Yes / Cocrystals consist of two molecules bonded together in a single crystal lattice giving rise to wide applications including improving solubility of poorly soluble pharmaceuticals. Cocrystallization reaction occurs in the oily phase of liquid–liquid phase separation (LLPS) after it is mixed with coformers. Indomethacin–saccharin cocrystal formation was monitored in situ, and the kinetics of crystallization were determined. The crystallization rates show that the process can be proposed to prevent unwanted oily phase formation during LLPS. / Research Development Fund Publication Prize Award winner, Sep 2022.

Cette thèse concerne l’étude de phase de séparation de deux polymères thermosensibles connus-poly(N-isopropylacylamide) (PNIPAM) et poly(2-isopropyl-2-oxazoline) (PIPOZ). Parmi des études variées sur ces deux polymères, il y a encore deux parties de leurs propriétés thermiques inexplicites à être étudiées. Une partie concerne l’effet de consolvant de PNIPAM dans l’eau et un autre solvant hydromiscible. L’autre est l’effet de propriétés de groupes terminaux de chaînes sur la séparation de phase de PIPOZ. Pour ce faire, nous avons d’abord étudié l’effet de l’architecture de chaînes sur l’effet de cosolvant de PNIPAMs dans le mélange de méthanol/eau en utilisant un PNIPAM en étoile avec 4 branches et un PNIPAM cyclique comme modèles. Avec PNIPAM en étoile, l’adhérence de branches PNIPAM de à un cœur hydrophobique provoque une réduction de Tc (la température du point de turbidité) et une enthalpie plus faible de la transition de phase. En revanche, la Tc de PNIPAM en étoile dépend de la masse molaire de polymère. La coopérativité de déhydratation diminue pour PNIPAM en étoile et PNIPAM cyclique à cause de la limite topologique. Une étude sur l’influence de concentration en polymère sur l’effet de cosolvant de PNIPAM dans le mélange méthanol/eau a montré qu’une séparation de phase liquide-liquide macroscopique (MLLPS) a lieu pour une solution de PNIPAM dans le mélange méthanol/eau avec la fraction molaire de méthanol entre 0.127 et 0.421 et la concentration en PNIPAM est constante à 10 g.L-1. Après deux jours d’équilibration à température ambiante, la suspension turbide de PNIPAM dans le mélange méthanol/eau se sépare en deux phases dont une phase possède beaucoup plus de PNIPAM que l’autre. Un diagramme de phase qui montre la MLLPS pour le mélange PNIPAM/eau/méthanol a été établi à base de données expérimentales. La taille et la morphologie de gouttelettes dans la phase riche en polymère condensée dépendent de la fraction molaire de méthanol. Parce que la présence de méthanol influence la tension de surface des gouttelettes liquides, un équilibre lent de la séparation de phase pour PNIPAM/eau/méthanol système a été accéléré et une séparation de phase liquide-liquide macroscopique apparait. Afin d’étudier l’effet de groupes terminaux sur les propriétés de solution de PIPOZ, deux PIPOZs téléchéliques avec groupe perfluorodécanyle (FPIPOZ) ou groupe octadécyle (C18PIPOZ) comme extrémités de chaîne ont été synthétisés. Les valeurs de Tc des polymères téléchéliques ont beaucoup diminué par rapport à celle de PIPOZ. Des micelles stables se forment dans des solutions aqueuses de polymères téléchéliques. La micellization et la séparation de phase de ces polymères dans l’eau ont été étudiées. La séparation de phase de PIPOZs téléchéliques suit le mécanisme de MLLPS. Des différences en tailles de gouttelettes formées à l’intérieur de solutions de deux polymères ont été observées. Pour étudier profondément les différences dans le comportement d’association entre deux polymères téléchéliques, les intensités des signaux de polymères correspondants et les temps de relaxation T1, T2 ont été mesurés. Des valeurs de T2 de protons correspondants aux IPOZs sont plus hautes. / This thesis focused on the phase separation of two well-known thermoresponsive polymers, namely PNIPAM (poly(N-isopropylacrylamide)) and PIPOZ (poly(2-isopropyl-2-oxazoline). Despite various studies of the two polymers, two aspects of their thermal properties remained unclear and needed to be investigated. One is the cononsolvency effect of PNIPAM in water and a second water miscible solvent. The other is the effect of the end group properties on the phase separation of PIPOZ. With this in mind, we first studied the effect of the chain architecture on the cononsolvency of PNIPAM in water/methanol mixture, employing a 4-arm star shape PNIPAM and a cyclic PNIPAM as model. Tethering PNIPAM arms to a hydrophobic core resulted in a reduced Tc (cloud point temperature) and a lower phase transition enthalpy change. The Tc of the star shape PNIPAM was inversely dependent on the polymer molecular weight. The dehydration cooperativity was depressed for the star PNIPAM and cyclic PNIPAM due to topological constraints. A study of the effect of