also higher in G3 and G4 in intraabdominal adipose tissue (p<0.001) and perirenal (p=0.001) compared to the other groups. In the mesenteric adipose tissue, this fatty acid was increased in G4, followed by G3 (p<0.001). The total amount of SFA was higher at G4 in intraabdominal adipose tissue (p<0.001), mesenteric (p=0.008) and perirenal (p=0.005). The consumption of coconut oil also increased IL-1β concentrations (p=0.039) and IL-12 (p=0.014). Furthermore, we observed increased activity of the enzyme catalase in the groups that received coconut oil (p<0.001) and reduced malondialdehyde in G3, compared to G1 (p=0.021). Thus, we can conclude that although coconut oil consumption in a normolipidic diet increase the catalase enzyme activity and reduce lipid peroxidation, the replacement of higher amounts of dietary lipids of coconut oil may raise plasma concentrations of triglycerides and lead to greater accumulation of C10:0, C14:0 and the total SFA, both in the liver and in the different adipose tissues. These results, associated with increased concentrations of pro- inflammatory cytokines in adipose tissue, point out that the consumption of oil should be carried out with care and attention and therefore more studies are necessary to determine the appropriate amount to be consumed.

Os biossurfatantes (BS) são produtos de origem microbiana com propriedades tensoativas e emulsificantes. Estes compostos são candidatos para substituir os surfatantes sintéticos em aplicações industriais devido à sua menor toxicidade, maior biodegradabilidade, maior diversidade química e maior eficiência e efetividade em condições físicas extremas de salinidade, pressão e temperatura. O uso comercial e industrial dos BS ainda não é sustentável devido a seu alto custo de produção relacionado principalmente ao baixo rendimento. A utilização de substratos de baixo custo e ferramentas estatísticas para melhorar o rendimento de produção dos BS são duas das principais estratégias para tratar este problema. O objetivo do trabalho foi estudar a produção e recuperação do BS produzido por B. luteolum, visando o melhoramento na sua produção através do uso do planejamento fatorial e caracterizar a estrutura química do BS. A partir dos resultados, determinou-se que a adsorção em resina foi mais efetiva para a recuperação do BS comparada com a precipitação ácida. A produção do BS foi melhorada através de um planejamento fatorial 23 usando como fatores as concentrações da fonte de carbono (vaselina), a fonte de nitrogênio (nitrato de amônio) e a água do mar artificial e como resposta a tensão superficial da solução 0,1% de BS. A maior produção de BS foi obtida com 4% de fonte de carbono, 2% de fonte de nitrogênio e 20% de água do mar artificial gerando tensão superficial de 27 mNm-1. O BS foi caracterizado como uma mistura de lipopeptídeos com ácidos graxos cujo comprimento da cadeia variou entre 10-18 unidades de carbono e um conteúdo de proteína total de 5%. Três estruturas químicas foram sugeridas para os compostos ativos: dois prolina-lipídeos com os ácidos graxos C16:0 e C18:0 respectivamente e um lipopeptídeo com uma sequência peptídica Phe-Al-X-X-Pro-Pro-Thr (X=Leu/Ile) ligada a uma cadeia de ácido graxo C16:0. Não observou-se atividade antimicrobiana contra as cepas de S. aureus, E. coli, S. enteritidis, L. monocytogenes e S. mutans nas faixas de concentrações de BS testadas. O uso de vaselina como substrato para a produção do BS sugere que a bactéria e o BS podem ser explorados para aplicações como a biorremediação e a recuperação melhorada de petróleo (EOR). / Biosurfactants (BS) are microbial-derived molecules showing tensoactive and emulsification properties. These compounds are candidates to replace synthetic surfactants for industrial applications due to their less toxicity, greater biodegradation capacity, greater chemical diversity and greater efficiency and effectiveness under extreme physical conditions of salinity, pressure and temperature. Commercial and industrial use of BS is not sustainable due their high production cost mainly related to low production yields. The use of low cost substrates and statistical tools to enhance the production yield of biosurfactants are two of the main strategies to deal with that problem. The objective of this work was to study the production and recovery of the BS produced by B. luteolum, aiming to enhance its production through a factorial experimental design, and to characterize the chemical structure of the BS. It was found that resin adsorption was more effective than acid precipitation to recover the BS. The production of BS was enhanced through a factorial experimental design 23 using the concentrations of the carbon source (mineral oil), the nitrogen source (ammonium nitrate) and artificial seawater as the factors and the surface tension of a solution 0,1% of BS as the response. The value of factors that enhanced the production of BS were 4% of carbon source, 2% of nitrogen source and 20% of artificial sea water showing a surface tension of 27mNm-1. The BS was characterized as a mix of lipopeptides with fatty acid chains varying between 10-18 carbon units and a total protein content of 5%. Three chemical structures were proposed for the active compounds: two proline-lipids with the fatty acid chains C16:0 e C18:0 respectively and a lipopeptide with a peptide sequence Phe-Al-X-X-Pro-Pro-Thr (X=Leu/Ile) linked to a fatty acid chain C16:0. BS did not show antimicrobial activity against S. aureus, E. coli, S. enteritidis, L. monocytogenes and S. mutans at concentration range tested. The use of mineral oil as a substrate for the production of the BS suggests that the bacteria and the BS can be explore for applications as bioremediation and enhanced oil recovery (EOR).

