Lipossomas são estruturas auto-organizadas adequadas para encapsular e proteger substâncias antimicrobianas de interações com componentes dos alimentos. O presente estudo teve por objetivo desenvolver lipossomas contendo nisina e bacteriocina produzida por Bacillus sp. P34 (BLS P34) para o controle de Listeria monocytogenes em produtos lácteos. Os lipossomas desenvolvidos nesse trabalho foram preparados utilizando fosfatidilcolina de soja parcialmente purificada. Inicialmente, a encapsulação de nisina foi avaliada através de duas metodologias: fase reversa e hidratação do filme. Com isso, observou-se que a metodologia de hidratação do filme foi a mais adequada para a continuação dos estudos devido à manutenção integral da atividade antimicrobiana da bacteriocina após a encapsulação. BLS P34 foi encapsulada nas mesmas condições. Os lipossomas contendo nisina ou BLS P34 foram estáveis por 24 dias, apresentando as seguintes características: tamanho entre 130 e 160 nm e polidisperdidade entre 0,22 e 0,35, determinados por espalhamento de luz; morfologia esférica, determinada por microscopia eletrônica; eficiência de encapsulação de 94,12% para a nisina e 100% para a BLS P34, determinados por ultra-filtração; potencial zeta de -55 mV para a nisina e -24 mV para a BLS P34. A nisina livre manteve 100% de sua atividade antimicrobiana inicial após 24 dias, enquanto que a nisina encapsulada apresentou 25% de atividade antimicrobiana residual. Não houve diferença na atividade antimicrobiana de BLS P34 livre e encapsulada durante o armazenamento. O modo de ação de BLS P34 encapsulada contra Listeria monocytogenes demonstrou que não ocorre fusão entre o lipossoma e a bactéria, sendo necessária a liberação do peptídeo para a ação antimicrobiana. A ação antimicrobiana das bacteriocinas livres e encapsuladas sobre leite e queijo Minas frescal contaminados artificialmente com L. monocytogenes foi investigada. A nisina livre foi mais eficiente na inibição do patógeno em leite desnatado armazenado a 30ºC. Entretanto, em temperatura de refrigeração, nisina livre e encapsulada exerceram efeito bactericida. BLS P34 livre e encapsulada mantiveram as contagens de células viáveis de L. monocytogenes sempre abaixo do controle em leite desnatado e integral armazenados a 30ºC e 7ºC. Em queijo Minas frescal, todos os tratamentos reduziram a população do patógeno em comparação ao controle, por 21 dias. Porém, a encapsulação de nisina e BLS P34 promoveram melhor efeito inibitório do que as bacteriocinas livres após 10 dias de armazenamento do queijo. A partir desses resultados evidencia-se o potencial da tecnologia de encapsulação de peptídeos antimicrobianos no controle de L. monocytogenes em produtos lácteos. / Liposomes are promising self-organized structures able to encapsulate and protect antimicrobial substances of the interactions with food components. This study aimed to develop liposomes containing nisin and the bacteriocin produced by Bacillus sp. P34 (BLS P34) for control of Listeria monocytogenes in dairy products. The liposomes developed in this work were prepared using partially purified soybean phosphatidylcholine. Initially, the encapsulation of nisin was evaluated by two methods: reverse phase and film hydration. It was observed that the film hydration method was the most suitable for further studies due to the overall maintenance of the antimicrobial activity after encapsulation. BLS P34 was encapsulated in the same conditions. The liposomes containing nisin or BLS P34 were stable for 24 days, showing the following characteristics: size between 130 and 160 nm and polydispersity between 0.22 and 0.35 determined by light scattering; spherical morphology, determined by electron microscopy; encapsulation efficiency of 94.12% for nisin and 100% for BLS P34, as determined by ultra filtration; zeta potential of -55 mV for nisin and -24 mV for BLS P34. Free nisin retained 100% of its original antimicrobial activity after 24 days, while the encapsulated nisin showed 25% residual antimicrobial activity. There was no difference in antimicrobial activity of free and encapsulated BLS P34 during storage. The mode of action of encapsulated BLS P34 against Listeria monocytogenes showed that no fusion occurs between liposomes and bacteria, being necessary to release the peptide for antimicrobial activity. The antimicrobial action of free and encapsulated bacteriocins on milk and Minas cheese artificially contaminated with L. monocytogenes was investigated. Free nisin was more effective in inhibiting of the pathogen in skim milk stored at 30°C. However, under refrigeration, free and encapsulated nisin exerted bactericidal effect. Viable cell counts of L. monocytogenes were always below the control in whole and skimmed milk stored at 30 and 7°C in presence of free and encapsulated BLS P34. In Minas cheese, all treatments reduced the pathogen population in comparison to control, for 21 days. However, the encapsulation of nisin and BLS P34 promoted better inhibitory effect than the free bacteriocins after 10 days storage of cheese. These results show the potential of liposomes containing nisin or BLS P34 on the control of L. monocytogenes in dairy products.

