Le poisson Astyanax mexicanus présente, au sein de la même espèce, plusieurs populations de poissons de rivières (SF) et de poissons de grottes aveugles (CF). Chez les poisons cavernicoles aveugles, les yeux se développent presque normalement pendant l’embryogenèse. Mais 24 heures après la fécondation (hpf), quand l’embryon éclot, le cristallin entre en apoptose, ce qui déclenche la dégénérescence progressive de l’œil entier. Mon projet de thèse visait à comprendre le mécanisme conduisant à l’apoptose du cristallin, jusqu’alors totalement incompris, en partant du postulat selon lequel le défaut devait avoir lieu pendant les stades précoces du développement du cristallin. Le cristallin se développe à partir d’une placode, un épaississement de l’ectoderme au stade neurula. Toutes les placodes, qui donnent naissance à des organes des sens de la tête, sont issues du champ panplacodal, situé à la bordure de la plaque neurale antérieure à 10 hpf. Nous avons comparé la régionalisation de ce champ chez les deux morphes, par hybridations in situ de gènes marqueurs des différentes placodes. Chez le CF, le territoire présomptif du cristallin est réduit à 10 hpf, et le cristallin est plus petit à tous les stades étudiés. D’autre part, la placode olfactive est étendue, et donne naissance à un épithélium olfactif plus large chez le CF. Les modifications de taille de ces deux placodes pourraient être le résultat évolutif d’un « trade-off » entre ces deux composantes sensorielles. La régionalisation modifiée du champ panplacodal chez le CF est due au moins partiellement à des différences spatiales et temporelles d’expression des molécules de signalisation Shh, Fgf, et peut-être Bmp4.Nous avons pensé que la petite taille du cristallin pouvait être la cause directe de son entrée en apoptose, par un défaut d’effet de communauté. Nous avons réalisé une ablation laser partielle des cellules précurseurs du cristallin à 12-14 hpf chez l’embryon SF, mimant ainsi la taille du cristallin CF. L’apoptose dans le petit cristallin des larves SF à 60 hpf n’a pas été augmentée, ce qui montre que la petite taille n’est pas suffisante pour induire l’apoptose.L’apoptose du cristallin pourrait aussi provenir de défauts de morphogenèse ou d’un problème de lignage cellulaire. Nous utilisons donc l’imagerie biphoton in vivo sur des embryons SF et CF, de 10 à 24 hpf, préalablement injectés au stade une cellule avec des ARNm de H2B-mCherry et Ras-GFP pour marquer les noyaux et les membranes. Les premiers résultats sur les poissons de surface montrent que nous pouvons suivre à rebours les cellules du cristallin de la fin du film jusqu’au champ panplacodal, et étudier la morphogenèse et les divisions.La différenciation du cristallin est également affectée chez le CF : au moins 5 cristallines, qui sont des protéines structurales du cristallin, ne sont pas exprimées correctement chez le CF, d’après des hybridations in situ et des qPCR. Cependant, le rôle fonctionnel de deux de ces modifications d’expression a été testé, et individuellement, elles n’expliquent pas le phénotype apoptotique. Nous émettons l’hypothèse qu’une combinaison de défauts d’expression de plusieurs cristallines serait à l’origine de l’apoptose du cristallin CF. Enfin, et plus largement, les forces évolutives qui ont conduit à la perte de l’œil chez Astyanax mexicanus ne sont pas encore comprises. Par une étude d’évolution moléculaire à l’échelle du transcriptome nous avons identifié des mutations fixées entre SF et CF, et avons pu mettre en évidence une accumulation de mutations dans des « gènes d’yeux » chez les CF. Cela suggère un relâchement de la pression de sélection sur ces gènes, peut-être devenus inutiles dans l’obscurité. De même, les séquences des cristallines de CF paraissent accumuler des mutations fixées à un taux élevé vu leur bas niveau de polymorphisme. / The fish Astyanax mexicanus presents, within the same species, several populations of river-dwelling surface fish (SF) and blind cave-living fish (CF). In blind cavefish, the eyes first develop almost normally during embryogenesis. But 24 hours after fertilization (hpf), when the embryo hatches, the lens enters apoptosis, which triggers the progressive degeneration of the entire eye. My thesis project aimed at understanding the mechanism leading to lens apoptosis, which was so far unknown. We reasoned that the defect(s) should take place during the early stages of lens development. The lens develops from a placode, a thickening of the ectoderm at the neurula stage. All placodes, giving rise to sense organs of the head, originate from the “panplacodal” field, located at the border of the anterior neural plate at 10 hpf. We compared the patterning of the panplacodal field in the 2 morphs, using in situ hybridizations for placodal marker genes. In CF, the lens placode territory is reduced at 10 hpf, and the lens is smaller at all stages examined. Conversely, the olfactory placode is enlarged, and gives rise to a bigger olfactory epithelium in CF. The modifications in size of these two placodes could result evolutionarily from a trade-off between these two sensory components. Developmentally, the modified patterning of the panplacodal field in CF is at least partly due to the spatial and temporal differences in the expression of Shh and Fgf (and perhaps Bmp4) signaling molecules.We hypothesized that the small size of the lens could be the direct cause of its apoptosis, through a lack of community effect. We performed partial laser ablation of lens precursor cells at 12-14hpf in surface fish (thereby mimicking the CF lens size). Apoptosis in the resulting small lens of SF larvae at 60hpf was not enhanced, showing that small size is not sufficient to induce apoptosis. Lens apoptosis could also result from morphogenesis defects or from a problem in cell lineage. We are performing two-photon live imaging, from 10 to 24 hpf, of SF and CF embryos previously injected at the one cell stage with H2B-mCherry and Ras-GFP mRNAs to label nuclei and membranes. First results on surface fish show that we can back-track lens cells to the panplacodal field, and follow morphogenesis and divisions. Lens differentiation is also affected in cavefish: at least 5 crystallins, which are lens structural components, are not expressed correctly in CF, based on in situ hybridization and qPCR data. However the functional role of two of these expression modifications / losses was tested and, individually, they don’t seem to explain the apoptosis phenotype. We propose that a combination of several crystallins expression defects would explain CF lens apoptosis.Finally, and more globally, evolutionary forces that led to eye loss in Astyanax mexicanus are not yet understood. Through a transcriptome-wide molecular evolution approach, we identified fixed mutations in transcripts between SF and CF, and we could show an accumulation of mutations in “eye genes” in CF. This suggests that the selection is relaxed on these genes, that have maybe become useless in the dark. Similarly, CF crystallin sequences seem to accumulate fixed mutations at a high rate, considering their low polymorphism level.