Os biossurfatantes (BS) são produtos de origem microbiana com propriedades tensoativas e emulsificantes. Estes compostos são candidatos para substituir os surfatantes sintéticos em aplicações industriais devido à sua menor toxicidade, maior biodegradabilidade, maior diversidade química e maior eficiência e efetividade em condições físicas extremas de salinidade, pressão e temperatura. O uso comercial e industrial dos BS ainda não é sustentável devido a seu alto custo de produção relacionado principalmente ao baixo rendimento. A utilização de substratos de baixo custo e ferramentas estatísticas para melhorar o rendimento de produção dos BS são duas das principais estratégias para tratar este problema. O objetivo do trabalho foi estudar a produção e recuperação do BS produzido por B. luteolum, visando o melhoramento na sua produção através do uso do planejamento fatorial e caracterizar a estrutura química do BS. A partir dos resultados, determinou-se que a adsorção em resina foi mais efetiva para a recuperação do BS comparada com a precipitação ácida. A produção do BS foi melhorada através de um planejamento fatorial 23 usando como fatores as concentrações da fonte de carbono (vaselina), a fonte de nitrogênio (nitrato de amônio) e a água do mar artificial e como resposta a tensão superficial da solução 0,1% de BS. A maior produção de BS foi obtida com 4% de fonte de carbono, 2% de fonte de nitrogênio e 20% de água do mar artificial gerando tensão superficial de 27 mNm-1. O BS foi caracterizado como uma mistura de lipopeptídeos com ácidos graxos cujo comprimento da cadeia variou entre 10-18 unidades de carbono e um conteúdo de proteína total de 5%. Três estruturas químicas foram sugeridas para os compostos ativos: dois prolina-lipídeos com os ácidos graxos C16:0 e C18:0 respectivamente e um lipopeptídeo com uma sequência peptídica Phe-Al-X-X-Pro-Pro-Thr (X=Leu/Ile) ligada a uma cadeia de ácido graxo C16:0. Não observou-se atividade antimicrobiana contra as cepas de S. aureus, E. coli, S. enteritidis, L. monocytogenes e S. mutans nas faixas de concentrações de BS testadas. O uso de vaselina como substrato para a produção do BS sugere que a bactéria e o BS podem ser explorados para aplicações como a biorremediação e a recuperação melhorada de petróleo (EOR). / Biosurfactants (BS) are microbial-derived molecules showing tensoactive and emulsification properties. These compounds are candidates to replace synthetic surfactants for industrial applications due to their less toxicity, greater biodegradation capacity, greater chemical diversity and greater efficiency and effectiveness under extreme physical conditions of salinity, pressure and temperature. Commercial and industrial use of BS is not sustainable due their high production cost mainly related to low production yields. The use of low cost substrates and statistical tools to enhance the production yield of biosurfactants are two of the main strategies to deal with that problem. The objective of this work was to study the production and recovery of the BS produced by B. luteolum, aiming to enhance its production through a factorial experimental design, and to characterize the chemical structure of the BS. It was found that resin adsorption was more effective than acid precipitation to recover the BS. The production of BS was enhanced through a factorial experimental design 23 using the concentrations of the carbon source (mineral oil), the nitrogen source (ammonium nitrate) and artificial seawater as the factors and the surface tension of a solution 0,1% of BS as the response. The value of factors that enhanced the production of BS were 4% of carbon source, 2% of nitrogen source and 20% of artificial sea water showing a surface tension of 27mNm-1. The BS was characterized as a mix of lipopeptides with fatty acid chains varying between 10-18 carbon units and a total protein content of 5%. Three chemical structures were proposed for the active compounds: two proline-lipids with the fatty acid chains C16:0 e C18:0 respectively and a lipopeptide with a peptide sequence Phe-Al-X-X-Pro-Pro-Thr (X=Leu/Ile) linked to a fatty acid chain C16:0. BS did not show antimicrobial activity against S. aureus, E. coli, S. enteritidis, L. monocytogenes and S. mutans at concentration range tested. The use of mineral oil as a substrate for the production of the BS suggests that the bacteria and the BS can be explore for applications as bioremediation and enhanced oil recovery (EOR).

