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Etude des longs ARNs non codants dans la leucémie aiguë myéloblastique à caryotype normal / Study of long non coding RNAs in acute myeloid leukemia with normal karyotypeDe Clara, Etienne 26 November 2015 (has links)
Les longs ARN non codants (lncRNAs) sont définis comme des transcrits de plus de 200nt et n'ayant pas de potentiel codant. Des études récentes ont démontré que les lncRNAs pouvaient être impliqués dans la régulation de la transcription, de la traduction, de la différenciation cellulaire, de l'expression génique, du cycle cellulaire et des modifications de la chromatine. De plus, il a été montré un impact fonctionnel de certains lncRNAs dans le processus de cancérogenèse mais nos connaissances actuelles sur ces molécules dans le cancer, et plus particulièrement dans la leucémie, restent extrêmement limitées. Au cours de cette étude, nous avons analysé l'expression des lncRNAs par RNA-sequencing sur 40 patients atteints de leucémie aiguë myéloblastique (LAM) à caryotype normal. Parmi les 11065 lncRNAs exprimés dans nos échantillons, nous avons identifié une signature de lncRNAs associée à la mutation de NPM1. Afin de mettre en évidence les fonctions putatives des lncRNAs sélectionnés, nous avons utilisé un algorithme de prédiction d'interaction protéine/ARN. De manière intéressante, plus de la moitié des lncRNAs présentent des sites d'interactions potentiels à SUZ12, une sous unité du complexe PRC2 (Polycomb repressive complex 2), connu pour être recruté par des lncRNAs pour la régulation épigénétique de gènes cibles. Par RNA immunoprécipitation (RIP) de SUZ12, nous avons pu démontrer que le lncRNA XLOC_087120 interagissait avec SUZ12. De plus, son expression est anti-corrélée avec celle des gènes voisins codants des histones, suggérant un rôle dans la régulation négative des histones par ce lncRNA. L'impact de la dérégulation de XLOC_087120 sur les histones a été confirmé par des expériences de surexpression et d'inhibition de ce lncRNA dans des lignées de LAM. De plus, même si la mutation NPM1 ne semble pas affecter directement l'expression de ce lncRNA, des expériences d'infection de la forme mutée de NPM1 dans une lignée LAM ont montré que NPM1 pourrait réguler la localisation nucléaire/cytoplasmique de XLOC_087120 et moduler sa fonction de répresseur. En conclusion, ces données suggèrent que les lncRNAs sont des facteurs clés dans la pathogenèse des LAMs. / Long noncoding RNAs (lncRNAs) are defined as RNA transcripts that are larger than 200 nt but do not appear to have protein- coding potential. Recent studies have demonstrated that lncRNAs regulate many processes such as transcription, translation, cellular differentiation, gene expression regulation, cell cycle regulation, and chromatin modification. Cumulative evidence points towards an important role of lncRNAs in cancer initiation, development, and progression. However, our overall knowledge of lncRNAs in cancer, including leukemia, remains extremely limited. In this study, we investigated lncRNA expression by RNA-sequencing in 40 acute myeloid leukemia (AML) patients with normal karyotype. Among 11065 lncRNA expressed in our samples, we identified specific lncRNA signature associated with the presence of NPM1 mutation. To go further into the putative function of these lncRNAs, we used catRAPID Omics algorithm to predict potential protein partners. Interestingly, the majority of the selected lncRNAs contains putative SUZ12 binding sites, a PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) component known to be linked to lncRNAs and to epigenetically regulates target genes. By using SUZ12 RNA Immunoprecipitation, we identify one lncRNA named XLOC_087120 linked to SUZ12. XLOC_087120 is located in a region enriched in histone genes. Pearson correlation showed a significative anti-correlation between XLOC_087120 and histone neighboring coding gene expression suggesting a role of this lncRNA in the regulation of histone genes. The impact on histone genes expression was confirmed by overexpression and inhibition of XLOC_087120 in AML cell lines. Overexpression of NPM1 mutant in an AML cell line showed that NPM1 modulates the nuclear/cytoplasmic localization of XLOC_087120 and consequently its repressive function. Altogether, these data suggest that lncRNAs should be considered as key players in the pathogenesis of acute myeloid leukemias.