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-22T19:05:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribas_AlessandroMarra_M.pdf: 3158406 bytes, checksum: d1b6bb2251e7c8fb427735b4f282d768 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Lipossomas ou vesículas lipídicas, são estruturas nas quais os fosfolipídios agregam-se em bicamadas, formando partículas capazes de encapsular compostos de natureza tanto hidrofilica quanto hidrofóbica. Essas características fazem dos lipossomas um sistema muito atrativo para diversas aplicações, dentre as quais o encapsulamento e liberação controlada de medicamentos. Um dos principais problemas associados com as aplicações de lipossomas "in vivo" é a perda de estabilidade da bicamada lipídica em presença de fluidos biológicos. As interações com proteinas ou com outras substâncias que apresentam atividade de superficie desestruturam a bicamada, provocando a liberação indesejável do composto encapsulado / Abstract: Ljposomes or lipids vesicles,are structures in which the phospholipids agregate in bilayers, forming particles able to encapsulate compounds with both hydrophilic and hydrophobic character. This feature make liposomes a very attractive system for several applications, such as drug encapsulation for controlled delivery. One of the main problems associated with liposomes aplications 'lu vivo" is the lack of lipid bilayer stability in presence of biological fluids. The interaction with proteins or other substances which have surface activity desestructure the bilayer, causing the undesirable delivery of the encapsulated compound / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Angela Maria Moraes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:57:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_CarlaAndreiaMirandada_M.pdf: 3794622 bytes, checksum: 8d6dcff32793d56790b11dbb1a4f2cab (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A pesquisa envolvendo o uso de veículos para a liberação controlada de agentes anti-câncer no interior de tumores tem-se intensificado nos últimos anos. Dentre os veículos testados destacam-se os lipossomas, ou vesículas lipídicas. Este trabalho teve por objetivo a preparação e caracterização de lipossomas encapsulando compostos de interesse na terapia de melanomas, em formulações potencialmente adequadas para administração por via dermatológica. Os encapsulamento em lipossomas de 5-fluorouracil e bleomicina, em caráter detalhado, e de ácido azelaico, em caráter preliminar, foram avaliados empregando-se diferentes métodos de incorporação. As formulações preparadas foram caracterizadas quanto às concentrações finais de lipídios e de drogas e quanto aos diâmetros médios das vesículas. Os lipossomas encapsulando 5-fluorouracil, por terem apresentado melhor eficiência de encapsulamento, tiveram sua estabilidade de estocagem e na presença do tenso ativo C12Es avaliadas, para a verificação da integridade da bicamada lipídica.A bleomicina foi incorporada aos lipossomas através de encapsulamento ativo por gradiente de pH e de injeção de etanol. Ambas as técnicas resultaram em reduzida eficiência de encapsulamento. O encapsulamento do 5-fluorouracil pelos métodos de hidratação do filme lipídico, incorporação ativa empregando gradiente de pH, injeção de etanol e evaporação em fase reversa indicaram que a última técnica foi a mais adequada do ponto de vista da eficiência de encapsulamento, porém este processo ainda pode ser otimizado. Na presença do tensoativo, verificou-se que a droga promove estabilização das vesículas. Quando estocados a 4°C, estes lipossomas não sofreram agregação ou fusão no período de um mês, tendo, entretanto, liberado praticamente toda a droga encapsulada neste período.O encapsulamento de ácido azelaico mostrou-se promissor, entretanto a quantificação da droga encapsulada não pôde ser efetuada / Abstract: The investigation with vehicles for controlled release of anticancer agents into tumors has been intensified in the last years. Among the vehicles tested, outstand liposomes or lipid vesicles, for drug delivery. The aim of this work was the preparation and characterization of liposomes entrapping compounds of interest in melanoma therapy with potential to be topically administered.The entrapment of 5-fluorouracil and bleomycin in liposomes, in a detailed forro, and of azelaic acid, in a preliminary forro, were analyzed using different incorporation methods. The formulations werw evaluated for stability both concerning to storage and in the presence ofthe surfactant C12Es, to verify the lipid bilayer integrity. Bleomycin was incorporated in liposomes by active loading with pH gradients and by ethanol injection. Both methods have resulted in low encapsulation efficiency.The entrapment of 5-tluorouracil was tested by the hydration of a dríed lipid film, active loading with pH gradients, ethanol injection and reverse-phase evaporation demonstrating that the last method was the most efficient in terms of encapsulation capacity, however this process should be optimized. In the presence ofthe surfactant, it was observed that the drug promotes the stabilization of these