polymer concentration on the cononsolvency of PNIPAM in water/methanol mixture revealed a macroscopic liquid-liquid phase separation (MLLPS) for PNIPAM in water/methanol mixtures of methanol molar fraction ranging from 0.127 to 0.421 at a polymer concentration of 10 g·L-1. The turbid suspension of PNIPAM/water/methanol separated into a polymer rich phase coexisting with a polymer poor solution phase after equilibration for two days at room temperature. The phase diagram showing the MLLPS for the PNIPAM/water/methanol mixtures was constructed based on experimental data. The droplets in the condensed polymer rich phase showed a dependence on the methanol molar fraction. Methanol affects the surface tension of the liquid droplets. The slow equilibrium kinetics of PNIPAM phase separation was sped up and a macroscopic liquid-liquid phase separation realized. In order to study the effect of end groups on the solution properties of PIPOZ, two telechelic PIPOZ end capped with perfluorodecanyl groups (FPIPOZ) and octadecyl groups (C18PIPOZ), respectively, were synthesized. The Tc values of the telechelic polymers were greatly reduced after end-functionalization. Stable micelles formed in aqueous solutions of the telechelic polymers. The micellization and phase separation of the telechelic polymers in water were studied. The phase separation of the telechelic PIPOZs in water followed a liquid-liquid phase separation mechanism. Differences in the sizes of droplets formed inside of the two polymer solutions were observed. To further investigate the differences in the association behaviour between the two telechelic polymer, NMR signal intensities and T1 and T2 relaxation times were examined. Higher 1H T2 values were obtained for the IPOZ unit in FPIPOZ than that in C18PIPOZ, indicating a higher mobility of the main chain in the FPIPOZ micelles than that in the C18PIPOZ micelles. Together with the 13C NMR and 19F NMR relaxation studies, we obtained better knowledge of the association properties of the telechelic PIPOZ in water. NMR relaxation studies proved to be efficient way of probing the solution behaviour of the polymers.

Zellen sind in der Lage, gleichzeitig ganz unterschiedliche biochemische Prozesse zu bewältigen. Dies gelingt ihnen durch eine Einteilung ihres Inneren in Kompartiemente, sogennante Organellen, die die jeweils geeignete biochemische Umgebung für die unterschiedlichen Aufgaben schaffen. Bei membranumschlossenen Kompartimenten ist leicht vorstellbar, dass sie eine andere biochemische Zusammensetzung als ihre Umgebung haben können. Jedoch existieren auch Organelle ohne Membran die durch eine flüssig-flüssig Phasenseparation entstehen. Manche dieser Kompartiemente haben die Fähigkeit, RNA zu binden und Proteinkomplexe auszubilden, während andere auf die Veränderungen innerhalb der Zelle, wie z.B. die Veränderung des pH-Werts und der damit Verbunden Änderung ihres Protonierungszustands, reagieren können. Um diese Prozesse theoretisch analysieren zu können, entwickeln wir zunächst ein allgemeingültiges, thermodynamisches Gerüst, um Systeme zu untersuchen, die im chemischen Gleichgewicht flüssig-flüssig hasensepariert vorliegen können. Dies erlaubt, basierend auf den Erhaltungsgrößen, im chemischen Gleichgewicht thermodynamisch konjungierten Variablen zu identifizieren, welche aus den erhaltenen Komponenten und den zugehörigen chemischen Potentialen bestehen. Mithilfe des obig erwähnten Gerüsts können wir den Einfluss des pH-Wertes auf die flüssig-flüssig Phasenseparation in einem minimalen Modell untersuchen. Dies beschreibt die makromolekulare Phasenseparation, kontrolliert durch Protonierungs- und Deprotonierungreaktionen, welche wiederum vom pH-Wert abhängig sind. Unsere Untersuchung der pH-Abhängigkeit der Phasenseparation kommt zu folgenden Ergebnissen: Erstens liegt die größte Region von Phasenseparation im Phasendiagramm typischerweise im Bereich des isoelektrischen Punkts. Zweitens zeigt das Modell eine Fähigkeit der erneuten Mischung auf. Drittens ist die Topologie des Phasendiagrams von der dominantesten Interaktion bestimmt. Unser Modell stimmt mit experimentellen Beobachtungen zur Phasenseparation von intrinsisch ungeordneten, Proteinen, deren Struktur sich pH abhängig verändern, überein. Das Modell ist außerdem konsistent mit Beobachtungen von Phasenseparation von Proteinen im Zytosol von Hefezellen, die entsteht, wenn der intrazellulare pH-Wert in die Nähe des isoelektrischen Punkt dieser Proteine gebracht wird. Des Weiteren geht diese Arbeit auf den physikalischen Mechanismus ein, mit dem flüssigkeitsähnliche Organellen, sog. P granules, im Organismus Caenorhabditis elegans positioniert werden. Um dieses Phänomen zu analysieren, stellen wir zunächst experimentelle Beobachtungen vor, die zeigen, dass PGL-3, eine Hauptkomponente der P granules, flüssigkeitsähnliche Tropfen