Foram realizados dois ensaios experimentais a fim de avaliar diferentes níveis de lisina digestível e zinco quelato para frango de corte macho, da linhagem Ross na fase dos 22 aos 42 dias de idade. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 5 x 2, cinco níveis de lisina e dois níveis de zinco 43 e 243ppm. As dietas foram formuladas para conter 3.150 kcal de EM/kg e 19% de PB. No ensaio I, os níveis de lisina digestível foram 0,841, 0,874, 0,995, 1,019 e 1,028%, aplicados a três unidades experimentais. A unidade experimental correspondeu a 1 boxe com 30 frangos com peso médio inicial de 957,38g. Avaliaram-se características de desempenho, rendimento de cortes e composição corporal. No ensaio II, os níveis de lisina digestível foram 0.779, 0,825, 0,961, 1,066 e 1,222%, aplicados a seis repetições. A unidade experimental correspondeu a uma gaiola com três animais com peso médio inicial de 866,22g. Determinou-se, nesse estudo, o balanço de nitrogênio e a digestibilidade das dietas. Constatou-se interação do nível de lisina e zinco nas variáveis: peso final, ganho de peso, conversão alimentar, matéria seca ingerida, nitrogênio ingerido, energia bruta ingerida, energia bruta excretada e balanço energético. Porcentagem de peito e porcentagem de coxa e sobrecoxa foram crescentes pelo aumento na concentração de lisina digestível na dieta, seguindo equação linear. O melhor nível de lisina, de acordo com o desempenho, foi de 1,06% de lisina total ou 0,93% de lisina digestível para dietas com 43ppm de zinco. Para dietas com 253ppm, a exigência de lisina digestível foi igual ou maior que 1,028%. / In order to evaluate the different levels of digestible lysine and zinc chelate effect on Ross male broiler chicken from 22 to 42 days of age, two trials were carried out. The experimental design was completely randomized with a 5x2 arrangement, with treatments consisting of five levels of lysine and two levels of zinc chelate (43 and 243ppm). All diets contained 3,150 kcal of ME/kg and 19% of crude protein. In trial I, a 30 poultry pen was considered one experimental unit and three pens received the following lysine levels: 0.841, 0.874, 0.995, 1.019 and 1.028%. Average weight at pen was 957.38g. For this trial, parameters evaluated were: performance traits, cut yield and body composition. In trial II, each three birds cage, weighting 866.22g in average, was considered one experimental unit. Birds were fed in repetition another five lysine levels: 0.779, 0.825, 0.961, 1.066 and 1.222%. In this latter trial, data on nitrogen-balance and diets digestibility were determined. Interaction between lysine and zinc chelate was observed for weight at day 42, weight gain, feed:ration gain, dry matter intake, nitrogen intake, crude energy intake, crude energy excreted and energy balance. There was an increasing in breast, thigh and drumstick percentage concomitant with the increase of lysine levels on diet, following a linear equation. The most effective lysine level, accordingly to performance traits, was 1.06% of total lysine, or 0.93% of digestive lysine, when the zinc chelate level was 43ppm. A 253ppm diets required lysine levels of 1.028% or greater.

A imunização transcutânea (TCI) é uma via atrativa para o desenvolvimento de vacinação livre de agulhas, atuando nas APCs da pele, podendo substituir algumas das imunizações convencionais, em termos de facilidade, segurança e eficácia. O presente estudo avaliou a resposta imune da TCI com proteína recombinante de leptospira LipL32, uma proteína altamente conservada em cepas patogênicas e potente candidata vacinal. A TCI com a LipL32 na região abdominal de C57BL-6 foi capaz de primar o sistema imune, suscitando resposta sistêmica com altos níveis de anticorpos contra o antígeno, após reforços subimunizantes, ID e Tc. O padrão de citocinas em cultivo de células do sangue total dos grupos imunizados indicou que a imunização Tc foi capaz de primar o sistema imune, tanto inato quanto adaptativo. O tratamento local ou a coadministração com surfactantes ou PEG não evidenciou ação emoliente ou adjuvante. A coadministração Tc da LipL32 com MPL-A levou a efeito moderador da reação pro-inflamatória, redirecionando a resposta adaptativa, tanto humoral quanto celular. / Transcutaneous immunization (TCI) offers an attractive pathway for the development of needle-free vaccination by acting on APCs of the skin, showing potential to replace conventional immunization, in terms of safety and efficacy. In this study we evaluated the immune response by TCI with recombinant protein of leptospira LipL32, a highly conserved protein among pathogenic strains, a potential vaccine candidate. TCI with LipL32 was evaluated in C57BL-6 mice abdominal region and was able to confer systemic response with high levels of antibodies after subimmunizing ID and Tc boosters. The pattern of cytokines in cell cultures from whole blood of immunized groups indicated that the TCI was able to prime the immune system, for both innate and adaptive response. Local treatment of the skin or coadministration with surfactants and PEG did not show an emollient and an adjuvant action. Co-administration of LipL32 with MPL-A influenced the antibody response as well as showed a moderating effect of the pro-inflammatory reaction, redirecting the adaptive response.