vesicles. When stored at 4°E, these lipo_ showed no fusion or aggregation during a month, however the drug was completely released ITom the vesicles in this period. The loading of azelaic acid seemed to be feasible, however the quantification of the encapsulated¿ drug could not be performed. / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientadores : Maria Helena Andrade Santana, Gisella Maria Zanin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-28T00:44:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_HeronOliveiradosSantos_D.pdf: 8224466 bytes, checksum: c86c6bdb30ae60b67680056e810c68da (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A tuberculose é uma doença produzida pelo Bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis) ao se instalar no organismo humano e tem sido considerada um problema de saúde pública mundial dado o número de óbitos observados nos últimos tempos. A falência do tratamento deve-se principalmente ao abandono por parte dos pacientes, causado pelos efeitos colaterais dos fármacos na forma livre. As ações de combate à tuberculose incluem tanto o desenvolvimento de novos medicamentos, limitado pelos elevados custos, quanto a busca de novas formas de administração que proporcionem o aumento do índice terapêutico. Nesse último aspecto, tanto a encapsulação de fármacos em lipossomas (vesículas lipídicas) como a complexação em ciclodextrinas (oligossacarídeos cíclicos) representam alternativas viáveis para a melhoria do tratamento da Tuberculose. Considerando o grande potencial das aplicações de lipossomas e ciclodextrinas destinados à administração e liberação controlada de fármacos, neste trabalho estudou-se os processos de associação e liberação dos fármacos de primeira linha no tratamento da tuberculose, Pirazinamida (Pz) e lsoniazida (Iz), nesses suportes. Os lipossomas usados foram dos tipos convencional e com superfície modificada com polietileno glicol ("Stea1th"). Os fármacos foram associados aos lipossomas nas formas livre ou complexados em _-ciclodextrinas (_-CD). As preparações foram caracterizadas em relação à complexação em ciclodextrinas, eficiência de encapsulação ou associação dos complexos de ciclodextrinas em lipossomas, diâmetro e distribuição de tamanhos dos lipossomas, estabilidade física, cinética de liberação dos fármacos, hemólise de células e ação contra o Mycobacterium tuberculosis. As eficiências máximas de encapsulação em lipossomas convencionais obtidas para os fármacos na forma livre foram 14,2% para pz e 10,0% para Iz correspondendo às razões fármaco/lipídio (F/L) finais 0,019 e 0,013, respectivamente. Para os fármacos complexados em _-ciclodextrinas foram 11,3% para Pz:_-CD e 9,0% para Iz:_-CD à razões (F/L) finais 0,015 e 0,012, respectivamente. Em lipossomas do tipo "Stealth", as eficiências de encapsulação para os fármacos livres foram 7,5% para pz e 8,3% para Iz, relativas às razões (F/L) finais 0,010 para ambos os fármacos, e 11,2% para Pz:_-CD e 7,5% para Iz:_­CD relativas às razões (F/L) finais 0,015 e 0,010, respectivamente. Os estudos de liberação dos compostos mostraram que para uma mesma razão (F /L) inicial, a taxa de liberação total foi maior para os lipossomas convencionais (24h) seguidos dos "Stealth" (36h) e, fmalmente dos complexos _-CD associados a lipossomas "Stealth" (48h) / Abstract: Tuberculosis is a disease produced by the Koch Bacillus (Mycobacterium tuberculosis) when installed in the human organismo It has been considered a world health problem due to the number of deaths observed lately. The failure in the treatment is mainly due to the poor adherence by patients caused by the side effects of the drugs in fTee formo The fighting actions against Tuberculosis include both the development of new medicines, limited by the high costs, and the new ways of administrating, which provide the increase in the therapeutic index. In this latter aspect, both the encapsulation of drugs in liposomes (lipid vesicles) and the complexation in cyclodextrins (cyclic oligosaccharides) represent feasible alternatives for the improvement oftuberculosis treatment. Considering the great potential of applications of liposomes and cyclodextrins in the administration and controlled release of medicines, in this work the association and delivery of Pyrazinamide (Pz) and Isoniazid (Iz), in these supports were studied. The liposomes used were of the conventional and Stealth types. The drugs were associated to liposomes in fTee form or complexed in l3-cyclodextrins (I3-CD). The preparations were characterized in terms of the complexation in cyclodextrins, encapsulation efficiency or association of cyclodextrin complexes in liposomes, diameter and size distribution of liposomes, physical stability, drug delivery kinetic, cell hemolysis and action against the Mycobacterium tuberculosis. The maximum efficiencies of encapsulation in conventionalliposomes obtained for fTee drugs were 14.4% for pz and 10.0% for Iz related to the final drug-lipid ratio (F/L) 0.019 and 0.013, respectively. For drug:l3-cyclodextrin complexes they were 11.3% for Pz:I3-CD and 9.0% for Iz:I3-CD at (FIL) final ratio 0.015 and 0.012, respectively. For Stealth