bildet, deren Zusammensetzung von RNA moduliert werden kann. Darüber hinaus zeigen wir Daten, die großen Unterschiede zwischen der RNA-Bindungsaffinität von Proteinen wie Mex-5, die für die Positionierung der P granules relevant sind, und solchen, die P granules bilden, wie PGL-3, zeigen. Dies deutet darauf hin, dass eine Konkurrenz zwischen den Bestandteilen der P Granula und MEX-5 um die zur Bindung zur Verfügung stehende RNA besteht, die die Kondensation und Auflösung von P Granula räumlich kontrollieren könnte. Auf diesen experimentellen Befunden aufbauend führen wir ein minimalles Modell ein, in dem wir die Phasenseparation von PGL-3 an Bindungsreaktionen der MEX-5 Proteine und RNA koppeln. Um die experimentellen Beobachtungen beschreiben zu können, muss die Neigung des PGL-3 Proteins zur Phasenseparation zunehmen, wenn es Komplexe mit RNA bildet. Dies unterstützt die Idee, dass MEX-5 diese Phasenseparation unterdrückt, indem es die Anzahl an möglichen RNA-Bindungspartner für PGL-3 herabsetzt und damit die weitere Entstehung derartiger Protein-RNA-Komplexe erschwert. Dieser einfache Mechanismus scheint die Hauptursache dafür zu sein, dass P granules auf der posterioren Seite des Caenorhabditis elegans Embryos zu finden sind. / One of the main features of cells is their incredible ability to control biochemical processes in space and time. They do so by organizing their interior in sub-compartments called organelles, each of them with a different biochemical environment that allows them to perform specific tasks in the cell. It is sometimes believed that these compartments need a membrane in order to have a stable biochemical environment and regulat their compositions. However, there are some organelles which lack a membrane and seem to form and organize via liquid-liquid phase separation. Some of the components that form these membraneless organelles have the ability to bind to RNA and form complexes, while some others react to changes in the intracellular environment such as pH variations, which in turn affects their protonation state. In order to study these processes from a theoretical perspective, we develop a generic thermodynamic framework to study systems exhibiting liquid-liquid phase separation at chemical equilibrium. This framework, based on the use of conservation laws in chemical reactions, allow us to identify thermodynamic conjugate variables at chemical equilibrium, which are given by a set of conserved quantities and the corresponding conjugate chemical potentials. Within the aforementioned framework, we introduce a minimal model to study the effect of pH on liquid-liquid phase separation. Our model explains macromolecular phase separation controlled by protonation and deprotonation reactions, which are tuned by the pH of the system. We study the phase behavior of the system as a function of pH. Our main findings are: Firstly, the broadest region of phase separation is typically found at the isoelectric point. Secondly, the system exhibits reentrant behavior. Thirdly, that the dominating interaction in the system determines the topology of the phase diagrams. Our model is in agreement with experimental observations of in vitro protein phase separation of pH-responsive intrinsically disordered proteins, as well as with observations of protein phase separation exhibited by many cytosolic proteins when the intracellular pH in yeast cells is brought close to the isoelectric point of such proteins. Moreover, this work analyses the physical mechanism behind the positioning of liquid-like organelles in the {\it{Caenorhabditis elegans}} organism known as P granules. In order to study this phenomenon, we first present firm experimental evidence showing that PGL-3 protein, a key component of P granules, forms liquid-like drops whose assembly can be modulated by RNA. We then present data showing that the RNA-binding affinity differs significantly between proteins relevant for the positioning of P granules, such as MEX-5 and the proteins forming the P granules, like the aforementioned PGL-3. This points to a possible mechanism of RNA-binding competition between P granule constituents and MEX-5 in order to spatially control the condensation and dissolution of P granules. Based on the experimental evidence, we propose a minimal model in which we couple phase separation of PGL-3 to a set of binding reactions involving the MEX-5 protein and RNA. We find that in order to explain the experimental data, the tendency for phase separation of the PGL-3 protein increases with the formation of complexes of PGL-3 bound to RNA. This therefore supports the idea that MEX-5 inhibits this protein phase separation by depleting the RNA available for PGL-3 to form such complexes. This simple mechanism is at the core of how P granules localize to the posterior side of the Caenorhabditis elegans embryo.