The nematode Caenorhabditis elegans has served as one of the primary model organisms in neuroscience. As C. elegans research became more specific, so have the biological tools for manipulating C. elegans improved and matured. Additionally, in some avenues of research, technologies have been developed to manipulate the animals in very efficient and quantitative ways. However, the field of dynamic studies has remained without significant technological support. Dynamic studies focus on processes occurring over time and span a range of time-scales of i) minutes to hours requiring continuous imaging for accurate observation, ii) hours to days requiring periodic imaging of the same animal, and iii) days to weeks requiring daily monitoring. Because of a lack of suitable tools and technologies to perform these studies, researchers have to either apply standard biological methods with limited ability to observe processes dynamically or simply cannot perform such studies with the desired set of experimental conditions. To address this problem, a comprehensive microfluidic toolkit for dynamic studies has been created. The first element is a novel method for reversible and repeatable immobilization at benign conditions in tandem with a microfluidic system for isolated culture of C. elegans with integrated temperature control. The second element is a system for efficient handling of C. elegans embryos in a high-throughput and scalable fashion for chemical and thermal embryonic stimulation with subsequent study of development. The third component is a system capable of selective immobilization of animals’ bodies, while simultaneously facilitating feeding and normal physiological function for live imaging. The last component is capable of culturing animals over their life-span with efficient animal handling, environmental control (temperature and dietary conditions), and high data content experimentation. As a whole, the work in this thesis enables dynamic studies over the whole range of time scales applicable to C. elegans research. These types of studies were previously very difficult or near impossible to perform practically. Now, instead of building population composites to understand the dynamics of a process, risking affecting physiology via the experiment itself, or dealing with extremely labor intensive physical handling of animals, a toolkit for efficient handling of C. elegans facilitating dynamic and direct observation of individual animals is available. The biological applications range from dynamically studying lipid droplet morphology or studying synaptic vesicle transport, through observing the dynamics of synaptic re-arrangement during development or the effect of cancer drugs on development, to performing high-content life-span experiments able to ascertain the relationship between aging and behavior. Additionally, many of the principles in these designs can be expanded to accommodate research on other model organisms, such as other nematode species, zebra fish embryos, or cells and embryoid bodies.

The two defining features of mouse embryonic stem (ES) cells are self-renewal and naive pluripotency, the ability to give rise to all cell lineages in the adult body. In addition to being a unique and interesting cell type, pluripotent ES cells have demonstrated their potential for continued advancements in biomedical science. Currently, there is an improved understanding in the chemical signals and the gene regulatory network responsible for the maintenance of ES cells in the naive pluripotent state. However, less is understood about how ES cells exit pluripotency. My main aim is to study the dynamics and the factors affecting the irreversible exit from pluripotency. Expression of the reporter Rex1-GFPd2, which is inactivated upon exit from naive pluripotency, was analyzed by quantitative long-term single-cell imaging over many generations. This technique allowed chemical, physical, and genealogical information to be recorded during the transition to exit. Culture conditions that provided homogeneous populations were used in all assays and these data were validated against bulk-culture data where appropriate. Changes in real-time cell behavior were seen in cell-cell contact, motility, and cell-cycle duration. Undifferentiated ES cells form tightly joined colonies, with cells that exhibit low motility and a constant cell-cycle duration. Exit is associated with increasing cell motility, decreased cell-cell contact, and an acceleration in cell proliferation. The onset of exit is associated with a sudden and irreversible inactivation of the Rex1-GFPd2 reporter. This inactivation is asynchronous, as it occurs at different times and in different generations during ES cell differentiation. However, examination of daughter cells generated from the same mother revealed a high level of synchronicity. Further investigation revealed that high levels of correlation in cell-cycle duration and Rex1-GFPd2 expression exist between differentiating sister and cousin cells, providing strong evidence that cell potency is inherited symmetrically in cell divisions during exit $\textit{in vitro}$. How cells change fate is a fundamental question in developmental biology. Knowing the cellular dynamics during the transition out of naive pluripotency is important for harnessing the potential of ES cells and understanding how cell fate decisions are made during embryonic development. The quantification of the timing of exit from naive pluripotency coupled with identifiable changes in cellular behaviors, such as motility, cell size, and cell-cycle duration, enhances the understanding of how cell fate changes are regulated during directed differentiation.