liposomes efficiences of encapsulation for the fTee drugs were 7.5% for pz and 8.3% for Iz, related to (F/L) final rates 0.010 for both drugs, and 11.2% for Pz:I3-CD and 7.5% for Iz:I3-CD related to the (F/L) final rates 0.015 and 0.010, respectively. The studies about drug delivery showed that for the same (F/L) initial ratio, the delivery rate was greater for conventional liposomes (24 h) followed by the Stealth (36h) and, finally by 13­CD complexes associated to Stealth liposomes (48h) / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientadores : Maria Helena Andrade Santana, Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-29T06:07:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanin_MariaHelenaAmbrosio_D.pdf: 3129739 bytes, checksum: 3bf129235472299864d6a448f93f8cab (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A importância farmacológica dos gangliosídios tem crescido nos últimos anos devido à identificação desses compostos como antígenos, produzindo anticorpos antigangliosídios que podem estar envolvidos em algumas doenças autoimunes ou neuropatias. Os estudos na literatura dos gangliosídios abrangem desde suas propriedades e funções nas membranas neuronais assim como a sua farmacologia no sistema nervoso central, quando injetados na forma pura em animais e humanos. Entretanto, o estudo de seus efeitos no sistema imunológico, quando associados aos lipossomas, ainda é escasso, o que motivou o desenvolvimento dessa pesquisa. Este trabalho compreendeu a preparação e caracterização de lipossomas multilamelares compostos de dipalmitoilfosfatidilcolina, colesterol, dihexadecilfosfato e gangliosídios, monossialogangliosídio (GM1) e Mist (mistura de GM1 21%, dissialogangliosídio (GD1a) 40%, dissialogangliosídio (GD1b) 16%, trissialogangliosídio (GT1b) 19%) e avaliação do efeito imunológico destes lipossomas quando injetados em camundongos. Os animais testados foram camundongos do tipo Balb/c, os quais receberam seis doses de lipossomas a cada duas semanas, perfazendo um total de doze semanas. Após este período os animais foram sacrificados e seus soros submetidos a testes ELlSA para avaliação da produção de anticorpos antigangliosídios, classes IgM e IgG. Em termos de significância estatística os lipossomas livres de gangliosídios e os associados à Mist não apresentaram imunogenicidade e alguns soros de animais tratados com lipossomas associados ao GM1 apresentaram algumas classes de imunoglobulinas. Porém, em termos de avaliação para diagnóstico de anticorpos, todas as formulações foram consideradas não imunogênicas quando considerada as unidades arbitrárias / Abstract: The pharmacological importance of gangliosides has increased in the last few years due to the identification of these compounds as antigens, producing antiganglioside antibodies, which may be involved in autoimmune diseases or neuropathy. Studies in ganglioside literature encompass their properties and functions in the neuronal membranes as well as their pharmacology in the central nervous system upon injection in pure ganglioside form in animais and humans. However, as associated to the liposomes, the studies of their effects on the immunological system are still scarce, which motivated the development of this research. This work includes the preparation and characterization of multilamellar liposomes consisting of dipalmitoyl phosphatidyl choline, cholesterol, dihexadecylphosphate and gangliosides, monosialoganglioside (GM1) and Mist (mixture of GM1 21%, disialoganglioside (GD1a) 40%, disialoganglioside (GD1b) 16%, trisialoganglioside (GT1b) 19%) and evaluation of immunologic effect of hese liposomes as administered in mice. The animais tested were Balb/c mice, which were treated with six liposome doses at 2 week-intervals during twelve weeks. After this period the animais were sacrificed and their sera were assayed by ELlSA tests in order to evaluate the production of antiganglioside antibodies of IgM and IgG classes. With respect to the statistical significance, the liposomes without gangliosides and the ones associated to the Mist were non immunogenic and some of animal sera, which were treated with liposomes associated to the GM1, showed some Immunoglobulin classes. H oweve r, in terms of evaluation of the antibody diagnostic, ali of liposome formulations were considered non immunogenic in regard to the arbitrary units / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador : Angela Maria Moraes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:21:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RodriguezJusto_Oselys_D.pdf: 6789253 bytes, checksum: 957a32ab7a2cc3d4583e89c8880c4593 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Este trabalho teve por objetivo o escalonamento da produção de lipossomas projetados para a liberação controlada por inalação de fármacos utilizados no tratamento da tuberculose, visando a melhoria de sua eficácia terapêutica e a redução de sua toxicidade. O método de injeção de etanol foi selecionado para a produção das vesículas, por ser simples e de baixo custo. Os fármacos isoniazida, pirazinamida e rifampicina, comumente usados na terapia primária da tuberculose e o agente