Recently, there has been a growing drive towards the bottom-up development of synthetic cells that mimic key cellular features. A cellular feature ubiquitous amongst cells is that of compartmentalisation. Compartmentalisation enables the spatiotemporal control of biochemical reactions and is thus vital for the development of synthetic cells. To date, most synthetic cell models have utilised classical membrane bound containers as model compartments. However, recent advances in cell biology have highlighted the importance of membraneless compartments formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) as organisation centres. It has been suggested that these organelles play a critical role in regulating cell biochemistry, yet very little is known about their interactions with enzymatic reactions. Thus, aiming to develop novel synthetic capabilities, the work presented in this thesis designs and characterises synthetic cells which include features of membraneless compartmentalisation. These systems utilise complex coacervates, a specific type of LLPS that is driven by the electrostatic attraction of oppositely charged polymers, as model membraneless compartments. These low complexity systems subsequently provide ideal platforms for systematic investigations of the interaction of membraneless coacervate compartments with enzymatic reactions. In Chapter 3 and 4, I focus on developing a responsive synthetic cell system that recapitulates features of membrane-bound and membraneless compartmentalisation. I generate a pH-responsive system by exploiting the intrinsic pKa of cationic polylysine to trigger coacervation within a liposome. This synthetic cell is then functionalised with the enzyme formate dehydrogenase (FDH). I show that coacervate properties can be utilized to locally concentrate and activate the FDH reaction at low enzyme concentrations, thus demonstrating that membraneless compartments can activate reactions via sequestration into coacervate reaction centres. In Chapter 5, I then proceed to characterise whether the diffusive exchange of molecules across a droplet phase boundary effects enzyme dynamics. Synthetic cells constructed from emulsion droplets with coacervate sub-compartments were used as model systems with diffusive exchange, while bulk coacervate and supernatant phases were used as uncoupled model systems without exchange. I studied the FDH reaction in both models and I conclude that coupling of the phases increases reaction rates compared to an uncoupled system. When coupled, the supernatant acts as a ’sink’ removing the product NADH from the coacervate droplets. This increases the apparent reaction rate in the supernatant, while the reduction of NADH concentration in the coacervate reduces product inhibition. This demonstrated that the open phase boundary tightly couples membraneless droplets to their surroundings, which can ultimately lead to increased reaction rates both inside and outside the compartments. Finally in Chapter 6, I scrutinize enzyme kinetics of the enzymes FDH and β -galactosidase in the unique coacervate physicochemical environment using Michaelis-Menten assays in CM-Dex/PDDA bulk phase. Results show that the KM and Vmax of FDH significantly increased compared to buffer, while those of β-galactosidase do not. I hypothesise that the negatively charged formate substrate of the FDH reaction interacts strongly with the positively charged PDDA, decreasing its affinity for the enzyme. Furthermore, I suggest that the coacervate environment facilitates the rate limiting hydride transfer of the reaction, thereby increasing the maximum rate. This data demonstrates that the coacervate environment itself can tune and control enzyme dynamics. In conclusion, my work establishes responsive, tunable and enzymatically active syn- thetic cellular systems with features of membraneless compartmentalisation. My results indicate that membraneless compartments can have significant impact on the dynamics of enzymatic reactions, opening up possible ways to control reaction rates in synthetic systems and suggesting plausible functions for membraneless organelles in vivo. Overall, I demonstrate that rationally designed synthetic cells provide biomimetic experimental platforms that offer insights into the influence of membraneless compartmentalisation on enzymatic reactions. Parts of the presented work have been published as two first author publications in peer-reviewed journals. / ‘Bottom-up'’ Modelle synthetischer Zellen, die Schlüsselmerkmale zellbasierten Lebens imitieren, rücken immer mehr in den Fokus. Von zentraler Bedeutung ist hier die Kompartmentbildung. Sie erst ermöglicht die räumliche und zeitliche Kontrolle biochemischer Abläufe und ist daher entscheidend bei der Entwicklung synthetischer Zellen. Bisher wurden in der Mehrzahl der synthetischen Zellmodelle klassische, membrangebundene Reaktionsräume als Modellkompartimente verwendet. Jüngste Fortschritte in der Zellbiologie belegen jedoch die Bedeutung von membranlosen Kompartimenten, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) gebildet werden. Es wird angenommen, dass diese membranlosen Kompartimente eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Zellchemie spielen. Jedoch ist bisher nur sehr wenig über ihren Einfluss auf enzymatische Reaktionen bekannt und experimentell belegt. Mit dem Ziel, die Bandbreite und das Verständnis synthetischer Modelle zu erweitern, wurden in dieser Arbeit neue Methoden entwickelt und dargestellt, die membranlose Kompartmentbildung benutzen. Es wurden hierfür komplexe Koazervate