Dans les cellules des eucaryotes, la transcription des gènes est contrôlée par une pléthore de complexes protéiniques. Cependant, la plupart de nos connaissances fondamentales sur la régulation de la transcription viennent des expériences biochimiques ou des expériences d’immunofluorescences utilisant des cellules fixées. Par conséquent, beaucoup d’efforts ont été consacré récemment pour obtenir des informations sur les mouvements dynamiques ou sur l’assemblage des facteurs de transcription directement dans des cellules vivantes. Nous avons développé une stratégie de marquage, appelé « versatile antibody-based imaging approach » (VANIMA), dans laquelle des anticorps marqués avec un fluorochrome sont introduit dans des cellules vivantes pour visualiser spécifiquement des protéines endogènes ou des modifications post-traductionnelle. Nous avons pu montrer que VANIMA peut être utilisé pour étudier des processus dynamique des mécanismes fondamental de la biologie y compris les facteurs de la machinerie de transcription ainsi que les modifications des histones dans des cellules vivantes de cancer humaine en utilisant la microscopie conventionnelle ou à super-résolution. Dans l’avenir VANIMA va servir comme un outil valable pour révéler les dynamiques des processus endogènes en biologie y compris la transcription directement dans des cellules vivantes individuelles. / In eukaryotic cells, gene transcription is controlled by a plethora of protein complexes. However, most of our basic knowledge about transcription regulation originate from biochemical experiments or immunofluorescence experiments using fixed cells. Consequently, many efforts have been devoted recently to obtain information about the dynamic movements or assembly of transcription factors directly from living cells. Therefore, we developed a labeling strategy, named versatile antibody-based imaging approach (VANIMA), in which fluorescently labeled antibodies are introduced into living cells to image specific endogenous proteins or posttranslational modifications. We were able to show that VANIMA can be used to study dynamical processes of fundamental biological mechanisms including factors of the transcription machinery as well as histone modifications in living human cancer cells using conventional or super-resolution microscopy. Hence, in the future VANIMA will serve as a valuable tool to uncover the dynamics of endogenous biological processes including transcription directly in single living cells.

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Los fotorreceptores de los mamíferos, las células externas de la retina que detectan la luz, carecen de capacidad de autorregeneración tras una lesión. En los estadios avanzados de las IRD, los fotorreceptores se pierden pero la estructura interna de la retina se conserva durante largos periodos de tiempo, aunque con una importante remodelación sináptica y gliosis. Para estas condiciones, las terapias regenerativas dirigidas a reemplazar los fotorreceptores y establecer sinapsis funcionales con las neuronas internas de la retina viables restantes podrían permitir la recuperación de la visión en pacientes que de otro modo serían ciegos. En otras palabras, la terapia con células madre está dirigida al tratamiento de las degeneraciones de la retina en aquellas situaciones en las que se han perdido los fotorreceptores y, por lo tanto, no es posible restaurar la funcionalidad a través de enfoques más comunes como la terapia de reemplazo de genes. Se han desarrollado y caracterizado células madre embrionarias humanas (hESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células precursoras de fotorreceptores (PRPC) contenidas en organoides de retina (RO) para terapias experimentales regenerativas. Aunque la terapia con células madre es un campo que ha mostrado resultados prometedores en animales de laboratorio, no hay informes que evalúen la seguridad y eficacia de su uso en perros. Con un inyector subretiniano que fue modificado para acomodar el gran tamaño de los agregados celulares, inyectamos con éxito las células en el espacio subretiniano (SRS) canino utilizando un procedimiento quirúrgico sencillo (inyección manual en bolo sin vitrectomía previa). Pudimos monitorizar la supervivencia y las características de las células injertadas a lo largo del tiempo utilizando un enfoque de imagen multimodal que incluía la detección mediante fotografía del fondo de ojo y/o cSLO de los genes reporteros fluorescentes (tdTomato o GFP) expresados por las PRPC. Esto nos permitió superar un reto importante encontrado en otros estudios, donde las células donantes no fluorescentes fueron seguidas sólo por OCT o detectadas por histología después de la terminación. La visualización de las PRPC fluorescentes en el animal vivo nos permitió diferenciarlas de