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Rôle de la transcription pervasive antisens chez Saccharomyces cerevisiae dans la régulation de l'expression des gènes / Role of pervasive transcription in gene expression regulation in Saccharomyces cerevisiaeChery, Alicia 04 October 2017 (has links)
L'expression des gènes est finement régulée dans la cellule et soumise à de multiples contrôles-qualité. Cette régulation intervient à différents niveaux, de façon à garantir une synthèse efficace des produits fonctionnels de l'expression génique, et pour assurer une adaptation à un changement environnemental. Notamment, les régulations transcriptionnelles sont cruciales pour contrôler la cinétique et le niveau d'expression des gènes. La transcription pervasive est une transcription généralisée non-codante et instable qui fut révélée chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Bien que son potentiel régulateur ait été démontré de façon ponctuelle, la question de sa fonctionnalité globale restait ouverte. Lors de ma thèse, j'ai pu montrer l'existence de phénomènes multiples d'interférence transcriptionnelle liés à la transcription pervasive, pour co-réguler un ensemble de gènes entre la phase exponentielle et la quiescence. En effet, la transcription non-codante en antisens des gènes concernés conduit à leur répression, dans des conditions où ils ne doivent pas être exprimés. Le mécanisme de répression fait intervenir des modifications de la chromatine. La levure bourgeonnante, dépourvue de la machinerie d'ARN interférence, présente donc un système fin de régulation de l'expression génique utilisant la transcription pervasive. / In the cell, gene expression is finely tuned and is submitted to different quality-controls. Gene are regulated at different expression levels in order to guarantee a proper synthesis of functional products, and to ensure an optimal adaptation to environmental changes. In particular, transcriptional regulations are critical for gene expression level and kinetics.Pervasive transcription, defined as a generalized non-coding and unstable transcription, was discovered in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Although its regulatory potential was punctually shown, the question of its global functionality still remained. During my PhD, I could show the existence of numerous transcriptional interference mechanisms involved in the co-regulation of a group of genes between exponential phase and quiescence. Indeed, non-coding transcription in antisense to genes promoter leads to its repression in conditions where they have to be switched off. The repression mechanism is allowed by chromatin modifications.Hence, budding yeast that lacks RNA interference machinery has developed a fine regulation system using pervasive transcription.
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MiRNA degradation by a conserved target RNA regulates animal behavior / Dégradation de miARN par une cible ARN conservée régulant le comportement animalBitetti, Angelo 26 September 2017 (has links)
L’objectif de mon projet principal de thèse est de déterminer la fonction biologique d’un lncARN conservés chez le zebrafish que nous avons appelé libra. La séquence de libra étant hautement homologue à la région 3’UTR de la protéine Nrep. Ces deux transcrits, libra et Nrep, contiennent en effet un site de liaison au miARN profondément conservé et inhabituellement complémentaire au miR-29. En utilisant à le modèle souris et les cellules murines, nous avons décrypté la relation régulatrice entre ce transcrit conservé dans l’évolution des vertébrés et la voie métabolique des miARN. Nous avons montré que Nrep limite le domaine d’expression de miR-29 au cervelet, et qu’il le déstabilise en rognant sa séquence. Notre travail révèle donc le premier exemple de dégradation endogène ciblée des miARN (ou TDMD). De plus, un ensemble d’expériences in vivo sur les modèles zebrafish et souris, nous a permis de démontrer que libra et Nrep contrôlent tout les deux le comportement animal. Via la perturbation génétique du site de liaison au miARN de Nrep murin, nous avons observé que ce gène régule le dosage du miR29 de part son site de liaison aux miARN, et que cette régulation est nécessaire à un comportement animal normal. Dans la seconde partie de ma thèse, je décris une stratégie exploré afin de déréguler les lncARN de la manière la moins invasive possible. Les lncARN sont actuellement neutralisés par des approches qui introduisent de vastes changements de séquence au niveau génomique. Nous avons donc développer une stratégie in vivo, appliquée au zebrafish, qui inactive les lncARN via l’insertion génomique d’une séquence ribozyme autoclivante ou d’un signal polyA prématuré. / The goal of my main thesis