terapêutico kanamicina, empregado em casos de tuberculose resistente a múltiplos compostos terapêuticos, assim como o fármaco modelo doxorrubicina, foram incorporados nas vesículas unilamelares contendo basicamente lecitina natural purificada e colesterol, dentre outras formulações. Foram avaliados os efeitos de variáveis operacionais como temperatura, taxa de agitação, velocidade de injeção e concentração inicial de lipídios nas características finais dos lipossomas obtidos. As formulações preparadas foram caracterizadas quanto às concentrações finais de lipídios e de fármacos, ao tamanho dos lipossomas, a sua lamelaridade, à estabilidade de estocagem na forma de suspensão aquosa e de pó liofilizado reconstituído. Os principais resultados indicaram que as vesículas preparadas pelo método de injeção de etanol em escala de bancada permitiram encapsular ativamente os fármacos em estudo, embora o gradiente de pH estabelecido nestes lipossomas tenha se mostrado estável por menos de cinco dias. As características finais das vesículas preparadas por injeção de etanol em maior escala foram influenciadas pelo tipo e intensidade da agitação da fase aquosa, pela temperatura desta fase e pelo diâmetro da agulha de injeção. Foram obtidas altas eficiências de encapsulação ativa dos fármacos nestes lipossomas, atingindose até 100%, sendo tais eficiências influenciadas principalmente pela concentração inicial e pela composição lipídica das vesículas. As vesículas constituídas de fosfatidilcolina sintética mostraram-se mais apropriadas para a encapsulação dos fármacos, entretanto, seu custo é substancialmente maior. As populações mais freqüentes nos lipossomas apresentaram diâmetros médios variando de 132 a 156 nm. O processo de liofilização das vesículas provocou aumento em seu diâmetro médio e diminuição nas eficiências de encapsulação obtidas, e a adição dos criprotetores manitol e sacarose não preveniu a agregação e fusão dos lipossomas. A análise preliminar da viabilidade econômica da produção de lipossomas preparados por injeção de etanol em larga escala e a subseqüente incorporação do fármaco kanamicina indicou que o processo é economicamente viável / Abstract: The aim of this work was to the scale-up of the production of liposomes designed for the administration through inhalation of drugs used in tuberculosis therapy, seeking to improve drug therapeutic efficacy as well to reduce drug toxicity. The method based on ethanol injection was selected for vesicle production due to its simplicity and low cost. The drugs isoniazid, pyrazinamide and rifampin, indicated for tuberculosis primary treatment, as well as kanamycin, a drug used for multiresistant tuberculosis therapy and doxorubicin, a model drug, were incorporated in unilamellar vesicles basically prepared from purified natural lecithin and cholesterol, among other formulations. The effects of operational variables such as temperature, mixing rate, injection rate and initial lipid concentration on the characteristics of the vesicles were analyzed. The preparations were characterized concerning to lipid and drug concentration, vesicle diameter and lamelarity and also to liposomal storage stability both in aqueous solution and in the lyophilized form after rehydration. The most relevant results indicate that the vesicles prepared by ethanol injection in bench scale were able to actively encapsulate the studied drugs, however, the pH gradient stablished in liposomal membrane was stable for less than five days. The final characteristics of vesicles prepared by ethanol injection in larger scale were affected by aqueous phase mixing type and intensity, temperature as well as by the injection needle inner diameter. High active encapsulation efficiencies of the evaluated drugs in liposomes were achieved, reaching 100%, and those efficiency values were influenced by lipid concentration and composition. The vesicles containing synthetic phosphatidylcholine were more adequate for drug encapsulation, however, their cost is substantially higher. The most frequent populations in liposomes presented average diameters varying in the range from 132 to 156 nm. The lyophilization caused increases in vesicle mean diameters, reduced drug incorporation efficiency and the addition of the cryoprotectors mannitol and sucrose did not prevent vesicle aggregation and fusion. A preliminary analysis showed that the large scale production of liposomes through ethanol injection followed by kanamycin active loading is economically feasible / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Eneida de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-31T21:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_DanieleRibeirode_M.pdf: 5040962 bytes, checksum: a792ef89e3934d5414e2de392da2a716 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Entre as várias classes de fármacos utilizados no tratamento da dor encontram-se os anestésicos locais (AL). Com a finalidade de prolongar a duração de ação e reduzir a toxicidade sistêmica desses fármacos, pesquisas têm sido desenvolvidas utilizando diferentes carreadores como lipossomas e ciclodextrinas que possibilitam a liberação controlada (prolongando o efeito anestésico) e evitam picos plasmáticos das drogas (reduzindo a toxicidade). Assim, este trabalho teve por finalidades preparar, caracterizar e avaliar in vivo a eficácia de formulações contendo os AL bupivacaína (aVC) e mepivacaína (MVC) encapsulados em lipossomas ou complexados com ciclodextrinas para, posteriormente, compará-Ias com as preparações disponíveis na clínica. Análises do diâmetro médio dos lipossomas revelaram a presença de duas populações de vesículas distintas (400 nm e 150 nm) sendo observada uma maior percentagem de encapsulação para ave do que para MVC. Com relação aos sistemas de AL em ciclodextrinas, foram observadas diferenças nas temperaturas de transição de fases e na morfologia dos cristais dos compostos puros (AL e ciclodextrinas) evidenciando a complexação. A avaliação do bloqueio motor em camundongos mostrou que os AL livres, as formulações lipossomais e as complexadas induziram um aumento dose - dependente na intensidade e na duração do mesmo. Porém, esses parâmetros não foram alterados quando comparou-se as preparações entre si, nas mesmas concentrações. Também, os efeitos antinociceptivos sistêmicos foram similares para todas as formulações testadas. Já a potência e a duração do bloqueio sensorial foram aumentadas pela complexação de BVC com ciclodextrinas e pela encapsulação de MVC em lipossomas, em relação às drogas livres (p < 0,001). Esses resultados podem ser explicados pela liberação controlada das drogas e pelo aumento da disponibilidade das mesmas no sítio de injeção. A encapsulação de MVC em lipossomas possibilitou o transporte da fração da droga disponível no interior da bicamada lipídica e a complexação de avc com ciclodextrinas aumentou a quantidade de droga solubilizada (na fase aquosa) conferindo-Ihes maior potência anestésica em relação às preparações comerciais. Desta forma, as formulações de MVC em lipossomas e BVC em ciclodextrinas apresentam-se como novas alternativas no tratamento da dor aguda e crônica / Abstract: Local anesthetics (LA) belong to the class of drugs used for the treatrnent of pain. In order to prolong the duration of action and to reduce their systemic toxicity of LA, many studies have been developed using carriers such as liposomes and cyclodextrins; these vehicles allow controlled release (improving anesthetic effect) and avoid high plasmatic levels of the anesthetics to be reached (reducing the toxicity). This work aimed to prepare, to characterize and to evaluate in vivo drug - delivery systems for bupivacaine (BVC) and mepivacaine (MVC) in liposomes or cyclodextrins, comparing them with the clinically used LA solutions. Mean size diameter analysis showed that the liposomes have diameters of 400 nm and 150 nm, with encapsulation efficiencies higher for BVC than MVC. Regarding to LA systems in cyclodextrins, differences on phase transition temperature and structural changes in the crystal's pattems evidenced LA : J3-CD complexation. Liposomal and ciclodextrin formulations increased the intensity and duration of the motor blockade showing dose-dependent relationships although these parameters did not change, if compared at the sarne concentrations. AIso the systemic antinociceptive effects were similar for ali the formulations tested. Potency and duration of sensory blockade were improved afier injection of complexed BVC and liposomal MVC in relation to the free drug injection (p < 0.001). These results can be explained by the controlled release of the LA and increased availability of the LA in their site of injection. Encapsulation of MVC in liposomes increased the amount of available drug for membrane partition while complexation into cyclodextrin increased BVC concentration in the aqueous phase, improving their anesthetic potency in relation to the commercial solutions and these LA. These drug-delivery systems offer a potential new therapeutic option for the treatments of acute and chronic pain using LA / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Anselmo Gomes de Oliveira / Orientador: Marcela R. Longhi / Banca: Elba I. Buján / Banca: Santiago Palma / Banca: Palmira Daflón Gramião / Programa de Pós Graduação doutorado em Ciências Químicas / Resumo: Não disponível / Abstract: Not available / Doutor

As doenças alérgicas representam um problema de saúde pública mundial, sendo a rinite e a asma as doenças mais comuns. Essas doenças exigem o uso contínuo de medicamentos cujos efeitos colaterais comprometem a qualidade de vida dos alérgicos e justifica a busca por novos fármacos, ou formulações, relevantes no tratamento das alergias. Neste contexto, destaca-se a planta medicinal Mangifera indica L. cujo extrato aquoso, o Vimang®, tem sido utilizado para o tratamento de diversas patologias. O estudo fitoquímico deste extrato levou ao isolamento de vários compostos fenólicos, dentre os quais a mangiferina (Mgf) é a majoritária (~46 %) e responsável por propriedades farmacológicas importantes tal como a antialérgica. Esta molécula é metabolizada no intestino e transformada na sua aglicona, o noratiriol (Nrt), que é encontrada no plasma em maior concentração que a Mgf. Como a relação estrutura-atividade destas