Neste trabalho são apresentados vários estudos com o peptídeo melanotrópico catiônico alfa-MSH (hormônio estimulador de melanócito) e análogos biologicamente mais ativos. Foram utilizadas as técnicas de fluorescência estática e resolvida no tempo, e RPE (ressonância paramagnética eletrônica). Com fluorescência, foi monitorado o aminoácido Trp (triptofano), presente em todos os peptídeos, e o aminoácido D-Nal (D-naphtul alanine), presente nos análogos cíclicos aqui estudados, para a obtenção de informações estruturais. Com RPE, utilizou-se marcadores de spin incorporados a dispersões lipídicas aniônicas de DMPG (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol), para o estudo da estrutura dos agregados anfifílicos e da interação peptídeo/lipídio, e o aminoácido paramagnético Toac (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl-4-amino-4-carboxylic acid), ligado covalentemente ao alfaMSH e a seu análogo linear MSH-I (Nle POT.4, DPhe POT.7-alfa-MSH), para o estudo comparativo da conformação destes peptídeos. Com marcadores de spin, foi feito um estudo sobre modificações que o alfa-MSH causa em vesículas de DMPG, correlacionando o aumento da concentração de moléculas de água, em toda a extensão da cadeia hidrocarbônica, com a diminuição da fluidez da bicamada lipídica. O perfil de polaridade da bicamada lipídica, medido em amostras congeladas, foi encontrado ser diferente do observado em lipídeos na fase fluida, particularmente na presença de moléculas polares. É mostrado aqui que fosfolipídeos paramagnéticos, marcados no 16o. carbono da cadeia acila, incorporados em vesículas, monitoram a presença de duas populações, na chamada fase intermediária do DMPG (entre a fase gel e a líquido-cristal). A presença das duas populações fica evidente com a comparação dos espectros de RPE obtidos na presença e ausência de alfa-MSH: o peptídeo parece fazer desaparecer um dos ambientes monitorados pelo marcador de spin. ) As estruturas de análogos cíclicos do alfa-MSH, contendo, além do Trp, o fluoróforo D-Nal, foram estudadas em solução aquosa e em presença de vesículas de DMPG, e comparadas com a do peptídeo natural. Medidas de fluorescência do Trp indicam que, em meio aquoso, a estrutura dos análogos cíclicos (na região do Trp) está próxima da conformação adquirida pelo alfa-MSH em bicamadas lipídicas, sugerindo que os peptídeos cíclicos encontram-se, em solução, em uma forma mais adequada para penetração na membrana. Comparando com resultados obtidos com alfa-MSH, nos peptídeos cíclicos, o Trp parece penetrar mais profundamente na membrana lipídica. O aminoácido D-Nal penetra na bicamada lipídica, tendo seu espectro de fluorescência, e tempo de vida do estado excitado, drasticamente alterados pela presença de vesículas de DMPG. Tanto por RPE do Toac, como através da fluorescência do Trp, observa-se dependência da conformação do alfa-MSH e MSH-I com o pH do meio, o que é atribuído a titulação de cadeias laterais dos peptídeos. A análise das curvas de titulação dos peptídeos alfa-MSH e MSH-I, por fluorescência do Trp, sugere pequenas diferenças conformacionais entre estes dois peptídeos em meio aquoso, sendo maior o efeito observado em pH alcalino. Mostra também que as estruturas dos análogos marcados com a sonda paramagnética, em solução aquosa, são ligeiramente diferentes daquelas dos peptídeos originais, apesar de ter sido observado que a inserção do Toac em peptídeos melanotrópicos não altera a atividade biológica dos mesmos / Some studies with the cationic melanotropic peptide a-MSH (a-melanocyte stimulating hormone), and analogues biologically more active are presented here. Steady-state and time resolved fluorescence and EPR (electron paramagnetic resonance) have been used. Peptide structural information was obtained by the fluorescence spectroscopy of both the amino acid Trp (tryptophan), present in all the peptides monitored here, and that of D-Nal (D-naphtyl alanine), present only in cyclic analogues. EPR of spin labels incorporated in anionic lipid dispersions of DMPG (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol) has been used to study amphiphilic aggregate structure and peptide/lipid interaction. EPR was also applied to a comparative structural study of the paramagnetic amino acid Toac (2,2 ,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl-4-amino-4-carboxylic acid), covalently bound to a-MSH and its linear analogue MSH-1 (Nle4, DPhe7-a-MSH). With spin labels incorporated into the bilayers, it is shown that there is a correlation between the packing of fluid DMPG membranes, caused by a-MSH/lipid interaction, and the increase in bilayer interchain hydration. In frozen samples, alterations on the lipid bilayer polarity profile are shown to be different from those obtained at room temperature, particularly in the presence of polar molecules. It is shown here that paramagnetic phospholipids labeled at the 16th carbon of the acylchain, incorporated in DMPG vesicles, monitor the presence of two distinct sites in the lipid bilayer intermediate phase (between the gel and liquid crystal phases) . The presence of the two different spin populations is evident comparing the EPR spectra obtained in the presence and absence of a-MSH, as the peptide seems to make disappear one of the microenvironments monitored by the spin label.