project was to determine the biological function of a deeply conserved zebrafish long noncoding RNAs (lncRNA) which we called libra. libra shows sequence similarity with the 3'UTR of the NREP a protein coding transcript. Both libra and Nrep contain a deeply conserved and unusually complementary microRNA (miRNA) binding site for miR-29. Using both the mouse model and mouse cell lines, we deciphered the regulatory relationship between this conserved transcript and the miRNA pathway. We showed that Nrep restricts the spatial expression domain of miR-29 in the cerebellum and that it destabilizes miR-29 through 3' trimming. Until now, only viral transcripts and artificial reporters engineered to contain highly complementary miRNA binding sites have been shown to regulate miRNAs in this fashion. Thus, our work uncovers the first example of endogenous target-directed miRNA degradation (TDMD). In addition, through a set of in vivo experiments in zebrafish and mouse, we showed that both libra and Nrep control normal animal behavior. By genetically disrupting the miR-29 binding site in Nrep in mouse, we showed that Nrep regulates miR-29 dosage through its miR-29 site and controls animal behavioral. In a second part of my thesis I describe a strategy to genetically downregulate lncRNAs in a minimally invasive manner. Approaches to knock-out lncRNAs that do not introduce vast sequence changes at the genomic level have not been adequately developed yet. I present our in vivo strategy applied to the zebrafish model using a genomic knock-in of a self-cleaving ribozyme sequence and a premature poly(A) signal to knock-out lncRNAs.
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Single molecule characterization of the roles of long non-coding RNAs in eukaryotic transcription regulationRahman, Samir 05 1900 (has links)
Récemment, des analyses dans divers organismes eucaryotes ont révélé que l'ensemble
du génome est transcrit et produit en plus des ARNs messagers, une grande variété d’ARNs
non codants de différentes longueurs. Les ARNs non codants de plus de 200 nucleotides,
classés comme longs ARNs non codants (LARNnc), représentent la classe la plus abondante
de transcripts non codants. Les études des fonctions des LARNnc suggèrent que beaucoup
d'entre eux seraient impliqués dans la régulation de la transcription. L'objectif de ma thèse de
doctorat était d'élucider les mécanismes de la régulation transcriptionnelle médiée par des
LARNnc dans différents systèmes eucaryotes.
Dans mon premier projet, j'ai étudié le rôle d'un long ARN non codant antisens dans la
régulation transcriptionnelle du gène PHO84, codant un transporteur de phosphate à haute
affinité, chez S. cerevisiae. Des études antérieures ont montré que la suppression d’une
proteine de l’exosome Rrp6 entraîne une augmentation de l'expression antisens et la répression
de PHO84. Il a été suggéré que la perte de Rrp6 entraîne une stabilisation antisens au locus
PHO84, entraînant le recrutement de l'histone de-acétylase Hda1 et la répression de PHO84.
Cependant, le mécanisme par lequel Rrp6p régule la transcription de PHO84 n’était pas
connu. En combinant des méthodes à l’échelle de cellule unique, des approches biochimiques
et génétiques, nous avons montré que les niveaux d'ARN antisens sont régulés principalement
lors de l'élongation par le complexe Nrd1-Nab3-Sen1, qui nécessite Rrp6 pour un recrutement
efficace à l`extrémité 3`de PHO84. De plus, nous révélons l'expression anticorrelé du sens et
de l'antisens, En résumé, nos données suggèrent que la transcription antisens régule le seuil
d'activation du promoteur PHO84.
Dans mon second projet, j'ai étudié les rôles des ARNs dérivés des amplificateurs
(ARNa) dans la regulation de la transcription. En utilisant les cellules de cancer du sein MCF7
comme système modèle, nous avons cherché à déterminer comment les ARNa induits par
l'oestrogène (E2) participent à la régulation de la transcription médiée par le recepteur
d’oestrogène (ERα) au niveau de l'allèle unique. À l'aide de l’hybridation fluorescente à
l’échelle de molécule unique (smFISH), nous avons révélé qu`après induction d'E2, les ARNa
sont induits avec une cinétique similaire à celle des ARNm cibles, sont localisés
exclusivement dans le noyau, principalement associés à la chromatine, et sont moins
abondants que les ARNm. De manière surprenante, nous avons constaté que les ARNa sont
rarement co-transcrits avec leurs loci cibles, indiquant que la transcription active des gènes ne
nécessite pas la synthèse continue ou l'accumulation d'ARNa sur l'amplificateur. En outre, en
utilisant des mesures de la distance à sous-diffraction, nous avons démontré que la cotranscription
des ARNa et des ARNm se produit rarement dans une boucle amplificateurpromoteur.