las células del huésped. En consonancia con lo descrito anteriormente, observamos dos patrones temporales de pérdida de células del donante: una reducción temprana del número de células injertadas en la primera semana del trasplante que no dependía del estado de la inmunosupresión (IS), y un rechazo retardado del injerto, observado en aquellos perros que no estaban inmunosuprimidos. De hecho, hasta donde sabemos, no hay estudios que evalúen el tiempo de pérdida de fotorreceptores tras el trasplante, con y sin IS, controlando simultáneamente la transferencia de material citoplasmático entre las células del donante y del huésped. Aquí observamos signos compatibles con el rechazo del trasplante en animales que no recibieron IS sistémico, así como en un único perro cuyo tratamiento con IS se interrumpió. El grado de inflamación clínica variaba entre los animales, pero la vasculitis retiniana, el vítreo turbio y la inflamación de la retina eran comunes en todos los perros con rechazo de las células del donante. Estos signos se detectaron por primera vez entre 1-2 y 12 semanas después del trasplante, lo que respalda la necesidad de un seguimiento frecuente de las retinas tratadas en los meses siguientes al trasplante para detectar posibles signos tempranos de rechazo y ofrecer la oportunidad de ajustar el régimen inmunosupresor. Dado que el rechazo del trasplante en el SRS también puede producirse sin inflamación clínica manifiesta, se justifica la identificación de nuevos biomarcadores que puedan detectar la inflamación subclínica temprana para modular la respuesta inmunitaria y prolongar la supervivencia del injerto. Aunque se desconocen todos los factores que promueven la supervivencia de las células del donante, descubrimos que el IS sistémico desempeñaba un papel fundamental en la supervivencia de las hESC-PRPCs administradas por vía subretiniana, como se había informado anteriormente. En el presente estudio, algunas PRPC desarrollaron estructuras similares a pedículos, expresaron la proteína presináptica sinaptofisina y establecieron contactos con las células bipolares del anfitrión. Estos resultados alentadores preparan ahora el terreno para la evaluación funcional de estas xenosinapsis. La retinosis pigmentaria es un grupo de enfermedades genéticas que provocan una pérdida progresiva de la visión, siendo una de las principales causas de ceguera en los países desarrollados. Está bien documentado que en pacientes con retinosis pigmentaria, existe una disfunción vascular asociada que conduce al adelgazamiento de los vasos; sin embargo, las implicaciones de esta disfunción vascular en la degeneración de los fotorreceptores no se comprenden completamente. Los modelos caninos de degeneraciones retinianas hereditarias han sido de gran relevancia en el desarrollo traslacional de terapias de reemplazo génico para múltiples formas de retinosis pigmentaria, Amaurosis congénita de Leber, y enfermedad de Best. De manera similar a lo que ocurre en pacientes con retinosis pigmentaria, los perros afectados con las mismas mutaciones también experimentan remodelación vascular, sin embargo, la cinética de esta remodelación vascular en enfermedades retinianas hereditarias caninas no se ha estudiado y no se han establecido los parámetros normales en el perro. La angiografía por tomografía de coherencia óptica (OCTA) es un método novedoso de obtención de imágenes sin necesidad del uso de contraste intravenoso que permite la visualización detallada de la circulación retiniana, lo que permite el estudio de los distintos plexos vasculares por separado. Esta importante extracción de imágenes de los diferentes plexos, junto con la alta resolución de estos angiogramas, permite una cuantificación más precisa de la densidad vascular y otros parámetros, teniendo muchas aplicaciones en sujetos sanos y en pacientes con diferentes enfermedades oculares y sistémicas. Con el uso de modernas técnicas de imagen, este trabajo ha confirmado la presencia de cuatro plexos retinianos distintos. Aunque muchos estudios han informado de los datos cuantitativos de las imágenes OCTA en retinas humanas, no se han descrito parámetros vasculares caninos. Este estudio proporciona datos normativos para el SVP+ICP, DCP y WR, estableciendo con éxito un rango de referencia que puede ser consultado y comparado en futuros estudios. En los ojos humanos, el número de plexos retinianos y sus densidades disminuyen hacia la periferia, y esto es similar a lo que Engerman et al. describieron previamente en perros. Nuestro trabajo no sólo confirma este hallazgo, sino que ahora proporciona datos cuantitativos para cuatro parámetros que se utilizan frecuentemente para caracterizar las redes vasculares. En nuestra evaluación, los angiogramas de OCTA tenían una mayor resolución en comparación con las imágenes de