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides - P. brasiliensis ou P. lutzii. A alta incidência da PCM no Brasil, somada à gravidade que o quadro clínico pode assumir e ainda à ausência de um antifúngico de baixa toxicidade para tratamento de curta duração, motivaram a avaliação de adjuvantes e caracterização dos componentes antigênicos de P. brasiliensis em um modelo imunoterapêutico de PCM. Assim, inicialmente, avaliou-se o efeito de monofosforil lipídeo A (MPLA) de Salmonella minnesota, PAM3CSK4, hidróxido de alumínio e AS04 em camundongos cronicamente infectados com P. brasiliensis. Quando camundongos da linhagem BALB/c foram infectados pela via intratraqueal com 3 × 105 leveduras de P. brasiliensis, tratados no dia 20 após a infecção com um dos adjuvantes e analisados 30 dias após a administração do tratamento, observou-se que MPLA, ao contrário dos outros adjuvantes, induziu (1) uma redução significativa no número de unidades formadoras de colônias (UFC), (2) uma expressiva diminuição no número de granulomas e células fúngicas no tecido pulmonar e (3) uma resposta imunológica protetora (Th1) quando comparado aos animais controle tratados com PBS. Quanto ao rastreamento de antígenos de P. brasiliensis candidatos a agentes terapêuticos, evidenciou-se que as frações proteicas da preparação de exoantígenos (ExoAg) eram as mais promissoras. Dentre essas frações, a que continha o ExoAg majoritário diidrolipoil desidrogenase induziu maior porcentagem de proliferação de linfócitos T CD3+ esplênicos de camundongos infectados e tratados com MPLA. O gene de diidrolipoil desidrogenase foi clonado em vetor de expressão e a proteína recombinante produzida, purificada e utilizada no protocolo terapêutico da PCM experimental. Surpreendentemente, a administração terapêutica de diidrolipoil desidrogenase recombinante induziu uma redução significativa na contagem de UFC dos animais infectados cronicamente com P. brasiliensis, mesmo na ausência de adjuvantes, o que não foi observado quando foi administrada a preparação de ExoAg nos animais. A localização subcelular de diidrolipoil desidrogenase, por microscopia eletrônica de transmissão, utilizando anticorpos policlonais de camundongos contra essa proteína, mostrou que a mesma está localizada na mitocôndria e também no citoplasma. A análise da expressão gênica diferencial de diidrolipoil desidrogenase em P. brasiliensis mostrou que essa proteína é significativamente mais expressa em leveduras em comparação a hifas e formas de transição. Em conclusão, nossos resultados mostram os efeitos benéficos de MPLA na PCM experimental e sugerem que diidrolipoil desidrogenase é um alvo terapêutico potencial para o tratamento da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides - P. brasiliensis and P. lutzii. The high incidence of PCM in Brazil, added to the severity of the disease and the absence of an antifungal that brings together low toxicity and short-term treatment, led us to evaluate adjuvants and characterize antigenic components of P. brasiliensis that could be used as immunotherapy in an experimental model of PCM. In this work, firstly, we evaluated monophosphoryl lipid A (MPLA) from Salmonella minnesota, PAM3CSK4, aluminum hydroxide and AS04 in mice chronically infected with P. brasiliensis. When mice were infected intratracheally with 3 × 105 P. brasiliensis yeasts, treated with one of the adjuvants or vehicle on day 20 postinfection, and analyzed 30 days after the treatment, we observed that MPLA, unlike other adjuvants, induced (1) a significant reduction in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of the mice, (2) an expressive decrease of granulomas and yeast cells in lung tissue, and (3) a more protective immune response (Th1) when compared with the control mice. Concerning to detection of antigens for PCM therapy, we noticed that among the fractions of a preparation of exoantigens (ExoAg), the one containing the protein identified as dihydrolipoyl dehydrogenase induced a high percentage of proliferation of splenic CD3+ T lymphocytes from mice infected and treated with MPLA. The gene of dihydrolipoyl dehydrogenase was cloned into expression plasmid vector, and the recombinant protein produced, purified and used in the therapeutic protocol of experimental PCM. Surprisingly, the therapeutic administration of recombinant dihydrolipoyl dehydrogenase, but not ExoAg preparation, induced a significant reduction in fungal load in the animals chronically infected with P. brasiliensis, even in the absence of adjuvants. Immunogold labeling and transmission electron microscopy revealed that the dihydrolipoyl dehydrogenase is localized in mitochondria and cytoplasm of P. brasiliensis. The differential expression of dihydrolipoyl dehydrogenase gene in P. brasiliensis showed that yeast had an expression more significant than hyphae, with an intermediate level of gene expression in the transitional forms. In conclusion, our results show that MPLA and dihydrolipoyl dehydrogenase are potential therapeutic targets for the treatment of PCM due to their beneficial effects in a therapy model of PCM.