substâncias ainda é pouco explorada, este estudo propôs a síntese de novas moléculas, a partir do esqueleto da Mgf, com modificações estruturais em seus substituintes para avaliação, in vitro, do potencial antialérgico. Foram sintetizadas moléculas análogas da Mgf (compostos 4, 5 (Nrt) e 6), através de modificações pontuais de hidroxilas do anel xantônico, por meio de uma estratégia sintética que proporcionou maior rendimento reacional. O Nrt apresentou maior potencial antialérgico que a Mgf sugerindo que o açúcar, de fato, interfere na biodisponibilidade. A presença de hidroxilas nas posições 6 e 7 do anel xantônico (grupo catecol) é crucial para a bioatividade, pois estes substituintes influenciam consideravelmente a solubilidade da molécula. Os grupos hidroxila nas posições 1 e 3 do anel xantônico também são importantes, uma vez que a substituição da hidroxila, apenas na posição 3, inibiu totalmente a bioatividade. Como a Mgf e o Nrt (os mais bioativos) são pouco solúveis em água e susceptíveis à oxidação química, ou degradação enzimática, foi planejada a incorporação em nanocarreadores lipossomais, a fim de melhorar a biodisponibilidade. O estudo da melhor formulação foi desenvolvido para a Mgf pela maior quantidade disponível e por seu merecido destaque nas mais diversas aplicações biológicas. Os lipossomos de PC:PE:COL (52:28:20), nas concentrações lipídicas de 2,9; 14,5 e 29 mmol/L, foram preparados pelo método de hidratação do filme lipídico em diferentes razões Mgf/lipídeo (0,01; 0,02; 0,04 e 0,10), nos pHs 6,5; 7,0 e 7,4. Todas as formulações foram estáveis no período de 29 dias, com tamanhos ao redor de 100 nm e índices de polidispersividade ao redor de 0,3, apropriados para aplicação intravenosa. A formulação com maior capacidade de carga (3,4 %) foi a de 2,9 mmo/L de lipídeos totais e razão Mgf/lipídeo de 0,1 a qual foi mantida nos ensaios biológicos. A formulação lipossomal manteve o perfil de inibição da desgranulação observado para os bioativos livres. Este resultado é relevante para a aplicação biológica, uma vez que o bioativo está protegido de degradação química e ainda exerce suas propriedades farmacológicas. Como os lipossomos são sistemas que mimetizam a membrana biológica, a localização da Mgf e os efeitos na membrana foram estudados por anisotropia de fluorescência, DSC e RPE, no pH 7,4. Os resultados mostraram que a Mgf interage com a membrana lipídica, aumentado sua fluidez e diminuindo a cooperatividade lipídica, reforçando a bioatividade dessa molécula vinculada à sua ação em proteínas de membrana, o que é comum para moléculas polifenólicas. / Allergic diseases represent a worldwide public health issue, being asthma and rhinitis the most common ones. These diseases demand the continuous use of medications whose side effects impinge on the affected people´s quality of life, justifying the search for new drugs, or formulations, relevant to the treatment of allergies. In this context, we highlight the medicinal plant Mangifera indica L., whose aqueous extract, Vimang®, has been utilized for the treatment of several pathologies. The phytochemical study of this extract led to the isolation of various phenolic compounds, among which Mangiferin (Mgf) is predominant (~46 %) and responsible for important pharmacological properties, such as the antiallergic one. This molecule is metabolized in the intestine and transformed into its aglycone, norathyriol (Nrt), which is found in the plasma in a higher concentration than Mgf. Seeing as the structure-activity relationship of these substances is still little explored, this study proposed the synthesis of new molecules from the core structure of Mgf, with structural modifications in its substituent groups for in vitro evaluation of the antiallergic potential. Analogous molecules to Mgf were synthesized (compounds 4, 5 (Nrt) and 6), through specific modifications of hydroxyl groups of the xanthonic ring, by means of a synthesis strategy that allowed for a greater reactional yield. Nrt showed a higher antiallergic potential than Mgf, suggesting that sugar does in fact interfere in bioavailability. The presence of hydroxyl groups in the 6 and 7 positions of the xanthonic ring (catechol group) is crucial for bioavailability, because these substituents considerably influence the molecule´s water solubility. The hydroxyl groups in the 1 and 3 positions of the xanthonic ring are also important, seeing as the substitution of the hydroxyl group only in position 3 completely inhibited bioactivity. Seeing as Nrt and Mgf (the most bioactive) are slightly soluble in water and susceptible to chemical oxidation or enzymatic degradation, the incorporation in liposomal nanocarriers was planned to improve bioavailability. The study for the best formulation was developed for Mgf due to the greater quantity available and its well-earned spotlight in various biological applications. The liposomes of PC:PE:COL (52:28:20), in the lipid concentrations of 2.9, 14.5 and 29 mmol/L, were prepared by the lipid film hydration method in different Mgf/lipid ratios (0.01, 0.02, 0.04 and 0,10), in pHs 6.5, 7.0 and 7.4. All the formulations were stable in the period of 29 