eingesetzt, eine spezielle Art der LLPS, welche durch die elektrostatische Anziehung von entgegengesetzt geladenen Polymeren angetrieben wird. Diese verhältnismäßig einfachen Systeme bieten eine ideale Plattform für systematische Untersuchungen des Einflusses von membranlosen Koazervatkompartimenten auf enzymatische Reaktionen. In den Kapiteln 3 und 4 konzentrierte ich mich auf die Entwicklung eines reaktionsfähigen synthetischen Modellsystems, das die Phänomene sowohl membrangebundener als auch membranfreier Kompartmentbildung vereint. Zur Steuerung der Koazervierung innerhalb von Liposomen wurde ein pH-reaktives System verwendet, welches sich den intrinsischen pKa von kationischen Polylysin zunutze macht. Diese synthetis- che Zelle wurde im folgenden Schritt mit dem Enzym Formiat-Dehydrogenase (FDH) funktionalisiert. Ich konnte damit zeigen, dass es die Eigenschaften von Koazervaten ermöglichen, die FDH-Reaktion bei global sehr niedrigen Enzymkonzentrationen zu aktivieren. Hierbei wirken die membranlosen Koazervate in Folge einer lokal er- höhten Enzymkonzentration als Zentren gesteigerter Reaktivität. Dies geschieht durch die lokale Konzentrationserhöhung in Koazervaten, was bei LLPS auch durch den Verteilungskoeffizient beschrieben wird. Mit anderen Worten agieren diese membran- losen Kompartimente durch Sequestrierung als Reaktionszentren. Im Kapitel 5 charakterisierte ich den Einfluss von diffusivem Molekülaustausch auf die Enzymkinetik über die Koazervat-Phasengrenze hinweg. Hierbei wurden zwei Systeme miteinander verglichen. Einerseits wurde ein synthetisches Zellmodell, beste- hend aus mikrofluidisch hergestellten Wasser-in-Öl Emulsionstropfen, die Koazervate enthalten, als Modellsystem mit diffusivem Austausch zwischen den Phasen verwendet. Andererseits wurden separate, reine Koazervatphasen und reine Überstandsphasen als Modellsysteme ohne Austausch verwendet. Ich habe die FDH-Reaktion in beiden Modellsystemen untersucht und kam zu dem Schluss, dass die Kopplung der Phasen die Reaktionsgeschwindigkeiten im Vergleich zu den ungekoppelten Systemen erhöht. Bei der Kopplung wirkt die Überstandsphase als Senke, die das Produkt NADH aus den Koazervaten aufnimmt. Dies erhöht die scheinbare Reaktionsgeschwindigkeit im Überstand, während die Verringerung der NADH-Konzentration im Koazervat die Produkthemmung verringert. Dies zeigt, dass die offene Phasengrenze membranloser Kompartimente eng mit ihrer Umgebung gekoppelt ist, was als erhöhte Reaktionsraten sowohl innerhalb als auch außerhalb der Kompartimente gemessen werden kann. Schließlich untersuchte ich in Kapitel 6 die Enzymkinetik der Enzyme FDH und β- Galaktosidase in der physikalisch-chemischen Umgebung des Koazervats. Mit Hilfe von Michaelis-Menten-Experimenten in der CM-Dextran/PDDA-Bulkphase konnte gezeigt werden, dass KM und Vmax von FDH im Vergleich zum Überstand signifikant erhöht sind, wohingegen jene von β-Galaktosidase ein solches Verhalten nicht zeigen. Das führte mich zu der Hypothese, dass das negativ geladene Formiatsubstrat der FDH- Reaktion stark mit dem positiv geladenen PDDA interagiert, wodurch seine Affinität für das Enzym abnimmt. Darüber hinaus wird der ratenbegrenzende Hydridtransfer in der Umgebung des Koazervats erleichtert und es kann eine Erhöhung der Reaktionsrate beobachtet werden. Die Daten zeigen, dass abhängig vom Koazervat-Milieu die Enzymdynamik in verschiedene Richtungen gesteuert werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Arbeit reaktionsfähige, steuerbare und enzymatisch aktive synthetische Zellsysteme mit Eigenschaften membranloser Kompartmentbildung etabliert. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass membranlose Kompartimente einen signifikanten Einfluss auf die Dynamik enzymatischer Reaktio- nen haben. Meine Untersuchungen eröffnen damit neuartige Wege zur Kontrolle der Reaktionsgeschwindigkeit in synthetischen Systemen und erweitern das Verständnis möglicher Funktionen membranloser Organellen in vivo. Insgesamt zeige ich, dass über- legt entworfene synthetische Zellen eine hervorragende biomimetische Plattform bieten, um Einblicke in den Einfluss von membranloser Kompartimentierung auf enzymatische Reaktionen zu gewinnen. Teile der vorgestellten Arbeit wurden als wissenschaftliche Beiträge in zwei begutachteten Journalen als Erstautor veröffentlicht.

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第24983号 / 生博第512号 / 新制||生||68(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 荒木 崇, 教授 鈴木 淳, 教授 谷口 雄一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

L'homéostasie cellulaire implique une régulation fine de la production ainsi que de l'élimination des protéines. La dérégulation de cette homéostasie entraîne des effets néfastes touchant de nombreuses voies de signalisation et de métabolisme et pouvant conduire à diverses maladies telles que le cancer ou la neurodégénérescence. De ce fait, la dégradation des protéines est un processus hautement contrôlé effectué par le système ubiquitine-protéasome (UPS) qui permet le ciblage, l’étiquetage et la dégradation des protéines mal repliées, endommagées ou en fin de vie. Le protéasome est un complexe multiprotéique vital présent dans toutes les cellules eucaryotes dont la biogenèse, la fonction de dégradation et la régulation dans le cytoplasme sont bien connues. Cependant, la fonction du protéasome dans le noyau, notamment en réponse au stress, est encore peu comprise. Les cellules ont développé de nombreux mécanismes adaptatifs en réponse à la variation de l'apport en nutriments comme l’augmentation de la dégradation et