AF en la misma localización. Al igual que en el caso de los seres humanos, la angiografía por OCT en perros permitió identificar lechos capilares (ICP y DCP) que no se identificaban con la AF. Sin embargo, la AF proporcionó un mayor campo de visión y los artefactos que se encontraron en algunas de las exploraciones de OCTA (artefactos de movimiento y anormalidades de descorrelación debido al artefacto de proyección) no se observaron en las imágenes de AF. Cuando se compara con las imágenes obtenidas por IHC en montajes completos de retina, nuestro estudio confirma que la OCTA proporciona una buena visualización de la SVP y la DCP. También encontramos que había una subrepresentación de los vasos de pequeño calibre en la OCTA, especialmente los situados en capas altamente reflectantes (ICP). Cuando se compara con las imágenes adquiridas en las mismas localizaciones por microscopía confocal/IHC, nuestros resultados sugieren que la OCTA es una técnica valiosa para visualizar y cuantificar la vasculatura retiniana en perros, especialmente para el análisis de la VD en el DCP. Además, por IHC encontramos que el ICP se fusiona con el SVP pero no con el DCP como ocurre en las retinas humanas. Nuestro estudio ha confirmado la viabilidad del uso de OCTA en perros, proporcionando imágenes resueltas en profundidad de diferentes capas retinianas segmentadas que permiten la evaluación de plexos individuales. Esto allana el camino para otros análisis in vivo de la vasculatura de la retina canina en un amplio número de patologías de la retina con un fenotipo vascular. Además, evaluamos los cambios vasculares en el area centralis de perros afectados por varias formas de IRD que fueron visualizados por OCTA en diferentes etapas de la enfermedad. Identificamos que la DCP está más afectada que las redes vasculares más superficiales en una etapa temprana de la enfermedad. Además, confirmamos que existe una fuerte asociación entre el VD en el DCP y el grosor de la ONL, lo que sugiere que la evaluación de la vascularización en este plexo puede utilizarse como un marcador indirecto para la evaluación de los requisitos metabólicos de la retina externa. Por último, hemos validado mediante el análisis de los vasos en los montajes planos de la retina los hallazgos de la OCTA, y hemos descubierto que en los modelos caninos de IRD la migración de las células del RPE también desempeña un papel en las alteraciones vasculares de la fase posterior que se producen en los pacientes con RP. Encontramos que los cambios microscópicos observados en los vasos con degeneración eran diferentes en las distintas redes retinianas. En la DCP, se confirmó un estrechamiento y una pérdida progresiva de vasos, que acabó con la desaparición completa de esta red. En el SVP de los tres modelos, los vasos presentaban un mayor grosor de la pared debido a la deposición de material que rodea la pared vascular que, en las fases finales, conduce al estrechamiento y la oclusión vascular. En la fase final de la enfermedad, se observó que múltiples vasos de la SVP estaban rodeados de estructuras pigmentadas. El marcaje específico de RPE65 reveló que se trataba de células del PRE que habían migrado para rodear estos vasos internos de la retina. Aquí caracterizamos dos tipos diferentes de degeneración vascular que se producen en los plexos retinianos SVP y DCP, lo que podría aportar información para futuros estudios que evalúen específicamente la fisiopatología de esta degeneración vascular. Un animal del modelo crd2/NPHP5 fue tratado con terapia de reemplazo génica unilateralmente con una inyección subretiniana que cubría el area centralis. En este perro, la pérdida de ONL en el momento de la intervención de terapia génica era inferior al 50%. Al comparar las fotografías del fondo de ojo del ojo no tratado y el tratado, se identificó fácilmente una marcada preservación de la vascularización en el área que fue cubierta por la terapia génica. Las imágenes OCTA se procesaron con el programa AngioTool, y la evaluación cualitativa de las imágenes esqueletizadas mostró una regresión vascular en el ojo no tratado y una notable preservación de la integridad vascular en el ojo tratado. También demostramos que en estas enfermedades naturales, así como en un modelo de degeneración aguda de fotorreceptores inducido por la luz, el DCP se ve afectado antes que los otros plexos vasculares de la retina. La posterior disminución de la VD en el SVP+ICP que se produce en las últimas fases de la degeneración, es probablemente una respuesta al marcado adelgazamiento de la retina externa y a la capacidad de que el oxígeno transportado por los vasos coroideos llegue a las localizaciones internas de la retina, como se ha confirmado previamente en modelos animales felinos utilizando perfiles espaciales de oxigenación de la retina.