Neste trabalho são apresentados vários estudos com o peptídeo melanotrópico catiônico alfa-MSH (hormônio estimulador de melanócito) e análogos biologicamente mais ativos. Foram utilizadas as técnicas de fluorescência estática e resolvida no tempo, e RPE (ressonância paramagnética eletrônica). Com fluorescência, foi monitorado o aminoácido Trp (triptofano), presente em todos os peptídeos, e o aminoácido D-Nal (D-naphtul alanine), presente nos análogos cíclicos aqui estudados, para a obtenção de informações estruturais. Com RPE, utilizou-se marcadores de spin incorporados a dispersões lipídicas aniônicas de DMPG (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol), para o estudo da estrutura dos agregados anfifílicos e da interação peptídeo/lipídio, e o aminoácido paramagnético Toac (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl-4-amino-4-carboxylic acid), ligado covalentemente ao alfaMSH e a seu análogo linear MSH-I (Nle POT.4, DPhe POT.7-alfa-MSH), para o estudo comparativo da conformação destes peptídeos. Com marcadores de spin, foi feito um estudo sobre modificações que o alfa-MSH causa em vesículas de DMPG, correlacionando o aumento da concentração de moléculas de água, em toda a extensão da cadeia hidrocarbônica, com a diminuição da fluidez da bicamada lipídica. O perfil de polaridade da bicamada lipídica, medido em amostras congeladas, foi encontrado ser diferente do observado em lipídeos na fase fluida, particularmente na presença de moléculas polares. É mostrado aqui que fosfolipídeos paramagnéticos, marcados no 16o. carbono da cadeia acila, incorporados em vesículas, monitoram a presença de duas populações, na chamada fase intermediária do DMPG (entre a fase gel e a líquido-cristal). A presença das duas populações fica evidente com a comparação dos espectros de RPE obtidos na presença e ausência de alfa-MSH: o peptídeo parece fazer desaparecer um dos ambientes monitorados pelo marcador de spin. ) As estruturas de análogos cíclicos do alfa-MSH, contendo, além do Trp, o fluoróforo D-Nal, foram estudadas em solução aquosa e em presença de vesículas de DMPG, e comparadas com a do peptídeo natural. Medidas de fluorescência do Trp indicam que, em meio aquoso, a estrutura dos análogos cíclicos (na região do Trp) está próxima da conformação adquirida pelo alfa-MSH em bicamadas lipídicas, sugerindo que os peptídeos cíclicos encontram-se, em solução, em uma forma mais adequada para penetração na membrana. Comparando com resultados obtidos com alfa-MSH, nos peptídeos cíclicos, o Trp parece penetrar mais profundamente na membrana lipídica. O aminoácido D-Nal penetra na bicamada lipídica, tendo seu espectro de fluorescência, e tempo de vida do estado excitado, drasticamente alterados pela presença de vesículas de DMPG. Tanto por RPE do Toac, como através da fluorescência do Trp, observa-se dependência da conformação do alfa-MSH e MSH-I com o pH do meio, o que é atribuído a titulação de cadeias laterais dos peptídeos. A análise das curvas de titulação dos peptídeos alfa-MSH e MSH-I, por fluorescência do Trp, sugere pequenas diferenças conformacionais entre estes dois peptídeos em meio aquoso, sendo maior o efeito observado em pH alcalino. Mostra também que as estruturas dos análogos marcados com a sonda paramagnética, em solução aquosa, são ligeiramente diferentes daquelas dos peptídeos originais, apesar de ter sido observado que a inserção do Toac em peptídeos melanotrópicos não altera a atividade biológica dos mesmos / Some studies with the cationic melanotropic peptide a-MSH (a-melanocyte stimulating hormone), and analogues biologically more active are presented here. Steady-state and time resolved fluorescence and EPR (electron paramagnetic resonance) have been used. Peptide structural information was obtained by the fluorescence spectroscopy of both the amino acid Trp (tryptophan), present in all the peptides monitored here, and that of D-Nal (D-naphtyl alanine), present only in cyclic analogues. EPR of spin labels incorporated in anionic lipid dispersions of DMPG (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol) has been used to study amphiphilic aggregate structure and peptide/lipid interaction. EPR was also applied to a comparative structural study of the paramagnetic amino acid Toac (2,2 ,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl-4-amino-4-carboxylic acid), covalently bound to a-MSH and its linear analogue MSH-1 (Nle4, DPhe7-a-MSH). With spin labels incorporated into the bilayers, it is shown that there is a correlation between the packing