le recyclage des protéines. Chez l’humain, le protéasome est dégradé dans le cytoplasme par autophagie lors d’une privation de nutriments mais les mécanismes de régulation du protéasome nucléaire en réponse au stress métabolique restent peu connus. Nous avons trouvé que le protéasome 26S et la sous-unité régulatrice PSME3 forment des foyers nucléaires dans différents types cellulaires de mammifère en réponse à une privation en nutriments. Les foyers, nommés SIPAN pour Starvation-Induced Proteasome Assemblies in the Nucleus, ne sont colocalisés avec aucune structure ou corps nucléaires connus. La formation des SIPAN est réversible lors d’une réintégration des nutriments, suggérant une réponse spécifique liée à un stress métabolique. La manipulation de la quantité d’acides aminés intracellulaire a révélé que les acides aminés non-essentiels jouent un rôle important dans la formation et la résolution des SIPAN. Une analyse métabolomique a permis de trouver des voies reliées au métabolisme des nucléotides et des acides aminés qui pourraient fournir des facteurs clés pour la dissipation des foyers du protéasome. Le fort dynamisme des SIPAN, la présence d’événements de fusion et leur instabilité vis-à-vis des conditions cellulaires suggèrent que les SIPAN résultent d’une séparation de phase liquide-liquide (LLPS). De plus, nous avons trouvé que l’ubiquitine conjuguée est présente dans les SIPAN et que l’ubiquitination et la déubiquitination semblent être impliquées dans la formation et la résolution, respectivement. Nous avons ensuite découvert que la perte du récepteur à l’ubiquitine RAD23B empêche la formation des SIPAN. En effet, les domaines de liaison au protéasome UBL et de liaison à l’ubiquitine UBA1/UBA2 sont nécessaires pour la formation des SIPAN. De manière intéressante, la perte de RAD23B ou du complexe régulateur PSME3 retarde l’induction de l’apoptose et promeut la survie cellulaire. Enfin, en utilisant un inducteur de l’apoptose, nous avons observé l’apparition de ces foyers du protéasome dans le noyau des cellules dont certaines caractéristiques sont similaires aux SIPAN. Notre étude aborde une question très importante dans la compréhension des rôles et du dynamisme du protéasome nucléaire, en particulier dans l'adaptation au stress, qui peut réguler le niveau des protéines nucléaires. De façon générale, cela nous aidera à mieux comprendre le rôle du protéasome dans l’homéostasie nucléaire et son implication dans les maladies humaines. / Cellular homeostasis involves specific regulation of the production as well as the elimination of proteins. The deregulation of this equilibrium leads to harmful effects affecting many signaling and metabolic pathways and can lead to various diseases, such as cancer or neurodegeneration. Hence, protein degradation is a highly controlled process performed by the ubiquitin-proteasome system (UPS) that allows targeting, labeling and degradation of misfolded, damaged, or end-of-life proteins. The proteasome is a vital multiprotein complex found in all eukaryotic cells whose biogenesis, degradative function, and regulation in the cytoplasm are well known. However, the function of the proteasome in the nucleus, particularly in response to stress, is still poorly understood. Cells have evolved many adaptive mechanisms in response to varying nutrient supply such as increased protein degradation and recycling. In humans, the proteasome is degraded in the cytoplasm by autophagy during nutrient deprivation, but the regulatory mechanisms of the nuclear proteasome in response to metabolic stress remain poorly understood. We have found that the 26S proteasome and regulatory subunit PSME3 form nuclear foci in different mammalian cell types in response to nutrient deprivation. These foci, called SIPAN for Starvation-Induced Proteasome Assemblies in the Nucleus, do not colocalize with any known nuclear structures or bodies. The formation of SIPAN is reversible upon nutrient replenishment, suggesting a specific response to metabolic stress. Manipulation of the intracellular amino acid pool revealed that non-essential amino acids play important roles in the formation and resolution of SIPAN. A metabolomics study has identified pathways related to nucleotide and amino acid metabolism that may provide key factors for the dissipation of the proteasome foci. The strong dynamism of SIPAN, the presence of fusion events and their instability towards cellular conditions suggest that SIPAN result from liquid-liquid phase separation (LLPS). Additionally, we have found that conjugated ubiquitin is present in SIPAN and that ubiquitination and deubiquitination appear to be involved in their formation and resolution, respectively. We then discovered that the depletion of the ubiquitin receptor RAD23B prevents the formation of SIPAN. Indeed, the UBL proteasome binding domain and UBA1/UBA2 ubiquitin binding domains are required for SIPAN formation. Interestingly, the depletion of RAD23B or the proteasome regulatory particle PSME3 delays the induction of apoptosis and promotes cell survival. Finally, we found that an apoptosis-inducing agent promotes proteasome foci formation in the nucleus of cells, and these organelles share similarities with SIPAN. Our study addresses a very important question in understanding the roles and dynamism of the proteasome in the nucleus, specifically during stress adaptation, which can regulate the level of nuclear proteins. In general, this will help us to better understand the role of the proteasome in nuclear homeostasis and its involvement in human diseases.