Les plantes présentent une incroyable diversité de tailles, formes et couleurs, étroitement liée à certaines de leurs fonctions biologiques telles que la photosynthèse, la reproduction, etc. De ce fait, la façon dont ces organismes multicellulaires acquièrent des formes complexes est une question clé en biologie du développement. La morphologie des organes végétaux résulte en effet de la modulation, à l’échelle cellulaire, de patrons d’expression génétique, de croissance et de différenciation. Bien que la morphogénèse ait été largement étudiée d’un point de vue moléculaire, nous ne savons toujours pas comment ces réseaux génétiques sont traduits en formes biologiques. Le but de ce projet de recherche est donc d’étudier le développement des organes latéraux (feuilles juvéniles, feuilles caulinaires et organes floraux, id sépales, pétales et anthères) chez l’espèce modèle Arabidopsis thaliana. Afin d’approcher la question du rôle des interactions complexes entre cellules et organes lors du développement, nous nous intéressons à la variabilité entre les organes, mais aussi à la variabilité cellulaire intrinsèque de chaque organe. Nous avons donc testé (1) si la diversité de formes observées chez les organes latéraux résulte de modulations d’un programme développemental commun; (2) si la croissance et le développement des organes latéraux est un phénomène stochastique ou dépend de mécanismes sous-jacents spécifiques. Pour ce faire, nous utilisons une approche multidisciplinaire basée sur la génétique, la microscopie confocale et l’analyse d’images 3D pour extraire les patrons de croissance inhérents aux différents organes. Les résultats de la première étude (Chapitre 2) montrent que la forme des organes dépend de l’équilibre entre croissance et différentiation, dont la régulation précise permet l'acquisition de fonctions hautement spécialisées. La feuille caulinaire, par exemple, présente un retard de différenciation qui permet une activité morphogénétique prolongée et une redistribution de la croissance. À travers la suppression transitoire de la croissance lors des premiers stades de développement, la trajectoire développementale de la feuille caulinaire permet sa double fonction, à la fois protectrice et photosynthétique.\par La deuxième étude (Chapitre 3), quant-à-elle, s’intéresse aux comportements des cellules individuelles, dont la croissance, bien que contrôlée par des informations positionnelles, est souvent hétérogène. Cette variabilité résulte de la différenciation de cellules spécialisés, les stomates, qui suivent un programme de développement spécifique. Le comportement autonome de ces cellules, asynchrone, est la principale source de variabilité dans des tissus dont la croissance est autrement homogènes. Dans l’ensemble, cette thèse a permis de mettre en lumière l’importance de la temporalité lors du développement des organes végétaux. Que ce soit à l’échelle de l’organe, du tissu ou de la cellule, la modulation et la synchronisation de la croissance et de la différentiation sont nécessaires à l’acquisition des formes stéréotypiques des organes et à leur complexité fonctionnelle. / Plants display an incredible diversity of sizes, shapes, and colors, closely linked to some of their biological functions, such as photosynthesis, reproduction, etc. How these multicellular organisms acquire complex shapes is, therefore, a key question in developmental biology. The morphology of plant organs results from cell-level modulation of patterns of gene expression, growth, and differentiation. Although morphogenesis has been extensively studied from a molecular point of view, how genetic networks are translated into biological forms is still unclear. Thus, the aim of this research project is to study the development of lateral organs (rosette leaves, cauline leaves, and floral organs, i.e. sepals, petals, and anthers) in the model species Arabidopsis thaliana. To address the question of the role of complex cell-organ interactions during development, we are interested not only in variability between organs but also in the intrinsic cellular variability of each organ. We, therefore, tested (1) whether the diversity of shapes observed in lateral organs results from modulations of a common developmental program; (2) whether the growth and development of lateral organs is a stochastic phenomenon or depends on specific underlying mechanisms. To this end, we are using a multidisciplinary approach based on genetics, confocal microscopy, and 3D image analysis to extract the growth patterns inherent in the different organs. The results of the first study (Chapter 2) show that organ shape depends on the balance between growth and differentiation, which fine regulation enables the acquisition of highly specialized functions. The cauline leaf, for example, shows a delay in differentiation that allows for prolonged morphogenetic activity and growth redistribution. Through the transient growth suppression at early stages, the cauline leaf developmental trajectory allows for its dual function, from protection to photosynthesis. The second study (Chapter 3) focuses on the behavior of individual cells, whose growth, although controlled by positional information, is often heterogeneous. This variability results from the differentiation of specialized cells, the stomata, which follow a specific developmental program. The autonomous, asynchronous behavior of these cells is the main source of variability in tissues whose growth is otherwise homogeneous. Overall, this thesis has shed light on the importance of timing in plant organ development. Whether at the organ, tissue, or cell level, modulation and synchronization of growth and differentiation are necessary for the acquisition of stereotypic organ shapes and functional complexity.

During embryogenesis and post-embryonic patterning, active transport of the phytohormone auxin, reflected in the expression of the Arabidopsis PIN family of auxin efflux mediators, generates local auxin distributions that are crucial for correct organ and tissue specification. Polar auxin transport routes have also long been postulated to regulate vein formation in the leaf. The molecular identification of PIN proteins has made it possible to investigate this hypothesis further by visualizing auxin transport routes in developing leaves. In Arabidopsis leaf primordia, PIN1 is expressed before the earliest known markers of vascular identity, in domains that are gradually restricted to sites of vein formation. PIN1 polarity indicates that auxin is directed towards distinct “convergence points” (CPs) in the marginal epidermis, from which it defines the sites of major vein formation. Within incipient veins, PIN1 polarity indicates drainage of auxin into preexisting veins, such that veins connected at both ends display two divergent polarities. Local auxin application triggers the formation of ectopic CPs and new veins, demonstrating the sufficiency of auxin as a vein-specifying signal. However, not all PIN1-labeled auxin transport routes differentiate as veins: Minor veins are initially unstable, suggesting local competition for auxin transport. Expression of ATHB8, a marker of vascular cell selection, correlates with enhanced PIN1 expression domain (PED) stability and vascular differentiation. Auxin application and auxin transport inhibition reveal that both CP formation in the epidermis and subepidermal PED dynamics are auxin-dependent and self-organizing. Furthermore, normal auxin perception through the ARF-Aux/IAA signaling pathway is required for the restriction of PIN1-mediated auxin transport to narrow subepidermal domains. ARF-Aux/IAA signaling is known to control auxin transport through the regulation of PIN1 dynamics, but the mechanism of this regulation is unclear. It is here shown that two redundantly acting AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) transcription factors, ARF5/MONOPTEROS (MP) and ARF7/NPH4, jointly regulate both PIN1 expression and localization during lateral root patterning in Arabidopsis, in part through the direct transcriptional activation of PIN1 by MP. Taken together, these results indicate that feedback between PIN-mediated auxin transport and ARF-Aux/IAA signaling regulates the patterning of root and shoot organs.