of fluid DMPG membranes, caused by a-MSH/lipid interaction, and the increase in bilayer interchain hydration. In frozen samples, alterations on the lipid bilayer polarity profile are shown to be different from those obtained at room temperature, particularly in the presence of polar molecules. It is shown here that paramagnetic phospholipids labeled at the 16th carbon of the acylchain, incorporated in DMPG vesicles, monitor the presence of two distinct sites in the lipid bilayer intermediate phase (between the gel and liquid crystal phases) . The presence of the two different spin populations is evident comparing the EPR spectra obtained in the presence and absence of a-MSH, as the peptide seems to make disappear one of the microenvironments monitored by the spin label.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides - P. brasiliensis ou P. lutzii. A alta incidência da PCM no Brasil, somada à gravidade que o quadro clínico pode assumir e ainda à ausência de um antifúngico de baixa toxicidade para tratamento de curta duração, motivaram a avaliação de adjuvantes e caracterização dos componentes antigênicos de P. brasiliensis em um modelo imunoterapêutico de PCM. Assim, inicialmente, avaliou-se o efeito de monofosforil lipídeo A (MPLA) de Salmonella minnesota, PAM3CSK4, hidróxido de alumínio e AS04 em camundongos cronicamente infectados com P. brasiliensis. Quando camundongos da linhagem BALB/c foram infectados pela via intratraqueal com 3 × 105 leveduras de P. brasiliensis, tratados no dia 20 após a infecção com um dos adjuvantes e analisados 30 dias após a administração do tratamento, observou-se que MPLA, ao contrário dos outros adjuvantes, induziu (1) uma redução significativa no número de unidades formadoras de colônias (UFC), (2) uma expressiva diminuição no número de granulomas e células fúngicas no tecido pulmonar e (3) uma resposta imunológica protetora (Th1) quando comparado aos animais controle tratados com PBS. Quanto ao rastreamento de antígenos de P. brasiliensis candidatos a agentes terapêuticos, evidenciou-se que as frações proteicas da preparação de exoantígenos (ExoAg) eram as mais promissoras. Dentre essas frações, a que continha o ExoAg majoritário diidrolipoil desidrogenase induziu maior porcentagem de proliferação de linfócitos T CD3+ esplênicos de camundongos infectados e tratados com MPLA. O gene de diidrolipoil desidrogenase foi clonado em vetor de expressão e a proteína recombinante produzida, purificada e utilizada no protocolo terapêutico da PCM experimental. Surpreendentemente, a administração terapêutica de diidrolipoil desidrogenase recombinante induziu uma redução significativa na contagem de UFC dos animais infectados cronicamente com P. brasiliensis, mesmo na ausência de adjuvantes, o que não foi observado quando foi administrada a preparação de ExoAg nos animais. A localização subcelular de diidrolipoil desidrogenase, por microscopia eletrônica de transmissão, utilizando anticorpos policlonais de camundongos contra essa proteína, mostrou que a mesma está localizada na mitocôndria e também no citoplasma. A análise da expressão gênica diferencial de diidrolipoil desidrogenase em P. brasiliensis mostrou que essa proteína é significativamente mais expressa em leveduras em comparação a hifas e formas de transição. Em conclusão, nossos resultados mostram os efeitos benéficos de MPLA na PCM experimental e sugerem que diidrolipoil desidrogenase é um alvo terapêutico potencial para o tratamento da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides - P. brasiliensis and P. lutzii. The high incidence of PCM in Brazil, added to the severity of the disease and the absence of an antifungal that brings together low toxicity and short-term treatment, led us to evaluate adjuvants and characterize antigenic components of P. brasiliensis that could be used as immunotherapy in an experimental model of PCM. In this work, firstly, we evaluated monophosphoryl lipid A (MPLA) from Salmonella minnesota, PAM3CSK4, aluminum hydroxide and AS04 in mice chronically infected with P. brasiliensis. When mice were infected intratracheally with 3 × 105 P. brasiliensis yeasts, treated with one of the adjuvants or vehicle on day 20 postinfection, and analyzed 30 days after the treatment, we observed that MPLA, unlike other adjuvants, induced (1) a significant reduction in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of the mice, (2) an expressive decrease of granulomas and yeast cells in lung tissue, and (3) a more protective immune response (Th1) when compared