De plus, nous avons révélé que la transcription basale d'ARNa n'exige pas ERα ou
l'histone méthyltransférase MLL1 qui active l'amplificateur par la mono-méthylation H3K4.
Dans l'ensemble, nos résultats ont montré que les ARNa peuvent jouer un rôle lors de
l'activation du promoteur, mais ne sont pas nécessaires pour maintenir la transcription de
l'ARNm ou pour stabiliser les interactions amplificateur-promoteur. / Transcription is the initial step in gene expression and is subject to extensive
regulation. Recently, analyses in diverse eukaryotes have revealed that in addition to protein
coding genes, transcription occurs throughout the noncoding genome, producing non-coding
RNAs of various lengths. Non-coding RNAs longer than 200 nucleotides, classified as long
non-coding RNAs (lncRNAs), represent the most abundant class of non-coding transcripts,
whose functions however are poorly understood. Recent studies suggest that many lncRNAs
might have roles in transcription regulation. The goal of my PhD thesis was to elucidate the
mechanisms of lncRNA mediated transcription regulation in different eukaryotic systems.
For my first project, I investigated the role of an antisense long noncoding RNA in
transcription regulation of the high-affinity phosphate transporter gene PHO84 in the
unicellular eukaryote S. cerevisiae. Previous studies showed that deletion of the nuclear
exosome component Rrp6 results in increased antisense expression and repression of PHO84.
It was suggested that the loss of Rrp6 results in antisense stabilization at the PHO84 locus,
leading to recruitment of the histone de-acetylase Hda1 and repression of PHO84. However,
most of the mechanistic details of how Rrp6p functions in regulating PHO84 transcription
were not understood. Combining single cell methods with biochemical and genetic
approaches, we showed that antisense RNA levels are regulated primarily during
transcriptional elongation by the Nrd1-Nab3-Sen1 complex, which requires Rrp6 for efficient
recruitment to the 3’end of PHO84. Furthermore, we reveal anti-correlated expression of sense
and antisense, which have distinct modes of transcription. In summary, our data suggest a
model whereby antisense transcriptional read-through into the PHO84 promoter regulates the
activation threshold of the gene.
For my second project, I investigated the roles of enhancer derived RNAs (eRNAs).
eRNAs are lncRNAs transcribed from enhancers that have been suggested to regulate
transcription through different mechanisms, including enhancer-promoter looping, RNA
polymerase elongation, and chromatin remodeling. However, no coherent model of eRNA
function has yet emerged. Using MCF7 breast cancer cells as a model system, we sought to
determine how estrogen (E2) induced eRNAs participate in estrogen receptor alpha (ERα)
mediated transcription regulation at the single allele level. Using single molecule fluorescent
in situ hybridization (smFISH), we revealed that upon E2 induction eRNAs are induced with
similar kinetics as target mRNAs, but are localized exclusively in the nucleus, mostly
chromatin associated, and are less abundant than mRNAs. Surprisingly, we found that eRNAs
are rarely co-transcribed with their target loci, indicating that active gene transcription does
not require the continuous synthesis or accumulation of eRNAs at the enhancer. Furthermore,
using sub-diffraction-limit distance measurements, we demonstrated that co-transcription of
eRNAs and mRNAs rarely occurs within a closed enhancer-promoter loop. Moreover, we
revealed that basal eRNA transcription does not require ERα or the histone methyltransferase
MLL1, which activates the enhancer through H3K4 mono-methylation. Altogether, our
findings showed that eRNAs may play a role during promoter activation, but are not required
to sustain mRNA transcription or stabilize enhancer-promoter looping interactions.