During embryogenesis and post-embryonic patterning, active transport of the phytohormone auxin, reflected in the expression of the Arabidopsis PIN family of auxin efflux mediators, generates local auxin distributions that are crucial for correct organ and tissue specification. Polar auxin transport routes have also long been postulated to regulate vein formation in the leaf. The molecular identification of PIN proteins has made it possible to investigate this hypothesis further by visualizing auxin transport routes in developing leaves. In Arabidopsis leaf primordia, PIN1 is expressed before the earliest known markers of vascular identity, in domains that are gradually restricted to sites of vein formation. PIN1 polarity indicates that auxin is directed towards distinct “convergence points” (CPs) in the marginal epidermis, from which it defines the sites of major vein formation. Within incipient veins, PIN1 polarity indicates drainage of auxin into preexisting veins, such that veins connected at both ends display two divergent polarities. Local auxin application triggers the formation of ectopic CPs and new veins, demonstrating the sufficiency of auxin as a vein-specifying signal. However, not all PIN1-labeled auxin transport routes differentiate as veins: Minor veins are initially unstable, suggesting local competition for auxin transport. Expression of ATHB8, a marker of vascular cell selection, correlates with enhanced PIN1 expression domain (PED) stability and vascular differentiation. Auxin application and auxin transport inhibition reveal that both CP formation in the epidermis and subepidermal PED dynamics are auxin-dependent and self-organizing. Furthermore, normal auxin perception through the ARF-Aux/IAA signaling pathway is required for the restriction of PIN1-mediated auxin transport to narrow subepidermal domains. ARF-Aux/IAA signaling is known to control auxin transport through the regulation of PIN1 dynamics, but the mechanism of this regulation is unclear. It is here shown that two redundantly acting AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) transcription factors, ARF5/MONOPTEROS (MP) and ARF7/NPH4, jointly regulate both PIN1 expression and localization during lateral root patterning in Arabidopsis, in part through the direct transcriptional activation of PIN1 by MP. Taken together, these results indicate that feedback between PIN-mediated auxin transport and ARF-Aux/IAA signaling regulates the patterning of root and shoot organs.

La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est un processus incontournable dans de nombreux contextes normaux et pathologiques, tels que gastrulation, organogenèse, fibroses et cancers. Cette transformation de cellule épithéliale en cellule mésenchymateuse est indissociable de l'acquisition de propriétés migratoires et est généralement associée à un changement de destin cellulaire. Différentes voies moléculaires sont impliquées selon le contexte de l'EMT concernée. Récemment, notre laboratoire a mis en évidence que la voie Notch cytoplasmique contrôle l'EMT des cellules de la lèvre dorso-médiale du somite (DML). Les crêtes neurales exprimant DLL1 activent « en passant » le récepteur NOTCH, liberant ainsi le domaine intra-cytoplasmique de NOTCH (NICD). Dans le cytoplasme, NICD inhibe la kinase GSK3ß, conduisant à la stabilisation de SNAIL, un gène maître de la transition épithélio-mésenchymateuse. Il en résulte une libération de la βcaténine des jonctions adhérentes qui, après translocation dans le noyau, active la transcription des gènes de la myogénèse (Myf5). Ainsi, l'activation de la voie Notch cytoplasmique permet une induction concomitante de l'EMT et de la myogénèse. La fonction cytoplasmique de Notch reste controversée et le mécanisme par lequel NICD inhibe GSK3ß reste obscur. Au cours de ma thèse j'ai cherché à élucider le mécanisme par lequel NICD inhibe l'activité kinase de GSK3ß. J'ai confirmé l'interaction de GSK3ß et de NICD en démontrant leur interaction via CoIP. Après avoir démontré l'implication de la sérine-thréonie kinase AKT dans la myogenèse des cellules de la DML, j'ai mis en évidence, via CoIP et électroporation, que l'inhibition GSK3ß par NICD est très certainement médiée par AKT, connue pour être impliquée dans l'EMT et inhiber GSK3ß par phosphorylation. En comparant le NICD1 de poulet et les 4 NICD de souris, j'ai montré que l'expression exogène de ces 5 molécules induit l'EMT et la différenciation myogénique de manière similaire. J'ai aussi montré que parmi des différents domaines de NICD, le domaine RAM, connu pour se lier à l'ADN (via RBPJ), est nécessaire et suffisant à l'inhibition de GSK3ß. Un second axe de ma thèse a été de tester l'implication de la voie Notch cytoplasmique dans d'autres contextes d'EMT. Pour ce faire, j'ai mis en évidence que cette voie est impliquée dans les autres lèvres du dermomyotome mais aussi dans les crêtes neurales