Les protéines de type prion, contenant des Séquences en acides aminés de Faible Complexité (SFC), ont tendance à s’agréger et à former des compartiments non-membranaires dans la cellule. Ces derniers ont des propriétés physiques communes à celles des liquides, telles que la capacité de mouiller les surfaces, de s’écouler et de fusionner avec d’autres corps liquides. Dans cette étude, nous avons démontré que la protéine Hrp1 forme, in vitro, des gouttes de différentes tailles via une transition de phase liquide à liquide, et ce, uniquement lorsqu’elle est exposée à un milieu chargé négativement. Exclusivement dans ce même milieu, nous avons aussi observé que le domaine SFC de Hrp1 s’assemble et forme une matière de type gel. Sur la base de ces observations, nous avons émis l’hypothèse que la tendance des systèmes moléculaires à former des compartiments liquides in vivo peut être influencée par la présence, dans le cytosol, de polyélectrolytes chargés négativement tels que l'ADN, l'ARN et les polyphosphates (PolyP). En utilisant la levure comme modèle cellulaire et des techniques de microscopie à fluorescence, nous nous sommes focalisés sur l’étude du rôle des PolyP dans l'assemblage des P-bodies. Les P-bodies ont été choisis comme système moléculaire de référence in vivo, étant des corps qui, après une transition de phase, se trouvent dans le cytosol sous forme de gouttes. Nous avons démontré que la déplétion du phosphate et la délétion du gène vtc4, responsable de la synthèse des PolyP dans la levure, n’ont pas d’influence dans la formation des P-bodies. Nous avons aussi remarqué que les PolyP et la protéine Edc3, une des composantes principales des P-bodies, ne sont pas co-localisés dans la cellule. Cette étude préliminaire nous suggère un manque de corrélation entre la formation des P-bodies et la présence de PolyP dans la cellule. Cependant, pour confirmer nos observations, des expériences complémentaires doivent être envisagées, en considérant d’autres composantes des P-bodies, tel que Lsm4, ou en analysant, in vivo, les effets des PolyP sur d’autres systèmes moléculaires de nature liquide. / Prion-like proteins containing Low Complexity Sequences (LCSs) have the propensity to aggregate and form membrane-less compartments in the cell. These proteins form droplets that have liquid features such as wetting, dripping and fusion. In this study, we demonstrated that the prion domain-containing protein Hrp1 forms droplets of different sizes in the presence of negatively charged polymers via liquid-liquid phase separation, whereas under the same conditions, the prion-like domain PolyQ/N of Hrp1 forms a gel-like material. Based on these findings, we hypothesize that droplets in vivo could be modulated by negatively charged polyelectrolytes found in the cell such as DNA, RNA and polyphosphate (PolyP). My goal was to examine the role of the polyanionic nature of PolyP on the assembly of P-bodies using Saccharomyces cerevisiae as a cellular model and fluorescence microscopy. We chose to study processing (P)- bodies, based on previous findings that these cellular subcompartments are formed by liquid-liquid phase separation of component proteins in the cytoplasm. We found that depleting phosphate from the media and deleting vtc4 gene, which is responsible for PolyP synthesis, did not have any effect on P-body formation. In addition, we demonstrated that PolyP and the protein Edc3, a core component of P-bodies, do not colocalize. Our data suggest that PolyP does not affect P-body formation. However, further and complementary studies have to be performed to confirm that PolyP have no effects on other membrane-less organelles.

<p>Supersaturating drug delivery systems are an attractive solubility enabling formulation strategy for poorly soluble drugs due to their potential to significantly enhance solubility and hence, bioavailability. Compendial dissolution testing is commonly used a surrogate for assessing the bioavailability of enabling formulations. However, it increasingly fails to accurately predict <i>in vivo</i> performance due its closed-compartment characteristics and the lack of absorptive sink conditions. <i>In vivo</i>, drug is continually removed due to absorption across the gastrointestinal membrane, which impacts the luminal concentration profile, which in turn affects the dissolution kinetics of any undissolved material, as well as crystallization kinetics from supersaturated solutions. Thus, it is critical to develop an improved methodology that better mimics <i>in vivo</i> conditions. An enhanced approach integrates dissolution and absorption measurements. However, currently-used two-compartment absorptive apparatuses, employing a flat-sheet membrane are limited, in particular by the small membrane surface area that restricts the mass transfer, resulting in unrealistic experimental timeframes. This greatly impacts the suitability of such systems as a formulation development tool. The goal of this research is two-fold. First, to develop and test a high surface area, flow-through, absorptive dissolution testing apparatus, designed to provide <i>in vivo</i> relevant information about formulation performance in biologically relevant time frames. Second, to use this apparatus to obtain mechanistic insight into physical phenomenon occurring during formulation dissolution. Herein, the design and construction of a coupled dissolution-absorption apparatus using a hollow fiber membrane module to simulate the absorption process is described. The hollow fiber membrane offers a large membrane surface area, improving the mass transfer rates significantly. Following the development of a robust apparatus, its application as a formulation development tool was evaluated in subsequent studies. The dissolution-absorption studies were carried out for supersaturated solutions generated via anti-solvent addition, pH-shift and by dissolution of amorphous formulations. The research demonstrates the potential of the apparatus to capture subtle differences between formulations, providing insight into the role of physical processes such as supersaturation, crystallization kinetics and liquid-liquid phase separation on the absorption kinetics. The study also explores dissolution-absorption performance of amorphous solid dispersions (ASDs) and the influence of resultant solution phase behavior on the absorption profile. Residual crystalline content in ASDs is a great concern from a physical stability and dissolution performance perspective as it can promote secondary nucleation or seed crystal growth. Therefore, the risk of drug crystallization during dissolution of ASDs containing some residual crystals was assessed using absorptive dissolution measurements and compared to outcomes observed using closed-compartment dissolution testing. Mesoporous silica-based formulations are another