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Identification de nouveaux mécanismes moléculaires dans les pathologies de croissance fœtale et postnatale des syndromes de Beckwith-Wiedemann et de Silver-Russell : approche génétique et épigénétique / Identification of new molecular defects underlying two diseases relating to growth in humans, the Beckwith-Wiedemann and Silver-Russell syndromes, through genetic and epigenetic approachesAbi Habib, Walid 21 June 2016 (has links)
La croissance fœtale et postnatale est un processus finement régulé par des facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux complexes. Le système des IGFs (insulin-like growth factors) est l’un des acteurs principaux jouant un rôle crucial dans le développement fœtal et postnatal. Chez l’humain, plusieurs mutations des gènes IGF1 et IGF-1R ainsi qu’une mutation d’origine paternelle d’IGF2 ont été rapportées chez des patients ayant un retard de croissance intra-utérin (RCIU) qui peut persister et/ou s’aggraver en postnatal. Par ailleurs, les phénomènes épigénétiques comme la méthylation de l’ADN et le code histone jouent également un rôle prépondérant dans le développement fœtal et postnatal. L’empreinte parentale, mise en place grâce à des marques épigénétiques, est un des mécanismes important pour le développement fœtal. Chez l’humain, une anomalie de régulation de gènes soumis à empreinte parentale est associée à plusieurs syndromes de retard de croissance intra-utérin et postnatal ou à l’inverse de croissance excessive. Ce travail comporte deux parties: nous nous sommes dans un premier temps particulièrement intéressés à l’étude génétique et épigénétique de la région 11p15.5 et de son centre d’empreinte régulant le domaine IGF2/H19 dans une population de patients ayant une croissance excessive ou bien un RCIU (syndromes de Beckwith-Wiedemann et Silver-Russell respectivement), afin de mieux comprendre la régulation de ce domaine. Puis, la deuxième partie de notre étude a porté sur l’identification de nouvelles causes génétiques et épigénétiques de syndrome de Silver-Russell, altérant l’expression d’IGF2 mais n’étant pas directement secondaires à un défaut moléculaire de la région 11p15.5. / Fetal and postnatal growth is a process finely regulated by genetic, epigenetic and environmental complex. The IGFs system (insulin-like growth factors) is one of the main actors playing a crucial role in fetal and postnatal development. In humans, several mutations of IGF1 and IGF-1R genes and a paternal IGF2 mutation have been reported in patients with intrauterine growth restriction (IUGR), which can persist and/or worsen in postnatal life. Moreover, epigenetic phenomena such as DNA methylation and histone code also play a major role in fetal and postnatal development. Genomic imprinting, established due to epigenetic marks, is one of the major mechanisms for fetal development. In humans, abnormal regulation of genes subject to imprinting is associated with several syndromes of intrauterine and postnatal growth restriction or conversely excessive growth. This work has two parts: we initially particularly interested in the genetic and epigenetic study of the 11p15.5 region and its imprinting control region regulating the IGF2/H19 domain in a population of patients with overgrowth or IUGR (Beckwith-Wiedemann syndrome and Russell-Silver respectively), to better understand the regulation of this area. Then, the second part of our study focused on the identification of new genetic and epigenetic causes of Silver-Russell syndrome, altering the expression of IGF2, without being directly caused by a molecular defect of 11p15.5 region.