qui délaminent du toit du tube neural. J'ai en particulier mis en évidence une co-activation des voies Wnt et Notch, une inhibition de la kinase GSK3ß par NICD cytoplasmique ainsi qu'une inhibition de la différenciation en présence d'une ß-caténine mutée, retenue à la membrane, ou en présence d'une molécule SNAIL2 dominant-négative. Le dernier axe de ma thèse a consisté à élucider le mécanisme de régulation de l'induction de l'EMT et de la myogenèse via l'activation de NICD. Il a été mis en évidence que toutes les cellules de la DML peuvent être activées via DLL1 et que la surexpression massive de NICD dans la DML provoque une différenciation massive et une déplétion du groupe de cellules progénitrices. Afin de déterminer si la régulation de cette initiation se fait avant ou après induction de NICD, j'ai créé un plasmide permettant de répondre à cette question et afin de visualiser son expression in vivo, j'ai initié une collaboration avec une équipe de l'ILM afin de créer un microscope vertical SPIM biphoton permettant l'observation d'embryon de poulets vivants [etc...] / The epithelio-mesenchymal transition (EMT) is a well-known mechanism by which epithelial cells lose their adherent connections and gain migratory properties, associated with a gain of a mesenchymal phenotype. This EMT is required in numerous processes as gastrulation, organogenesis, fibrosis and cancers. Various molecular pathways orchestrate the EMT depending on the EMT biological context. Recently, our laboratory highlighted the implication of the cytoplasmic Notch pathway in the dorso-medial lip (DML) EMT. In the DML tissue, theEMT is synchronized with differentiation pathways, to generate cells forming the primary myotome. Our laboratory showed that neural crests cells expressing DLL1 activate NOTCH receptor of the DML cells, via a “kiss and run” model. This leads to NOTCH cleavage, releasing an activated intra-cytoplasmic NOTCH domain (NICD). In the cytoplasm, NICD inhibits the GSK3ß kinase, leading to the stabilization of SNAIL and the free cytoplasmic ßcatenin. These molecules translocate into the nucleus and lead to the activation of MRF as Myf5 (ß-catenin) and to the repression of adherent genes (SNAIL). Therefore, Notch cytoplasmic pathway allows a synergized induction of both, the EMT and myogenic programs. This pathway remains controversial and the precise mechanism how NICD inhibits GSK3ß needs to be elucidated. Therefore, the aim of my thesis project was to clarify how NICD inhibits GSK3ß activity. First, I confirmed that NICD and GSK3ß physically interact by CoIP. Moreover, I demonstrated that the serin-threonin kinase AKT, known to inhibit GSK3ß by phosphorylation and also to mediate EMT in cancer, can physically interact with NICD in the cytoplasm. I have also shown that AKT mediates the induction of the myogenic program through the inhibitory phosphorylation of GSK3ß and that SNAIL is downstream of AKT. Together, these experiments indicate that AKT mediates, through phosphorylation, the cytoplasmic NICD inhibition of GSK3ß leading to myogenesis. A comparison of the chicken NICD1 and the 4 isoforms of mouse NICD highlighted that these 5 proteins induce EMT and myogenesis similarly. The dissection of the different conserved domains in the 5 different NICD proteins demonstrated that the RAM domain, known to activate transcription by binding to RBPJ, is necessary and sufficient for GSK3ß inhibition. A second axis of the thesis has been to test the involvment of the cytoplasmic Notch pathway in other EMT contexts. First, I highlighted that this pathway induces myogenesis, showing that NICD inhibits GSK3ß activity in the ventro-lateral lip. I further demonstrated that the cytoplasmic Notch pathway is implicated in the EMT and differentiation of the neural crests cells delaminating from the dorsal neural tube. Particularly, I have shown a co-activation of the Wnt and Notch pathway in premigratory and migratory neural crests. Moreover, I demonstrated a cytoplasmic inhibition of the kinase activity of GSK3ß by NICD, as well as the induction of the differentiation by cytoplasmic ß-catenin or SNAIL2. In a third axis of my thesis, I tried to clarify the regulatory mechanism involved in Notch activation. Previously it has been demonstrated that in all the DML cells Notch can be activated by an overexpression of DLL1 and that an ectopic expression of NICD in the DML cells induce a massive differentiation and depletion of the progenitor pool. To determine if the regulation of this initiation of the myogenic program occurs before or after Notch activation, I designed a plasmid to visualize Notch activation in vivo. In order to be able to follow the DLM cells and Notch activation in vivo, I initiated a collaboration with an ILM team to create a vertical SPIM biphoton microscope. In the future, this microscope will allow us to follow cells in living chicken embryos [etc...]