with the control mice. Concerning to detection of antigens for PCM therapy, we noticed that among the fractions of a preparation of exoantigens (ExoAg), the one containing the protein identified as dihydrolipoyl dehydrogenase induced a high percentage of proliferation of splenic CD3+ T lymphocytes from mice infected and treated with MPLA. The gene of dihydrolipoyl dehydrogenase was cloned into expression plasmid vector, and the recombinant protein produced, purified and used in the therapeutic protocol of experimental PCM. Surprisingly, the therapeutic administration of recombinant dihydrolipoyl dehydrogenase, but not ExoAg preparation, induced a significant reduction in fungal load in the animals chronically infected with P. brasiliensis, even in the absence of adjuvants. Immunogold labeling and transmission electron microscopy revealed that the dihydrolipoyl dehydrogenase is localized in mitochondria and cytoplasm of P. brasiliensis. The differential expression of dihydrolipoyl dehydrogenase gene in P. brasiliensis showed that yeast had an expression more significant than hyphae, with an intermediate level of gene expression in the transitional forms. In conclusion, our results show that MPLA and dihydrolipoyl dehydrogenase are potential therapeutic targets for the treatment of PCM due to their beneficial effects in a therapy model of PCM.

Foram realizados dois ensaios experimentais a fim de avaliar diferentes níveis de lisina digestível e zinco quelato para frango de corte macho, da linhagem Ross na fase dos 22 aos 42 dias de idade. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 5 x 2, cinco níveis de lisina e dois níveis de zinco 43 e 243ppm. As dietas foram formuladas para conter 3.150 kcal de EM/kg e 19% de PB. No ensaio I, os níveis de lisina digestível foram 0,841, 0,874, 0,995, 1,019 e 1,028%, aplicados a três unidades experimentais. A unidade experimental correspondeu a 1 boxe com 30 frangos com peso médio inicial de 957,38g. Avaliaram-se características de desempenho, rendimento de cortes e composição corporal. No ensaio II, os níveis de lisina digestível foram 0.779, 0,825, 0,961, 1,066 e 1,222%, aplicados a seis repetições. A unidade experimental correspondeu a uma gaiola com três animais com peso médio inicial de 866,22g. Determinou-se, nesse estudo, o balanço de nitrogênio e a digestibilidade das dietas. Constatou-se interação do nível de lisina e zinco nas variáveis: peso final, ganho de peso, conversão alimentar, matéria seca ingerida, nitrogênio ingerido, energia bruta ingerida, energia bruta excretada e balanço energético. Porcentagem de peito e porcentagem de coxa e sobrecoxa foram crescentes pelo aumento na concentração de lisina digestível na dieta, seguindo equação linear. O melhor nível de lisina, de acordo com o desempenho, foi de 1,06% de lisina total ou 0,93% de lisina digestível para dietas com 43ppm de zinco. Para dietas com 253ppm, a exigência de lisina digestível foi igual ou maior que 1,028%. / In order to evaluate the different levels of digestible lysine and zinc chelate effect on Ross male broiler chicken from 22 to 42 days of age, two trials were carried out. The experimental design was completely randomized with a 5x2 arrangement, with treatments consisting of five levels of lysine and two levels of zinc chelate (43 and 243ppm). All diets contained 3,150 kcal of ME/kg and 19% of crude protein. In trial I, a 30 poultry pen was considered one experimental unit and three pens received the following lysine levels: 0.841, 0.874, 0.995, 1.019 and 1.028%. Average weight at pen was 957.38g. For this trial, parameters evaluated were: performance traits, cut yield and body composition. In trial II, each three birds cage, weighting 866.22g in average, was considered one experimental unit. Birds were fed in repetition another five lysine levels: 0.779, 0.825, 0.961, 1.066 and 1.222%. In this latter trial, data on nitrogen-balance and diets digestibility were determined. Interaction between lysine and zinc chelate was observed for weight at day 42, weight gain, feed:ration gain, dry matter intake, nitrogen intake, crude energy intake, crude energy excreted and energy balance. There was an increasing in breast, thigh and drumstick percentage concomitant with the increase of lysine levels on diet, following a linear equation. The most effective lysine level, accordingly to performance traits, was 1.06% of total lysine, or 0.93% of digestive lysine, when the zinc chelate level was 43ppm. A 253ppm diets required lysine levels of 1.028% or greater.