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Régulation épigénétique des cellules souches cancéreuses mammaires : un nouveau rôle pour l'ARN non-codant Xist / Epigenetic regulation of breast cancer stem cells : a new role for the long non-coding RNA XistSalvador, Marion 16 December 2014 (has links)
La récidive et la progression métastatique du cancer du sein ne sont toujours pas curables. Le concept des cellules souches cancéreuses (CSC) pourrait apporter une explication à ces échecs. Les CSC résisteraient aux thérapies conventionnelles (chimiothérapies, radiothérapie) et seraient responsables de la rechute et de la progression du cancer. L'élimination des CSC semble être un pré-requis indispensable pour le traitement des patientes. L'identité et le destin des cellules souches sont finement régulés par des acteurs épigénétiques. Les travaux de cette thèse se sont intéressés aux conséquences de la dérégulation de deux acteurs épigénétiques en particulier : les enzymes HDAC et le long ARN non-codant Xist. Nous avons montré que la modulation épigénétique via l'inhibition des HDAC (HDACi) permet d'éliminer les CSC en induisant leur différenciation. Nous présentons une nouvelle stratégie thérapeutique pour le cancer du sein : la thérapie différenciante. Nous avons déterminé Xist comme étant le biomarqueur prédictif de la réponse aux HDACi. Xist étant un partenaire clé de la plasticité cellulaire, les travaux de cette thèse se sont ensuite intéressés aux conséquences de la dérégulation de Xist dans l'initiation tumorale. Nous avons observé que l'inhibition de Xist favorise la division des cellules souches mammaires normales. Nous proposons un nouveau modèle de l'initiation tumorale où la dérégulation épigénétique est une modification précoce sans conséquence sur l'homéostasie tissulaire mais pourrait être la première étape de la transformation cancéreuse. / These last decades have allowed deciphering the biology of breast cancer and improving the therapeutic management. However, recurrence and metastatic progression of the disease are still not curable. The concept of cancer stem cells (CSC) could provide an explanation for these failures. CSC would resist conventional therapies (chemotherapy, radiotherapy) and would be responsible for both relapse and progression of cancer. The elimination of CSC seems to be an essential prerequisite for the treatment of patients. The identity and fate of stem cells are tightly regulated by epigenetic mechanisms. The work of this thesis investigated the consequences of deregulation of two epigenetic players: HDAC enzymes and long non-coding RNA Xist. We have shown that epigenetic modulation via HDAC inhibitor (HDACi) eliminates the CSC by inducing their differentiation. We present a new therapeutic strategy for breast cancer: differentiation therapy. We determined Xist as the predictive biomarker of response to HDACi. Xist is a key partner of cell plasticity, the work of this thesis therefore interested in the consequences of Xist deregulation in tumor initiation. We observed that Xist inhibition promotes division of normal breast stem cells. We propose a new model of tumor initiation: epigenetic deregulation is an early change without consequence on tissue homeostasis but could be the first step of the cancerous transformation.
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Régulation de l’expression et de la localisation des ARN TLC1 et TERRA en réponse à différents stress génomiques chez la levureLalonde, Maxime 06 1900 (has links)
Les télomères forment la structure qui coiffe les extrémités des chromosomes. Ils sont essentiels pour protéger l’intégrité génomique. À cause du problème de fin de réplication, les télomères raccourcissent à chaque division cellulaire, menant à l’arrêt du cycle cellulaire, à la sénescence et à la mort cellulaire. Pour contrevenir au raccourcissement des télomères, les cellules immortalisées et hautement prolifératives, ainsi que la plupart des eucaryotes unicellulaires tels que Saccharomyces cerevisiae, expriment la télomérase, un complexe ribonucléoprotéique enzymatique qui rallonge les télomères.
Pour permettre le maintien de la longueur des télomères et assurer l’intégrité du génome, plusieurs régulateurs contrôlent le recrutement et l’activité de la télomérase, s’assurant du ciblage précis de l’activité de la télomérase à ses substrats. Aux télomères, un dérèglement des mécanismes de régulation de la télomérase peut mener au raccourcissement des télomères, à des fusions de chromosomes et au développement d’un potentiel cancéreux. La télomérase peut aussi agir aux cassures d’ADN où son activité se traduit par l’ajout de novo d’un télomère et conduit à la perte de matériel génétique, à l’instabilité génomique et possiblement à la mort cellulaire. Son recrutement et son activité y sont donc inhibés. Les mécanismes par lesquels la cellule régule l’activité de la télomérase aux télomères et aux cassures d’ADN restent encore peu connus. De plus, en réponse à certains stress, ces mécanismes peuvent être altérés. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour but d’étudier les régulateurs de l’activité de la télomérase et l’impact de certains stress cellulaires sur cette régulation.