type of amorphous formulations that are gaining increased interest due to higher physical stability and rapid release of the amorphous drug. However, their application may be limited by incomplete drug release resulting from the adsorption tendency of the drug onto the silica surface. Thus, the performance of mesoporous silica-based formulations was also evaluated in the absorptive dissolution testing apparatus to determine the impact of physiological conditions such as gastrointestinal pH and simultaneous membrane absorption on the adsorption kinetics during formulation dissolution. Overall, the aim of this research was to demonstrate the potential of the novel <i>in vitro</i> methodology and highlight the significance of a dynamic absorptive dissolution environment to enable better assessment of complex enabling formulations. <i>In vivo</i>, there are multiple physical processes occurring in the gastrointestinal lumen and the kinetics of these processes strongly depend on the absorption kinetics and <i>vice-a-versa</i>. Thus, using this novel tool, the interplay between solution phase behavior and the likely impacts on bioavailability of supersaturating drug delivery systems can be better elucidated. This approach and apparatus is anticipated to be of great utility to the pharmaceutical industry to make informed decisions with respect to formulation optimization.</p>

Le système ubiquitine-protéasome représente une plateforme de signalisation cellulaire chez les eucaryotes et joue un rôle majeur dans la coordination des processus cellulaires. Des progrès récents suggèrent que l’ubiquitination joue un rôle important dans les phénomènes de séparation de phase liquide-liquide (LLPS), un processus permettant la localisation d’une quantité accrue de protéines dans un compartiment subcellulaire, afin de réaliser une fonction biologique. En effet, il a été démontré que l’ubiquitination joue un rôle central dans les mécanismes qui gouvernent la LLPS durant la formation des granules de stress dans le cytoplasme ou les foci de réparation de l’ADN dans le noyau. D’autre part, chez la levure, des travaux ont montré que le protéasome est capable de s’assembler sous forme de granules dans le cytoplasme suite à un stress métabolique. Toutefois, les mécanismes par lesquels le système ubiquitine-protéasome ainsi que ses régulateurs contrôlent les processus de LLPS restent à déterminer. Dans la première étude de cette thèse, nous avons investigué le mécanisme d’action de la déubiquitinase USP16, qui a été suggérée comme un régulateur négatif de la LLPS, empêchant la formation des foci de réparations de dommages à l’ADN. Cependant, nos résultats démontrent que USP16 est majoritairement cytoplasmique et que seulement une entrée forcée de USP16 dans le noyau empêche la formation des foci de réparation des cassures double brin induites par des radiations ionisagntes et ce en favorisant la déubiquitination de l’histone H2A. De plus, aucune translocation nucléaire de USP16 n’a été observée durant le cycle cellulaire ou suite à des dommages à l’ADN. Nos travaux montrent que USP16 est activement exclue du noyau via son signal d’export nucléaire et régulerait indirectement la LLPS menant à la formation des foci de réparation de l’ADN. Dans la deuxième étude, nous décrivons le comportement dynamique des protéines du protéasome lors d’une LLPS induite par un stress métabolique. Nos résultats indiquent que le protéasome forme des foci distincts dans le noyau des cellules humaines en réponse à une privation de nutriments. Nous avons constaté que ces foci sont enrichis en ubiquitine conjuguée et nous avons démontré que le récepteur d’ubiquitine Rad23B ainsi que l’absence des acides aminés non essentiels sont des éléments clés nécessaires à l’assemblage de ces foci du iv protéasome. De plus, des expériences de survie cellulaire montrent que la présence de ces foci est associée à la mort des cellules par apoptose. En conclusion, nos travaux mettent en lumière l’importance du système ubiquitine-protéasome dans la formation et la régulation des foci cellulaires suite à une LLPS. De même, cette étude aidera également à approfondir notre compréhension sur les mécanismes qui gouvernent l’homéostasie des protéines, la survie cellulaire et le développement du cancer. / The ubiquitin-proteasome system represents a major cell-signaling platform in eukaryotes and plays a pivotal role in the coordination of cellular processes. Recent studies provided evidence that ubiquitination plays a role in liquid-liquid phase separation (LLPS), a process that results in the localization of highly increased levels of a protein in a defined subcellular compartment, in order to achieve a biological function. Indeed, ubiquitination has been shown to play a central role in the mechanisms that govern LLPS and subsequent formation of stress granules in the cytoplasm or the DNA repair foci in the nucleus. On the other hand, several studies have shown that the proteasome itself is able to form granules in the cytoplasm following metabolic stress in yeasts. However, the mechanisms by which the ubiquitin-proteasome system and its regulators control LLPS processes remain to be determined. In the first study of this thesis, we investigated the mechanism of action of USP16 deubiquitinase, which has been suggested as a negative regulator of LLPS preventing the formation of DNA damage repair foci. However, our results demonstrate that USP16 is predominantly cytoplasmic and that only enforced nuclear entry of USP16 prevents the formation of repair foci after double strand breaks induced by ionizing radiation, and this by promoting the deubiquitination of histone H2A. In addition, no nuclear translocation of USP16 was observed during cell cycle or following DNA damage. Our study shows that USP16 is actively excluded from the nucleus via its nuclear export signal and would indirectly regulate LLPS that lead to DNA repair foci. In the second study, we describe the dynamic behavior of proteasome proteins during metabolic stress, a process that involves LLPS. Our results indicate that the proteasome forms distinct foci in the nucleus of human cells in response to nutrients deprivation. We found that these foci are enriched with conjugated ubiquitin and demonstrated that the ubiquitin receptor Rad23B as well as the absence of nonessential amino acids are the key elements necessary for the assembly of these proteasome foci. In addition, cell survival experiments show that the presence of these foci is associated with cell death by apoptosis. In conclusion, our work has shed new light on the importance of the ubiquitin-proteasome system in the formation and regulation of cell foci following LLPS. Likewise, this vi study will also help deepen our understanding of the mechanisms leading to protein homeostasis, cell survival and cancer development.