days, with sizes around 100 nm and polydispersity indexes around 0.3, appropriate for intravenous application. The formulation with the highest loading capacity (3.4 %) was the one with 2.9 mmol/L of total lipids, and a Mgf/lipid ratio of 0.1, which was used in the biological essays. The liposomal formulation maintained the antiallergic potential profiles observed for free drugs. This result is relevant for biological application since the drugs are protected from chemical degradation and still exerts its pharmacological properties. Seeing as liposomes are systems that mimic the biological membrane, the location of Mgf and its effects on the membrane were studied by fluorescence anisotropy, DSC and EPR, in pH 7.4. The results showed that Mgf interacts with the lipid membrane, increasing its fluidity and reducing the lipid cooperation, reinforcing the bioactivity of Mgf linked to its action on membrane proteins, which is common for polyphenolic molecules.

A associação lipídio/citocromo c é importante e deve ser estudada, pois repercute na atividade peroxidática da proteína abordada e pode contribuir para o processo apoptótico, ou morte programada da célula, e também desempenha um papel significativo na cadeia respiratória. A natureza e a especificidade da interação do citocromo c com bicamadas lipídicas têm sido bastante investigadas ultimamente, mas informações detalhadas e precisas sobre tais assuntos ainda não existem. É aceito que ocorre primeiramente uma interação eletrostática entre a proteína citocromo c e as membranas fosfolipídicas. Em seguida, há uma interação hidrofóbica. Entretanto, ainda não é bem compreendido o papel da cadeia fosfolipídica. A associação do citocromo c com membranas lipídicas induz mudanças no estado de spin do átomo de ferro. A interação entre as vesículas carregadas e o citocromo c induz mudanças estruturais na proteína, as quais são refletidas no seu centro ativo, ou grupo heme. As mudanças do campo cristalino no sítio do ferro hemínico de forte para fraco são acompanhadas por mudanças do estado de spin de baixo para alto, respectivamente. Neste trabalho, estuda-se sistematicamente a natureza da interação entre o citocromo c e a cadeia fosfolipídica. As mudanças estruturais no grupo heme foram correlacionadas com a natureza do lipídio, ou seja, com a carga da cabeça e com o tamanho e o tipo da cadeia fosfolipídica. Foram utilizados treze lipídios diferentes, naturais e sintetizados, com cabeças polares negativas e neutras e com cadeias carbônicas saturadas e insaturadas de diferentes comprimentos. Para tal investigação, utilizamos as técnicas: Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) Onda Contínua (CW) e Pulsada (PW) e Dicroísmo Circular Magnético (MCD). As técnicas enunciadas avaliam as mudanças de estado de spin e a simetria do citocromo c nos seus estados férrico e ferroso. A interação lipoprotéica lipídio/citocromo c foi avaliada com lipídios diferentes, inclusive com o lipossomo PCPECL, que mimetiza a membrana interna da mitocôndria nos eucariontes. A partir dos resultados experimentais, sugerimos um modelo para esse tipo de associação. / This association lipid/cytochrome c is interesting to study in order to understand the peroxidase activity of this protein, that plays an important role in the respiratory chain and in the apoptosis process or the programmed cell death. The nature and specificity of the interaction of cytochrome c with lipid bilayers have been major goals in recent studies, but detailed information on that issue is not yet widely available. In this regard, it is generally accepted that the electrostatic interaction is an important factor in the association of cytochrome c with phospholipid membranes, followed by a hydrophobic interaction. However, the role played by the phospholipid chain is not well understood. The association of cytochrome c with negative membranes induces a change in the heme iron spin state. The interaction between the charged vesicles and cytochrome c leads to structural changes in the active central or heme group. The changing of the crystalline field of the heme iron from strong to weak is accompanied by spin states changes from low to high spin, respectively. These facts concerned us to investigate more systematically the nature of the interaction between cytochrome c and the phospholipid chains. The lipid-induced effects in the heme iron crystalline field are correlated to the nature of the charged head group and to the size and type of the phospholipid chain. Thirteen different lipids, nature and synthetic, were used, with negative and neutra1 polar head group and saturated and unsaturated acyl chains with different length. This work investigates the change of heme iron spin state and symmetry of ferric cytochrome c using Continuous Wave (CW) and pulsed (PW) Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and Magnetic Circular Dichroism (MCD) techniques. These techniques analyze the spin state change and the symmetry of the iron cytochrome c in its ferric and ferrous states. The effect of the different lipids were analyzed, including PCPECL membrane that mimetics the inner mitocondrial membrane in eukaryotes.