Dans la première partie, nous avons étudié la localisation de l’ARN TLC1, la sous-unité ARN de la télomérase, à travers le cycle cellulaire chez S. cerevisiae. Alors que cet ARN est majoritairement dans le nucléoplasme en G1/S, il démontre une accumulation nucléolaire en phase G2/M du cycle cellulaire. Chez la levure, la réparation des cassures d’ADN se fait majoritairement par recombinaison homologue et est exclue du nucléole. Dans ce contexte, nous avons formulé l’hypothèse que l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléole en G2/M constitue un mécanisme par lequel l’ajout de novo de télomère est inhibé aux cassures d’ADN. Nous avons fixé comme buts de caractériser les mécanismes régulant l’accumulation nucléolaire de l’ARN TCL1 et d’étudier comment la présence de dommage à l’ADN influence cette régulation.
Nous avons pu montrer que la localisation nucléolaire de l’ARN TLC1 dépend de l’hélicase Pif1, de la protéine de la recombinaison homologue Rad52 et que la présence de dommage à l’ADN et l’absence de Rad52 influence le trafic nucléaire de cet ARN. Dans ces conditions, la protéine de la recombinaison homologue Rad51 permet l’accumulation de Cdc13 aux cassures et favorise l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléoplasme et aux cassures d’ADN. Cette accumulation est dépendante de la SUMO ligase Siz1 et mène à une augmentation d’ajout de novo de télomère aux sites de cassures d’ADN. Pour pouvoir quantifier l’augmentation d’ajout de novo de télomère, nous avons développé une nouvelle approche basée sur le séquençage haut-débit de type Illumina pour identifier et quantifier les événements d’ajout de novo de télomère sur le génome entier de manière non-biaisée.
Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons étudié les mécanismes contrôlant l’expression d’un régulateur de la télomérase nommé TERRA (telomeric repeats containing RNA). TERRA est un long ARN non-codant qui est transcrit à partir des régions sous-télomériques jusqu’aux répétitions télomériques. Chez S. cerevisiae, l’expression de TERRA est inhibée au niveau de sa transcription par le complexe SIR et au niveau de sa dégradation par l’exonucléase Rat1. Pourtant, les télomères courts expriment TERRA à des niveaux élevés. Cette augmentation de l’expression de TERRA permet de concentrer et de cibler l’activité de la télomérase aux télomères courts. En étudiant l’expression de TERRA, nous avons remarqué que les télomères exprimant cet ARN démontrent une perte prématurée de leur cohésion en phase S du cycle cellulaire. Nous pensons que l’organisation structurelle des télomères et, plus particulièrement, la cohésion télomérique participe à la régulation de l’expression de TERRA. De plus, plusieurs groupes ont montré que l’expression de TERRA était régulée en réponse à plusieurs stress, de façon indépendante de la taille des télomères. Dans ce contexte, nous formulons l’hypothèse que le stress oxydatif et les changements métaboliques induits durant la transition diauxique influence l’expression de TERRA. Pour cette partie de la thèse, nous avions comme but d’étudier comment l’expression de TERRA étaient régulé par les changements métaboliques comme la transition diauxique et d’étudier le rôle joué par le complexe de la cohésine dans la régulation de l’expression de TERRA.
Nous avons montré que les télomères courts montrent une perte de cohésion prématurée en début de phase S, ce qui favorise l’expression de TERRA en cis. Alors qu’une perte de fonction partielle de la cohésine résulte en une augmentation de l’expression de TERRA, la rétention forcée de cohésine à un télomère court réprime sa transcription. Cette perte de cohésion aux télomères courts est dépendante de Sir4 mais indépendante de Sir2, ce qui suggère que le rôle de Sir4 dans l’ancrage des télomères à la membrane nucléaire pourrait être impliqué dans ce phénomène. Nous avons également montré que la transcription de TERRA est induite durant la transition diauxique, une phase de croissance cellulaire où, suite à la déplétion du glucose, les cellules adaptent leur métabolisme en faveur de la respiration oxydative. Cette augmentation d’expression coïncide avec l’accumulation cytoplasmique de TERRA.
Ensemble, les travaux présentés dans cette thèse explorent les liens entre les stress cellulaires tels que les dommages à l’ADN, le raccourcissement télomérique, le stress oxydatif et le métabolisme cellulaire, et leur impact sur le trafic de la télomérase et l’expression de son régulateur TERRA. / Telomeres constitute the structure at the end of linear chromosomes which is essential to protect genome integrity. Due to the end-replication problem, telomeres get shorter with every cell division, leading to cell cycle arrest, senescence and cell death. To counteract telomere shortening, highly proliferative cells and most unicellular eukaryotes, like Saccharomyces cerevisiae, express telomerase, a ribonucleoprotein enzyme that elongates telomeres.
Many regulatory pathways affect telomerase activity and recruitment to assure precise targeting of telomerase activity to its proper substrate, the telomeres. Impairing these pathways can lead to telomere shortening, end-to-end chromosome fusions and immortalization. Telomerase can also be recruited at double strand breaks (DSBs), where its activity leads to de novo telomere additions which induce genomic instability, loss of genetic information and possibly cell death. For this reason, telomerase recruitment and activity is strongly inhibited at DSB. However, the mechanisms behind this regulation are still poorly understood. Furthermore, many cellular stresses affect telomerase regulation at telomeres and DSBs. Our goal is to study the regulation of telomerase activity and the impact of cellular stresses on this regulation.
In the first part of this thesis, we looked at the cell cycle localization of the Saccharomyces cerevisiae RNA subunit of the telomerase, TLC1 RNA. While TLC1 RNA is mostly in the nucleoplasm in G1/S, it accumulates in the nucleolus in G2/M. In yeast, the most common DSB repair pathway is homologous recombination (HR). As HR is mostly excluded from the nucleolus in G2/M, we propose that the accumulation of TLC1 RNA in the nucleolus in G2/M may represent a regulatory pathway that repress de novo telomere addition by physically separating telomerase from sites of DNA repair by HR. We aim to characterize the mechanisms by which TLC1 RNA localization is regulated and how the presence of DSB affects this trafficking.
We were able to show that the nucleolar localization of TLC1 RNA is dependent on the Pif1 helicase and on the HR protein Rad52. Furthermore, we showed that the presence of DSBs and the absence of Rad52 alter the nuclear trafficking of TLC1 RNA. In these conditions, Rad51 favors the accumulation of Cdc13 at DSBs and promotes the nucleoplasmic accumulation of TLC1 RNA. This accumulation is dependent on the SUMO ligase Siz1 and leads to an increased addition of de novo telomere at DNA breaks. In order to identify de novo telomere addition events genome-wide, we developed an unbiased genome-wide technique based on Illumina sequencing of genomic DNA.
In the second part of this thesis, we studied another regulator of telomerase activity, the long non-coding RNA (lncRNA) TERRA (telomeric repeats-containing RNA), which is transcribed from subtelomeric regions through the telomeric tracts. In S. cerevisiae, TERRA expression is controlled at the transcriptional level by the SIR complex and its degradation by the exonuclease Rat1. Nevertheless, short telomeres escape transcriptional inhibition and degradation to express TERRA at higher levels. TERRA serves as a regulator of telomerase, allowing the concentration and the targeting of telomerase activity to short telomeres. While studying TERRA expression, we observed that TERRA-expressing telomeres display a premature S-phase loss of cohesion. We propose that cohesin and telomere cohesion are regulators of TERRA expression. In addition, other groups have shown that TERRA expression was regulated in response to different cellular stress. This regulation seems to be independent from telomere length. In these contexts, we propose that oxidative stress and metabolic changes induced during the diauxic shift affect TERRA expression. We aim to study how the diauxic shift affects TERRA expression and study the role of cohesin in regulating TERRA expression.
We were able to show that telomere cohesion inhibits TERRA expression and that short telomeres display a premature loss of cohesion to allow TERRA expression. This loss of cohesion is dependent on Sir4 and probably on Sir4-mediated telomere anchoring at the nuclear membrane. Additionally, we showed that TERRA transcription is increased during the diauxic shift, when yeast cells switch from fermentative glycolysis to oxidative respiration. Yeast cells in this phase also display a cytoplasmic accumulation of TERRA molecules.
Altogether, the articles presented in this thesis explore the interplay between cellular stresses such as DNA damage, telomere shortening, oxidative stress and respiratory metabolism, and their roles in the regulation of the localisation and expression of TLC1 RNA and TERRA.
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